M-S-Lc-I002 Instructivo de Ensayo Determinación Ffósforo Total Por Digestion Acida, Método Del Ácido Ascórbico SM 4500-p B, E. v3
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Código: M-S-LC-I002
DETERMINACIÓN FÓSFORO TOTAL POR Versión : 03
DIGESTION ACIDA, MÉTODO DEL ÁCIDO Fecha: 21/10/2020
ASCÓRBICO SM 4500-P B, E.
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1. OBJETIVO
Establecer la metodología para la determinación del fosforo total por colorimetría en agua, SM 4500-P B, E.
2. ALCANCE
Este método de análisis aplica a muestras de aguas residuales domesticas e industriales, aguas
superficiales, lluvias y subterráneas.
Esta técnica se aplica en el GLCA para el recurso hídrico superficial; el rango de aplicación es de: 0,05mg P
Total / L – 1,00mg P Total / L.
En la tabla 1 se observan los resultados obtenidos en la confirmación del método:
Tabla 1. Resultados Confirmación del método
CUADRO PARÁMETROS DE CONFIRMACIÓN DEL MÉTODO
CÓDIGO DEL INSTRUCTIVO DE ENSAYO:
FECHA DE INFORME DE ESTANDARIZACIÓN: 20 / 11 / 2018
PARÁMETRO VALOR UNIDADES OBSERVACIÓN
Corresponde al límite de
LIMITE DE DETECCION 0,05 mg P total/L
cuantificación
12,21 % Nivel de concentración bajo
PRECISIÓN EN TÉRMINOS DE % CV
4,72 % Nivel de concentración alto
EXACTITUD EXPRESADO COMO % DE 6,50 % Nivel de concentración bajo
ERROR RELATIVO 1,20 % Nivel de concentración alto
RANGO DE TRABAJO (Lectura Directa) 1,0 Sin dilución de la muestra
Tratar los residuos producto del análisis de la determinación, de acuerdo al documento de disposición final
de residuos.
Realizar la adición de los ácidos y la digestión de las muestras en la cabina extractora de vapores inorgánicos.
5. EQUIPOS, REACTIVOS Y MATERIALES
5.1 Equipos
● Espectrofotómetro UV-VIS marca Hewlett Packard modelo 8453, detector de arreglo de diodos, ancho
de banda de 0,1 nm, provisto de una celda de vidrio con paso de luz de 1,0 cm, y consta de lo siguiente:
*Sistema óptico revertido de haz sencillo.
*Fuente de radiación, lámpara de tungsteno.
*Monocromador
*Detectores fotodiodos y a su vez arreglo de diodos.
● Plancha de calentamiento Schott Ceran ó Thermolyne Cimarec2
● Balanza analítica electrónica con resolución de 0,0001 g.
● Cabina extractora para vapores inorgánicos.
5.1.1 Verificación de Equipos
● Verificar la balanza analítica antes de realizar cualquier pesaje, de acuerdo con el Instructivo de
Aseguramiento Metrológico M-S-LC-I048.
● Verificar el volumen dispensado por las pipetas y transferpipetas según el volumen requerido.
5.2 Reactivos
Solicitar los reactivos diligenciando el formato correspondiente.
● Agua ultra pura.
● Ácido sulfúrico (H2SO4), concentrado.
● Ácido Nítrico (HNO3), concentrado.
● Ácido sulfúrico (H2SO4), 5N: En un vaso de precipitado de 400 mL, agregar 200 mL de agua ultra pura,
adicionar lentamente y con agitación 70 mL de ácido sulfúrico (H2SO4) concentrado, como se produce
una reacción exotérmica, esperar hasta la solución este fría, en ese momento transferir
cuantitativamente la solución a un balón de 500 mL y completar con agua ultra pura. Mantener en
frasco de vidrio a temperatura ambiente.
