UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

-Departamento de Fisiología y Biología Molecular y Celular-

“Estudio estructural y funcional de la familia de proteínas de tipo

perforina en Babesia spp. y su rol en la interacción patógeno-
hospedador”

Tesis presentada para optar por el título de Doctor de la Universidad de

Buenos Aires en el área Ciencias Biológicas.

Lic. Martina Soledad Paoletta

Directora de tesis: Dra. Silvina Elizabeth Wilkowsky

Consejero de estudios: Dr. Horacio Esteban Hopp

Lugar de trabajo: Laboratorio de Hemoparásitos. Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular

(IABIMO) INTA-CONICET.

Buenos Aires, 2019.

Estudio estructural y funcional de la familia de proteínas de tipo perforina en
Babesia spp. y su rol en la interacción patógeno-hospedador

Resumen

La babesiosis bovina es una enfermedad transmitida por garrapatas causada por parásitos
protozoarios del género Babesia que en el hospedador mamífero invaden y replican únicamente
dentro de los eritrocitos. Esta enfermedad afecta la producción ganadera en regiones de clima tropical
y subtropical generando importantes pérdidas económicas a nivel global. Si bien existen estrategias de
prevención de la enfermedad tales como el control del vector o la vacunación con cepas atenuadas,
las mismas presentan importantes limitaciones por lo que es necesario el desarrollo de estrategias
superadoras para controlar la enfermedad. En ese sentido, resulta indispensable dilucidar las bases
moleculares de la interacción patógeno-hospedador y estudiar las proteínas involucradas en los
procesos de invasión, replicación y egreso parasitario.

El objetivo de esta tesis fue caracterizar estructural y funcionalmente la familia de proteínas tipo
perforina (PLP) en el género Babesia. Estas proteínas, en organismos estrechamente relacionados a
Babesia como Toxoplasma gondii y Plasmodium spp., poseen capacidad de formar poros en
membranas de células blanco y son esenciales para la invasión y/o egreso de la célula hospedadora.

En este trabajo, se realizó la identificación y caracterización estructural de toda la familia de proteínas

PLP en las distintas especies de Babesia mediante análisis bioinformáticos sobre genomas ya
secuenciados. Se identificó un número variable de genes en las diferentes especies, desde 3 en B. canis
a 8 en B. bigemina y B. divergens. El análisis estructural de las proteínas PLP identificadas mostró que
están altamente conservadas a nivel de su estructura secundaria y terciaria tanto dentro del género
como con otras proteínas PLP del phylum Apicomplexa, mientras que a nivel de estructura primaria las
mismas son divergentes, manteniendo conservados sólo algunos aminoácidos de sus dominios
funcionales. El análisis de datos de transcriptómica de diferentes estadios de B. bovis, la especie bovina
más virulenta del género, mostró que los 6 genes plp se transcriben durante alguna etapa del ciclo de
vida y tres de ellos (plp1, plp2 y plp5) tienen una transcripción estadio-específica. El gen plp1 presentó
el mayor nivel de transcripción en el merozoíto, estadio presente sólo en bovinos. A través de análisis
de Western blot realizados con el dominio funcional de la proteína PLP1 recombinante se demostró la
presencia de anticuerpos específicos contra dicha proteína en bovinos naturalmente infectados con B.
bovis indicando que PLP1 es inmunogénica y posee epítopes B inmunodominantes expuestos al
sistema inmune bovino durante de la infección. Los ensayos de hemólisis in vitro con el dominio

2
funcional de PLP1 recombinante demostraron una alta capacidad hemolítica de este dominio frente a
eritrocitos bovinos en un amplio rango de condiciones de pH y concentración de Ca2+.

Para completar la caracterización funcional de la proteína PLP1 se generó una cepa de B. bovis knock
out (KO) para el gen plp1 (Δplp1) por disrupción de su secuencia codificante, generada por doble
recombinación homóloga. La línea clonal B. bovis Δplp1 fue caracterizada a nivel genético mediante
PCR y Southern blot para verificar la correcta eliminación del gen plp1. A nivel fenotípico se observaron
con regularidad en el cultivo Δplp1 formas tetraméricas formadas por dos pares de merozoítos
presentes en un mismo eritrocito. Estas formaciones son inusuales en la cepa salvaje lo que indicaría
la presencia de un fenotipo mutante en donde las formas apareadas no pueden egresar del eritrocito
para invadir uno naïve. Por otra parte, la tasa de crecimiento en cultivos in vitro de la cepa Δplp1 fue
significativamente menor respecto a la cepa salvaje, lo que indica que, si bien la expresión del gen plp1
no es esencial para la supervivencia del estadio sanguíneo, PLP1 juega un papel importante en estos
estadios ya que su ausencia causa una disminución significativa en el fitness del parásito.

En conclusión, tanto la conservación de la estructura de las proteínas PLPs como los ensayos
funcionales de PLP1 en B. bovis sugieren que estas proteínas se expresan en el estadio en bovinos y
tienen la capacidad de generar poros en membranas eritrocitarias. Los estudios realizados con la
mutante Δplp1 muestran que la proteína PLP1 no es esencial para la supervivencia y el desarrollo del
merozoíto en el eritrocito, lo que podría explicarse por la redundancia de PLP1 con otros miembros de
la familia que podrían haber compensado su ausencia. En base a estos resultados postulamos que la
proteína PLP1 está involucrada en el egreso de la célula hospedadora dado que los parásitos Δplp1 que
carecen de esta proteína formadora de poros no pueden egresar de forma eficiente de los eritrocitos
con la consecuente disminución del fitness del parásito.

Futuros ensayos que evalúen la transcripción y expresión de los miembros de la familia PLP en la cepa
Δplp1 y de replicación in vivo de esta cepa en infecciones experimentales de bovinos y garrapatas
permitirán determinar si la proteína PLP1 es necesaria para la replicación y el desarrollo de otros
estadios de B. bovis y si la compensación funcional con otras proteínas de la familia es capaz de
suplantar su función en el fenotipo KO.

Palabras clave: Babesiosis, Babesia bovis, proteínas tipo perforina, transfección, hemólisis, proteína
formadora de poro.

3
 Structural and functional characterization of the perforin-like protein family
in Babesia spp. and their role in the host-pathogen interaction

Abstract

Bovine babesiosis is a tick-borne disease caused by protozoan parasites of the Babesia genus that
invade and replicate within the host's red blood cells. This disease affects livestock production in
tropical and subtropical regions causing significant economic losses worldwide. Although there are
strategies to control the disease, such as vector control or vaccination with attenuated strains, they
have important drawbacks. Therefore, it is necessary to develop improved strategies to control the
disease. In this sense, it is essential to elucidate the molecular basis of the host-pathogen interaction
including the proteins involved in the processes of parasitic invasion, replication and egress.

The aim of this thesis was to characterize the family of perforin-like proteins (PLP) in the Babesia genus
at the structural and functional levels. The PLP proteins of organisms closely related to Babesia such
as Toxoplasma gondii and Plasmodium spp. have the ability to form pores in cell membranes and are
essential for invasion and/or egress from the host cell.

In this work, the identification and structural characterization of the PLP family in different Babesia
species was accomplished through bioinformatics analysis on available genomes. A variable number
of genes was identified in different species, ranging from 3 in B. canis to 8 in B. bigemina and B.
divergens. Comparative analysis showed that the secondary and tertiary structure of PLPs are highly
conserved, both within the genus and with other PLP proteins of the phylum. On the contrary, the
primary amino acid sequence is divergent, conserving only a few amino acids of their functional
domain. Transcriptomic data analysis from different B. bovis stages, the most virulent bovine species
of the genus, showed that the 6 plp genes are transcribed during at least one stage of the life cycle and
three of them (plp1, plp2 and plp5) have a stage-specific transcription. The plp1 gene showed the
highest level of transcription in merozoites, a stage only present in cattle. Western blot analysis
performed with the recombinant PLP1 protein demonstrated the presence of specific antibodies
against it in cattle naturally infected with B. bovis, indicating that PLP1 is immunogenic and contains
B-cell epitopes exposed to the bovine immune system during infection. Hemolysis assays with the
functional domain of recombinant PLP1 demonstrated high hemolytic capacity against bovine red
blood cells in a wide range of pH conditions and Ca2+ concentration.

To complete the functional characterization of the PLP1 protein, a B. bovis knock out (KO) strain was
generated for the plp1 gene (Δplp1) by disruption of its coding sequence by double homologous

4
recombination. The B. bovis Δplp1 clonal line was characterized at the genetic level by PCR and
Southern blot to verify the correct elimination of the plp1 gene. At the phenotypic level, tetrameric
forms formed by two pairs of merozoites present in the same erythrocyte were regularly observed in
the Δplp1 culture. These formations are unusual in the parental strain which suggests a mutant
phenotype where the paired forms cannot egress the erythrocyte to invade a naïve one. On the other
hand, the in vitro growth rate of the Δplp1 strain was significantly lower compared to the wild type
strain, which indicates that although expression of the plp1 gene is not essential for the survival of the
blood stages, PLP1 plays an important role in these stages since its absence causes a significant
decrease in the parasite's fitness.

In conclusion, the conservation of the structure of the PLP proteins and the functional characterization
of PLP1 in B. bovis suggest that these proteins are expressed in merozoites and have the ability to
generate pores in the erythrocyte membrane. Studies on the endogenous PLP1 show that this protein
is not essential for the survival and development of merozoite in the erythrocyte, which could be
explained by the redundancy of PLP1 with other family members, that could have compensated for its
absence. The PLP1 protein is probably involved in the egress of the parasite from the host cell and
since Δplp1 parasites lack this pore-forming protein they cannot egress efficiently from the
erythrocytes, leading to a decrease in the parasite's fitness.

Future assays aimed to evaluate transcription and expression of other PLPs in the Δplp1 strain, and the
in vivo replication of this strain in experimental infections of cattle and ticks will allow to determine if
PLP1 is necessary for the replication and development of other stages of B. bovis and to determine
redundancy between PLP family members.

Keywords: Babesiosis, Babesia bovis, perforin-like proteins, transfection, hemolysis, pore-forming

protein.

5
Agradecimientos

Tengo tanto que agradecer que ni siquiera sé por dónde empezar… Agradezco que durante todos estos
años de doctorado estuve rodeada de personas maravillosas que hicieron que transitar este camino
fuera una experiencia hermosa, y que me ayudaron a superar las dificultades que fueron apareciendo,
porque digamos la verdad, el camino a veces se pone difícil.

En primer lugar, agradezco a la educación pública, gratuita y de calidad, y en especial a la Universidad

de Buenos Aires que me brindó una formación de grado y de posgrado de excelencia. Me considero
una privilegiada.

Gracias al INTA tanto por la beca de Formación como por el lugar de trabajo, que me dieron la
posibilidad de hacer este doctorado. Y gracias a las fundaciones Fulbright, Bunge y Born y Williams
por haberme otorgado la beca que permitió culminar con éxito esta tesis.

A mi directora Silvina, quien confió en mi desde el primer momento, hace ya unos cuantos años!
Gracias por darme libertad para trabajar, sin dejar de acompañarme y guiarme durante todo el camino,
buscando alternativas para superar las dificultades y dándome la confianza de que todo iba a salir bien.
Esta tesis es tan mía como tuya. Y a Marisa, que fue mi directora de beca, gracias por darme la
oportunidad de hacer el doctorado con esta beca, por haber contribuido en la discusión de
experimentos y resultados, y por haber estado presente y dispuesta a ayudar en todo momento.
Espero que esta tesis sea el primero de muchos logros trabajando las tres juntas.

Un agradecimiento muy especial a los Hemos, con quienes compartimos tantas horas juntos, tantas
actividades extra-lab, y sobre todo tantas risas. Más que mis compañeros ya son mi familia. Agradezco
haber caído a este grupo fantástico, en el que siempre nos apoyamos mutuamente, trabajando codo
a codo con buena onda y tanto humor. Hay tantas anécdotas y locuras para recordar… A Lud, a Eli y a
Pepe, gracias por recibirme con los brazos abiertos en este laboratorio y hacerme sentir parte del
grupo desde el primer momento. Lud, recuerdo esas charlas a la mañana bien temprano donde, con
un mate de por medio, te contaba mis últimos resultados y vos me ayudabas a pensar como seguir.
Cómo extraño esas charlas… Y por abrirme siempre las puertas de tu casa, simplemente gracias! A Eli,
gracias por haberme enseñado y guiado, con mucha paciencia, durante mis primeros pasos dentro de
la biología molecular, cuando ni siquiera sabía bien lo que era una PCR! Gracias por estar siempre
dispuesta a ayudar, por tus consejos y tus palabras justas. A Pepe, gracias por tu ayuda en todo
momento, por tus consejos, por bancarme los días que había que quedarse trabajando hasta tarde y
sobre todo gracias por que trabajar en el lab con vos haya sido siempre una fiesta! A Sofi, que ni bien
llegaste al lab sentí que te conocía de toda la vida. Gracias por todo, por compartir conmigo no sólo
horas de trabajo sino también viajes y tantas, tantas risas! Y gracias por enseñarme las letras correctas

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de las canciones que me gusta cantar… No hubiera sido lo mismo sin vos! A Vale, por estar siempre
dispuesta a ayudar y aconsejarme, siempre con una sonrisa. Gracias también por tanta paciencia con
mis numerosas consultas veterinarias! A Maga, gracias por tu buena onda, por sumarte a este grupo
de locos, y por tus palabras de aliento y tu buena voluntad para ayudarme siempre. A Chris, que si bien
tu paso por el lab fue fugaz, el tiempo que compartimos fue muy divertido y siempre estas presente y
seguís acompañándonos a la distancia. No hubiera sido lo mismo sin todos ustedes, los quiero hasta el
infinito y más allá!

Agradezco también a Carlos Suarez y a todo su equipo de trabajo por haberme recibido en su
laboratorio y brindado todo su apoyo y generosidad. A special thanks to Paul for all the help that you
gave me during my stay in Pullman, and for your patience while teaching me the art of culturing
Babesia, and to Jacob for continuing the experiments once I returned to Argentina. Heba, for your

kindness and affection and for showing me a different culture, ‫شكرا جزيلا‬. Gracias también a todas las
personas que en Pullman me hicieron sentir como en casa, especialmente a Carlos y Jessy que me
trataron como a una hija, y a Aita que con su buena onda y cariño me incluyó en todos sus planes con
el grupo de “los latinos” y con quien me divertí mucho en esos 4 meses que compartimos.

Gracias también a mis amigos del alma Flor, Zeta y Zequi. Que sería de nosotros si no nos tuviéramos
mutuamente. Gracias por estar conmigo siempre, en las buenas y en las malas, estemos cerca o a un
océano de distancia, desde hace más de 20 años… siempre con palabras de aliento, consejos y muchas
pero muchas risas y locuras. We’re family, los adoro!

Gracias a mis amigos de Mar del Plata, en especial a Juan, Hernán y Santi, por su cariño y buena onda
durante todos estos años, siempre dispuestos a salir a pasear, tomar unos mates y reírnos un rato para
salir de la rutina.

Gracias a Juan, con quién compartí muchos de estos años… La vida ahora nos lleva por caminos
separados, pero gracias por haber apoyado y respetado mis decisiones siempre, y por haber tenido la
paciencia para escucharme practicar todos mis seminarios.

Y finalmente agradezco muy especialmente a toda mi familia, en particular a mis papás y mi hermano,
Facu. Sinceramente las palabras no alcanzan para agradecer tanto amor y apoyo que recibí y recibo de
ustedes. Gracias por alentarme a perseguir mis sueños y a dar lo mejor de mí en todo momento. Los
amo.

Como dijo un grande, GRACIAS TOTALES!

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"In fin dei conti, non temete i momenti difficili. Il meglio
scaturisce da lì."
"Después de todo, no temas a los momentos difíciles. Lo
mejor surge de ahí".

Rita Levi-Montalcini

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 TABLA DE CONTENIDOS
1 Introducción .................................................................................................................................. 13

1.1 La babesiosis bovina .............................................................................................................. 13

1.1.1 Babesiosis bovina en Argentina, importancia económica............................................. 14

1.2 Medidas de control de la babesiosis bovina ......................................................................... 15

1.2.1 Control del vector .......................................................................................................... 15

1.2.2 Tratamiento de animales infectados ............................................................................. 17

1.2.3 Vacunación .................................................................................................................... 17

1.3 Los agentes etiológicos B. bovis y B. bigemina ..................................................................... 19

1.3.1 Clasificación taxonómica y filogenia.............................................................................. 19

1.3.2 Ciclo de vida................................................................................................................... 20

1.3.3 Morfología y estructura del merozoíto ......................................................................... 23

1.3.4 Mecanismo de invasión y egreso del merozoíto y proteínas asociadas ....................... 25

1.4 Proteínas formadoras de poros............................................................................................. 33

1.4.1 El dominio MACPF ......................................................................................................... 33

1.4.2 Proteínas tipo perforina ................................................................................................ 35

2 Hipótesis y objetivos ..................................................................................................................... 40

3 Materiales y métodos.................................................................................................................... 41

3.1 Caracterización estructural de la familia de proteínas tipo perforina en Babesia spp ......... 41

3.1.1 Búsqueda del motivo MACPFapi en bases de datos ....................................................... 41

3.1.2 Identificación de genes plp en genomas de Babesia..................................................... 41

3.1.3 Análisis filogenético de las proteínas tipo perforina de Babesia spp............................ 42

3.1.4 Análisis de ortología y sintenia de la familia de proteínas tipo perforina ..................... 43

3.1.5 Predicción de la estructura tridimensional y de la función de la familia de proteínas

tipo perforina ................................................................................................................................ 43

3.2 Caracterización funcional de las proteínas tipo perforina de B. bovis .................................. 44

 3.2.1 Análisis de la transcripción de genes plp de B. bovis .................................................... 44

3.2.2 Clonado del gen BboPLP1 para su expresión en bacterias............................................ 45

3.2.3 Expresión y purificación de la proteína PLP1 recombinante ......................................... 46

3.2.4 Generación de anticuerpos en ratones contra rPLP1_MACPF ...................................... 47

3.2.5 Ensayos de hemólisis ..................................................................................................... 47

3.3 Generación de una cepa de B. bovis modificada genéticamente para el gen plp1 y su
análisis fenotípico .............................................................................................................................. 49

3.3.1 Generación de una cepa de B. bovis knock out para PLP1 (Δplp1) ............................... 49

3.3.2 Caracterización genética de la cepa B. bovis Δplp1....................................................... 54

3.3.3 Enriquecimiento del cultivo de B. bovis Δplp1 mediante separación de células activada
por fluorescencia (FACS) ............................................................................................................... 56

3.3.4 Análisis de la transcripción de los genes plp1 y plp5 en la cepa Δplp1 ......................... 57

3.3.5 Análisis fenotípico de la cepa Δplp1 mediante curvas de crecimiento ......................... 58

4 Resultados ..................................................................................................................................... 59

4.1 Identificación y caracterización estructural de la familia de proteínas tipo perforina en

Babesia spp ....................................................................................................................................... 59

4.1.1 Identificación de PLPs en los genomas disponibles de Babesia .................................... 59

4.1.2 Conservación de las secuencias de las proteínas tipo perforina ................................... 62

4.1.3 Ortología y sintenia de la familia de proteínas tipo perforina ...................................... 67

4.1.4 Predicción de la estructura terciaria de las proteínas tipo perforina de Babesia ......... 69

4.2 Caracterización funcional de las proteínas tipo perforina de B. bovis .................................. 74

4.2.1 Análisis de la transcripción de genes plp de B. bovis .................................................... 74

4.2.2 Caracterización funcional de BboPLP1 recombinante .................................................. 76

4.2.3 Análisis de la expresión de PLP1 en B. bovis ................................................................. 80

4.2.4 Ensayos de hemólisis ..................................................................................................... 82

4.3 Caracterización de una cepa de B. bovis modificada genéticamente para el gen plp1 ........ 84

4.3.1 Generación de una cepa de B. bovis knock out para el gen plp1 .................................. 84

10
 4.3.2 Caracterización genética de la cepa B. bovis ∆plp1....................................................... 86

4.3.3 Caracterización fenotípica de la cepa ∆plp1 ................................................................. 91

5 Discusión ....................................................................................................................................... 95

6 CONCLUSIONES ........................................................................................................................... 107

7 Bibliografía................................................................................................................................... 109

8 Anexo I – Figuras suplementarias................................................................................................ 120

9 Anexo II – Técnicas y protocolos de biología molecular ............................................................. 123

9.1 Cepas y medios de cultivo bacterianos ............................................................................... 123

9.2 Extracción de ADN genómico .............................................................................................. 123

9.3 Técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de tiempo final ............................. 123

9.4 Electroforesis en geles de agarosa ...................................................................................... 124

9.5 Purificación de ADN a partir de geles de agarosa ............................................................... 125

9.6 Reacciones de ligado molecular .......................................................................................... 125

9.7 Transformación de bacterias E. coli competentes químicas ............................................... 125

9.8 Transformación de bacterias E. coli por electroporación ................................................... 126

9.9 Minipreparaciones de ADN ................................................................................................. 126

9.10 Digestión de ADN usando enzimas de restricción............................................................... 127

9.11 Secuenciación de ADN ......................................................................................................... 127

9.12 Expresión de proteínas recombinantes............................................................................... 127

9.13 Electroforesis de proteínas en geles de poliacrilamida (SDS – PAGE)................................. 127

9.14 Tinción de proteínas en SDS- PAGE con colorante Coomassie blue ................................... 128

9.15 Electrotransferencia de las membranas de nitrocelulosa ................................................... 128

9.16 Detección inmunológica de las proteínas por Western blot ............................................... 128

9.17 Purificación de proteínas recombinantes ........................................................................... 129

9.18 Southern blot....................................................................................................................... 130

9.19 Extracción de ARN ............................................................................................................... 131

9.20 Síntesis de ADN copia (ADNc).............................................................................................. 132

11
 9.21 Reacciones de PCR en tiempo real (qPCR) .......................................................................... 132

10 Anexo III – Cebadores y plásmidos .......................................................................................... 134

12
1 INTRODUCCIÓN

1.1 LA BABESIOSIS BOVINA

La babesiosis es una enfermedad causada por parásitos protozoarios intraeritrocíticos pertenecientes

al género Babesia que afectan diversas especies de mamíferos en todo el mundo, causando un gran
impacto en el ganado y el hombre (Bock et al., 2004; Zintl et al., 2003). Estos parásitos son transmitidos
por garrapatas y tienen una distribución global, afectando regiones con clima tropical y subtropical
que presentan las condiciones climáticas propicias para el desarrollo del vector.

El mayor impacto económico de la babesiosis se da sobre la industria ganadera y se estima que más
de la mitad de los 1200 millones de bovinos del mundo corren riesgo de infección y enfermedad por
habitar en regiones tropicales y subtropicales del mundo donde esta enfermedad es enzoótica (Bock
et al., 2004). La babesiosis bovina fue reportada por primera vez en Rumania en 1888 donde Viktor
Babes observó la presencia de cuerpos redondeados dentro de los eritrocitos del ganado afectado
(Babes, 1888). Más tarde, se demostró que garrapatas provenientes de ganado infectado eran capaces
de transmitir la enfermedad al ganado susceptible (Smith y Kilborne, 1893), constituyendo el primer
reporte de un artrópodo vector como el portador de la enfermedad.

Existen numerosas especies del género Babesia capaces de infectar bovinos. Las especies más
relevantes son Babesia bovis, B. bigemina y B. divergens. B. bovis y B. bigemina son transmitidas por
garrapatas del género Rhipicephalus y son las especies más ampliamente distribuidas, causando un
mayor impacto en África, Asia, Australia, América Central y del Sur (Bock et al., 2004). B. divergens es
transmitida por garrapatas del género Ixodes y si bien su presencia se limita al Centro y Norte de
Europa, es una especie importante ya que es capaz de afectar humanos. La babesiosis en humanos es
poco común, pero se observa un aumento en los reportes de infecciones en pacientes
inmunocomprometidos, a menudo causando la muerte (Vannier y Krause, 2012). Existen otras
especies con distribución local que menos frecuentemente pueden infectar al ganado bovino, tales
como B. ovata (Asia Oriental), B. major (Europa), B. occultans (África) y B. jakimovi (Siberia). Estas
especies menos virulentas son transmitidas por garrapatas de los géneros Ixodes, Haemaphysalis y
Hyalomma.