● Fenolftaleína en solución alcohólica: Disuelva 1 g de fenolftaleína en 100 mL de alcohol etílico y
adicione 100 mL de agua ultra pura.
● Hidróxido de sodio, NaOH, 10 N. Disuelva 400 g de NaOH en un vaso de precipitado de un litro, lleve
a temperatura ambiente y complete a un litro con agua ultra pura, en un balón clase B.
● Solución de Tartrato de Antimonio y Potasio: Disolver 0,6858 g de K(SbO)C4H4O6½H2O en 200 mL
de agua ultra pura, en un balón aforado de 250 mL llevar a volumen. Almacenar a temperatura ambiente
en frasco de vidrio por un período de tiempo no mayor a 3 meses. No utilizar este reactivo después del
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tiempo recomendado ya que forma un precipitado azul en las muestras, minutos después de adicionar
el reactivo combinado, registrando valores más bajos en los resultados.
● Solución de Molibdato de Amonio: Disolver 20 g de heptamolibdato de amonio tetrahidratado,
(NH4)6Mo7O244H2O en 500 mL de agua ultra pura. Almacenar refrigerado en frasco de vidrio por un
período de tiempo no mayor a 6 meses. Este reactivo puede formar un precipitado blanco con el tiempo,
que no interfiere en la calidad del análisis. Agitar muy bien antes de utilizar.
● Ácido Ascórbico, 0,1 M: Disolver 1,76 g de ácido ascórbico en 100 mL de agua ultra pura. Guardar
en frasco de vidrio ámbar, esta solución es estable por una semana, refrigerada a 4C.
● Reactivo Combinado: Dejar que todos los reactivos alcancen la temperatura ambiente antes de
agregarlos. Mezclar los siguientes reactivos en estricto orden y proporciones, agitando después de la
adición de cada uno de los reactivos:
Tabla 2. Proporciones de reactivos
Número de Ácido
Volumen H2SO4 5 N
muestras Tartrato (mL) Molibdato (mL) ascórbico
preparado (mL)
aprox. (mL)
25 100 mL 50 5 15 30
20 80 mL 40 4 12 24
12 50 mL 25 2.5 7.5 15
7 30 mL 15 1.5 4.5 9
Nota: Si se prepara este reactivo en un recipiente de vidrio transparente se puede observar una coloración
amarilla que indica que quedó bien preparado. Si se nota algo de turbidez, agitar y dejar en reposo por
unos minutos hasta que ésta desaparezca. Este reactivo es estable por 4 horas.
● Solución Patrón de Fosfato de 50 mg (P-PO4)/L: Colocar 0,25 g de fosfato diácido de potasio también
denominado fosfato monobásico de potasio KH2PO4 grado analítico a secar a 105°C durante dos (2)
horas. Disolver en agua ultra pura 0,2195 g de KH2PO4 anhidro y diluir a 1000 mL en balón volumétrico.
Almacenar en nevera a 4°C en frasco de vidrio. 1,00 mL = 50,0 µg PO4–3 P. Esta solución es estable
durante seis (6) meses.
● Solución Mezcla Fósforo Orgánico e Inorgánico colocar 7,0 mg de ortofosfato de fósforo PO 4-P/L,
3,0g hexametafosfato de sodio/L, 0,23mg ácido adenílico/L, 0.20 mg NH3-N/L, 0,05mg NO3-N/L, y 400
mg Cl/L, todo se llevara a un volumen de 1000ml.
5.2.1 Procedimiento de Preparación de Estándares
5.2.1.1 Estándares de curva calibración
A partir de la solución patrón de fosfato de 50mg P-PO4/L, preparar el estándar intermedio de 10mg/L para
la preparación posterior de las concentraciones indicadas en la Tabla 4, con las cuales se debe elaborar la
curva de calibración.
● Estándar intermedio de 10mg/L. A partir de la solución patrón de 50mg/L, tomar 20mL y llevarlos a
volumen en un balón aforado de 100mL, con agua ultra pura.