Los síntomas de la presentación aguda de la babesiosis bovina incluyen fiebre, anemia hemolítica,
anorexia, letargia, hemoglobinuria, taquicardia e ictericia, pudiendo incluso provocar la muerte en el
ganado afectado. Las especies más virulentas son B. bovis y B. bigemina. Los síntomas son similares,
aunque cabe destacar que la infección por B. bigemina genera en el bovino una alta hemólisis
provocando anemia severa con hemoglobinuria. Por otro lado, B. bovis tiene la capacidad de alterar
 Introducción

drásticamente la estructura y la función de los glóbulos rojos infectados ocasionando su acumulación

en la microvasculatura de varios órganos, incluido el cerebro y los pulmones. Esto induce una
manifestación clínica diferente y a menudo mortal de la enfermedad conocida como babesiosis
cerebral, caracterizada por signos neurológicos, dificultad respiratoria y fallas en múltiples órganos
(Callow y McGavin, 1963; Gohil et al., 2013).

1.1.1 Babesiosis bovina en Argentina, importancia económica

En Argentina, la babesiosis bovina es causada sólo por B. bovis y B. bigemina, siendo la primera la
especie más virulenta. Ambas especies, junto con la bacteria Anaplasma marginale, causan un
conjunto de enfermedades conocidas comúnmente como el complejo tristeza bovina. Este complejo
es considerado uno de los problemas sanitarios de mayor importancia en la ganadería de la región del
noreste y noroeste argentino. Se distribuye abarcando una superficie aproximada de 60 millones de
hectáreas ubicadas al norte del paralelo 33° S, con excepción de la región andina, que se corresponde
con el área donde la garrapata transmisora Rhipicephalus microplus está presente.

Las enfermedades bovinas transmitidas por garrapatas están ganando mayor importancia en la
ganadería del país principalmente por dos motivos. Por un lado, a nivel global se observa una mayor
distribución espacial de las garrapatas debido al cambio climático que genera que las condiciones
propicias para su desarrollo se extiendan (Randolph, 2004). Por otro lado, en Argentina durante la
década de los noventa se produjo un corrimiento de la ganadería desde la región pampeana hacia el
norte del país, en razón de desarrollos tecnológicos y mejoras en las técnicas de labranza que
permitieron un incremento del área cultivada por sobre áreas tradicionalmente ganaderas. Además,
el mercado actual de granos y oleaginosas permite predecir a futuro un importante impacto en
detrimento de la actividad ganadera en el centro del país (Cap y González, 2004; Nasif, 2007), lo que
genera un incremento del stock ganadero en las provincias del litoral y del norte argentino donde la
garrapata y por ende la babesiosis está presente. Por todos estos factores, el mejoramiento de las
condiciones sanitarias de las regiones del noroeste y noreste argentino resulta de suma importancia.

Los últimos datos disponibles indican que en Argentina la población bovina expuesta a la babesiosis
supera los 12 millones de cabezas de ganado, lo cual representa el 22% de la población bovina total de
nuestro país. Las pérdidas económicas se han estimado en 38.9 millones de dólares por año (Späth et
al., 1994) y se deben no sólo a la mortalidad, al aumento de la tasa de aborto y la disminución en la
producción de carne y leche, sino también a los gastos en medidas de control y prevención de la
enfermedad como son los tratamientos con acaricidas y las vacunas.

14
 Introducción

1.2 MEDIDAS DE CONTROL DE LA BABESIOSIS BOVINA

A pesar de que la babesiosis bovina fue descripta por primera vez hace más de un siglo, las opciones
de control y tratamiento para esta enfermedad siguen siendo limitadas. En la actualidad el control de
la babesiosis se aborda mediante la combinación de diversos métodos entre los que se encuentran el
control del vector transmisor, el tratamiento de los animales enfermos y la vacunación de los bovinos
para generar inmunidad (Suarez y Noh, 2011).

1.2.1 Control del vector

Una de las medidas que se pueden aplicar para controlar la babesiosis es actuar sobre el vector
transmisor con el objetivo de disminuir o eliminar su presencia. Esta medida indirecta implica atacar
la garrapata mediante el uso de acaricidas que se aplican bañando regularmente a los animales de
aquellas zonas donde la garrapata está presente o aplicando los garrapaticidas en forma de pour-on.
Los productos que se utilizan son principalmente derivados de la amidina (Amitraz) o piretroides
(Cipermectrina y Flumetrina). Aunque esta medida resulta efectiva, sólo debe considerarse como una
medida temporal y presenta algunos inconvenientes. En primer lugar, el uso de compuestos acaricidas
a lo largo de los años produjo una selección de poblaciones de garrapatas que desarrollaron resistencia
a los químicos (Cutullé et al., 2013; Lovis et al., 2013; Rosario-Cruz et al., 2009). En segundo lugar, la
aplicación de acaricidas va acompañada de riesgo de brotes posteriores de la enfermedad si las
medidas de control disminuyen, ya que debido a la reducción de las tasas de inoculación, el ganado
presenta bajo grado de inmunidad contra la babesiosis (de Waal y Combrink, 2006). La erradicación de
las garrapatas es una solución permanente al problema, pero rara vez se considera práctica,
ambientalmente sostenible o económicamente justificable ya sea a nivel nacional como a nivel local
(Bock et al., 2004).

En Argentina, en 1938 se lanzó el “Plan Nacional de Control y/o Erradicación de la Garrapata del bovino
Rhipicephalus microplus”, donde se planteó la importancia de preservar las zonas naturalmente libres
de garrapatas. Este plan fue actualizado en 2017, donde se tuvieron en cuenta tanto la evolución del
efecto de los productos garrapaticidas como las evidencias de resistencia de R. microplus a diferentes
principios activos por el uso inadecuado. En esta actualización se plantea el uso racional y estratégico
de los garrapaticidas de manera tal de preservar la eficacia de los productos y demorar la aparición de
cepas resistentes. El objetivo del control estratégico no es la eliminación total de las garrapatas sino
establecer niveles aceptables de control, minimizando el número de aplicaciones anuales (Nava et al.,
2019).

15
 Introducción

El plan de control y erradicación de la garrapata delimita distintas zonas en el territorio nacional según
su situación respecto a la misma (Figura 1). La zona de control es aquella en la que la garrapata posee
condiciones ecológicas aptas para la evolución de su ciclo biológico en donde se aplican medidas de
control voluntarias tendientes a garantizar un nivel mínimo de saneamiento. Luego existe una zona de
erradicación donde la garrapata está presente y se adoptan estrategias obligatorias de limpieza y
eliminación progresiva del parásito hasta alcanzar su supresión total del ambiente. En ambos casos, se
aplica el método de baños regulares con acaricidas que se mencionó anteriormente, donde se
combinan y alternan los principios activos de los garrapaticidas y los controles sanitarios son
fiscalizados por el SENASA. Finalmente existe una tercera zona, llamada indemne, que comprende toda
región del país que ecológicamente no es apta para el desarrollo del vector por lo cual no se aplica
ninguna medida.

Figura 1: Zonificación del país con relación al plan de lucha contra la garrapata común del bovino Rhipicephalus
microplus. El paralelo 33º S marca la división entre la región endémica y la región libre de la enfermedad (SENASA,
1999).

Otra forma de control del vector es mediante la vacunación del ganado con antígenos de la garrapata.
Un ejemplo fue la vacuna basada en la proteína Bm86, una glicoproteína localizada en la superficie de
las células de la membrana intestinal de la garrapata R. microplus. Este antígeno induce una respuesta
inmune mediada por anticuerpos del hospedador que dañan la garrapata afectando su peso y su
sobrevida, lo que impacta directamente en su capacidad reproductiva reduciendo la infestación de las

16
 Introducción

generaciones sucesivas (Rodríguez et al., 1995b, 1995a; Tellam et al., 2002). Estas vacunas
demostraron un control efectivo sobre infestaciones de R. microplus y R. annulatus cuando se
aplicaron en controles integrales que incluían el uso de acaricidas (de La Fuente et al., 1999, 1998;
Fragoso et al., 1998; Redondo et al., 1999). Sin embargo, no son efectivas para controlar las garrapatas
en todos los estadios y tampoco resultaron efectivas contra algunas cepas de R. microplus de regiones
geográficas particulares, lo que impide su uso generalizado (García-García et al., 1999).

Actualmente se están realizando numerosos estudios genómicos sobre las garrapatas, que aportan
información sobre la interacción de las mismas con el hospedador y apuntan al desarrollo de nuevas
vacunas para el control del vector. Estos abordajes de vacunología reversa permitieron la identificación
de numerosos genes que son críticos para la supervivencia de la garrapata durante la interacción con
el hospedador, y de diferentes antígenos que fueron capaces de disminuir la infestación. Sin embargo,
a pesar de todos estos esfuerzos, actualmente no existen vacunas eficaces ni ampliamente aceptadas
para la prevención de infestaciones de garrapatas en el ganado (Lew-Tabor y Rodriguez Valle, 2016).

1.2.2 Tratamiento de animales infectados

La quimioterapia de la babesiosis es importante para controlar la enfermedad, ya sea para tratar casos
de campo como para controlar infecciones experimentales y el éxito del tratamiento depende del
diagnóstico precoz y la pronta administración de los medicamentos. Existe una gran cantidad de
compuestos químicos contra los parásitos del género Babesia, pero a pesar de que muchos de ellos
resultaron efectivos, los mismos han sido retirados del mercado por varias razones, entre las que se
encuentran problemas de seguridad en la fabricación, o problemas de residuos en la cadena
alimentaria. Actualmente las drogas diminazen e imidocarb son los únicos tratamientos disponibles
para el tratamiento de la babesiosis bovina. Dado que la quimioprofilaxis es generalmente de corta
duración, la administración repetida de medicamentos terapéuticos demanda mucho tiempo y es
costosa. Además, el uso indiscriminado de agentes profilácticos, incluida la administración de estas
drogas en niveles subletales para los parásitos, puede producir la selección de poblaciones de parásitos
resistentes a los medicamentos (Rodriguez y Trees, 1996; Zintl et al., 2003), un problema que requerirá
a futuro el desarrollo de nuevas drogas.

1.2.3 Vacunación

Otra forma de controlar la enfermedad es mediante la vacunación de los bovinos que están en
potencial riesgo de adquirir la enfermedad. A pesar de que el desarrollo de vacunas de nueva
generación ha sido objeto de intensas investigaciones, hasta la fecha sólo se utiliza como medida de

17
 Introducción

prevención la vacunación con cepas vivas atenuadas de ambas especies de Babesia. Las vacunas
atenuadas de Babesia spp. se obtienen por pasajes sucesivos de los parásitos en terneros
esplenectomizados y se utilizan en Argentina, Australia, Sudáfrica, Uruguay e Israel (de Castro, 1997;
Florin-Christensen et al., 2014). En nuestro país, las vacunas contra Babesia spp. y A. marginale son
producidas por el Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria y por una empresa privada (Litoral
Biológicos). Estas vacunas, que pueden administrarse en forma bivalente (B. bovis y B. bigemina),
consisten en una suspensión de eritrocitos infectados con cepas atenuadas de B. bovis y B. bigemina.
La vacuna también se comercializa en forma trivalente con la misma formulación a la que se le suman
eritrocitos infectados con Anaplasma centrale, especie que confiere inmunidad cruzada contra A.
marginale. Este formulado confiere protección contra el complejo tristeza bovina (anaplasmosis y
babesiosis) y permite brindar protección contra los 3 patógenos transmitidos por la misma garrapata
vector.

Si bien estas vacunas con cepas vivas atenuadas son altamente efectivas para inducir una respuesta
inmune que confiere protección al bovino durante toda su vida útil, también presentan numerosos
riesgos y desventajas (de Waal y Combrink, 2006; Shkap et al., 2007). En primer lugar, no se
recomienda el uso de esta vacuna en animales adultos (mayores a 10 meses de edad) ya que pueden
llegar a producirse reacciones post-vacunación graves e incluso la muerte si no se controlan
adecuadamente (Trueman y Blight, 1978). Otro inconveniente serio es el riesgo de que las vacunas
producidas in vivo transmitan otros microorganismos patógenos provenientes de los bovinos dadores
(Hugoson et al., 1968; Rogers et al., 1988). Aunque en Argentina no se han reportado casos, existe
también el riesgo de reversión de las cepas atenuadas a cepas patógenas (Timms et al., 1990) o que la
cepa vacunal no resulte protectora contra las cepas circulantes (Bock et al., 1995, 1992).

Otros inconvenientes asociados al uso de estas vacunas son el costo de producción elevado, el
mantenimiento de cultivos in vitro usando eritrocitos bovinos normales de animales libres de
enfermedades y, para el caso de las vacunas producidas in vivo, el mantenimiento de terneros
esplenectomizados y libres de enfermedades específicas. A esto se le suma la limitación logística de
mantener la cadena de frío y que la vacuna tiene una vida útil corta ya debe administrarse en un lapso
no mayor a 7 días desde la fecha de formulación.

Existe una versión ultracongelada de la vacuna trivalente que supera el inconveniente de la corta vida
útil de la vacuna refrigerada. En Argentina es producida y comercializada por la empresa Litoral
Biológicos y permite el almacenamiento del stock a largo plazo y la realización de controles de
inocuidad, esterilidad y potencia. A pesar de estas ventajas respecto a la vacuna tradicional, la misma
sigue teniendo las limitaciones de potencial reversión de la atenuación y además es necesario

18
 Introducción

mantener el producto en termos con nitrógeno líquido hasta su aplicación por lo que su transporte es
dificultoso.

“Si bien el uso de acaricidas, la quimioprofilaxis y la vacunación con cepas atenuadas han sido
capaces de proporcionar medidas de control de la babesiosis bovina, estas medidas continúan
teniendo inconvenientes y limitaciones importantes. El control sostenible de esta enfermedad
requiere del desarrollo de medidas preventivas alternativas, que incluyan idealmente la prevención
de enfermedades bajo condiciones de campo, que confiera una protección duradera contra cepas
homólogas y heterólogas, que su fabricación a gran escala sea factible, y que tanto su
almacenamiento y transporte como su administración sea sencilla (Gohil et al., 2013; Mosqueda et
al., 2012; Suarez y Noh, 2011)”

1.3 LOS AGENTES ETIOLÓGICOS B. BOVIS Y B. BIGEMINA

1.3.1 Clasificación taxonómica y filogenia

El género Babesia pertenece al phylum Apicomplexa, clase Aconoidasida, orden Piroplasmida, familia
Babesiidae. Dentro de este phylum también se encuentran numerosos patógenos de importancia en
salud animal y humana tales como las especies del género Plasmodium responsables de la malaria en
un amplio rango de mamíferos, Theileria spp. que causa enfermedad en rumiantes y equinos, y los
coccidios Toxoplasma gondii que causa toxoplasmosis aguda en humanos inmunocomprometidos y en
fetos con infección congénita, Neospora caninum responsable de abortos espontáneos en bovinos,
Cryptosporidium spp. que afecta a humanos inmunocomprometidos y a otros mamíferos, y Eimeria
spp. que afecta aves y mamíferos domésticos.

Los análisis filogenéticos (Figura 2) muestran una relación monofilética entre los géneros Babesia,
Theileria y los archeopiroplasmidos, que a su vez mantienen una estrecha relación con las especies del
género Plasmodium (Hikosaka et al., 2010).

Dentro del phylum Apicomplexa, tanto T. gondii como algunas especies del género Plasmodium
surgieron como organismos modelo ya que además de su importancia en la salud pública, presentan
una serie de ventajas que facilitan los experimentos en el laboratorio. Entre estas ventajas se destacan
el desarrollo de metodologías para realizar estudios de genética clásica y reversa, y la relativamente
sencilla manipulación en cultivo permitiendo su propagación en líneas celulares de mamífero (Kim y
Weiss, 2004). En relación con los estudios en Babesia spp., la ventaja de las especies de Plasmodium

19
 Introducción

usadas como modelo es que, a pesar de que su manipulación es algo más trabajosa que T. gondii,
también tienen un vector transmisor con diferentes estadios de desarrollo en el mismo, constituyendo
un organismo modelo más cercano al género Babesia.

Figura 2: Árbol filogenético construido con el método de Máxima Similitud basado en los genes mitocondriales
cox1 y cob concatenados. El dinoflagelado Crypthecodinium cohnii fue usado como grupo externo. En los nodos
se muestran los valores de soporte de rama (Hikosaka et al., 2010).

1.3.2 Ciclo de vida

Los parásitos del phylum Apicomplexa han desarrollado ciclos de vida altamente complejos,
caracterizados por tres etapas de multiplicación llamadas merogonia, gametogonia y esporogonia
(Chauvin et al., 2009). Al igual que Plasmodium, las especies del género Babesia alternan una fase de
reproducción sexual en el vector artrópodo (gametogonia y esporogonia) con otra fase de proliferación
asexual en el hospedador mamífero (merogonia) (Figura 3). Durante estas fases el parásito presenta
diferentes etapas de diferenciación, con estadios que invaden y se multiplican en diversos tipos
celulares, teniendo a los eritrocitos como única célula blanco en el hospedador mamífero.

Fase de reproducción asexual en el mamífero: Cuando una larva de garrapata infectada con B. bovis
o ninfa en el caso de B. bigemina se alimenta de un bovino, inocula con su saliva los esporozoítos dando
inicio a la fase de reproducción asexual (Figura 3A). Cuando alcanzan la circulación, los esporozoítos
invaden los eritrocitos donde se dividen asexualmente por fisión binaria para convertirse en

20
 Introducción

merozoítos que, una vez maduros, egresan del eritrocito. Tras la liberación, los merozoítos invaden
nuevos eritrocitos donde se transforman en trofozoítos (Figura 3B). Éstos se dividen por fisión binaria
(Figura 3C, merogonia) para producir un nuevo par de merozoítos que inicialmente quedan unidos por
un extremo (Figura 3D), luego al madurar se separan y salen del eritrocito perpetuando el ciclo asexual
(Figura 3E-F). El conocimiento sobre los mecanismos de invasión y egreso tanto de los esporozoítos
como de los merozoítos es incompleto y se discutirá en detalle más adelante.

Este proceso de multiplicación que alterna ciclos de invasión y lisis de eritrocitos, se da de manera
asincrónica lo que permite observar diferentes estadios del parásito en el torrente sanguíneo
simultáneamente (Figura 4) (Chauvin et al., 2009). La única forma de parásito que se encuentra
temporalmente fuera de la célula es el merozoíto invasivo que se ha liberado para luego invadir un
nuevo eritrocito. Recientemente se han reportado mecanismos mediante los cuales los merozoítos de
Babesia generan cambios eléctricos en la membrana de un eritrocito infectado impidiendo que otro
merozoíto invada la misma célula (Scudiero et al., 2018) y también se sabe que, a excepción de B.
divergens y B. microti, en las demás especies un merozoíto de Babesia atraviesa sólo una ronda de
replicación antes de egresar en busca de una nueva célula fresca para invadir, por lo que en el torrente
sanguíneo suelen observarse formas simples o pares en los eritrocitos.

Fase de reproducción sexual en el vector: Cuando una garrapata se alimenta de un bovino infectado,
los eritrocitos infectados son ingeridos durante el proceso de alimentación y la mayoría de los parásitos
degeneran y se destruyen. Sin embargo, algunos estadios específicos del parásito (pre-gametocitos)
sobreviven e inician el ciclo sexual en el hospedador invertebrado (Chauvin et al., 2009). Los estadios
sexuales se liberan de los eritrocitos en el lumen del intestino de la garrapata (Figura 3G) y se
diferencian en gametocitos, que a su vez van a dar lugar a gametas femeninas y masculinas que se
fusionarán formando un cigoto (Figura 3H). Este cigoto tiene una organela particular que facilita la
invasión de las células del intestino de la garrapata mediante invaginación de la membrana de la célula
(Figura 3I).

Una vez que el cigoto se ha internalizado, se forman cuerpos de fisión que se desarrollan
posteriormente en kinetos móviles (Figura 3J). Estos kinetos destruyen las células intestinales, escapan
a la hemolinfa e invaden diferentes tejidos y tipos celulares, incluyendo los ovarios, donde infectan a
los embriones (Figura 3K-M). Esta capacidad de los parásitos de transmitirse de un hospedador a su
progenie se conoce como transmisión transovárica (Bock et al., 2004) y tiene suma importancia a nivel
epidemiológico.

Una vez que las larvas infectadas emergen de los huevos, permanecen en el ambiente adheridas a la
pastura en espera de un bovino para su alimentación posterior. Los kinetos de Babesia migran a las

21
 Introducción

glándulas salivales de la larva de garrapata, donde forman un esporoblasto (Figura 3N). De cada
esporoblasto emergen miles de esporozoítos que se liberarán al sistema circulatorio del bovino a
través de la saliva cuando la larva o ninfa se alimente (Figura 3O-P).

Figura 3: Ciclo de vida de Babesia spp. (Mosqueda et al., 2012).

22
 Introducción

Figura 4: A. Babesia bigemina en eritrocitos bovinos. Frotis teñido con Giemsa. B. Babesia bovis en eritrocitos
bovinos. Frotis teñido con Giemsa. C. Representación de los distintos estadios de Babesia spp. en el hospedador
bovino. Se observan merozoítos libres (1), trofozoítos (2) y merozoítos en formas pares (3). (Imagen cortesía del
Departamento de Agricultura del Estado de Queensland, Australia).

1.3.3 Morfología y estructura del merozoíto

Los merozoítos son el estadio responsable de la enfermedad en bovinos ya que su rápida reproducción
genera la destrucción masiva de los eritrocitos bovinos (Mehlhorn y Schein, 1985) y junto con su
capacidad de alterar la membrana del eritrocito (Al-Khedery y Allred, 2006; Dzikowski y Deitsch, 2006)
desencadenan los signos clínicos tales como anemia, fiebre y signos neurológicos en el caso de B. bovis.

El cuerpo del merozoíto (Figura 5) tiene una forma ovalada de 1 a 5 µm y posee una membrana
plasmática simple. Debajo de la membrana plasmática se encuentra una red membranosa de vesículas
aplanadas llamada complejo de membrana interna (IMC: inner membrane complex), sostenida por
microtúbulos subpeliculares que dan estabilidad y forma al merozoíto.

Al igual que todos los miembros del phylum Apicomplexa, las especies del género Babesia se
caracterizan por presentar un complejo apical en el extremo anterior de la célula. Este complejo apical
está formado por estructuras citoesqueléticas y organelas secretorias que son esenciales para la
motilidad, la invasión celular y el egreso. Las organelas secretorias son las roptrias, los micronemas y
los cuerpos esféricos (Jalovecka et al., 2019).

Las roptrias de las especies de Babesia varían en número, tamaño y forma. Tienen forma de pera o
basto, con un extremo unido a la membrana (Figura 5) que permite la exocitosis de su contenido hacia
la célula hospedadora al unirse el extremo apical del parásito con la membrana del hospedador
(Blackman y Carruthers, 2013; Chauvin et al., 2009). Los micronemas son organelas más pequeñas que
pueden estar agrupadas o dispersas, en el área entre la zona apical del merozoíto y el núcleo. Su
contenido consta principalmente de ligandos de reconocimiento de células hospedadoras, pero

23
 Introducción

también se encontraron proteínas formadoras de poros, involucradas en el egreso (Gubbels y

Duraisinghb, 2012). Los cuerpos esféricos son organelas análogas a los gránulos densos reportados en
otros apicomplejos, y se encuentran debajo de las roptrias y los micronemas (Terrón et al., 2016). A
diferencia que los demás organismos del phylum, los organismos del género Babesia no presentan un
conoide en el extremo apical del parásito.