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● Estándar de 1,00 mg/L. A partir de la solución intermedia de 10 mg/L, tomar 20 mL de ésta solución y
llevar a volumen en un balón aforado de 200 mL, con agua ultra pura.
● Estándar de 0,80 mg/L. A partir de la solución patrón de 50 mg/L, tomar 4 mL de ésta solución y llevar
a volumen en un balón aforado de 250 mL, con agua ultra pura
● Estándar de 0,50 mg/L. A partir de la solución intermedia de 10 mg/L, tomar 10 mL de ésta solución y
llevar a volumen en un balón aforado de 200 mL, con agua ultra pura.
● Estándar de 0,30 mg/L. A partir de la solución intermedia de 10 mg/L, tomar 6 mL de ésta solución y
llevar a volumen en un balón aforado de 200 mL, con agua ultra pura.
● Estándar de 0,10 mg/L. A partir de la solución intermedia de 1,00 mg/L, tome 20 mL de ésta solución y
llevar a volumen en un balón aforado de 200 mL, con agua ultra pura.
● Estándar de 0,05 mg/L. A partir de la solución intermedia de 1,00 mg/L, tomar 10 mL de ésta solución
y llevar a volumen en un balón aforado de 200 mL, con agua ultra pura.
Tomado del SM Tabla 4020: I (3. Consulte 4020B del SM para más Requisitos de control de calidad).
● Con cada lote se correrá una mezcla de fósforo orgánico e inorgánico preparada con los reactivos
Hexametafosfato e Sodio y Ácido Adenílico.
● Los blancos se analizan para determinar si la calidad del agua y de los reactivos es óptima. Estos
deben registrar absorbancia con cifras exponenciales de 10-3 y 10-4.
● Con cada lote de muestras se debe correr el LDM que para este caso es de 0,05 mg P/L.
● Los duplicados evalúan la limpieza del material de vidrio, la purga adecuada de la celda, la repetibilidad
del método.
● Realizar por duplicado una muestra adicionada al azar. Incluir un duplicado para cada tipo de matriz
diariamente con cada lote de 20 muestras o menos. El porcentaje de diferencia relativa (RPD) de los
duplicados no debe ser mayor al 10%; si la variación excede este límite, repetir el análisis para el grupo
de muestras contraladas por este duplicado.
● Llevar los registros de los estándares de control de 0,05 mg P/L, 0,10 mg P/L y 1,00 mg P/L en las
cartas de control Carta de control exactitud M-S-LC-F055, Carta de control Precisión M-S-LC-F056 y
Carta de control recuperación y duplicados M-S-LC-F057.
● Cuando los resultados se encuentren entre el límite de alarma y control, revisar todo el procedimiento
para determinar que ocurrió. Si cualquier dato cae fuera de los límites de control debe ser reexaminado
y si es necesario, se debe repetir el análisis de todo el grupo de muestras controlado por el estándar
que no cumplió. No realizar más análisis hasta verificar que sucedió, comunicar la anomalía al Líder de
fisicoquímica. Repetir iniciar nuevamente la marcha analítica cuando el Líder de fisicoquímica lo indique.
● Tomar las acciones respectivas en el caso que se presenten tendencias de datos en la carta de control,
de acuerdo con lo definido en el M-S-LC-I051 Instructivo de Aseguramiento de Calidad Analítica.
8. DESARROLLO
8.1 Principio
El fósforo total (P) se determina en una muestra sin filtrar y en ella están presentes todas las formas de
fósforo. Debido a que el fósforo puede estar presente en combinación con la materia orgánica, es necesario
para determinar el fósforo total, preparar la muestra mediante un método de digestión capaz de oxidar la
materia orgánica efectivamente, para liberar el fósforo como orto fosfato, para su posterior determinación por
el Método del Ácido Ascórbico. La concentración de fósforo total se registra como mg P total /L.