El citoplasma del merozoíto contiene numerosos ribosomas y una única mitocondria grande que recibe
el nombre de mitocondrión. El núcleo es grande y está localizado generalmente en el punto medio del
merozoíto, rodeado por dos membranas y con un nucleoplasma homogéneo y de baja densidad.

Una de las organelas características de los integrantes del phylum Apicomplexa es el apicoplasto, que
tiene una presencia ancestral dentro phylum. Esta organela posee un genoma circular con genes
propios de los plastos, a excepción de los genes fotosintéticos. Está rodeada por cuatro membranas,
lo que evidencia que fue adquirida mediante un proceso de endosimbiosis secundaria, y se pudo
comprobar que el apicoplasto deriva de un alga roja que se adquirió antes de que los dinoflagelados y
los apicomplejos divergieran (Janouškovec et al., 2010). Si bien se comprobó que esta organela es
esencial para la supervivencia del parásito, su rol exacto no se conoce completamente, pero alberga
caminos metabólicos importantes como la síntesis de ácidos grasos y precursores de isoprenoides y
coopera con la mitocondria en la síntesis del grupo hemo (McFadden y Yeh, 2017; Waller et al., 2000).

24
 Introducción

Figura 5: A. Esquema generalizado de un organismo del phylum Apicomplexa. B y C. Microscopía de transmisión

electrónica de merozoítos extracelulares de Babesia sp. (Holman et al., 2005); MP, membrana plasmática; IMC,
complejo de membrana interna; AC, complejo apical; Rh, roptrias; m, mitocondrión; N, núcleo; ER, retículo
endoplasmático. Escala: 0.5 µm.

1.3.4 Mecanismo de invasión y egreso del merozoíto y proteínas asociadas

Un punto de partida para conocer mejor la interacción patógeno-hospedador es el estudio de los

mecanismos de invasión de la célula hospedadora y de las proteínas involucradas en este proceso.

El proceso de replicación asexual consta de tres etapas: la invasión, la replicación y el egreso. La

continuidad de estos procesos durante la infección en el hospedador bovino da lugar a la destrucción
continua de eritrocitos. Las 3 etapas mencionadas implican múltiples pasos que están estrictamente
regulados y que aún no son íntegramente comprendidos para ninguna de las especies del phylum. Si
bien cada especie puede presentar sus particularidades, hay evidencias de conservación tanto de las
organelas como de las proteínas que intervienen en las diferentes etapas del ciclo de replicación
asexual de los merozoítos, por lo que se cree que es un proceso conservado en todo el phylum.

25
 Introducción

Asimismo, a pesar de que el conocimiento sobre estos mecanismos es limitado, se sabe que para este
proceso son indispensables tanto la exocitosis del contenido de las roptrias y los micronemas como
una forma particular de motilidad conocida como deslizamiento o “gliding motility”.

Ensayos de invasión in vitro de B. bovis sugieren que la invasión de los eritrocitos es dependiente de
Ca2+ (Mossaad et al., 2015) y requiere de la presencia de un motor basado en actina-miosina (Asada et
al., 2012), siguiendo así el patrón de invasión de otros apicomplejos relacionados como Plasmodium y
Toxoplasma.

Motilidad por deslizamiento o “gliding motility”

Mientras que la mayoría de los patógenos dependen de la modulación de factores de la célula

hospedadora para desencadenar su captación por endocitosis o fagocitosis, los parásitos apicomplejos
desarrollaron una maquinaria altamente compleja para penetrar activamente en su célula
hospedadora en pocos segundos. Esta motilidad por deslizamiento o “gliding” es dependiente de
sustrato y no requiere cambios de forma como el movimiento de pseudópodos en amebas, ni el uso
de cilios o flagelos, como la mayoría de los organismos unicelulares.

Para realizar su deslizamiento, el parásito emplea la translocación de adhesinas superficiales acopladas

a un motor de actina-miosina anclado en el IMC, debajo de la membrana plasmática (Figura 6). Así, el
parásito establece contactos transitorios con el sustrato a través de un complejo de adhesión, une sus
adhesinas al aparato motor dentro de la célula, y también ancla el complejo motor internamente de
modo que cuando este motor se activa, se pueda generar una fuerza locomotora que propulsa el
parásito sobre el sustrato. Esta forma de motilidad por deslizamiento requiere de la secreción de
factores de invasión presentes en las organelas especializadas del complejo apical, principalmente en
los micronemas (Carruthers y Boothroyd, 2007; Meissner et al., 2013). La motilidad por deslizamiento
ha sido reportada en numerosos apicomplejos incluyendo a B. bovis (Asada et al., 2012) y permite al
parásito propulsarse activamente a través de barreras biológicas no permisivas (migración), penetrar
rápidamente en diversos tipos de células (invasión) y salir de las células infectadas (egreso) (Blackman
y Carruthers, 2013; Blader et al., 2015).

26
 Introducción

Figura 6: Esquema generalizado del movimiento por deslizamiento en Apicomplexa (Frénal et al., 2017). La
exocitosis de los micronemas (naranja) en el extremo apical del parásito produce la inserción de adhesinas en la
membrana plasmática del parásito (MPp). Estas adhesinas interactúan con receptores presentes en la membrana
plasmática del hospedador (MPh) y el movimiento resulta de la traslocación hacia atrás del complejo adhesina-
receptor impulsado por el motor actina-miosina que se encuentra anclado al complejo de membrana interno
(IMC).

Invasión del eritrocito

La invasión de eritrocitos por merozoítos de Babesia implica una etapa inicial de reconocimiento entre
parásitos y eritrocitos, seguido de la unión y reorientación de los merozoítos (Yokoyama et al., 2006).

La invasión comienza con el proceso de reconocimiento en el que se establecen interacciones débiles

entre la superficie de la célula hospedadora y proteínas MSP (merozoite surface protein) que se
expresan constitutivamente en la superficie de los merozoítos. En el género Babesia se las denomina
MSA (merozoite surface antigen) y poseen una secuencia hidrofóbica amino-terminal, una región
central hidrofílica y una región conservada en el extremo carboxi-terminal que contiene una señal de
anclaje de glicosilfosfatidilinositol (GPI) (Florin-Christensen et al., 2002). B. bovis tiene al menos cinco
proteínas de la familia entre las que se encuentra una copia de MSA-1 y cuatro copias dispuestas en
tándem de MSA-2 (dos genes msa-2a, un msa-2b y un msa-2c). Si bien estas proteínas fueron
originalmente definidas como propias de los merozoítos, también fueron encontradas en la superficie
de esporozoítos derivados de garrapatas. Numerosos estudios realizados sobre estas proteínas
muestran que son inmunodominantes y que anticuerpos contra MSA-1, MSA-2a y MSA-2b tienen la
capacidad de bloquear la entrada tanto de merozoítos como de esporozoítos a los eritrocitos (Hines

27
 Introducción

et al., 1991; Mosqueda et al., 2002a, 2002b). Sin embargo, cuando estas proteínas fueron evaluadas
como candidatos vacunales en repetidas ocasiones, no fueron capaces de generar los anticuerpos
neutralizantes requeridos para conferir protección (Jaramillo Ortiz et al., 2019, 2016; Palmer y
McElwain, 1995).

El merozoíto luego se reorienta permitiendo que el extremo apical entre en estrecho contacto con la
superficie de la célula hospedadora. Estudios en Plasmodium y Toxoplasma demostraron que para que
la invasión ocurra, es indispensable la liberación secuencial y ordenada de una serie de proteínas que
están almacenadas en los micronemas, las roptrias y los gránulos densos (cuerpos esféricos en el
género Babesia). Estas proteínas se secretan a la membrana del merozoíto o al ambiente extracelular
y su función exacta permanece desconocida. Tras su liberación se produce la invaginación de la
membrana de la célula blanco y desde el extremo apical del parásito se forma una unión estrecha (tight
o moving junction) que permite la internalización progresiva a partir del sitio de contacto del complejo
apical (Carruthers y Boothroyd, 2007; Frénal et al., 2017; Sevilla et al., 2018).

Entre las proteínas secretadas por las organelas del complejo apical se destacan las familias RAP, TRAP
y AMA. Ensayos in vitro demostraron que RAP-1 (rhoptry-associated protein-1) es esencial para la
invasión de los merozoítos de Babesia (Yokoyama et al., 2002) y, al igual que las proteínas MSP, son
expresadas también por los esporozoítos (Mosqueda et al., 2002b). Además, se identificaron en B.
bovis dos proteínas homólogas a AMA-1 (apical membrane antigen 1) y TRAP (thrombospondin-related
anonymous protein) de Plasmodium. AMA-1 es una proteína secretada por los micronemas hacia la
superficie de merozoítos libres, mientras que TRAP funciona como ligando para interactuar con las
células del hospedador. Se demostró que anticuerpos específicos contra AMA-1 y TRAP inhiben la
invasión de eritrocitos por merozoítos de B. bovis (Gaffar et al., 2004a, 2004b), resaltando su
importancia como candidatos vacunales.

La entrada del merozoíto hacia la célula se produce en la dirección anteroposterior y detrás del parásito
se va formando y cerrando la vacuola parasitófora. Hasta hace poco tiempo se creía que, a diferencia
de Plasmodium y Toxoplasma, los parásitos del género Babesia salían rápidamente de la vacuola
parasitófora para residir en el citoplasma de la célula hospedadora (Rudinska y col., 1976). Sin
embargo, también se postuló la posibilidad de que durante su maduración intracelular, B. bovis genere
una cubierta derivada de la vacuola parasitófora (Okamura et al., 2007), aunque esta hipótesis aún
requiere ser validada.

En la figura 7 se resumen las diferentes fases del mecanismo de invasión, mientras que en la figura 8
se muestran las etapas de la invasión de un merozoíto de B. divergens visualizados mediante
microscopía electrónica de transmisión (del Carmen Terrón et al., 2016).

28
 Introducción

Figura 7: Esquema de las diferentes fases de la invasión de los merozoítos a un eritrocito, destacando las
organelas y proteínas que intervienen en casa fase. Figura modificada a partir de Frénal et al., 2017.

Figura 8: Etapas de la invasión de un merozoíto de B. divergens visualizados mediante microscopía electrónica

de transmisión (Terrón et al., 2016). A y B muestran la adhesión, formación de la unión estrecha (TJ, flechas
blancas) y la invaginación inicial de la membrana del eritrocito. En el extremo apical del merozoíto se observan
organelas consistentes con los gránulos densos (DG) y los micronemas (Mi). C muestra un merozoíto luego de
ingresar. Los micronemas aún están presentes en etapas tardías de la invasión. Las flechas negras muestran una
estructura membranosa sin identificar, en el punto de ingreso del merozoíto. En D se observa el parásito dentro
del eritrocito, rodeado por la vacuola parasitófora (PV). IMC, complejo de membrana interna; DG, gránulos
densos; Mi, micronemas; N, núcleo; RBC, eritrocito; TJ, unión estrecha; PV, vacuola parasitófora. Escala 500 nm.

29
 Introducción

Establecimiento y supervivencia del merozoíto dentro del eritrocito

Una vez que el parásito está dentro del eritrocito debe mantener la integridad mecánica de la célula,
lograr captar nutrientes del ambiente extracelular, evitar ser detectado por el sistema inmune e
impedir que el eritrocito parasitado sea destruido por el bazo. Los parásitos intraeritrocíticos, como
Babesia, Theileria y Plasmodium, han evolucionado para sobrevivir en eritrocitos maduros, que en
mamíferos carecen de núcleo y tienen una capacidad biosintética limitada. Dado que estos eritrocitos
maduros no poseen síntesis de novo de proteínas ni lípidos y tampoco tienen rutas de tráfico de
proteínas, todo esto debe lograrse utilizando la maquinaria propia del parásito.

Existen reportes que muestran que la alteración de la estructura y función normal de los eritrocitos y
en particular sus propiedades mecánicas y adhesivas son críticas para la supervivencia del parásito
(Gohil et al., 2010; O’Connor et al., 1999). Los eritrocitos infectados con B. bovis muestran una textura
y rugosidad de superficie distinta en comparación con los eritrocitos no infectados (Scudiero et al.,
2018), pierden la capacidad de deformarse y aumentan su adherencia a ciertos tipos celulares entre
los que se encuentran las células endoteliales. Estas modificaciones provocan que los eritrocitos
infectados queden secuestrados en capilares (Figura 9A) y de esta manera evitan que sean atrapados
y destruidos por las células del sistema reticuloendotelial del bazo y la consecuente respuesta
inmunológica que se generaría. Se describieron algunas proteínas involucradas en este fenómeno de
citoadherencia, aunque los mecanismos aún son desconocidos. Hay evidencias de microscopía
electrónica realizada sobre eritrocitos momentos después de la infección que muestran estructuras
similares a vesículas (Figura 9B) que podrían haberse originado de las organelas del complejo apical
del parásito, indicando que algunas proteínas pueden "inyectarse" directamente en el eritrocito
durante la invasión (Rudzinska et al., 1976).

Figura 9: A. Corte histológico del cerebro de un bovino infectado con B. bovis, coloreado con Giemsa (1000X). Se
observa un corte longitudinal de un capilar cerebral conteniendo eritrocitos bovinos parasitados (Nevils et al.,
2000). Escala 10 µm. B. Microscopía electrónica de transmisión de eritrocitos infectados con B. bovis. Las flechas
muestran estructuras similares a vesículas en el citoplasma del eritrocito. Escala 500 nm. Cortesía de Eric
Hanssen, LaTrobe University, Melbourne, Australia.

30
 Introducción

Entre las proteínas involucradas en las alteraciones adhesivas de los eritrocitos infectados con B. bovis
están las proteínas de la familia VESA (variant erythrocyte surface antigen). Estas proteínas pertenecen
a una familia multigénica con alrededor de 150 copias distribuidas por igual entre los cuatro
cromosomas del complemento genético del parásito, variando en secuencia, longitud y arquitectura
genética. B. bovis parece variar estos antígenos de superficie de manera similar a los genes vsg del
género Trypanosoma. La transposición duplicativa de segmentos génicos de genes ves inactivos a un
locus transcripcionalmente activo permite que el parásito genere un repertorio potencialmente
ilimitado de antígenos de superficie, lo que permite que los eritrocitos parasitados se unan a una
variedad de diferentes receptores del hospedador, facilitando el secuestro y la evasión del sistema
inmune (Al-Khedery y Allred, 2006; Dzikowski y Deitsch, 2006).

Otro grupo importante de proteínas que intervienen en la supervivencia del parásito en el eritrocito
son las proteasas. Estas proteínas están implicadas en el metabolismo, desarrollo e infectividad de los
protozoos, lo que las hace un blanco atractivo para drogas antiparasitarias. Dentro de ellas se destacan
las cisteín-proteasas que en apicomplejos tienen funciones catabólicas, de inmunoevasión y de
activación enzimática (Sajid y McKerrow, 2002). En los piroplasmidos Babesia y Theileria, se desconoce
el rol específico de estas cisteín-proteasas, pero su importancia fue puesta en evidencia en estudios
de inhibición donde se demostró que inhibidores de dichas proteínas alteran el crecimiento de los
parásitos en cultivo (Martins et al., 2011; Mesplet et al., 2010; Okubo et al., 2007).

Por otra parte, las SBPs (Spherical Body Proteins) son otro grupo de proteínas relevantes. Estudios de
inmunofluorescencia han demostrado que estas proteínas son descargadas desde los cuerpos
esféricos después de la invasión e interactúan con la cara citoplasmática del eritrocito parasitado
(Dowling et al., 1996; Ruef et al., 2000). Entre sus posibles funciones se encuentran la de cambiar la
permeabilidad de la membrana del eritrocito para permitir el ingreso de nutrientes requeridos por el
parásito, o la de favorecer la citoadherencia del eritrocito infectado a las células endoteliales.

Egreso del eritrocito

El proceso de egreso luego de la proliferación asexual de los parásitos es esencial para la supervivencia
ya que los merozoítos necesitan salir del eritrocito agotado nutricionalmente e invadir uno fresco para
seguir multiplicándose. Un estudio reciente realizado en B. divergens muestra mediante video-
microscopía como los merozoítos, antes de egresar, se unen desde adentro a la membrana del
eritrocito provocando una depresión en la misma (Sevilla et al., 2018). En estudios similares realizados
en B. bovis no se observó este fenómeno (Asada et al., 2012), por lo tanto el mecanismo que utilizan
los merozoítos de Babesia para salir de los eritrocitos es aún incierto.

31
 Introducción

Sin embargo, se sabe que en Plasmodium y Toxoplasma el egreso no es la mera ruptura de las
membranas sino que es un proceso activo y la motilidad contribuye a la diseminación de la infección
(Blackman y Carruthers, 2013). La salida del parásito se sincroniza con la finalización de su ciclo de
replicación, cuando la siguiente generación de parásitos invasores se ha desarrollado completamente.
El egreso requiere de la ruptura de la membrana de la vacuola parasitófora y la membrana plasmática
de la célula hospedadora, así como del citoesqueleto subyacente. El proceso de egreso de los parásitos
presenta algunas diferencias entre los géneros estudiados y las moléculas efectoras del parásito que
son directamente responsables de la ruptura de estas barreras permanecen definidas sólo
parcialmente.

Hay diversos elementos esenciales para que se desencadene el egreso de los parásitos y se observa
que la exposición a bajos niveles de potasio y cambios en el pH de la vacuola parasitófora son señales
que inducen el egreso. En respuesta a estas señales de salida, se produce la liberación de Ca2+ del
retículo endoplasmático, la mitocondria y los acidocalcisomas, activando en el parásito diferentes vías
de señalización mediadas por calcio que desencadenan en los merozoítos la liberación de moléculas
almacenadas en los micronemas (Alaganan et al., 2017; Carruthers et al., 1999; Sharma y Chitnis,
2013). Para este proceso en particular, la liberación del contenido de las roptrias no es necesaria (Beck
et al., 2013; Blackman y Carruthers, 2013).

Dentro de las proteínas esenciales para el egreso se describió que la proteína del hospedador calpaína-
1 es necesaria para la salida eficiente de T. gondii y P. falciparum, ya que participa de manera activa
en la ruptura del citoesqueleto de la célula hospedadora (Chandramohanadas et al., 2009).

En los últimos años se ha identificado en T. gondii y Plasmodium spp. una clase muy interesante de
moléculas que se almacenan en los micronemas, conocidas como proteínas tipo perforina (PLP:
Perforin-Like Proteins). Las PLPs pertenecen al grupo de las proteínas formadoras de poros ya que
contienen un dominio de ataque a membrana conocido como dominio MACPF. Estudios de genética
reversa tanto en Toxoplasma como en Plasmodium demostraron que estas PLPs cumplen diversas
funciones, y como se discutirá en la próxima sección, muchas de las PLPs caracterizadas cumplen un
rol fundamental en el parásito ya que mutantes que carecen de algunas de estas proteínas quedan
atrapados dentro de la célula hospedadora o son incapaces de migrar a través de diferentes epitelios
para alcanzar la célula blanco.

32
 Introducción

1.4 PROTEÍNAS FORMADORAS DE POROS

Las proteínas formadoras de poros son un componente clave en la interacción patógeno-hospedador

y son utilizadas por ambos, ya sea para el ataque como para la defensa del organismo involucrado.
Estas proteínas se caracterizan por tener un dominio conservado de ataque a membrana (MACPF –
Membrane Attack Complex/Perforin) y están ampliamente distribuidas en la naturaleza pudiendo
encontrarse a lo largo de todo el árbol de la vida, desde virus y bacterias hasta mamíferos (Gilbert et
al., 2013).

1.4.1 El dominio MACPF

El dominio MACPF fue definido inicialmente por la similitud de secuencia entre las proteínas del
complejo de ataque de membrana (MAC) del sistema del complemento y la perforina (PF), ambos
miembros del sistema inmune de mamíferos (Anderluh y Gilbert, 2014). Estas proteínas tienen un
papel crucial en la defensa inmune contra patógenos virales y bacterianos y en la eliminación de las
células tumorales. Por ejemplo, la perforina es la única molécula del sistema inmune humano que
forma un poro permitiendo la entrada de las granzimas a las células blanco dando inicio a la apoptosis.

El dominio MACPF luego fue identificado en proteínas de numerosos y diversos organismos, siempre
involucrado en la formación de poros en membranas. En la base de datos de PFAM (Finn et al., 2016)
la familia de proteínas MACPF (PF01823) contiene a la fecha un total de 3445 secuencias reportadas
conteniendo este dominio (PFAM versión 32.0, Septiembre 2018). La mayoría de estas secuencias
están presentes en metazoos, pero también se pueden encontrar en procariotas e incluso en
herpesvirus (Figura 10A) (Gilbert et al., 2013).

Las proteínas MACPF caracterizadas hasta el momento incluyen importantes mediadores en la defensa
del sistema inmune, venenos, factores de virulencia de patógenos eucariotas y proteínas que
funcionan en el desarrollo y la neurobiología (Dunstone y Tweten, 2012). Dependiendo del organismo
que las expresa, permiten la destrucción de las células blanco por disrupción de la membrana externa
(Rosado et al., 2008), la liberación de otras proteínas efectoras a través del poro (Pipkin y Lieberman,
2007) o la facilitación del recorrido de un patógeno a través de membranas (Schnupf y Portnoy, 2007).
Generalmente las proteínas formadoras de poro presentan sólo un dominio MACPF, aunque hay
algunas excepciones (Anderluh y Gilbert, 2014; Kafsack y Carruthers, 2010; Petrigh, 2010). Este
dominio está acompañado de otros que a menudo participan en las interacciones moleculares
necesarias para ejercer la función biológica de la proteína (Figura 10B).

33
 Introducción

Figura 10: A. Distribución de proteínas con dominio MACPF (PF01823) de acuerdo a la base de datos PFAM. Se
enumeran la cantidad de secuencias encontradas en cada grupo (sec), en cuantas especies se encontraron estas
proteínas (spp) y, cuando se conoce, las funciones asociadas a las mismas. B. Arquitectura de las proteínas con
dominio MACPF y dominios asociados (Gilbert et al., 2013).

Estudios realizados sobre las proteínas con dominio MACPF en diversos organismos demuestran que
esta clase de proteínas están relacionadas estructuralmente, aunque poseen poca similitud en la
secuencia primaria de aminoácidos. Dado que su estructura tridimensional está conservada, se puede
hipotetizar que también su función se conserva evolutivamente.

La estructura tridimensional del dominio comprende una hoja plegada β formada por cuatro cadenas
antiparalelas, ubicada sobre dos grupos de α-hélices (CH1 y CH2) que exhiben un patrón de alternancia
entre aminoácidos hidrofóbicos e hidrofílicos (Figura 11A). Estos grupos de α-hélices tienen la
capacidad de sufrir un re-arreglo conformacional transformándose en horquillas β anfipáticas que se
insertan en la membrana blanco durante la formación del poro (Figura 11B).

La conservación de la estructura tridimensional sugiere que existe un mecanismo común en la

formación del poro donde las proteínas se secretan como monómeros que se unen a receptores en la
membrana de la célula blanco, oligomerizan y sufren rearreglos estructurales para atravesar la
membrana formando poros tipo barril β (Figura 11C), creando lesiones importantes en la misma
(Dunstone y Tweten, 2012; Law et al., 2010). Como se mencionó anteriormente, a diferencia de la
estructura tridimensional, la conservación a nivel de secuencias es limitada, aproximadamente 20% de
similitud en toda la familia, pero todas presentan el motivo distintivo de 13 aminoácidos [YW] G [TS]
H [FY] X{6} G G (donde X representa cualquier aminoácido, los números entre llaves cuántas veces se
repite ese aminoácido, y los corchetes indican la posibilidad de ocurrencia de uno u otro aminoácido).

34
 Introducción

Figura 11: A. Estructura tridimensional del dominio MACPF. Se observan cuatro cadenas antiparalelas (β1-4) que
forman una hoja plegada β, y dos grupos de α-hélices (CH1 y CH2) (Anderluh y Gilbert, 2014). B. Esquema que
muestra el mecanismo molecular de la inserción en la membrana. Los dos grupos de α -hélices (cilindros rojos)
se desenrollan e insertan en la membrana como láminas β. C. Modelo del poro generado por una proteína con
dominio MACPF en una bicapa lipídica (utilizando la estructura Plu-MACPF, PDB ID: 2QP2) (Rosado et al., 2008).

1.4.2 Proteínas tipo perforina

Las proteínas formadoras de poros en el phylum Apicomplexa reciben el nombre de proteínas tipo
perforina (PLP por sus siglas en inglés) y constituyen un grupo importante dentro de las proteínas con
dominio MACPF. En todos los genomas de apicomplejos secuenciados hasta el momento se
encontraron genes que codifican para PLPs, con excepción de Cryptosporidium y Gregarina, especies
evolutivamente más alejadas de Babesia que los otros miembros del phylum.

Las PLPs estudiadas se expresan en diferentes etapas del ciclo de vida de los parásitos y todas cumplen
un papel fundamental en el mantenimiento de la infección y en consecuencia en la patogénesis. Estas
PLPs se encuentran dentro del conjunto de proteínas involucradas en la íntima relación patógeno-
hospedador ya que intervienen de forma directa o indirecta en la invasión y/o egreso del parásito a las
células hospedadoras (Kafsack y Carruthers, 2010), lo que hace que su estudio y caracterización sea de
especial interés como posible blanco para estrategias de control del patógeno.

La identificación de las PLPs en los genomas de los organismos se basa exclusivamente en la predicción
del dominio MACPF ya que por fuera de éste las secuencias son muy variables. El primer reporte de
PLPs en apicomplejos fue realizado por Kaiser y colaboradores en el año 2004, quienes identificaron
cinco genes que codifican para proteínas PLPs en el genoma del parásito de roedores, Plasmodium
yoelii. Otro estudio reportó la existencia de dos genes plp en Toxoplasma gondii (Kafsack et al., 2009)
y en un trabajo previo realizado en el Laboratorio de Hemoparásitos (Instituto de Biotecnología,
CICVyA, INTA) se identificó la familia de PLPs en B. bigemina encontrando ocho dominios MACPF que

35
 Introducción

presentan los elementos fundamentales para la formación del poro característico (Petrigh, 2010). Una
particularidad que se observó en las proteínas del género Plasmodium es que cada PLP está más
relacionada con sus ortólogas en otras especies de Plasmodium que con sus cuatro parálogas dentro
del mismo genoma, lo que sugiere una especialización de la función de cada PLP (Kaiser et al., 2004).

Al analizar la secuencia de las PLPs identificadas en organismos del phylum Apicomplexa mediante
alineamientos de sus dominios MACPF se revela el patrón conservado de 20 aminoácidos W X{2} [FL]
[FI] X{2} [FY] G T H X{7} G G, similar en espaciamiento y uso de aminoácidos al patrón canónico de la
familia MACPF (Kafsack y Carruthers, 2010). Todas las proteínas identificadas hasta el momento tienen
una secuencia péptido-señal que sugiere que o bien residen dentro de alguna organela, son secretadas
de la célula o son insertadas en alguna membrana celular. En todos los casos en los que se analizó su
ubicación subcelular se las encontró dentro de los micronemas y hasta el momento no se encontraron
proteínas que interactúen directamente con las PLPs.

Únicamente en las proteínas formadoras de poro del phylum Apicomplexa se identificó, acompañando
al dominio MACPF, un dominio rico en hojas plegadas β al que se le dio el nombre de APC-β (Kafsack y
Carruthers, 2010). Este dominio de aproximadamente 55 aminoácidos en general cuenta con tres
repeticiones directas, cada una conteniendo cuatro cisteínas altamente conservadas que
presumiblemente forman puentes disulfuro. La estructura de este dominio fue analizada mediante
cristalografía y se cree que el dominio APC-β cumple un rol mejorando la unión de la proteína a la
membrana (Guerra et al., 2018; Ni et al., 2018).

1.4.2.1 Proteínas tipo perforina de Toxoplasma gondii

En el genoma de T. gondii existen dos genes que codifican para proteínas tipo perforina, pero sólo para
uno de ellos se pudo demostrar su expresión. Trabajos realizados sobre la proteína TgPLP1 muestran
que está involucrada en los mecanismos de salida del parásito de la célula hospedadora ya que
parásitos knock out (KO) para este gen no logran salir de la célula normalmente, quedando atrapados
dentro de ella. Este defecto se debe a la incapacidad de permeabilizar de forma rápida la vacuola
parasitófora y la membrana de la célula del hospedador para el egreso y si bien no afecta el crecimiento
de los parásitos en cultivo, produce una reducción de la virulencia en ratones de más de 5 órdenes de
magnitud (Kafsack et al., 2009).

La proteína TgPLP1 se encuentra dentro de los micronemas y tiene actividad hemolítica y citolítica, y
los estudios de complementación funcional de la cepa KO demostraron que tanto el dominio MACPF
como el dominio C-terminal rico en láminas β (APC-β) son esenciales para cumplir su función (Roiko y
Carruthers, 2013). La estructura del dominio MACPF de la proteína PLP1 de T. gondii fue obtenida

36
 Introducción

mediante cristalografía mostrando una homología estructural conservada con el dominio MACPF de
otras proteínas formadoras de poro (Ni et al., 2018). Al igual que éstas, TgPLP1 parece oligomerizar
tras la unión a la membrana para formar grandes complejos multiméricos integrados en la membrana.
Además, se comprobó que la proteína TgPLP1 requiere bajo pH para su unión a la membrana blanco y
para tener actividad citolítica (Roiko et al., 2014). Aún se desconoce si la función principal de TgPLP1
es debilitar la membrana de la vacuola parasitófora o hacer que esta membrana sea permeable a otros
factores que posteriormente terminan rompiendo la misma para permitir el egreso del parásito.

1.4.2.2 Proteínas tipo perforina de Plasmodium spp.

En el caso de las especies del género Plasmodium, todos los genomas secuenciados hasta el momento
codifican para 4 o 5 PLPs distintas (Kaiser et al., 2004). A diferencia de Toxoplasma, Plasmodium
presenta un ciclo de vida más complejo ya que, además de desarrollar parte de su ciclo de vida en un
hospedador mamífero, incluye una fase de desarrollo dentro del vector artrópodo. Se observa que in
vivo los esporozoítos atraviesan varias barreras celulares antes de infectar un hepatocito final, donde
la migración a través de las células parece ser indispensable. Por un lado, luego de la picadura, en la
dermis esta migración permite atravesar las barreras endoteliales y resistir los ataques de células
fagocíticas en el proceso. Por otro lado, en el hígado permite atravesar las células Kupffer de la pared
celular sinusoidal del hígado y de esta manera llegar a los hepatocitos para su invasión.

Las PLPs en Plasmodium son necesarias tanto para el egreso del parásito de las células hospedadoras
(Deligianni et al., 2013; Garg et al., 2013; Wirth et al., 2014), como para las diferentes etapas de
migración del parásito previamente mencionadas, facilitando el camino del parásito a través de
diferentes epitelios con el fin de llegar a las células blanco (Amino et al., 2008; Deligianni et al., 2018;
Ecker et al., 2007; Kaiser et al., 2004; Risco-Castillo et al., 2015; Wirth et al., 2015).

La figura 12 muestra las etapas del ciclo de vida de P. falciparum en donde intervienen las PLPs
caracterizadas. Allí se pone en evidencia que estas proteínas intervienen tanto en el desarrollo en el
vector artrópodo como en el hospedador mamífero. Numerosos experimentos donde la expresión de
los genes plp es suprimida mediante diferentes estrategias, muestran un descenso significativo de la
virulencia de los parásitos que carecen de la proteína (Amino et al., 2008; Deligianni et al., 2018, 2013;
Ecker et al., 2007; Garg et al., 2013; Ishino et al., 2005; Kadota et al., 2004; Wirth et al., 2015, 2014).

37
 Introducción

Figura 12: Etapas del ciclo de vida de P. falciparum en las que intervienen proteínas tipo perforina (Guerra y
Carruthers, 2017).

Un trabajo sobre las proteínas PPLP1 y PPLP2 de P. falciparum (Garg et al., 2013) muestra que se
expresan en el estadio sanguíneo y se observa que PPLP1 se localiza en los micronemas de los
merozoítos. La secreción de PPLP1 es dependiente de calcio, al igual que su posterior unión a las
membranas de la célula hospedadora parasitada. PPLP1 cumple un rol crítico en la migración del
parásito a través de la dermis (Amino et al., 2008) y también es necesaria para romper la capa de
células sinusoidales del hígado antes de la invasión a los hepatocitos (Ishino et al., 2005). Por otro lado,
PPLP2 posee actividad hemolítica que resulta esencial para la salida de los gametocitos del eritrocito.
Curiosamente, parásitos de la especie P. berghei que carecen del gen PPLP1 (Ishino et al., 2005) o
PPLP2 (Deligianni et al., 2013) no mostraron alteraciones fenotípicas en los estadios asexuales, pero si
presentan defectos en el egreso de las gametas, lo que sugiere un papel diferente para estas proteínas
tipo perforina en diferentes especies de Plasmodium, o la existencia de alguna redundancia funcional.

PPLP3 también fue encontrada en los micronemas (Kadota et al., 2004) y junto con PPLP5 (Ecker et al.,
2007) intervienen en la migración del ookineto a través del epitelio del intestino de los mosquitos, ya
que parásitos que carecen de estos genes permanecen adheridos al epitelio intestinal. Los fenotipos

38
 Introducción

similares para las mutantes de plp3 y plp5 muestran que actúan juntos dentro de un complejo o
secuencialmente en la misma vía, pero no pueden compensarse entre sí (Ecker et al., 2007). En cuanto
a PPLP4, si bien hay controversias sobre si es expresada en todos los estadios del parásito (Wirth et al.,
2015) o sólo en los ookinetos (Deligianni et al., 2018), los trabajos coinciden en que tanto en P.
falciparum como en P. berghei esta proteína es esencial en los ookinetos para invadir el intestino
medio del mosquito.

1.4.2.3 Proteínas tipo perforina de Babesia spp.

En el género Babesia, en un trabajo previo realizado en nuestro laboratorio (Petrigh, 2010) se

identificaron los genes plp en las especies B. bovis y B. bigemina. Para esto, primero se buscaron en la
base de datos de genes de referencia del NCBI los genes de B. bovis anotados con dominio MACPF, los
cuales fueron usados para seleccionar aquellos contigs del genoma de B. bigemina que presentaban
similitud de secuencia dicho dominio. Esto permitió identificar en las especies B. bovis y B. bigemina a
6 y 8 proteínas con dominio MACPF respectivamente.

En este mismo trabajo se observó que una de estas proteínas, PLP2, presenta en ambas especies
analizadas una región de repeticiones en tándem río arriba del dominio MACPF, con un patrón
diferente para cada ortólogo y con polimorfismos en la cantidad de repeticiones entre cepas de una
misma especie. Sólo para B. bigemina, al analizar las repeticiones entre cepas virulentas y atenuadas
se pudo determinar un patrón característico de las cepas atenuadas distinto al de las cepas patógenas.

Por otro lado, si bien el análisis de las secuencias aminoacídicas de las proteínas tipo perforina
encontradas en Babesia spp. muestran la presencia de todos los elementos necesarios para la
formación del poro, hasta el momento no se hizo una caracterización exhaustiva de las mismas y se
desconoce su implicancia en el desarrollo del ciclo de vida y la virulencia del parásito.

“El estudio de proteínas involucradas en la virulencia de los patógenos que causan la babesiosis y
particularmente la caracterización de las proteínas tipo perforina es de especial interés para
comprender la interacción patógeno-hospedador y para desarrollar métodos nuevos y más seguros
para el control de la enfermedad.”

39
2 HIPÓTESIS Y OBJETIVOS

En base a los antecedentes detallados anteriormente, en esta tesis se propone la siguiente hipótesis:

“Las proteínas tipo perforina del género Babesia son importantes para la progresión del ciclo celular
ya que intervienen en la invasión y/o egreso del parásito de la célula hospedadora y constituyen
blancos posibles para nuevas estrategias de control”.

Teniendo en cuenta esta hipótesis se plantearon los siguientes objetivos:

Objetivo general

Caracterizar la familia de proteínas de tipo perforina (PLP – perforin-like protein) en el género Babesia
y estudiar su rol en la progresión del ciclo celular e interacción parásito-hospedador.

Objetivos particulares

1. Estudiar a nivel genómico la familia de genes que codifican para proteínas tipo perforina en
Babesia spp..

2. Realizar estudios comparativos de los genes que codifican para proteínas tipo perforina entre
diferentes especies del género Babesia para determinar el grado de conservación de estas
proteínas y sus dominios funcionales.

3. Caracterizar funcionalmente la proteína PLP1 de B. bovis en forma recombinante y mediante

la generación de una cepa knock out.

40
3 MATERIALES Y MÉTODOS

3.1 CARACTERIZACIÓN ESTRUCTURAL DE LA FAMILIA DE PROTEÍNAS TIPO PERFORINA EN

BABESIA SPP

3.1.1 Búsqueda del motivo MACPFapi en bases de datos

Se utilizó la base de datos EuPathDB (https://eupathdb.org/eupathdb/) para obtener todas las

proteínas del phylum Apicomplexa que contuvieran el dominio característico MACPF (Número de
acceso en PFAM: PF01823). Se estableció la siguiente estrategia de búsqueda dentro de la sección
“Search for genes”:

Protein features and properties  InterPro Domain  Organism: Apicomplexa  Domain database:
PFAM  Specific domain: PF001823

Se extrajeron las secuencias de aminoácidos de todas las proteínas arrojadas por la búsqueda, las
cuales fueron alineadas utilizando Clustal Ω (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/). Con este
alineamiento y utilizando la herramienta WebLogo (https://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi) se
construyó un logo de secuencia mediante modelos ocultos de Markov. Este logo de secuencia es una
representación gráfica de los aminoácidos hallados en cada una de las posiciones del alineamiento. Se
comparó esta nueva secuencia con la secuencia consenso de las PLPs de Apicomplexa, nombrada
MACPFapi que fue definida previamente por Kafsack y Carruthers en 2010 basándose en el número
reducido de genomas de apicomplejos secuenciados hasta ese momento.

3.1.2 Identificación de genes plp en genomas de Babesia

Para identificar la familia de genes plp en el género Babesia, se buscó en los genomas disponibles
aquellos marcos de lectura abierta (ORF por su sigla en inglés) que codificaran para proteínas con el
motivo MACPFapi definido previamente. Para poder realizar la búsqueda del motivo se utilizó la
herramienta “GoTo  Navigator  Find amino acid string” del programa Artemis que permite navegar
genomas y visualizar diferentes características de los mismos (Carver et al., 2008). Se analizaron
genomas de seis especies distintas de Babesia y en algunos casos, también se analizaron genomas de
diferentes cepas de una misma especie (Tabla 1).
 Materiales y Métodos

ESPECIE ORIGEN HOSPEDADOR REFERENCIA

B. bovis T2Bo EE. UU. Bovino (Jackson et al., 2014)
B. bovis C9.1 México Bovino (Jackson et al., 2014)
B. microti R1 EE. UU. Humano (Cornillot et al., 2012)
B. bigemina BOND Australia Bovino (Jackson et al., 2014)
B. bigemina PR Puerto Rico Bovino (Jackson et al., 2014)
B. bigemina JG29 México Bovino (Jackson et al., 2014)
B. bigemina S3P Argentina Bovino (Jackson et al., 2014)
B. divergens 1802A Francia Bovino (Jackson et al., 2014)
B. divergens Rouen1987 Francia Humano (Jackson et al., 2014)
B. ovata Miyake Japón Bovino (Yamagishi et al., 2017)
B. canis BcH-CHIPZ Hungría Perro (Eichenberger et al., 2017)
Tabla 1: Genomas disponibles de diferentes especies y cepas dentro del género Babesia.

Como resultado de esta búsqueda, se obtuvo la secuencia de nucleótidos y de aminoácidos de los ORFs
en los que se encontró la secuencia consenso del MACPFapi y se corroboró además que estos no sólo
presentaran el motivo característico de 20 aminoácidos, sino el dominio MACPF completo (≈ 350 aa,
Anderluh y Gilbert, 2014). Para este análisis se utilizó el recurso InterProDomain
(https://www.ebi.ac.uk/interpro/) que permite realizar un análisis funcional de las proteínas
clasificándolas en familias y prediciendo dominios y sitios importantes, combinando información de
numerosas bases de datos. Este análisis permitió también evaluar la presencia de péptido señal en los
ORFs identificados y la presencia de dominios transmembrana usando la herramienta TMpred
(https://embnet.vital-it.ch/software/TMPRED_form.html)

3.1.3 Análisis filogenético de las proteínas tipo perforina de Babesia spp

Se realizaron alineamientos de las secuencias de aminoácidos de las proteínas completas o del

fragmento correspondiente al dominio MACPF utilizando ClustalW. Los límites del dominio MACPF
fueron establecidos según el análisis realizado previamente con InterProDomain.

Para analizar diferencias entre secuencias de nucleótidos o aminoácidos se estimó la distancia

evolutiva entre las secuencias calculando el promedio del número de sustituciones en cada posición,
usando un modelo de corrección que asume que la tasa de sustitución de aminoácidos en cada sitio
𝑛𝑑
sigue la distribución de Poisson. La fórmula para calcular dicha distancia es 𝑑 = −ln⁡(1 − 𝑛
), donde n

42
 Materiales y Métodos

es el número de sitios comparados y nd el número de estos sitios que presentan diferencias (Nei y
Zhang, 2006). Los análisis filogenéticos se realizaron con el método de máxima similitud con el modelo
de Kimura 2-parámetros, usando la secuencia de la proteína PLP1 de T. gondii como grupo externo. En
todos los casos se calcularon los valores de bootstrap (soporte de rama) con 1000 pseudoréplicas. Los
alineamientos, la estimación de la distancia entre secuencias y el análisis filogenético se realizaron con
el programa MEGA version X software (Kumar et al., 2018).

3.1.4 Análisis de ortología y sintenia de la familia de proteínas tipo perforina

La ortología fue analizada mediante la herramienta OrthoMCL, alojada en el espacio de trabajo

EuPathDB Galaxy (https://eupathdb.globusgenomics.org/), que permite mapear una lista de proteínas
de interés a los grupos de ortología de la base de datos OrthoMCL. Las secuencias de todas las
proteínas de la familia PLP identificadas en Babesia fueron incorporadas para el análisis y asignadas a
diferentes grupos de ortología.

Por otra parte, para el análisis de la sintenia se utilizó la base de datos PiroplasmaDB
(http://piroplasmadb.org/piro/). Esta base de datos contiene una herramienta llamada Genome
Browser que muestra un alineamiento entre los genomas de diferentes especies de Babesia lo que
permite observar para cada gen de interés su posición dentro del genoma y los genes circundantes. En
PiroplasmaDB se encuentran depositados los genomas de B. bovis, B. bigemina, B. microti, B. divergens
y B. ovata. Se determinó la sintenia de cada gen plp analizando la identidad y el sentido de los genes
circundantes al gen de interés en los genomas de las especies analizadas. Además, al seleccionar un
gen particular, el programa informa si ese gen es o no sinténico con respecto a las especies que se
están comparando.

3.1.5 Predicción de la estructura tridimensional y de la función de la familia de proteínas tipo

perforina

Se realizó el modelado de estructura tridimensional de las proteínas completas y también de los

dominios MACPF y APC-β aislados de cada una de las PLPs de Babesia. Para este análisis se utilizó el
programa I-TASSER (https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/). El mismo realiza predicciones
mediante la identificación de templados estructurales en la base de datos PDB para luego simular una
estructura tridimensional completa. A la predicción de la estructura 3D se le asigna un valor “C-Score”
que indica cuan correcta es la topología global de la predicción. Valores de C > a -1.5 indican una
topología global correcta del modelado. Después de la predicción de la estructura, I-TASSER utiliza el

43
 Materiales y Métodos

programa de alineación estructural TM-align para analizar la similitud de la estructura predicha con
todas las depositadas en la biblioteca PDB y asigna a dicha comparación un TM-score que es una
medida de la similitud entre las dos estructuras comparadas. El TM-score asume valores entre 0 y 1,
donde 1 indica una coincidencia perfecta entre dos estructuras. Puntajes por debajo de 0.17
corresponden a proteínas no relacionadas elegidas al azar, mientras que un puntaje mayor a 0.5 indica
que se trata de estructuras con un mismo dominio.

3.2 CARACTERIZACIÓN FUNCIONAL DE LAS PROTEÍNAS TIPO PERFORINA DE B. BOVIS

Las técnicas y protocolos generales de biología molecular que fueron usados en este trabajo se detallan
en el Anexo II. Asimismo, se incluyó un listado de todos los cebadores específicos y plásmidos utilizados
en el Anexo III.

3.2.1 Análisis de la transcripción de genes plp de B. bovis

Para determinar in silico los niveles de transcripción de la familia de PLP en B. bovis se utilizaron
diferentes sets de datos transcriptómicos disponibles. Por un lado, se analizaron datos aún no
publicados de transcriptómica de diferentes estadios de B. bovis que fueron cedidos gentilmente por
el laboratorio del Dr. Massaro Ueti (USDA-ADRU; Department of Veterinary Microbiology and
Pathology Washington State University). Los datos incluían los estadios de merozoíto (presente en
hospedador mamífero) y de kineto (presente en vector artrópodo).

Por otro lado, se utilizaron los datos de transcriptómica comparativa entre cepas virulentas y
atenuadas de B. bovis publicados por Pedroni et al., 2013 que se encuentran depositados en el “NCBI’s
Gene Expression Omnibus” (www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE51560). Se analizaron
los niveles de transcripción de los genes plp y se incluyeron además actina y fructosa 1,6 bifosfato
aldolasa como control de genes que se expresan constitutivamente. Los análisis se realizaron para las
cepas argentinas virulenta L17_V y su variante atenuada L17_A.

Para ambos sets de datos se analizó el número de transcriptos obtenidos para cada uno de los genes
de interés, los cuales estaban previamente normalizados. Los genes fueron considerados como
diferencialmente transcriptos si se cumple la ecuación |log2 (FC)| ≥ 1, lo que corresponde a tener el
doble de transcriptos en una condición respecto de la otra.

44
 Materiales y Métodos

3.2.2 Clonado del gen BboPLP1 para su expresión en bacterias

En primera instancia se intentó el clonado y la expresión de la proteína PLP1 completa, pero dado que
no se obtuvo expresión de la misma en las diferentes condiciones evaluadas, se procedió al clonado y
expresión del dominio funcional, llamado PLP1_MACPF. El fragmento del gen correspondiente al
dominio PLP1_MACPF fue clonado por PCR en el vector de entrada pCR™8/GW/TOPO™ y sub-clonado
posteriormente en el vector de expresión procariota Gateway™ pDEST™17. El mismo tiene una
secuencia que codifica para una cola de poli-histidinas (6x-His tag) en el extremo N-terminal, lo que
permite la purificación de las proteínas recombinantes mediante cromatografía de afinidad con una
resina de níquel.

Para esto, en primer lugar, se realizó una amplificación del fragmento PLP1_MACPF mediante PCR con
los cebadores específicos Bbo_PLP1_MACPF_Fw y Bbo_PLP1_MACPF_Rv que amplifican la totalidad
del dominio de 346 aminoácidos. Los límites del dominio fueron establecidos según el análisis realizado
previamente con InterProDomain. La PCR se realizó como se describe en el anexo II, sección 9.3,
usando una temperatura de hibridación de 60 °C y un tiempo de extensión de 1’ 10’’. Dado que el gen
plp1 no contiene intrones, como templado para la PCR se utilizó ADN genómico de la cepa patógena
Argentina S2P. El fragmento amplificado de 1037 pb fue visualizado sembrando 5 µl de la mezcla de
reacción en un gel de agarosa 1%.