El fósforo se encuentra en aguas naturales y residuales casi exclusivamente como fosfatos, los cuales se
clasifican en ortofosfato, fosfatos condensados (piro-, meta-, y otros poli fosfatos) y fosfatos orgánicos
El Molibdato de amonio y el Tartrato de antimonio y potasio reaccionan en medio ácido con el ortofosfato
para formar un heteropoliácido -ácido fosfomolíbdico- que es reducido por Ácido ascórbico a un complejo
azul de molibdeno intensamente coloreado; sólo las formas de ortofosfato forman dicho color azul en esta
prueba.
La presencia de fósforo en los cursos de agua proviene del uso de fertilizantes, jabones, detergentes, o del
suelo. A mediano plazo pueden producir en las aguas continentales proliferación de algas y otros vegetales
acuáticos (eutrofización). Los polifosfatos utilizados en los detergentes o en el tratamiento de aguas
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● La muestra ya está lista para la determinación de fósforo por el Método del ácido ascórbico.
● Cuando en una muestra observe una buena digestión, pero ésta presenta algo de color o turbidez,
realizar corrección de turbidez, en el momento de la lectura en el espectrofotómetro.
8.4.2 Curva de Calibración
Con los estándares preparados en el numeral 5.2.1.1 proceder de la siguiente forma:
● Transferir una alícuota de 25 mL del blanco y de los estándares, a Erlenmeyer rotulados. Adicionar 4
mL del reactivo combinado al blanco y a los estándares, mezclar completamente, y después de mínimo
10 minutos, pero antes de 30 minutos, leer en el espectrofotómetro.
● Para iniciar las lecturas fotométricas, colocar el blanco de reactivos en la celda, leer como blanco para
verificar la observación de una línea recta horizontal en el rango de la longitud de onda de los 880 nm.
De presentarse alguna alteración, volver a hacer la lectura como blanco, hasta que sea normal.
● Leer el blanco como estándar y como muestra y codificar como blanco. La absorbancia debe registrar
cifras exponenciales de 10-3 y 10-4. Si no se cumple, volver a leer como estándar y como muestra.
● Leer los estándares en orden creciente, como estándares y enseguida como muestras. La gráfica de
absorbancia contra concentración de fosfato da una línea recta que pasa por el origen.
● El equipo solicita la rotulación de cada muestra, que debe indicar el valor nominal del estándar, con las
unidades.
● Antes de aceptar los datos, hacer la verificación de Control y aseguramiento de calidad, numeral 7 de
este instructivo.
● Almacenar los datos en la carpeta del año correspondiente, en la subcarpeta fósforo total. Grabar la
curva, los estándares y las muestras de dicha curva de calibración con la fecha en que se realizó el
análisis (dd/mm/aa), en la carpeta curvas, en la carpeta estándares y en la carpeta muestras
respectivamente. Imprimir el reporte y entregar al encargado de la auditoria de verificación.
● Registrar con la fecha los datos sobre la curva de calibración aprobada por la auditoría de verificación
en el seguimiento respectivo que realiza el laboratorio.
8.4.3 Procesamiento de la Muestra
● Solicitar las muestras a analizar con el suficiente tiempo para permitir atemperarlas.
● Pretratamiento de la muestra: Realizar la digestión (numeral 8.4.1 de este instructivo).
● Corrección por turbidez o color. El color natural del agua generalmente no interfiere a la longitud de
onda empleada. Para aguas altamente coloreadas o turbias, preparar un blanco de la muestra filtrada
que presenta esta característica, adicionar a 25mL de muestra, 4mL de reactivo combinado modificado
(mezclando exclusivamente 50mL de H2SO4 5N y 15mL de molibdato de amonio). Leer este blanco
como muestra, registrar el código de la muestra y la palabra blanco y a continuación leer la muestra a
la que se le ha adicionado el reactivo combinado completo. Reportar el valor de concentración de esta
muestra mediante cálculo adicional sustrayendo los valores de concentración de muestra y su blanco
correspondiente.