Otra alícuota de 5 µl del producto de PCR fue ligado en el vector de entrada pCR®8/GW/TOPO®
(Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante y con la ligación se transformaron bacterias
competentes E. coli DH5α mediante choque térmico. Las bacterias transformadas fueron plaqueadas
en LB-agar con espectinomicina ya que el plásmido contiene un gen de resistencia para este
antibiótico. Luego de una incubación de la placa por 16 hs a 37 °C se seleccionaron 10 clones para
evaluar la incorporación del inserto. Para ello se realizaron minipreparaciones de plásmido seguidas
de digestión con la enzima EcoRI para evaluar la liberación del inserto clonado. Adicionalmente, como
el clonado no fue direccionado, fue necesario comprobar la orientación en la que el fragmento se
insertó en el plásmido de entrada, para el correcto sub-clonado posterior. La evaluación de la
orientación se llevó a cabo mediante PCR usando los cebadores M13 Fw y Bbo_PLP1_MACPF_Rv. Esta
PCR se realizó con una temperatura de hibridación de 55 °C y 1’ 10’’ de extensión (anexo II, sección
9.3) y, debido a la orientación de los cebadores usados, sólo se obtuvo un fragmento de amplificación
cuando el inserto ligado ingresó en la orientación necesaria para el sub-clonado. Una vez identificado
un clon con el inserto en el sentido correcto, el ADN plasmídico fue purificado utilizando un kit
comercial (Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification System, Promega) y sub-clonado por
recombinación tipo “LR” en el vector procariota de expresión Gateway™ pDEST™17 (Invitrogen). La
recombinación se llevó a cabo utilizando el kit Gateway™ LR Clonase™ II Enzyme mix (Invitrogen),

45
 Materiales y Métodos

siguiendo las especificaciones del fabricante. La mezcla de recombinación fue luego utilizada para
transformar bacterias E. coli DH5α mediante choque térmico que luego fueron plaqueadas en LB-agar
con ampicilina. Los clones obtenidos fueron re-estriados en LB-agar ampicilina y en LB-agar
cloranfenicol. Si la recombinación se llevó a cabo correctamente, los clones no deberían crecer en este
último antibiótico ya que el gen de resistencia es eliminado durante la recombinación. Se realizaron
minipreparaciones de algunos clones que cumplieron con esta condición y se seleccionó uno para su
secuenciación utilizando el cebador T7 promotor. A este plásmido de expresión se lo llamó
pDEST17+PLP1_MACPF.

3.2.3 Expresión y purificación de la proteína PLP1 recombinante

El plásmido pDEST17+PLP1_MACPF fue utilizado para transformar mediante choque térmico bacterias
competentes E. coli BL21-AI y proceder a la expresión de la proteína PLP1_MACPF, tal como se describe
en el anexo II, sección 9.12. Se comprobó la expresión de la proteína realizando un SDS-PAGE seguido
de un Western blot revelado con un anticuerpo anti-Histidina comercial (anexo II, secciones 9.13 a
9.16).

En condiciones estándar de expresión (bacterias BL21-AI, 4hs de inducción a 37 °C, 0.2% Arabinosa) la
proteína recombinante PLP1_MACPF se expresa de manera insoluble formando cuerpos de inclusión.
Para la generación de anticuerpos en ratones, la proteína fue purificada en condiciones
desnaturalizantes a partir de estos cuerpos de inclusión como se describe en el anexo II, sección 9.17.
Para su uso en la inoculación de ratones, se procedió a la eliminación de la urea presente en las
alícuotas de proteína purificada realizando un SDS-PAGE preparativo seguido de una tinción negativa
transiente con CuCl2 300 mM. Se recortó la banda del gel donde se encontraba la proteína y se procedió
a la electroelución durante 2 hs a 150V en buffer Laemmli a 4 °C y diálisis durante 16 hs en PBS a 4 °C.

Dado que la proteína rPLP1_MACPF también debió ser evaluada en ensayos funcionales, se probaron
diferentes protocolos de inducción con el fin de obtener la proteína en estado nativo. Las condiciones
de inducción que se evaluaron se detallan en la tabla 2.

TEMPERATURA (°C) ARABINOSA (%)

A 28 0.2
B 16 0.2
C 4 0.2
D 28 0.1
E 16 0.1
F 4 0.1
Tabla 2: Diferentes combinaciones de temperatura y cantidad de inductor que se usaron para evaluar la
expresión de la proteína rPLP1_MACPF en condiciones solubles.

46
 Materiales y Métodos

Para todas las condiciones se realizaron cultivos de 5 ml inoculados con una única colonia proveniente
de la transformación de bacterias E. coli BL21-AI con el plásmido pDEST17+PLP1_MACPF, y se analizó
la expresión soluble de la proteína procesándola como se menciona en el anexo II sección 9.17. Dado
que los mejores resultados fueron obtenidos en la condición E, se realizó un cultivo de E. coli BL21-AI
+ pDEST17+PLP1_MACPF en un volumen de 50 ml y se purificó la proteína en condiciones nativas
mediante cromatografía de afinidad utilizando una resina de níquel sin el agregado de urea en los
buffers.

3.2.4 Generación de anticuerpos en ratones contra rPLP1_MACPF

Para la generación de anticuerpos en ratones se utilizó la proteína purificada de los cuerpos de

inclusión ya que el rendimiento en la producción de proteína resultó mucho mayor. Se utilizaron cinco
ratones macho Mus musculus de la cepa BALB/c AnN de 6 semanas de edad libres de patógenos
específicos. Los animales fueron adquiridos en el Bioterio de la Fundación Facultad de Ciencias
Veterinarias, Universidad Nacional de La Plata. El cuidado y la manipulación, así como también los
protocolos de inmunización y sacrificio de estos animales se realizaron en el Bioterio del Instituto de
Biotecnología del CICVyA (INTA) respetando las normas internacionales vigentes bajo la supervisión
del CICUAE – CICVyA (protocolo N° 42/2016).

Se realizó una sangría previa a las inoculaciones mediante incisión en la cola para obtener suero pre-
inmune y se utilizó un esquema de inmunización que consta de cuatro aplicaciones de 30 µg de
proteína por animal por vía subcutánea. La primera inmunización se realizó con adyuvante completo
de Freund, mientras que para las otras tres se utilizó el mismo adyuvante pero incompleto. Cada
inmunización se separó por 14 días de la anterior y 14 días después de la última inoculación se procedió
a una sedación inhalatoria utilizando isoflurano y posterior sangría a blanco a través del seno retro-
orbital. Luego, los animales fueron sacrificados mediante dislocación cervical.

3.2.5 Ensayos de hemólisis

Para los ensayos de hemólisis se utilizaron eritrocitos de bovinos sanos provenientes de un área libre
de babesiosis. Los eritrocitos provenientes de sangre entera de la vena yugular y con anticoagulante
fueron lavados en 9 volúmenes de PBS tres veces, centrifugando a 150 x g, a 4 °C. Luego, fueron
resuspendidos en un volumen de una solución de resuspensión de eritrocitos (SRE) con 150 mM NaCl,
1 mM CaCl2 y 20 mM Hepes y se calculó el hematocrito mediante centrifugación en un capilar. Los
glóbulos rojos fueron diluidos en SRE de manera tal de alcanzar un hematocrito de 2%. Un volumen

47
 Materiales y Métodos

de 50 µl de estos eritrocitos diluidos fueron incubados en un tubo de 0.5 ml con las diferentes proteínas
o compuestos a evaluar, durante 30’ a 37 °C. En un primer ensayo se incubaron los eritrocitos con la
proteína recombinante PLP1_MACPF dializada en una concentración de 100 nM y como control se
utilizó la misma cantidad de una proteína recombinante heteróloga no hemolítica (rSAG1: Surface
Antigen Glycoprotein de Neospora caninum) la cual fue purificada y dializada en las mismas
condiciones que rPLP1_MACPF (Wilkowsky et al., 2011). Se utilizó la solución SRE como control
negativo y Tritón X-100 1% para generar una lisis total de los eritrocitos (control positivo). Luego de la
incubación, el tubo se centrifugó a 900 x g durante 10’ y se tomó el sobrenadante cuidando de no
mover el pellet. Para evaluar la hemólisis se midió la absorbancia del sobrenadante a 405 nm, longitud
de onda a la cual absorbe la hemoglobina. Los valores de lisis de los tratamientos con proteína fueron
relativizados a la lisis observada con Tritón X-100 1%, que se consideró como 100% de lisis.

Para evaluar la relación dosis-respuesta de la proteína se realizó un ensayo de hemólisis con una curva
de concentración abarcando el rango desde 30 nM hasta 250 nM de rPLP1_MACPF y utilizando los
mismos controles antes descriptos.

Adicionalmente se realizaron ensayos de hemólisis a diferentes pH y concentración de Ca2+. Los

mismos se llevaron a cabo utilizando una concentración constante de proteína recombinante (100
nM). Para el ensayo de hemólisis en concentraciones variables de Ca2+, se evaluaron 5 concentraciones
diferentes de Ca2+ abarcando el rango de 0 a 1 mM. Para alcanzar la concentración de 0 mM se agregó
EGTA 1 mM a la solución de SRE. En el caso del ensayo a diferentes pH, la reacción se llevó a cabo en
PBS en un rango de pH de 5 a 9, ajustándolo con HCl o NaOH. Además de los controles usados en los
ensayos anteriores, se agregaron 3 controles negativos a diferentes pH (5, 7 y 9) para descartar que la
lisis observada fuera debido a los cambios en el pH, más que a cambios en la actividad de la proteína
a diferentes pH.

En todos los casos los ensayos fueron realizados por triplicado y para evaluar la significancia estadística
de los resultados se realizó una prueba de ANOVA de un factor seguida de una prueba de Dunnett de
comparaciones múltiples. Valores de p<0,001 fueron considerados significativos. Los análisis se
realizaron usando GraphPad Prism versión 5.01 para Windows (GraphPad Software, San Diego
California USA, www.graphpad.com).

48
 Materiales y Métodos

3.3 GENERACIÓN DE UNA CEPA DE B. BOVIS MODIFICADA GENÉTICAMENTE PARA EL GEN PLP1
Y SU ANÁLISIS FENOTÍPICO

3.3.1 Generación de una cepa de B. bovis knock out para PLP1 (Δplp1)

3.3.1.1 Mantenimiento de cultivos de B. bovis

La cepa Texas T3Bo de B. bovis y las cepas knock out generadas en este trabajo fueron multiplicadas y
mantenidas en cultivos in vitro de eritrocitos bovinos utilizando el método de fase estacionaria
microaerófilo (Levy y Ristic, 1980; Rodriguez et al., 1983). Se cultivaron eritrocitos bovinos infectados
con los parásitos en medio de cultivo HL-1 pH 7.2 (Gibco) enriquecido con 40% de suero bovino. El
medio se completó con la adición de 5-10% (V/V) de eritrocitos frescos de un bovino sano. Los cultivos
se incubaron en estufa a 37 °C con una atmósfera de 5% de CO2. El medio de cultivo fue reemplazado
cada 24 hs y cada 48-72 hs se realizaron divisiones del cultivo (subcultivo) 1:2 o 1:3 para mantener baja
la parasitemia y así evitar el agotamiento del cultivo.

3.3.1.2 Construcción del plásmido de transfección

El gen plp1 nuclear de la cepa virulenta de B. bovis T3Bo fue eliminado por doble recombinación
homóloga usando un plásmido que contiene las regiones 5’ y 3’ no codificantes (5’ y 3’ UTR, por sus
siglas en inglés) del gen plp1 (Figura 13). Estas regiones no codificantes fueron clonadas en un plásmido
pBluescript II SK (+) modificado (p3-177-042) generado y cedido por el laboratorio del Dr. Carlos Suarez
(USDA-WSU; Pullman, Washington, EE. UU.). Este plásmido fue diseñado para expresar la proteína de
fusión EGFP-BSD bajo el control del promotor ef-1α, un promotor constitutivo fuerte de B. bovis. El
gen egfp-bsd codifica para la proteína fluorescente EGFP y para BDS que confiere resistencia a la droga
blasticidina.

Figura 13: Esquema del plásmido de transfección pBboΔplp1 construido para generar la cepa B. bovis knock out
para plp1.

49
 Materiales y Métodos

La construcción del plásmido de transfección se realizó mediante amplificación por PCR de secuencias
parciales de los extremos 5’ y 3’ UTR del gen plp1 seguida de clonados secuenciales (Figura 14). Los
protocolos generales de biología molecular se encuentran en el Anexo II mientras que los detalles de
la amplificación por PCR y los diferentes clonados se describen a continuación. Los cebadores
específicos y plásmidos se listan en el Anexo III.

Amplificación por PCR de los fragmentos 5’ y 3’ UTR del gen plp1 y clonado en pGEM-T

Para amplificar el extremo 5’ UTR del gen plp1 se realizó una PCR usando los cebadores 5’UTR_BboPLP1
Fw y 5’UTR_BboPLP1 Rv con una temperatura de hibridación de 52 °C, mientras que para el extremo
3’ se usaron los cebadores 3’UTR_BboPLP1 Fw y 3’UTR_BboPLP1 Rv y una temperatura de hibridación
de 54 °C. En ambos casos se realizó la amplificación con 1 min de extensión ya que los fragmentos a
amplificar tienen un tamaño de 849 pb (5’UTR) y 935 pb (3’UTR). Los cebadores utilizados para la
amplificación poseen en su secuencia los sitios de restricción XhoI (5’ UTR) y BamHI (3’UTR) lo que
permite el sub-clonado posterior en el vector de transfección (ver listado de cebadores en Anexo III).
Se utilizó como templado ADN genómico de B. bovis de la cepa T2Bo.

Los fragmentos amplificados fueron clonados por separado en plásmidos pGEM-T y transformados
mediante choque térmico en bacterias DH5α competentes químicas. A partir de clones aislados se
realizaron minipreparaciones de ADN plasmídico y una digestión del plásmido con la enzima EcoRI para
corroborar la liberación de un fragmento del tamaño esperado. Luego, ambos plásmidos (pGEM-
T+5’UTR_PLP1 y pGEM-T+3’UTR_PLP1) fueron utilizados para secuenciar los fragmentos de interés.

Subclonado del fragmento 5’ UTR en el sitio XhoI del plásmido de transfección

En primer lugar, se insertó el fragmento 5’UTR en el plásmido de transfección 3.177.042 en el sitio de

corte de la enzima de restricción XhoI. Para esto, 1 µg del plásmido 3.177.042 y del pGEM-
T+5’UTR_PLP1 fueron digeridos con esta enzima (37 °C, 4 hs). Ambos productos de digestión fueron
sometidos a electroforesis en un gel de agarosa y tanto el fragmento liberado en el caso del plásmido
pGEM-T+5’UTR_PLP1, como el plásmido 3.177.042 linealizado fueron purificados a partir del gel
usando el kit EasyPure Quick Gel Extraction (Transgen). El plásmido 3.177.042 luego fue tratado con la
enzima fosfatasa rSAP (New England Biolabs) para evitar su religación. Ambos fragmentos purificados
fueron cuantificados mediante espectrofotometría.

Luego se procedió a la ligación entre el plásmido 3.177.042 linealizado y el fragmento 5’UTR_PLP1

utilizando la enzima T4 ligasa (New England Biolabs) y una relación inserto:vector 3:1. El producto de
la ligación se usó para transformar mediante electroporación bacterias DH5α, las cuales fueron
plaqueadas en LB-agar con ampicilina. A partir de los clones obtenidos se realizaron minipreparaciones

50
 Materiales y Métodos

de ADN plasmídico, los cuales fueron analizados mediante digestión con la enzima XhoI para evaluar
la liberación de un inserto del tamaño esperado.

Además, ya que la orientación del inserto resulta indispensable para la recombinación en el parásito y
dado que la ligación no fue direccional, se evaluó la orientación del inserto 5’UTR_PLP1 mediante PCR
con los cebadores T7 promotor y 5’UTR_BboPLP1 Rv, a una temperatura de 55 °C y un tiempo de
elongación de 1 min. Esta PCR da resultados positivos sólo si el fragmento se insertó en el sentido 5’
 3’, necesario para los pasos subsiguientes. También se realizó otra PCR usando como cebadores el
T7 promotor y el 5’UTR_BboPLP1 Fw, la cual daría resultados positivos sólo si el fragmento se hubiera
insertado en la orientación contraria a la buscada. Se tomó uno de los clones con el inserto en la
orientación correcta para continuar con la segunda etapa de la construcción del plásmido de
transfección.

Subclonado del fragmento 3’ UTR en el sitio BamHI del plásmido de transfección

Tanto el plásmido incompleto que ya contiene el extremo 5’ UTR del gen PLP1, como el plásmido
pGEM-T+3’UTR_PLP1 fueron digeridos con la enzima BamHI. Se digirió 1 µg de cada plásmido con 1 µl
de enzima, a 37 °C por 4 hs y se procedió tal como se mencionó anteriormente, purificando ambas
moléculas a partir de un gel de agarosa, y desfosforilando el plásmido linealizado para evitar su
religación. Se realizó una nueva ligación con la enzima T4 ligasa, entre el plásmido incompleto
linealizado y el inserto 3’UTR_PLP1. El plásmido producto de la ligación fue transformado en bacterias
DH5α mediante electroporación. Las colonias que crecieron en LB-agar con ampicilina fueron usadas
para hacer minipreparaciones de plásmido y se corroboró la presencia del inserto mediante digestión
con la enzima BamHI.

En este caso, para evaluar la orientación de los fragmentos se utilizó otra estrategia, que consistió en
digerir el plásmido con las enzimas HindIII y PstI, por separado. Dado que el sitio de restricción cambia
de posición de acuerdo con la orientación en la que se insertó el fragmento 3’UTR_PLP1, se puede
determinar el sentido del inserto evaluando el tamaño de los fragmentos generados en la digestión
(Tabla 3).

ENZIMA 5’UTR_PLP1 ; 3’UTR_PLP1  (CORRECTO) 5’UTR_PLP1  3’UTR_PLP1  (INVERTIDO)

HindIII 4538, 2576, 730 3874, 3234, 738
PstI 5650, 1290, 904 6501, 1296, 55
Tabla 3: Tamaño esperado de los fragmentos luego de la digestión del plásmido generado con las enzimas de
restricción. De acuerdo con el sentido en el que se insertó el fragmento 3’UTR_PLP1 se obtendrán productos de
digestión de diferentes tamaños.

51
 Materiales y Métodos

A partir de estos análisis, se seleccionó el clon que contuviera ambos insertos en el sentido correcto y
se secuenció el fragmento utilizando cebadores adecuados. Al plásmido de transfección completo se
lo denominó pBbo∆plp1.

Figura 14: Esquema de los pasos de digestión y ligación usados para obtener el plásmido de transfección
pBboΔplp1.

52
 Materiales y Métodos

3.3.1.3 Purificación del plásmido de transfección

Para obtener la cantidad y calidad de plásmido necesario para la transfección de B. bovis se realizó una
maxipreparación de plásmido usando el kit comercial EndoFree Maxikit (Qiagen) que permite obtener
grandes cantidades de ADN libre de endotoxinas.

Se transformaron bacterias E. coli Top10 con el plásmido pBbo∆plp1 y se las plaqueó en LB-agar con
ampicilina. Se tomó una colonia aislada para hacer un cultivo inicial de 2 ml en LB con ampicilina que
luego se usó para inocular 75 ml de medio LB con ampicilina que se dejó crecer 16 hs a 37 °C. El cultivo
de 75 ml fue centrifugado y se procedió a la purificación del plásmido siguiendo el protocolo provisto
por el fabricante. El mismo protocolo se usó para purificar el plásmido pBluescript que fue usado como
control en los ensayos de transfección.

3.3.1.4 Transfección de B. bovis para generar la cepa knock out Δplp1

Los ensayos de transfección y generación de la cepa B. bovis Δplp1, así como también la caracterización
genética y a evaluación fenotípica de la cepa generada se llevaron a cabo en el laboratorio del Dr.
Carlos Suarez (USDA-WSU; Pullman, Washington, EE. UU.) gracias a la obtención de una beca
financiada por las Fundaciones Fulbright, Bunge y Born y Williams.

Para la transfección de los parásitos se procedió tal como se describe en Suarez y McElwain, 2009.
Brevemente, 10 µg de plásmido pBbo∆plp1 se diluyeron en 70 µl de buffer cytomix (120 mM KCl, 0.15
mM CaCl2, 10 mM K2HPO4/KH2PO4 pH 7.6) previamente esterilizado. El plásmido pBbo∆plp1 fue
introducido por electroporación en 30 µl de eritrocitos infectados con la cepa wild type (WT) B. bovis
T3Bo en una parasitemia del 10%. En este trabajo se realizaron dos transfecciones independientes con
el plásmido pBbo∆plp1 (T220.1 y T220.2) y también, como control negativo de la transfección y
posterior selección, se transfectaron parásitos con el plásmido pBluescript vacío en las mismas
condiciones que el anterior. La electroporación de los plásmidos se realizó a 1.2 kV, 25 mF y 200 Ω,
usando el equipo BioRad Gene Pulser II (BioRad) y cubetas de 0.2 cm.

Luego de la electroporación, los parásitos fueron colocados en una placa de 48 pocillos con 50 µl de
eritrocitos frescos y 350 µl de medio de cultivo, y dejados en estufa a 37 °C por 12 horas. A partir de
ese momento se comenzó con la selección de los parásitos transformados adicionando blasticidina en
concentraciones inhibitorias al medio de cultivo, el cual fue cambiado a diario evitando retirar los
eritrocitos. Los cultivos fueron monitoreados regularmente para evaluar la aparición de parásitos
resistentes a blasticidina y fluorescentes. Para esto se calculó la parasitemia mediante extendidos de
2.5 µl del cultivo, los cuales fueron teñidos con el colorante Diff Quik (ThermoFisher Scientific) de

53
 Materiales y Métodos

acuerdo con lo especificado por el fabricante. Además, se verificó la emisión de fluorescencia de los
parásitos transfectados usando un microscopio de fluorescencia (Zeiss) con una magnificación de 60x
y un set de filtros apropiado para ver la emisión de eGFP.

3.3.2 Caracterización genética de la cepa B. bovis Δplp1

Para confirmar la integración del gen de fusión y estabilidad de la cepa B. bovis Δplp1 se usaron
diferentes técnicas.

3.3.2.1 PCR

Para evaluar que la integración del gen de fusión se haya dado en el locus correcto generando la
deleción del gen plp1, se realizaron una serie de amplificaciones por PCR sobre ADN genómico extraído
de las cepas T220.1 y T220.2 generadas con el plásmido pBbo∆plp1 y los controles de cepa WT T3Bo o
transfectada con el plásmido vacío.

Las diferentes combinaciones de cebadores que se usaron se resumen en la tabla 4. En todos los casos
la PCR se realizó a una temperatura de hibridación de 55 °C y un tiempo de extensión de 3’ 30’’. Para
demostrar la integración en los extremos 5’ y 3’ del gen plp1 se diseñó uno de los cebadores para que
hibride por fuera de la región no codificante modificada en la recombinación homóloga, combinándolo
con otro que hibrida en el gen de fusión egfp-bsd (Figura 15 y Tabla 4, PCR 1 y 2). De esta manera sólo
se obtendrá una amplificación de ADN en el caso de que la integración se haya llevado a cabo en el
locus de plp1. También se realizaron otras dos reacciones de PCR donde uno de los cebadores hibrida
en la región codificante de plp1, por lo que solo se obtendrán resultados positivos en los casos en los
que no se haya generado el KO (Figura 15 y Tabla 4, PCR 3 y 4). Además, se realizó una PCR del locus
msa1 como control de la extracción e integridad del ADN. Todos los amplicones obtenidos en estas
PCRs fueron purificados y clonados en el vector TOPO® TA Cloning vector (ThermoFisher Scientific).
Los fragmentos clonados fueron secuenciados utilizando los cebadores M13 Fw y M13 Rv cuya
secuencia está presente en el vector.

54
 Materiales y Métodos

RESULTADO
PCR NOMBRE CEBADORES ESPERADO
WT KO
1 Integración extremo 5’ 5’UTR ext Fw + egfp Rv - +

2 Integración extremo 3’ bsd Fw + 3’UTR ext Rv - +

3 5’ PLP1 ORF 5’UTR ext Fw + PLP1 ORF Rv + -

4 3’ PLP1 ORF PLP1 ORF Fw + 3’UTR ext Rv + -

5 msa1 msa1 Fw + msa1 Rv + +

Tabla 4: Diferentes reacciones de PCR usadas para evaluar la integración del gen de fusión en el locus de plp1.
Los colores de los cebadores coinciden con los representados en la figura 15.

Figura 15: Esquema del sitio de hibridación de los cebadores usados para evaluar la integración del gen de fusión
en el locus plp1 y de los amplicones generados.

55
 Materiales y Métodos

3.3.2.2 Ensayos de Southern blot

La inserción del plásmido en el genoma de B. bovis T3Bo fue analizada mediante Southern blot sobre
ADN genómico, sin digerir y digerido con la enzima BglII utilizando la cepa WT y las transfecciones
T220.1 y T220.2 generadas con el plásmido pBbo∆plp1. Las diferentes muestras fueron sometidas a
electroforesis en un gel de agarosa y transferidas a una membrana de nylon cargada positivamente.
Luego fueron hibridados con tres sondas diferentes marcadas con digoxigenina (DIG). Las sondas
usadas hibridan en la región 5’ no codificante del gen plp1, en el gen de fusión egfp-bsd y en la región
codificante del gen plp1. El protocolo de Southern blot y las sondas generadas fueron realizadas tal
cómo se describe en Suarez y McElwain, 2009 y son detalladas en el anexo II, sección 9.18.

3.3.3 Enriquecimiento del cultivo de B. bovis Δplp1 mediante separación de células activada por
fluorescencia (FACS)

El cultivo producto de la transfección T220.1 fue sometido a una separación de células activada por
fluorescencia utilizando al accesorio Clonecyte (FACS Vantage, Becton Dickenson, Immunocytometry
Systems, San José, CA). Aquellos eritrocitos infectados con parásitos Δplp1 son fluorescentes ya que
expresan la proteína eGFP, por lo que se configuró el sistema de clasificación de células de manera de
seleccionar y colocar 500 eritrocitos fluorescentes en un mismo pocillo de una placa de 96 pocillos. Se
generaron nuevos cultivos a partir de esta selección y se realizaron ensayos de microscopía de
fluorescencia y citometría, tanto del cultivo original (T220.1) como del cultivo enriquecido (eT220.1),
para confirmar el enriquecimiento y que en este último no se detectaran parásitos WT no
fluorescentes.

Para los ensayos de microscopía de fluorescencia, se realizaron extendidos de los cultivos original y
enriquecido, los cuales fueron marcados con el fluoróforo Hoechst 3342 (ThermoFisher Scientific) que
se intercala en ADN doble cadena, siguiendo el protocolo del fabricante para la tinción de células vivas
sin fijar. Los extendidos fueron visualizados en un microscopio de epifluorescencia con un aumento de
60X y usando filtros apropiados para la observación de ambos fluoróforos, y se tomaron imágenes que
luego fueron fusionadas para producir una imagen conjunta de la emisión de Hoechst 3342 y eGFP.

Los ensayos de citometría de flujo se realizaron con un citómetro FACSAria FusionTM (Becton
Dickinson) sobre los cultivos eT220.1, WT y de mezclas de eT220.1 con WT en proporciones 1:1 y 10:1
que sirvieron de control de las mediciones. Todas las muestras analizadas fueron previamente
marcadas con hidroetidina (ThermoFisher Scientific) según el protocolo del fabricante. Para todas las
muestras se realizaron mediciones de células marcadas con dicho intercalante y de células que
expresan eGFP.

56
 Materiales y Métodos

3.3.4 Análisis de la transcripción de los genes plp1 y plp5 en la cepa Δplp1

Para evaluar si existen diferencias en la transcripción de los genes plp1 y plp5 entre la cepa Δplp1 y la
WT, en primer lugar se realizó una extracción de ARN a partir de 100 µl de eritrocitos infectados de los
cultivos eT220.1 y T3Bo con parasitemias de 13% y 5.6%, respectivamente. Se procedió según el
protocolo descripto en el Anexo II, sección 9.19. y se obtuvieron alícuotas de 123 ng/µl (Δplp1) y 98
ng/µl (T3Bo). Estas alícuotas fueron tratadas con una enzima DNAsa para luego realizar la síntesis de
ADN copia como se describe en el Anexo II, sección 9.20.

Para la cuantificación de los transcriptos de los genes de interés se realizó un ensayo de PCR
cuantitativa en tiempo real (qPCR) sobre el ADN copia obtenido a partir del ARN de las cepas a analizar.
Se diseñaron cebadores específicos para amplificar fragmentos de aproximadamente 150 pb de los
transcriptos de los genes plp1, plp5 y hsp20 (que fue usado como control endógeno). La secuencia de
dichos cebadores se detalla en el Anexo III.

En primera instancia, los mismos fueron evaluados mediante PCR de tiempo final sobre ADN genómico
de la cepa T2Bo de B. bovis para determinar su especificidad. Posteriormente, para determinar y
optimizar la eficiencia de la amplificación de los pares de cebadores, se realizó la qPCR sobre una curva
estándar de ADN genómico de la cepa T2Bo que consistía en una serie de 5 diluciones al décimo
partiendo de una cantidad inicial conocida (parasitemia inicial de 1% y final de 10-4 %). La
determinación de la eficiencia se realizó usando el software StepOne™ asociado al equipo y se
estableció que, para las 3 reacciones, los mejores resultados se obtenían a una temperatura de
hibridación de 62 °C y concentración de cada cebador de 50 nM.

La cuantificación relativa de los transcriptos de plp1 y plp5 en la cepa Δplp1 con respecto a la WT T3Bo
se llevó a cabo mediante el método de curva estándar relativa, usando como control endógeno para
la normalización al gen hsp20 que se expresa a niveles similares en todas las muestras. Como muestra
de referencia se consideró la cepa WT por lo que la cantidad de amplicones en las muestras incógnita
se expresan como una cantidad relativa con relación a la cantidad presente en el WT. Se incluyeron
controles negativos con la mezcla de reacción sin ADN, y también los controles negativos de la
retrotranscripción (control RT-) de las muestras WT y Δplp1 para descartar que las mismas contuviera
trazas de ADN genómico que pudiera interferir en la cuantificación. Todos los ensayos de qPCR se
realizaron por triplicado y en todos los casos se analizó la especificidad de amplificación observando
los gráficos de las curvas de disociación (melting).

La cuantificación relativa se realizó usando el software StepOne™ v2.3, que en primera instancia
construye para cada fragmento a amplificar (hsp20, plp1 y plp5) una curva estándar a partir de los 5
puntos de la curva de diluciones seriadas de ADN. Luego, usando esta curva estándar el programa

57
 Materiales y Métodos

interpola la cantidad de amplicones obtenidos para cada gen target (plp1 y plp5) y para el control
endógeno (hsp20) tanto en la muestra incógnita (Δplp1) como en la referencia (WT). El programa
normaliza la cantidad de productos de amplificación del gen target (plp1 o plp5) comparándola con la
cantidad del control endógeno (hsp20). Finalmente, determina un valor de cantidad relativa
comparando las cantidades de amplicones normalizadas entre la muestra de referencia (WT) y la
muestra incógnita (Δplp1).

3.3.5 Análisis fenotípico de la cepa Δplp1 mediante curvas de crecimiento

Para evaluar el impacto de la disrupción del gen plp1 en los parásitos se realizaron curvas de
crecimiento in vitro en cultivos de eritrocitos, comparando la tasa de crecimiento de la cepa Δplp1
enriquecida, con la cepa WT T3Bo. Partiendo de una parasitemia inicial de 0.5% se cultivaron ambas
cepas en ausencia de blasticidina, realizando cambios de medio de cultivo diariamente, al igual que
para el mantenimiento de rutina de los parásitos. El porcentaje de eritrocitos parasitados se estimó
diariamente durante 4 días mediante observación al microscopio óptico de extendidos teñidos con Diff
Quik (ThermoFisher Scientific). Las curvas de crecimiento se realizaron por triplicado y los análisis
estadísticos se realizaron mediante un test-T de Student donde p<0.05 fue considerado significativo.
Estos análisis se realizaron con el programa GraphPad Prism versión 5.01 para Windows (GraphPad
Software, San Diego California USA, www.graphpad.com).

58
4 RESULTADOS

4.1 IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN ESTRUCTURAL DE LA FAMILIA DE PROTEÍNAS TIPO

PERFORINA EN BABESIA SPP

4.1.1 Identificación de PLPs en los genomas disponibles de Babesia

El primer análisis comparativo sobre las proteínas PLPs en apicomplejos data de un trabajo del año
2010 (Kafsack y Carruthers, 2010) en donde los autores analizaron las proteínas del phylum y
definieron un motivo de aminoácidos conservado presente en todas ellas al que llamaron MACPFapi,
que presenta homología estructural con componentes del sistema de complemento y la perforina del
sistema inmune.

En este trabajo se buscó confirmar, y de ser necesario, actualizar la información ya que la cantidad de
especies de apicomplejos cuyos genomas fueron secuenciados y anotados aumentó significativamente
desde el momento en el que se definió el motivo MACPFapi hace 9 años. Mientras que en el trabajo de
Kafsack y Carruthers, 2010 se analizó una sola especie de los géneros Toxoplasma, Neospora,
Plasmodium, Theileria y Babesia, en el presente trabajo se pudieron analizar un total de 91 genomas
pertenecientes a 13 géneros del phylum Apicomplexa.

Utilizando el portal EuPathDB, que proporciona acceso a un conjunto de datos de escala genómica de
numerosos y diversos patógenos eucariotas, se realizó una búsqueda de todas aquellas proteínas de
organismos del phylum Apicomplexa que contuvieran el dominio MACPF (PF01823) característico de
las proteínas PLP y responsable de la formación del poro. Como resultado, se identificaron 349
proteínas con dicho dominio MACPF, representando todos los géneros del phylum cuyas especies
fueron secuenciadas, a excepción de Gregarina y Cryptosporidium.

A continuación, se realizó un alineamiento de las secuencias de aminoácidos de todas las proteínas

PLPs y se estimó la distancia evolutiva entre dichas secuencias calculando el promedio del número de
sustituciones aminoacídicas en cada posición, usando el modelo de corrección de Poisson. Se
determinó que hay una mayor similitud a nivel de los aminoácidos que comprenden el dominio MACPF
que respecto a la proteína completa. Por fuera de este dominio las proteínas presentan mayor
divergencia a nivel de su secuencia aminoacídica (distancia evolutiva de 1.45 para las proteínas
completa y 1.09 para el dominio MACPF aislado).

En base al alineamiento de todos los dominios del phylum se construyó un logo de secuencia donde se
muestra de forma gráfica la frecuencia de aminoácidos que aparecen en cada posición del motivo
MACPFapi. De esta manera se actualizó la secuencia consenso y se introdujeron modificaciones que se
 Resultados

limitan solamente a dos posiciones aminoacídicas respecto al patrón previamente definido por Kafsack
y Carruthers, 2010. Estos cambios se observaron en la posición 2, donde se acotó el número de
aminoácidos posibles a metionina (M), isoleucina (I) o leucina (L) y en la posición 8 donde se determinó
que además de fenilalanina (F) y tirosina (Y), también puede aparecer una histidina (H), aunque en
menor frecuencia (Figura 16).

Figura 16: Secuencia consenso correspondiente al motivo MACPFapi presente en el dominio formador de poro de
las PLPs de Apicomplexa. * indica las posiciones actualizadas con respecto al motivo previamente publicado por
Kafsack y Carruthers, 2010. La altura total de la pila indica la conservación de la secuencia en esa posición,
mientras que la altura de los símbolos dentro de la pila indica la frecuencia relativa de cada aminoácido en esa
posición.

Una vez identificado el motivo MACPFapi y luego de actualizada su secuencia consenso, se buscó
identificar los genes de la familia de proteínas tipo perforina en Babesia en todos los genomas
disponibles del género. Para ello se seleccionaron aquellos marcos abiertos de lectura (ORF por sus
siglas en inglés) que codificaran para proteínas conteniendo dicho motivo.

Para corroborar que los genes realmente codificaran para proteínas con la potencial capacidad de
formar poros, se analizó la secuencia de aminoácidos de los ORFs identificados verificando que,
además de poseer los 20 aminoácidos del motivo MACPFapi, todas contuvieran el dominio formador de
poro completo. La tabla 5 resume información relevante sobre las proteínas de la familia PLP
identificadas en este trabajo en las diferentes especies del género Babesia, cuyos nombres (PLP 1-8)
fueron asignados en base a la homología con las proteínas de Plasmodium sp., definidas previamente
(Kaiser et al., 2004).

Para las especies B. bovis, B. microti y B. ovata se encontraron seis ORFs que codifican para proteínas
de la familia PLP. Como se reportó previamente para otras PLPs (Kafsack y Carruthers, 2010), la
proteína PLP3 de B. bovis y B. microti contiene tres dominios MACPF dentro de un único ORF. Para B.
bigemina y B. divergens, se identificaron un total de ocho genes plp donde cada uno codifica para

60
 Resultados

proteínas con un único dominio MACPF. Por otro lado, en B. canis sólo se pudieron identificar tres
genes plp. Es posible que esta reducción en el número de genes plp con respecto a las otras especies
del género no sea real, sino que sea producto de problemas con la anotación o ensamblado del genoma
ya que el mismo se encuentra fragmentado en un alto número de scaffolds (Eichenberger et al., 2017).

En los casos de B. bovis, B. bigemina y B. divergens se pudieron analizar genomas de diferentes cepas
de cada especie (B. bovis: 2; B. bigemina: 4; B. divergens: 2). No se observaron diferencias en el número
de PLPs entre diferentes cepas, salvo en el caso de B. divergens donde en la cepa “Rouen” no se
encontró la proteína PLP8. Nuevamente este podría ser el caso de problemas en el ensamblado del
genoma ya que el de esta cepa está fragmentado en un total de 482 scaffolds, a diferencia del genoma
1802A donde el número de scaffolds es de 81, o de los genomas de las cepas de B. bovis y B. bigemina
en donde el número de scaffolds no supera los 46 (Jackson et al., 2014).

Tal como se observa en la tabla 5, en la mayoría de las PLPs identificadas se encontró una secuencia
de péptido señal, lo que sugiere que éstas son proteínas que ingresan a la vía de secreción del parásito.
Además, en la mayoría de las proteínas PLPs identificadas se encontró una o más secuencias
transmembrana, por lo que se espera que interactúen y se inserten en alguna membrana, apoyando
la hipótesis de que las proteínas identificadas son capaces de formar poros en membranas blanco.

POSICIÓN
PÉPTIDO DOMINIO
ESPECIE PLP LOCUS TAG AA EXONES CROMOSOMA DEL
SEÑAL TM
MACPF

PLP1 BBOV_IV001370 978 1 4 Si (1-25) 422-646 694-711

553-572;
PLP2 BBOV_II007150 752 1 2 - 518-744
615-638

247-423;
548-700; 763-784;
PLP3* BBOV_III000410 1272 17 3 Si (1-21)
1076- 837-854
B. bovis T2Bo 1255

PLP4 BBOV_II002020 420 7 2 Si (1-22) 183-371 282-301

142-162;
PLP5 BBOV_II001970 559 8 2 Si (1-21) 157-354
442-459

326-343;
PLP6 BBOV_III000320 512 6 3 - 99-294
479-512

788-808;
PLP1 BOVATA_036650 1057 1 N/A - 552-777
897-917

PLP2 BOVATA_023240 1004 1 N/A - 767-992 856-875

B. ovata Miyake PLP3 BOVATA_042350 424 3 N/A Si (1-21) 206-419 -

PLP4 BOVATA_032330 604 10 N/A Si (1-19) 178-396 -

PLP6 BOVATA_042230 536 6 N/A Si (1-20) 145-330 400-422

PLP8 BOVATA_042310 592 8 N/A - 353-575 186-210

PLP1 BBBOND_0402480 966 1 4 - 462-686 807-826

B. bigemina BOND
PLP2 BBBOND_0103080 1206 1 1 Si (1-21) 972-1197 934-953

61
 Resultados

PLP3 BBBOND_0301750 450 4 3 Si (1-21) 247-445 211-235

PLP4 BBBOND_0202000 696 9 2 Si (1-25) 181-399 -

247-268;
288-310;
PLP5 BBBOND_0201960 651 6 2 Si (1-15) 154-386
474-491;
599-615

PLP6 BBBOND_0301590 563 7 3 Si (1-25) 146-340 -

470-494;
PLP7 BBBOND_0301700 637 10 3 Si (1-24) 159-373
520-536

PLP8 BBBOND_0301690 386 6 3 - 129-351 -

PLP1 13880 894 2 N/A - 387-613 -

PLP2 14980 513 2 N/A - 269-494 -

PLP3 18170 460 4 N/A Si (1-21) 259-454 263-282

263-281;
PLP4 11150 660 11 N/A Si (1-29) 178-396
B. divergens 445-463;
1802A 480-498;
PLP5 11160 610 12 N/A Si (1-21) 152-366
593-610

PLP6 18050 562 7 N/A Si (1-23) 140-339 269-290

PLP7 18160 621 11 N/A Si (1-28) 172-377 541-562

PLP8 18150 364 6 N/A - 121-342 528-553

336-354;
PLP1 BMR1_02g00320 879 6 2 Si (1-21) 347-575 613-633;
706-722

PLP2 BMR1_01G03475_2 352 4 1 - 131-346 216-235

42-252;
B. microti RI PLP3* BmR1_04g09590 982 12 4 - 356-584; 835-853
751-970

PLP4 BMR1_01G02875 614 12 1 Si (1-21) 133-365 -

PLP5 BMR1_01G02876 357 4 1 Si (1-21) 121-336 -

PLP6 BmR1_04g09550 504 8 4 - 109-317 -

PLP1 Bc-CHIPZ-H003086 602 N/A Si (1-18) 420-598 -

B. canis BcH-CHIPZ PLP2 Bc-CHIPZ-H001240 371 N/A - 179-362 -

PLP3 Bc-CHIPZ-H001168 259 N/A - 123-241 -

Tabla 5: PLPs identificadas en las distintas especies y cepas de Babesia. N/A indica genes no asignados a
cromosomas ya que el genoma no está ensamblado a ese nivel.

4.1.2 Conservación de las secuencias de las proteínas tipo perforina

Una vez identificada la familia de proteínas tipo perforina en el género Babesia se evaluó el grado de
conservación de cada proteína entre las diferentes especies y, cuando fue posible, entre cepas de una
misma especie. Se alinearon las secuencias del dominio MACPF o la proteína completa y se
construyeron árboles filogenéticos utilizando el método de Máxima Similitud.

En la figura 17 se muestra el alineamiento del dominio MACPF de las 6 proteínas PLP de B. bovis donde
se puede observar, al igual que para las demás especies de Babesia, una baja conservación de los

62
 Resultados

aminoácidos entre las proteínas parálogas y una conservación algo mayor sólo en los aminoácidos que
comprenden el motivo MACPFapi (sombreado gris). De los 20 aminoácidos del motivo, sólo 7 se
mantienen idénticos en las PLPs de B. bovis.

Al realizar el mismo análisis con las demás especies, 6 de 20 aminoácidos del motivo MACPF api son
idénticos entre las PLPs de B. bigemina y B. microti, 7 de 20 son idénticos en B. divergens y B. ovata,
mientras que 8 de 20 lo son en B. canis (datos no mostrados).

Alineamiento de múltiples secuencias: Dominio funcional de las proteínas PLP de B. bovis

BboT2BPLP6 --------LLSASINSMADDK-PTSKHTVNYRIAKSFCAIRESGIMVPFTGKISSVFIKE 51
BboT2BPLP1 -------FSFSASAGYKNMVR-TLATNETKNYILKTYCLRYVAGIQDFLNIEPTESFVYD 52
BboT2BPLP2 -------FKFAASVNYNNIKK-AYDSKGVNTYVSRSYCFNFVAGIPMSIKWDTTQAFQAA 52
BboT2BPLP5 -------GSGALRAGYTDISG-KTQHISSKQYTNSYYCFTYAAGMPPYFNWETTSDFDIA 52
BboT2BPLP3.2 VSYERTVVDTKQKLKTIMLSSKSEGGSGI--FKSNHKTVNTRDDIYNKLK-KSRNVLVRK 57
BboT2BPLP3.1 -------------VNYVMQNKEIAGMEDI-----VKKHMNVTRA------------FENA 30
BboT2BPLP3.3 LSAEITVF--CWKLRCPSTESSKLEVKQG-----KRVCSAFKKS------------FQNA 41
BboT2BPLP4 -----VAF--SASAKYK-NASEKLAHK--------TERMDTTSS------------FMEA 32
:

BboT2BPLP6 VEALPSINEDYGPCT---PDVFIVDPLKSDCS--SMHQWVKFFKRYGTHMTSHITIGGQI 106

BboT2BPLP1 VSQLPEKFHDG-ECL---LEVYRNDPEDEKCAS-VVRPWMKFFQKYGTHFTTVIHLGGKV 107
BboT2BPLP2 LKGLPKTFQEEGNGLVCHPYDYLVHPRSQACKELGVTAWMQFFTVFGTHVTTKVYLGGKM 112
BboT2BPLP5 LNELPKEVKSFDQCT---V--ELYKKKSKKCG--SISKWVDFFLQFGTHVTTEIQLGGKI 105
BboT2BPLP3.2 YRLKECQGD-F-KVADCPTEKYVENMDDESCSG-CISSWMRFFADYGTHVTRRISMGGIF 114
BboT2BPLP3.1 TKEIESYPD-K-EKCDTQEK-YLSD---AECKN-YCELWKKFFMNYGTHVISRITMGGKI 83
BboT2BPLP3.3 TKELKPNFK-K-AATECTTIRYAINPEYPDCKE--VKPWMQLFEMFGTHFTYNIKIGGRL 97
BboT2BPLP4 MKSLEPLPD-T-VKKMCSAHDMIDDMTKSECIP--LKKWIKFFEMFGTHYVHQLLLGGKL 88
. . * * :* :*** : :** .

BboT2BPLP6 ISIDRMVEG---------EKITK------MVKTL-------GGGESIYKVTDKFSSVMTG 144

BboT2BPLP1 TNQIQIDKKDVAKLQKDGYNIDV------MIKSGSISPVKVGGGFSHE-KKEESSSNFSS 160
BboT2BPLP2 LTIIETKSSQEADLKKKGIDVKA------ELSVQAEV-ATVDASVNAS-TSSLHNRDTES 164
BboT2BPLP5 IRLLTIPNNAMDSFLKSGLNVDV------AVKAVISG-ALL--EVNEK----LNSEQ--- 149
BboT2BPLP3.2 RRFSNVSNRESKRDASKQK---T------TIKKSSSWFHLVKKKSKKT-KSSSSKVSSEG 164
BboT2BPLP3.1 LQMDEMENTANENAESNDKKHNI--SVNVGVLSGSFNLNNTNEKQQKE-KVKK------- 133
BboT2BPLP3.3 TKISQVNLNKKTNTNMNSVNAGATTQVRNELFGASAGVGL-SKGSTKD-NTEN------- 148
BboT2BPLP4 IQTLKINASKLQALKNDSIDVDL---VVSSVLGSSSASLLADKVVNKY-KLDE------- 137
:

BboT2BPLP6 KRESHQMLILGGYYFSGLESNDSKAFNRWSKSVWERPMPIRANFTSLE-HFMGD-KSKSY 202

BboT2BPLP1 LQTEKLVIVIGGDVPT--DGTDKTTMLEWTKSLYRKPMPIKVNIESIKTLIDGHEKKKSF 218
BboT2BPLP2 LDTKKSMFVIGGDIYG--DGNT-IVFNDWAATVPENSMPIKAEYTPLA-MIMGHEYMKAY 220
BboT2BPLP5 ---QK--------AIK--ELQD-DSLLKWKSTVPIFPMPIRTIYAPLD-MFIHSSYKEAY 194
BboT2BPLP3.2 KEHDLVQYTVGPEPHN--ESMAPDVFEDWVRDVALNPVPIDVEYQPLSEIMMENQAKNLY 222
BboT2BPLP3.1 --KNGKFFIMGGDTFI--PVDTPEGFRDWVDSIKENSMPINVELTPMSQFMPI-GIRRHY 188
BboT2BPLP3.3 -ISFTYVNVLGGRTIG--NVEDENEYLEWINSIPEHPMPIRNQLAPLAKLFDSEELKETY 205
BboT2BPLP4 -LGAKSITVIGGNMPN--TPITDAEYAIWGNSVAENPMPIGIVGDSLKNLMDK-NLRDSY 193
* : :** : : :

BboT2BPLP6 QHAVRFY 209

BboT2BPLP1 DTALKYY 225
BboT2BPLP2 NDAYLFY 227
BboT2BPLP5 RNALNFY 201
BboT2BPLP3.2 AKAIEYY 229
BboT2BPLP3.1 WFALKSY 195
BboT2BPLP3.3 DDAMEYY 212
BboT2BPLP4 SLAIHKY 200
* *

Figura 17: Alineamiento del dominio MACPF de las 6 proteínas PLP parálogas de B. bovis. En gris se señalan los
aminoácidos que corresponden al motivo MACPFapi.