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● Encender el espectrofotómetro UV-VIS con la lámpara de tungsteno (roja en el equipo) 45 minutos antes
de iniciar las lecturas. La lectura de fósforo total debe hacerse a 880 nm. Cargar la curva
correspondiente a la última curva de calibración.
● Verificar que la celda de vidrio de 1cm esté perfectamente limpia; si esta manchada de color azul, dejarla
en jabón libre de fósforo y enjugar perfectamente con agua desionizada. Si continúa manchada lavarla
con ácido sulfúrico 5N y enjuagar con agua desionizada.
● Procesamiento de la muestra: Adicionar a cada muestra 4,0mL del reactivo combinado, mezclar
completamente, y después de mínimo 10 minutos, pero antes de 30 minutos, leer en el
espectrofotómetro.
● Al pasar un grupo de muestras, correr inicialmente un blanco de reactivos, leer como blanco y como
muestra. Enseguida, pasar el estándar de baja y luego el de alta concentración.
● Utilizar el duplicado de muestra y el fortificado con su duplicado como controles de grupos de máximo
veinte muestras, en cada lote.
● Identificar cada muestra con el consecutivo de radicación.
● Verificar que la absorbancia de la muestra no sobrepase el rango de absorbancia obtenida en la curva
de calibración para el estándar de más alta concentración (1,00mg/L).
● Grabar los resultados primarios en el disco duro del computador del espectrofotómetro, en el que queda
registrado el nombre del analito, nombre del método, archivo de la curva, ecuación de calibración, Límite
de Cuantificación/detección del método, fecha y hora del análisis, nombre del operador, firma, nombre
de la muestra, factor de dilución, concentración (mg/L) y absorbancia.
● Imprimir el reporte y entregar para archivar en la carpeta correspondiente, en espera de la auditoría
analítica.
● Reportar la concentración redondeando el resultado hasta con cuatro (4) cifras significativas, tres (3)
cifras decimales.
● Registrar en las cartas de control los resultados hasta con cuatro (4) cifras significativas, tres (3) cifras
decimales.
● Realizar las observaciones que sobre Control y aseguramiento de calidad se han definido en este
instructivo y en el Instructivo de Aseguramiento de Calidad Analítica M-S-LC-I051.
● Registrar los resultados en la correlación de variables (Fósforo).
8.5 Formatos
M-S-LC-F011 Formato entrega muestras a analistas
M-S-LC-F039 Solicitud de reactivos, vidriería y materiales
M-S-LC-F014 Rótulos de reactivos
M-S-LC-F007 Formato control diario del manejo de equipos
M-S-LC-F021 Formato de condiciones ambientales
M-S-LC-F054 Formato captura de datos primarios
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01 14/12/2017 Creación del documento con base a la nueva estructura del SGI
En el ´ítem 5.2 y 5.2.1.2 y 7, se incluye el uso de la Solución Mezcla Fosforo Orgánico e Inorgánico, de
igual forma el control de calidad del límite de cuantificación el cual se debe correr con cada lote de
02 15/04/2020 muestras, en el 8.4.3 el redondeo y reporte de las cifras significativas, se modifica el cargo que aprueba el
documento de Subdirector de hidrología por Coordinador Laboratorio de Calidad Ambiental: Realizo José
Alexander Afanador.
03 21/10/2020 Nueva versión producto de la actualización de la documentación del Sistema Integrado de Gestión.
Adriana Dueñas Moreno Carlos Martín Velásquez Ramírez Jonathan Danilo Uasapud García
Contratista Grupo Laboratorio de Contratista Líder Técnico Grupo Laboratorio de Coordinador Grupo Laboratorio de Calidad
Calidad Ambiental Calidad Ambiental Ambiental
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ANEXO 1. DIAGRAMA
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