63
 Resultados

Por otra parte, la figura 18 muestra el alineamiento del dominio MACPF de las PLP1 ortólogas en todas
las especies de Babesia analizadas en este trabajo. El análisis muestra una mayor conservación tanto
de los aminoácidos del motivo MACPFapi (11 de 20) como de los del dominio completo en comparación
al caso anterior, mostrando entonces una mayor conservación de aminoácidos del dominio entre
proteínas ortólogas que entre las parálogas en todas las especies del género y para todas las PLPs.

Figura 18: Alineamiento del dominio MACPF de la proteína PLP1 de las 6 especies de Babesia analizadas. En gris
se señalan los aminoácidos que corresponden al motivo MACPF api. Bmic: B. microti; Bbo: B. bovis; Bc: B. canis;
Bdiv: B. divergens; Bovata: B. ovata; Bbi: B. bigemina.

Para las especies B. bovis (n=2), B. bigemina (n=4) y B. divergens (n=2) se pudo analizar la variabilidad
intraespecífica ya que se contó con genomas de diferentes cepas de la misma especie. Se calculó la
distancia evolutiva entre las secuencias de un mismo gen (nucleótidos) o proteína (aminoácidos) entre
las diferentes cepas. El análisis determinó que cada PLP está altamente conservada entre cepas de
distinto origen geográfico y, en el caso de B. divergens, aisladas de distintos hospedadores, siendo
mayor la conservación a nivel de aminoácidos que de nucleótidos (Tabla 6). Para B. bovis y B. divergens,
cada proteína PLP mostró un 100% de identidad aminoacídica entre las cepas analizadas. Por otra
parte, si bien para B. bigemina se observaron mínimas diferencias para las 8 PLPs entre las cuatro cepas

64
 Resultados

analizadas, en todos los casos los cambios se produjeron entre aminoácidos de las mismas
características fisicoquímicas.

B. bovis (n=2) B. bigemina (n=4) B. divergens (n=2)

PLP NT AA NT AA NT AA
1 0.02 0 0.02 0.01 0 0
2 0 0 0.03 0.03 0 0
3 0.139 0 0.82 0.02 0 0
4 0 0 1.27 0.02 0 0
5 0 0 1.1 0.02 0 0
6 0 0 1.14 0.01 0.03 0
7 - - 1.04 0.01 0 0
8 - - 0.92 0.01 * *

Tabla 6: Distancia evolutiva entre las secuencias de nucleótidos (NT) y aminoácidos (AA) de cada PLP
perteneciente a distintas cepas de la misma especie. * el gen plp8 no está presente en la cepa B. divergens Rouen
por lo que no fue posible hacer la comparación.

Se construyó un árbol filogenético a partir de las secuencias de aminoácidos del dominio MACPF de las
proteínas del género Babesia ya que es la región que presenta mayor homología entre proteínas. Tal
cómo se mostró en el alineamiento de la figura 18 para PLP1, se pudo observar que las 8 PLPs de
Babesia mantienen una mayor homología entre proteínas ortólogas que entre parálogas (Figura 19).
En este árbol también se observa que el primer dominio MACPF de la proteína PLP3 de B. bovis,
designado como PLP3.1, agrupa con la proteína PLP3 de las otras babesias, mientras que el segundo y
tercer dominio (PLP3.2 y PLP3.3 respectivamente) agrupan con las proteínas PLP7 y PLP8 de las
especies restantes. La especie B. microti fue excluida en este análisis ya que pertenece a los
arqueopiroplásmidos y está filogenéticamente más relacionada con el género Theileria que con las
demás especies de Babesia (Figura 2).

65
 Resultados

Figura 19: Árbol filogenético construido con la secuencia aminoacídica de los dominios MACPF de las diferentes
PLPs de Babesia spp. B. bovis (Bbo; n=6), B. bigemina (Bbi; n=8), B. divergens (Bdiv; n=8), B. ovata (Bovata; n=6)
y B. canis (Bca; n=3), inferido por el método de Máxima Similitud habiendo realizado 1000 pseudoréplicas (los
valores de bootrstap se indican al lado de cada rama). La proteína PLP1 de Toxoplasma gondii (TgPLP1 RH) fue
incluida como grupo externo.

66
 Resultados

4.1.3 Ortología y sintenia de la familia de proteínas tipo perforina

Para continuar con la caracterización de las PLPs, se evaluó la ortología y la sintenia en toda la familia
de genes. En primer lugar, se analizó la ortología asignando cada una de las PLPs del género Babesia a
los grupos de ortología que se encuentran definidos en la base de datos OrthoMCL como conjuntos de
genes que han descendido de un ancestro común único dentro de un rango taxonómico de interés.
Según OrthoMCL, las 37 proteínas de Babesia analizadas fueron asignadas a 5 grupos de ortología
diferentes (Figura 20).

Figura 20: Grupos de ortología (OG) a los que fueron asignadas las PLPs de Babesia. En el grupo OG5_134280
también se encuentran proteínas PLP de otros géneros del phylum Apicomplexa. Bbo: B. bovis; Bbi: B. bigemina;
Bdiv: B. divergens; Bov: B. ovata; Bmi: B. microti; Bca: B. canis.

El grupo OG5_134280 contiene un total de 28 secuencias entre las que se encuentran las proteínas
PLP1 y PLP2 de todas las especies de Babesia analizadas. A este grupo pertenecen también algunas
proteínas tipo perforina ya caracterizadas funcionalmente, entre las que se destacan PLP1 y PLP3 de
Plasmodium y PLP1 de Toxoplasma gondii. Los cuatro grupos de ortología restantes sólo contienen
proteínas de Babesia y Theileria (dato no mostrado) aún no caracterizadas.

Por otra parte, para determinar si existe conservación en la estructura cromosómica de la región donde
se localizan los genes plp, se analizó la sintenia de cada uno de ellos utilizando el portal PiroplasmaDB.
Con la información disponible, se pudo comparar la sintenia entre las especies B. microti, B. bovis, B.

67
 Resultados

bigemina, B. divergens y B. ovata ya que son las especies cuyos genomas se encuentran depositados
en esta base de datos hasta la fecha (versión PiroplasmaDB 45; 5 Septiembre 2019).

La figura 21 muestra alineamientos de las regiones genómicas de las diferentes especies donde se
encuentra el gen PLP1 (delimitado entre líneas punteadas) y los genes circundantes al mismo. Los
alineamientos de los demás genes plp se muestran en las figuras suplementarias 1 a 5 (Anexo I).

Figura 21: Análisis de la sintenia del gen plp1 entre las especies B. bovis (bbovT2Bo), B. bigemina (bbigBOND), B.
divergens (bdiv1802A), B. microti (bmicRI), B. ovata (bovaMiyake). Se muestra la región del contig en la que
aparece cada gen plp (recuadro de líneas punteadas). En sombreado se señalan los genes ortólogos entre las
diferentes especies.

Los resultados muestran que los genes plp1, plp2, plp4, plp5 y plp6 son sinténicos en las especies de
Babesia analizadas, donde tanto la identidad cómo la distribución de los genes circundantes está
altamente conservada dentro del género. La mayoría de estos genes circundantes codifican para
proteínas hipotéticas conservadas de función desconocida o para proteínas de membrana. Dentro de
las proteínas con función conocida, no se destaca ningún patrón que permita agruparlas.

Ocasionalmente se observó la aparición de algún otro gen en esa región cromosómica y las mayores
diferencias se encontraron en la especie B. microti, que como se mencionó anteriormente, es la
especie filogenéticamente más alejada del género y cuyo genoma nuclear es el más pequeño entre

68
 Resultados

todos los parásitos apicomplejos secuenciados hasta la fecha (Cornillot et al., 2012). En el caso del gen
plp5, el mismo no está presente en B. ovata (figura suplementaria 4). Cabe destacar que los genes
adyacentes a plp5 están mucho menos conservados entre las especies analizadas que los genes
adyacentes a los demás plp.

En B. bovis y B. microti el gen plp3 codifica para una proteína que contiene tres dominios MACPF,
nombrados PLP3.1, PLP3.2 y PLP3.3. En los análisis filogenéticos mostrados anteriormente (Figura 19)
se observa que el dominio PLP3.1 es homólogo al dominio MACPF de la proteína PLP3 de B. bigemina,
B. divergens y B. ovata mientras que los dominios PLP3.2 y PLP3.3 son homólogos al de las proteínas
PLP7 y PLP8 respectivamente. Al analizar la región cromosómica donde se encuentran dichos genes,
se ve que plp3, plp7 y plp8 son adyacentes y que los genes circundantes a ellos son sinténicos en todas
las especies analizadas.

4.1.4 Predicción de la estructura terciaria de las proteínas tipo perforina de Babesia

Para profundizar el análisis de las PLPs se realizó una predicción de la estructura terciaria de las
proteínas para evaluar si su estructura tridimensional se conserva con las demás proteínas formadoras
de poros ya descriptas y en base a eso predecir con mayor certeza su función.

En primer lugar, para todas las PLPs se observa en la estructura secundaria (Figura 22A) la alternancia
entre hélices α y láminas β en la zona que corresponde al dominio MACPF de la proteína (recuadro
naranja) y la zona rica en láminas β hacia el extremo C-terminal que corresponde al dominio APC- β
(recuadro celeste). Además, el alineamiento de aminoácidos entre la proteína en estudio y todas
aquellas proteínas depositadas en el PFAM muestra que para todas las PLPs de Babesia analizadas, los
mejores alineamientos se dieron con proteínas que tienen capacidad de formar poros en membranas,
entre las que se destacan la proteína PLP1 de T. gondii (PDB ID: 5OUP; 5OWN), la perforina de linfocitos
T (3NSJ) y las proteínas de ataque a membrana del sistema del complemento (2RD7; 3T5O) (datos no
mostrados).

Se modeló el plegamiento y la estructura tridimensional de las PLPs mediante I-TASSER tanto para la
proteína completa como para los dominios MACPF y APC-β aislados (Figuras 22 y 23). Sólo se muestran
los resultados de PLP1 de B. bovis ya que para las demás PLPs del género Babesia se obtuvieron
resultados muy similares. Para todas las proteínas analizadas se observó que la predicción de la
topología global de la estructura fue buena, con un coeficiente C>-1.5 que indica una topología global
correcta del modelado. Se obtuvieron modelos con mejores coeficientes cuando se analizaron los
dominios MACPF y APC-β aislados que cuando se analizó la proteína completa. Esto va en concordancia
con la observación de que estos dominios corresponden a las regiones más conservadas de estas

69
 Resultados

proteínas y que por fuera de este la variabilidad aumenta. La estructura tridimensional predicha
muestra para los dominios MACPF de todas las PLPs de Babesia todos los elementos esenciales para la
formación de poros: las cuatro cadenas antiparalelas (β1-4, amarillo) que forman la hoja plegada β y
los dos grupos de α-hélices (CH1 y CH2, rosa) característicos del dominio (Figura 22B).

Una vez predicha la estructura tridimensional de la proteína, se la comparó con la de otras proteínas
depositadas en la base de datos PDB. La figura 22C muestra una muy buena superposición de la
proteína BboPLP1 (colores) con la proteína de la base de datos con mayor similitud en su estructura
(violeta). A juzgar por el TM-score, que calcula la similitud entre dos estructuras proteicas tomando un
valor TM=1 cuando hay una coincidencia perfecta entre ambas, la estructura tridimensional está
altamente conservada entre la proteína PLP y otras proteínas formadoras de poro. En este caso la
proteína más cercana al dominio MACPF de BboPLP1 fue la perforina de linfocitos T (PDB: 3nsj) con un
valor de TM de 0.811, mientras que la proteína PLP1 completa resulto más cercana a la proteína C6
del sistema de complemento humano (PDB: 3t5o) con un valor de TM de 0.756. Esta similitud
estructural apoya la hipótesis de que las PLPs en estos parásitos podrían cumplir alguna función
relacionada con la formación de poros en membranas.

Por otra parte, se analizó la presencia del dominio APC-β en el extremo C-terminal de las PLPs de
Babesia. Se pudo observar que la estructura primaria de este dominio está conservada dentro del
género y presenta tres repeticiones directas con 4 cisteínas altamente conservadas en cada repetición
(Figura 23A). Cuando se realizó el modelado de la estructura terciaria de este dominio aislado de la
proteína PLP1 de B. bovis, se observó un único dominio globular que se superpone con un muy alto
grado de coincidencia (TM=0.968) con la estructura del dominio APC-β de la proteína TgPLP1 obtenido
mediante cristalografía de rayos X (Figura 23B). La figura 23C muestra la posición de las cisteínas en la
estructura predicha, donde se pude observar que se encuentran enfrentadas en posiciones que
favorecen la formación de puentes disulfuro. De acuerdo con esta estructura conservada, el dominio
APC-β de BboPLP1 también tendría láminas β antiparalelas estabilizadas por puentes disulfuro entre
las cisteínas altamente conservadas en cada una de las repeticiones en tándem del dominio.
Adicionalmente, a la estructura modelada para APC- β, el programa le atribuye un posible sitio de
unión a Ca2+ mediado por los aminoácidos G202 y E204 que podría ser relevante para la función
biológica de la proteína.

70
 Resultados

Figura 22: Análisis de la estructura de la proteína PLP1 de B. bovis (BboPLP1). A. Estructura secundaria (arriba) y
predicción de la hidrofobicidad según Kyte & Doolittle (abajo) de la proteína PLP1. El recuadro naranja
corresponde al dominio MACPF donde se destaca la alternancia entre α-hélices (rojo) y hojas plegadas β (verde).
El recuadro celeste corresponde al dominio APC-β rico en hojas plegadas β y de alta hidrofobicidad. B. Estructura
tridimensional modelada para el dominio MACPF (izq.) y para la proteína completa (der.). Valores de C>-1,5
indican una buena topología global del modelado. En la estructura del dominio se destacan los dos grupos de α-
hélices (CH1 y CH2) que rodean las cadenas antiparalelas que forman la hoja plegada β. C. Superposición entre
el modelado (colores) del dominio MACPF (izq.) o la proteína BboPLP1 completa (der.) y la proteína más cercana
estructuralmente (línea violeta). 3nsj: perforina de linfocitos; 3t5o: proteína C6 del sistema de complemento
humano.

71
 Resultados

Figura 23: Análisis de la estructura del dominio APC-β de la proteína PLP1 de B. bovis. A. Esquema de los
dominios de BboPLP1. El rectángulo rojo corresponde al péptido señal. El dominio APC-β contiene tres
repeticiones directas ricas en hojas β representadas por las flechas. La secuencia consenso generada a partir de
todas las PLPs de Babesia muestra la conservación de los cuatro residuos cisteína. B. Izq. Estructura

72
 Resultados

tridimensional modelada para el dominio APC-β de B. bovis. Der. Vista frontal de la superposición entre este
modelado (colores) y el dominio APC-β de la proteína TgPLP1 (línea violeta). C. Izq. Vista inferior de la
superposición mostrada en B y detalle de la posición de los cuatro residuos cisteína de cada una de las
repeticiones del dominio APC-β (círculos punteados) y los puentes disulfuro que se forman entre ellas.

“Los estudios comparativos in silico de la estructura secundaria y terciaria de las PLPs de Babesia
sugieren una conservación de función con proteínas formadoras de poro tanto de organismos
relacionados como de organismos más distantes. Se necesitan estudios funcionales para determinar
fehacientemente la capacidad de estas proteínas de generar poros en las membranas y comprender
su rol en la interacción patógeno-hospedador.”

73
 Resultados

4.2 CARACTERIZACIÓN FUNCIONAL DE LAS PROTEÍNAS TIPO PERFORINA DE B. BOVIS

4.2.1 Análisis de la transcripción de genes plp de B. bovis

El análisis de la expresión y la posterior caracterización funcional de las proteínas tipo perforina en

este trabajo se limitó a las proteínas de la especie Babesia bovis ya que, como se comentó
anteriormente, es la especie más virulenta del género y la que causa un cuadro clínico con
consecuencias más severas en los animales.

Para evaluar la transcripción de los genes plp de B. bovis se realizó un análisis de dos sets de datos de
transcriptómica generados mediante RNASeq por otros grupos de investigación (Pedroni et al., 2013 y
datos no publicados del Dr. Massaro Ueti, USDA-ADRU y Washington State University, EE. UU.).

Para analizar diferencias en la transcripción de los genes entre las condiciones analizadas se tomó
como criterio la ecuación |log2 (Fold Change)| ≥ 1 lo que significa que se considera diferente la
transcripción de aquellos genes que muestran el doble (o la mitad) de transcriptos en una condición
respecto de la otra.

En primer lugar, se analizaron datos de secuenciación de ARN de la cepa T3Bo de B. bovis de los
estadios de merozoíto, presente en el hospedador bovino, y kineto, presente en la garrapata. El análisis
de los genes plp muestra que todos se transcriben durante alguna etapa del ciclo de vida del parásito
y además plp1, plp2 y plp5 tienen una transcripción diferencial entre los dos estadios analizados (Figura
24A). Más específicamente, en el estadio de merozoíto el gen plp1 muestra los mayores niveles de
transcripción, seguido por plp5, mientras que en el estadio de kineto los otros cuatro genes son
mayormente transcriptos, siendo plp2 el más abundante.

Por otra parte, se analizaron también datos de transcriptómica mediante RNASeq (Pedroni et al., 2013)
de una cepa argentina de B. bovis virulenta (L17) y su variante atenuada que fue generada por pasajes
seriados en bovinos esplenectomizados. El análisis de la transcripción de los genes plp mostró, al igual
que los datos anteriores, que plp1 es el gen de la familia con mayor nivel de transcripción en el estadio
de merozoíto (Figura 24B). Además, se puede observar que el patrón de transcripción de plp1 entre
ambas cepas es variable y asociado al fenotipo ya que se observan 1,8 veces más transcriptos en la
cepa virulenta que en la atenuada.

74
 Resultados

Figura 24: Número de lecturas obtenidas para los transcriptos de cada uno de los genes plp mediante
secuenciación de ARN en los estadios de merozoíto y kineto de la cepa T3Bo (A) o en el estadio intraeritrocítico
de la cepa virulenta L17 y su variante atenuada (B). Se muestra también el valor obtenido para el gen de actina
y la fructosa -1,6- bifosfato aldolasa, que se expresan constitutivamente. * denota diferencias significativas en la
transcripción, según el criterio |log2 (Fold Change)| ≥ 1.

75
 Resultados

4.2.2 Caracterización funcional de BboPLP1 recombinante

Teniendo en cuenta todos los análisis realizados anteriormente se seleccionó la proteína PLP1 de B.
bovis para avanzar con su caracterización funcional y determinar su implicancia en la progresión del
ciclo celular del parásito. Esta selección se basó en distintas evidencias. Por un lado, PLP1 pertenece al
grupo de ortología OG5_134280 (Figura 20) que también contiene PLPs de Plasmodium y Toxoplasma
previamente caracterizadas y las cuales han demostrado ser esenciales para la virulencia de estos
patógenos. Por otro, dado que el único estadio que replica en el bovino es el merozoíto y por lo tanto
está asociado a los signos clínicos de la enfermedad, resultó interesante seleccionar para caracterizar
una proteína que actuara en este estadio. En este sentido, el gen plp1 no sólo mostró una transcripción
estadio- específica siendo significativamente mayor en el merozoíto, sino que también es el gen que
más se transcribe en dicho estadio incluso en cepas aisladas de lugares geográficamente muy distantes
(Figura 24A cepa T3Bo, EE. UU.; Figura 24B cepa L17; Argentina). Adicionalmente, la predicción de la
estructura terciaria mostró que PLP1 presenta una estructura global con un alto grado de similitud con
otras proteínas formadoras de poros en membranas (Figura 22). Por todo lo mencionado, se prosiguió
con la caracterización funcional solamente de la proteína PLP1 de B. bovis.

4.2.2.1 Obtención de PLP1_MACPF recombinante

Para comenzar con el análisis funcional de la proteína PLP1 y determinar su acción hemolítica, se clonó
el gen plp1 completo para su expresión en un sistema procariota.

A pesar de los numerosos protocolos evaluados para obtener la proteína recombinante que
incluyeron diferentes combinaciones de vectores de expresión, cepas bacterianas y protocolos de
inducción (Tabla 7), en ninguno de los casos fue posible la expresión de la proteína. Posiblemente tanto
el tamaño de la proteína (108 kDa) como el hecho de que contiene numerosos residuos cisteína y
dominios transmembrana de alta hidrofobicidad en el extremo C-terminal (Figura 22) dificultaron su
expresión en los vectores procariotas evaluados.

PLÁSMIDOS CEPAS BACTERIANAS INDUCTORES TEMPERATURA/TIEMPO

DE INDUCCIÓN
pET28 BL21 IPTG (0.01, 0.1 y 1 mM) 37°C (1, 2 y 4hs)
pDEST17 BL21-AI Arabinosa (0.02, 0.2 y 2%) 28°C (4 y 16 hs)
Rosetta (DE3) 16 °C (16 hs)
4 °C (16 y 24 hs)
Tabla 7: Listado de los diferentes plásmidos, cepas bacterianas, inductores y condiciones de inducción que fueron
evaluados para la expresión de la proteína BboPLP1 completa recombinante.

76
 Resultados

Dado que varios estudios previos en distintas PLPs de Plasmodium (Deligianni et al., 2018, 2013; Garg
et al., 2013; Ishino et al., 2005; Wirth et al., 2014) demostraron que el dominio funcional de las
proteínas PLP (dominio MACPF) es suficiente para generar daño en las membranas y que antisueros
generados contra el dominio MACPF son capaces de reconocer la proteína completa, se decidió
expresar en E. coli el dominio funcional de la proteína BboPLP1 el cual posee un tamaño de 39.5 kDa.

La expresión del dominio se realizó en el sistema bacteriano TOPO-Gateway. Una vez obtenido el
plásmido de expresión denominado pDEST17+PLP1_MACPF, se lo secuenció para confirmar la
identidad del inserto y que la secuencia aminoacídica de la proteína codificada estuviera en marco con
la cola de poli-histidinas (6x-His tag) presente en el vector. Una vez confirmado este punto se procedió
a realizar un primer ensayo de inducción en condiciones estándar de expresión (bacterias cepa BL21-
AI, 37 °C, 0.2% arabinosa, 4hs). El análisis por SDS-PAGE mostró la expresión de la proteína
recombinante luego de la inducción en estas condiciones y este resultado fue corroborado también
mediante un Western blot utilizando un anticuerpo anti-Histidina (Figura 25A). La proteína
recombinante PLP1_MACPF presentó un tamaño de 42,4 kDa, similar a la predicción realizada usando
la herramienta Protein Molecular Weight (www.bioinformatics.org/sms/prot_mw.html) teniendo en
cuenta los aminoácidos que comprenden el dominio MACPF clonado (aproximadamente un tercio de
la proteína PLP1 completa) y los aminoácidos que aporta el plásmido de expresión. En la condición
ensayada para la inducción de la expresión con este sistema, la proteína PLP1_MACPF se agrega en la
bacteria formando cuerpos de inclusión (Figura 25B).

Figura 25: Expresión de la proteína recombinante PLP1_MACPF. A. SDS-PAGE teñido con Coomassie blue (izq.) y
Western Blot de las mismas alícuotas usando un anticuerpo anti-Histidina (der.) de las muestras: 1, cultivo sin
inducir; 2, cultivo clon α inducido; 3, cultivo clon β inducido; 4, proteína control rSAG1 con 6x-His tag; M,
marcador de peso molecular. B. SDS-PAGE teñido con Coomassie blue del lisado bacteriano y fracciones solubles
e insolubles (cuerpos de inclusión) de la proteína inducida en condiciones estándar: 1, cultivo clon α inducido; 2,
cuerpos de inclusión; 3, fracción soluble.

77
 Resultados

Para la producción de antisueros policlonales en ratones se purificó la proteína rPLP1_MACPF en

condiciones desnaturalizantes a partir de los cuerpos de inclusión utilizando urea y cromatografía de
afinidad con resina de níquel. La proteína fue eluida de la resina usando concentraciones crecientes
de imidazol y las diferentes fracciones fueron analizadas por SDS-PAGE (Figura 26A). Aquellas
fracciones que presentaban buena cantidad de proteína purificada (fracciones 7 a 9) fueron analizadas
de forma individual en geles de poliacrilamida preparativos. La banda correspondiente al tamaño de
42,4 kDa fue electroeluida y luego de la diálisis para eliminar la urea utilizada para su purificación, las
diferentes fracciones fueron cuantificadas por espectrofotometría. Se obtuvieron concentraciones de
280 µg/ml (fracción 7), 233 µg/ml (fracción 8) y 107 µg/ml (fracción 9), cantidades que resultaron
adecuadas para los ensayos de inmunización de ratones.

Para la inmunización se usó un esquema de cuatro inoculaciones de 30 µg de proteína por ratón con
su correspondiente adyuvante, separadas entre sí por 14 días. Se extrajo sangre para la obtención de
suero antes de las inmunizaciones (suero pre-inmune) y a los 14 días posteriores a la última
inmunización se realizó la sangría a blanco para obtener el suero hiperinmune.

Los ensayos de Western blot enfrentando a la proteína recombinante PLP1_MACPF con diferentes
diluciones de un pool de los sueros murinos (n=5) obtenidos tras la inmunización permitió verificar que
lo sueros son capaces de reconocer a la proteína recombinante, así como a una proteína de menor
tamaño (Figura 26B). Como es esperable, la intensidad de la señal decrece a medida que la dilución del
antisuero específico aumenta.

Figura 26: A. SDS-PAGE de las diferentes fracciones obtenidas en la purificación de la proteína recombinante
PLP1_MACPF mediante cromatografía de afinidad con resina de níquel. 1, cultivo sin inducir; 2, cultivo inducido;
3, percolado; 4-5, lavados; 6-8, eluciones con 250 mM de imidazol; 9-11, eluciones con 500 mM de imidazol; 12-
13, eluciones con 1M de imidazol; 14, resina post-elución. B. Western blot de la proteína recombinante

78
 Resultados

PLP1_MACPF enfrentada a diferentes diluciones de pooles de sueros de ratón inmunizados. 1, sueros pre-
inmunes; 2, dilución 1/50; 3, dilución 1/100; 4, dilución 1/200; 5, dilución 1/400; 6, control positivo con
anticuerpo anti-Histidina.

En paralelo a estos ensayos, se trabajó en la evaluación de diferentes protocolos de inducción que

permitieran obtener la proteína rPLP1_MACPF de manera soluble ya que para realizar los ensayos
funcionales es necesario obtener la proteína en estado nativo. La estrategia consistió en disminuir la
tasa de producción de la proteína en las bacterias, para dar tiempo a que la proteína se pliegue de
manera correcta y así evitar su agregado formando cuerpos de inclusión insolubles. Para lograr esto,
se probaron protocolos de inducción a menor temperatura y también con menores concentraciones
de inductor, en este caso arabinosa.

En todas las condiciones ensayadas se observó la expresión de la proteína (Figura 27A) a excepción de
la inducción a 4 °C, donde el crecimiento bacteriano fue bajo y la expresión de la proteína fue mínima
(datos no mostrados). Al analizar si en estas nuevas condiciones la expresión generó que rPLP1_MACPF
se encuentre en la fracción soluble, se pudo observar que, si bien la mayor parte de la proteína se sigue
acumulando en cuerpos de inclusión, se detecta una porción minoritaria en la fracción soluble (Figura
27A).

En base a este resultado, se determinó que la condición óptima para expresar la proteína en forma
soluble fue una incubación de 16 hs a 16 °C utilizando 0.1% de arabinosa. Con estos parámetros se
indujeron cultivos bacterianos de mayor volumen (50 ml) y se purificó la proteína en condiciones
nativas utilizando una cromatografía de afinidad con una resina de níquel usando el protocolo
descripto en el Anexo II, sección 9.17. La proteína rPLP1_MACPF fue obtenida en la segunda fracción
eluida con 250 mM de imidazol (Figura 27B), la cual fue dializada para eliminar los restos de sales y
detergentes presentes en el buffer de elución ya que estas podrían afectar los ensayos de hemólisis
subsiguientes. Finalmente, la proteína rPLP1_MACPF fue cuantificada mediante espectrofotometría,
arrojando un resultado de 93,75 µg/ml de proteína.

79
 Resultados

Figura 27: A. Análisis por SDS-PAGE de las distintas condiciones de expresión de la proteína recombinante
PLP1_MACPF para su obtención en forma soluble; NS, fracción no soluble que corresponde a los cuerpos de
inclusión; S, fracción soluble. B. Análisis por SDS-PAGE de diferentes fracciones obtenidas en la purificación de la
proteína recombinante PLP1_MACPF mediante una cromatografía de afinidad con resina de níquel; R, resina; P,
percolado; L1 y L2, lavados; E1 y E2, eluciones con 250 mM de imidazol; E3 y E4, eluciones con 500 mM de
imidazol; E5 y E6, eluciones con 1M de imidazol.

4.2.3 Análisis de la expresión de PLP1 en B. bovis

Con el objetivo de evaluar si la proteína PLP1 es expresada por los merozoítos de B. bovis durante su
estadio intraeritrocítico y de ser así, si esta proteína es expuesta al sistema inmune bovino durante la
infección, se analizaron por Western blot sueros de bovinos naturalmente infectados con B. bovis que
fueron diagnosticados como serológicamente positivos a esta especie por ELISA indirecto (Jaramillo
Ortiz et al., 2018).

Los resultados mostraron que los sueros bovinos son capaces de reconocer específicamente a la
proteína rPLP1_MACPF confirmando los datos de transcriptómica en cuanto a que la proteína se
expresa en los merozoítos. Además, estos datos demuestran que el dominio MACPF contiene epítopes
B inmunodominantes que son capaces de despertar una respuesta inmune de anticuerpos al ser
expuestos al sistema inmune bovino durante la infección (Figura 28A).

Por otro lado, para sumar evidencia de la expresión de la proteína PLP1 en los merozoítos y de la
presencia de epítopes B en el dominio MACPF de PLP1, se analizó por Western blot la reactividad de
los sueros anti rPLP1_MACPF generados en ratones frente a un lisado de merozoítos de B. bovis. En
este caso se esperaría obtener una banda correspondiente a una proteína de aproximadamente 108
kDa, lo que corresponde a la proteína PLP1 completa. De acuerdo con esta hipótesis, se observa en la
figura 28B una banda reactiva tenue de aproximadamente 110 kDa que sólo pudo ser visualizada al

80
 Resultados

revelar el Western blot usando un método quimioluminiscente de mayor sensibilidad que los métodos
colorimétricos (Figura 28B línea 5).

En conjunto, estos ensayos demuestran que la proteína PLP1 de B. bovis está presente en los
merozoítos y que en su dominio MACPF posee epítopes B inmunodominantes que son expuestos al
sistema inmune del bovino durante la infección y que son capaces de despertar una respuesta de
anticuerpos.

Figura 28: A. Western blot de la proteína rPLP1_MACPF: 1, sueros de bovino no infectado; 2, pool de 5 sueros de
bovinos naturalmente infectados con B. bovis confirmados por serología (1/25); 3, ídem 2 (1/50); 4, pool de
sueros de ratones inoculados con rPLP1_MACPF (1/200); 5, anticuerpo anti-Histidina; M, marcador de peso
molecular. En todos los casos se usó un método colorimétrico para el revelado. B. Western blot de un lisado de
merozoítos de B. bovis: 1, pool de sueros de ratones pre-inmunes; 2, pool de sueros de ratón anti-rPLP1_MACPF
(1/20); 3, pool de sueros de ratón anti-rPLP1_MACPF (1/50); 4, pool de sueros de ratón anti-rRAP1 (1/200); M,
marcador de peso molecular; 5, pool de sueros de ratón anti-rPLP1_MACPF (1/20). En las líneas 1-4 se utilizó un
sustrato colorimétrico (NBT/BCIP) para la enzima fosfatasa alcalina conjugada al anticuerpo secundario mientras
que en la línea 5 se empleó un método quimioluminiscente (ECL) para el revelado de la actividad peroxidasa.

81
 Resultados

4.2.4 Ensayos de hemólisis

Con el fin de analizar si, al igual que sus ortólogos en Toxoplasma y Plasmodium, el dominio MACPF de
B. bovis es capaz de generar daño en la membrana de los eritrocitos, se llevaron a cabo ensayos de
hemólisis in vitro.

Para ello, se incubaron eritrocitos bovinos frescos provenientes de un animal sano con una cantidad
constante de proteína rPLP1_MACPF y luego de 30 minutos de incubación, se midió la absorbancia a
405 nm. Esta medición permite estimar de manera directa la cantidad de hemoglobina liberada al
medio como producto de la lisis de los eritrocitos (Figura 29A). Como control negativo del experimento,
los eritrocitos fueron incubados sin el agregado de ningún otro agente (Figura 29A, SER), y además,
para determinar que el efecto hemolítico observado se debe a la proteína de interés y no a otros
factores, se realizaron réplicas con la proteína recombinante SAG1 de Neospora caninum que carece
de actividad hemolítica y que fue expresada, purificada y dializada en las mismas condiciones que
PLP1_MACPF (Figura 29A, rSAG). Los valores de absorbancia de este ensayo se relativizaron a la
hemólisis generada por una solución de Tritón X-100 1%, un detergente no iónico que aumenta la
permeabilidad de la membrana de la célula generando una lisis osmótica, al que se le atribuyó un valor
de lisis de 100% (Bielawski, 1990). Con este ensayo se pudo determinar que la proteína rPLP1_MACPF
es capaz de generar lisis en las membranas de los eritrocitos y que en la concentración de 100 nM
alcanza niveles de lisis del 90%, similares a los obtenidos con el Tritón X-100 1% (Figura 29A).

Luego, se evaluó si el efecto lítico observado estaba relacionado con la concentración de la proteína
rPLP1_MACPF. Para esto se realizó una curva de dosis-respuesta con concentraciones de proteína en
un rango de 30 a 250 nM (Figura 29B). En este caso se observa que a concentraciones menores a 75
nM los valores de hemólisis están por debajo del 10% mientras que al superar esta concentración se
produce un aumento abrupto de la hemólisis, alcanzando valores de más de un 90% luego de superar
la concentración de 90 nM de proteína. La curva obtenida tiene una forma sigmoidea reflejando una
respuesta de tipo cooperativo-positiva, demostrando que es necesario alcanzar determinado umbral
de concentración para que la proteína presente actividad lítica.

Para completar la caracterización de la proteína recombinante, se realizaron ensayos de hemólisis a

diferentes pH y concentraciones de Ca2+, dado que estudios recientes reportaron que el egreso de B.
bovis de los eritrocitos es dependiente de Ca2+ (Mossaad et al., 2015). Por otra parte, estudios
realizados sobre las PLP de Toxoplasma y Plasmodium mostraron su capacidad hemolítica sólo en
presencia de Ca2+ (Garg et al., 2013; Roiko et al., 2014; Roiko y Carruthers, 2013).

En cuanto a la relación entre pH y actividad hemolítica, los experimentos mostraron altos niveles de
hemólisis (> 90%) en el rango de pH 5.5 a 9. Esto demuestra que la proteína rPLP1_MACPF es activa en

82
 Resultados

un rango de pH amplio y que es funcional al pH≈7 presente tanto dentro del eritrocito como en el
plasma (Figura 29C). Con respecto a la concentración de Ca2+, se observa que a pesar de que el punto
con mayor actividad es a una concentración de Ca2+ de alrededor de 0.5 mM, no hay grandes
diferencias en la hemólisis en presencia o ausencia de este ion (Figura 29D).

Figura 29: Actividad hemolítica de la proteína recombinante PLP1_MACPF. Ensayos de hemólisis usando una
concentración constante de 100 nM de PLP1_MACPF (A), a diferentes concentraciones de rPLP1_MACPF (B) y en
diferentes pH (C) y concentraciones de Ca2+ (D). Los valores se relativizaron a la lisis generada por tritón X-100
1% al que se le atribuye un valor de lisis de 100%. SRE: eritrocitos en Solución de Resuspensión de Eritrocitos, sin
el agregado de otros agentes. rSAG: proteína no relacionada de N. caninum usada como control negativo. *p <
0.001 con un ANOVA de un factor seguido de un test de Dunnett.

83
 Resultados

4.3 CARACTERIZACIÓN DE UNA CEPA DE B. BOVIS MODIFICADA GENÉTICAMENTE PARA EL GEN

PLP1

Para completar la caracterización funcional del gen plp1 en B. bovis se generaron parásitos knock out
(KO) por deleción de dicho gen en la cepa T3Bo. La generación de parásitos KO en Babesia se realiza a
través de una doble recombinación homóloga entre un plásmido incorporado por electroporación y el
gen nuclear del parásito.

4.3.1 Generación de una cepa de B. bovis knock out para el gen plp1

Para la obtención de la línea mutante se transfectaron mediante electroporación parásitos de la cepa

T3Bo con el plásmido pBbo∆plp1 construido según lo descripto en la sección 3.3.1.2 de Mat. y Mét..
Este plásmido contiene las regiones 5’ y 3’ UTR del gen plp1 y fue diseñado para interrumpir la
estructura de dicho gen por inserción del doble marcador de selección egfp-bsd en el genoma de B.
bovis mediante doble recombinación homóloga. La figura 30 muestra una representación esquemática
del plásmido, el locus target y la estructura del locus que se espera obtener en los parásitos KO.

A pesar de que PLP1 pertenece a una familia de proteínas formadoras de poro, las secuencias
nucleotídicas entre los distintos miembros de esta familia son considerablemente diferentes, lo que a
priori favorece la recombinación específica en el locus del gen de interés en el genoma, minimizando
la posibilidad de integración inespecífica.

Figura 30: Representación esquemática del plásmido de transfección pBbo∆plp1, el locus del gen target plp1 y la
estructura esperada de dicho locus en el parásito Δplp1.

84
 Resultados

Una vez realizada la electroporación, los parásitos transfectados tanto con el plásmido pBbo∆plp1
como con el plásmido pBluescript vacío que se usó como control negativo fueron mantenidos en
cultivos in vitro usando un medio de selección conteniendo dosis inhibitorias de blasticidina. Los
cultivos fueron monitoreados diariamente mediante la observación de extendidos teñidos con Diff
Quik para evaluar la parasitemia y mediante observación al microscopio de fluorescencia para evaluar
la aparición de parásitos mutantes con fluorescencia verde que expresen eGFP.

Al cabo de 5 días, como era de esperar, en el cultivo transfectado con el plásmido pBluescript no se
detectaron parásitos resistentes al antibiótico (Figura 31A). Por otra parte, en dos cultivos
independientes (T220.1 y T220.2) transfectados con pBbo∆plp1 emergió, a los 5 días después de iniciar
la selección con la droga, una línea de B. bovis resistente a blasticidina y fluorescente compatible con
parásitos ∆plp1. Ambas líneas parasitarias fueron mantenidas en cultivos de 500 µl en placas de 48
pocillos, con pasajes cada 48 o 72 hs en presencia de blasticidina y monitoreadas regularmente al
microscopio (Figuras 31 B y C). Al cabo de 30 días de cultivo en estas condiciones (15 pasajes), se realizó
una expansión de ambas líneas para los experimentos que requerían obtener ADN genómico para
análisis genéticos posteriores que confirmaran la deleción.

Figura 31: Observación microscópica de los cultivos de B. bovis transfectados teñidos con Diff Quik (arriba) u
observados al microscopio de fluorescencia (aumento 60X, abajo). A. Cultivo transfectado con pBluescript, 5 días
post-transfección (dpt). B. Cultivo T220.1 transfectado con pBbo∆plp1, 5 dpt. C. Cultivo T220.1 transfectado con
pBbo∆plp1, 15 dpt.

85
 Resultados

4.3.2 Caracterización genética de la cepa B. bovis ∆plp1

Con el objetivo de demostrar la integración específica del cassette egfp-bsd en el locus de plp1 se
realizaron una serie de análisis por PCR. Se diseñaron cuatro reacciones distintas combinando
diferentes cebadores (Figura 15, Mat. Y Met.) y se usó como templado el ADN extraído de los cultivos
amplificados de las cepas WT T3Bo, las dos líneas transfectadas con el plásmido pBbo∆plp1 (T220.1 y
T220.2) y la línea con el plásmido pBluescript vacío. Todos los productos de amplificación generados
fueron analizados por electroforesis en geles de agarosa (Figura 32), clonados y secuenciados usando
cebadores que hibridan con sitios presentes en el vector.

Las secuencias obtenidas mostraron que tanto el tamaño de los amplicones como la secuencia de los
mismos son consistentes con la interrupción del gen plp1 por la inserción del gen de fusión egfp-bsd.
Más específicamente, en la figura 32 se puede observar que las PCRs 1 y 2, donde uno de los cebadores
hibrida por fuera del sitio de inserción y el otro en el gen de fusión egfp-bsd, presentan un producto
de amplificación sólo cuando se usa como templado ADN de las cepas transfectadas con el plásmido
pBbo∆plp1. De esta manera se demuestra la generación la cepa KO Δplp1 debido a la inserción del gen
de fusión en el locus target. Por otra parte, las PCRs 3 y 4, donde uno de los cebadores hibrida por
fuera del sitio de inserción mientras que el otro lo hace en la secuencia codificante del gen plp1 que
debiera estar eliminada en el KO, se observan amplicones tanto en la cepa WT como en la Δplp1. Estos
resultados, sumados a que con las PCRs 1 y 2 se pudo comprobar la generación de la cepa Δplp1,
sugieren que las líneas transfectadas T220.1 y T220.2 contienen una población mixta de parásitos, con
y sin interrupción en el gen plp1.

Cuando estos análisis se realizaron sobre ADN extraído del cultivo transfectado con el plásmido
pBluescript vacío a los 2 días post-transfección, se observa un producto de amplificación en las PCRs 3
y 4 correspondiente a la cepa WT. Esto se debe a que la extracción de ADN se realizó en una etapa
temprana antes de que todos los parásitos que incorporaron el plásmido vacío mueran debido a la
presencia de blasticidina en concentraciones inhibitorias en el medio de cultivo y por lo tanto todavía
existían parásitos de la cepa WT. Este cultivo no prosperó más allá de los 10 días post transfección y
selección con blasticidina. Finalmente, en todos los casos donde se realizó la PCR sobre el plásmido de
transfección se obtuvieron resultados negativos, como era de esperar. La PCR del gen msa-1 que se
usó como control de la integridad del ADN genómico extraído, arrojó resultados positivos en todos los
casos.

86
 Resultados

Figura 32: Análisis por PCRs para evaluar la interrupción del gen plp1. El recuadro inferior derecho muestra los
amplicones esperados en las cepas WT y Bbo∆plp1. En las PCR 1 y 2 uno de los cebadores hibrida por fuera del
sitio de inserción, mientras que el otro lo hace en el gen de fusión egfp-bsd. En las PCR 3 y 4 uno de los cebadores
hibrida fuera del sitio de inserción mientras que el otro lo hace en el ORF de plp1. En la PCR msa1 ambos
cebadores hibridan en dicho gen. Las PCRs se realizaron sobre ADN extraído de cultivos de cepa WT T3Bo (1),
cepa ∆plp1 T220.1 (2), cepa ∆plp1 T220.2 (3), cepa pBluescript (4). Las mismas reacciones de PCR se realizaron
sobre el plásmido de transfección pBbo∆plp1 (5) y un control negativo sin ADN (6).

Posteriormente y para terminar de caracterizar los cultivos ∆plp1 y determinar si efectivamente se

trataba de cultivos mixtos se analizó mediante Southern blot el ADN genómico total extraído de
cultivos WT y de las cepas ∆plp1 T220.1 y T220.2. Para esto, el ADN extraído se digirió con la enzima
BglII que no posee sitios dentro del plásmido pBbo∆plp1 ni del locus plp1. La membrana se hibridó con
sondas conteniendo secuencias de entre 390 y 540 pb complementarias a la región 5’UTR del gen plp1,
a la secuencia codificante de plp1 y al cassette de selección egfp-bsd (Figura 33A). Las sondas estaban
marcadas con digoxigenina (DIG) para su revelado con quimioluminiscencia según lo descripto en la
sección 9.18 del Anexo II.

87
 Resultados

Figura 33. A. Esquema de las regiones de hibridación de las distintas sondas usadas para el análisis por Southern
blot para confirmar la eliminación de plp1. B. Ensayo de Southern blot con las diferentes sondas. 1, ADN de la
cepa wild type T3Bo; 2, ADN de la cepa ∆plp1 T220.1; 3, ADN de la cepa ∆plp1 T220.2; 4, plásmido pBboΔplp1.
c, ADN cortado con la enzima BglII; sc, ADN sin cortar. M, marcador de tamaño de ADN. Las flechas muestran el
tamaño de banda esperado para las cepas B. bovis Δplp1 (α), B. bovis wild type (β) y para el plásmido de
transfección (γ).

Analizados en conjunto, los resultados del Southern blot con las diferentes sondas indican que los dos
cultivos transfectados con el plásmido pBboΔplp1 están conformados por una mezcla de poblaciones
∆plp1 y WT. Esto se pone en evidencia en la figura 33B que muestra que en los cultivos T220.1 y T220.2

88
 Resultados

la sonda A hibrida con dos fragmentos de ADN de diferente tamaño. El fragmento de menor tamaño
(β) corresponde a la cepa WT mientras que el más alto (α) corresponde a la ∆plp1 donde el ORF de
plp1 fue eliminado y en su lugar se incorporó el gen de fusión egfp-bsd de mayor tamaño. La
hibridación con la sonda B, que hace blanco en el cassette egfp-bsd, muestra que en la cepa WT no hay
ninguna copia de este inserto mientras que en las cepas ∆plp1 existen dos copias, lo que se evidencia
en dos fragmentos de distinto tamaño. La banda mayor (α) coincide con la observada para la sonda A
y corresponde al tamaño esperado para ∆plp1, mientras que la de menor tamaño (γ) corresponde a la
copia del cassette egfp-bsd que está presente en el plásmido de transfección y que podría permanecer
en el parásito como episoma. La hibridación con la sonda C cuyo blanco es la secuencia codificante de
plp1 confirma la presencia de parásitos WT en los cultivos transfectados ya que muestra una banda
correspondiente al tamaño esperado para dicha cepa (β).

En conjunto, el Southern blot y los datos de las PCRs ponen en evidencia la inserción estable del
cassette egfp-bsd por recombinación homóloga causando la disrupción del gen plp1 en la línea ∆plp1.
Dado que los análisis genéticos de la cepa ∆plp1 para plp1 además pusieron en evidencia que en el
cultivo transfectado coexisten poblaciones de parásitos KO con parásitos WT, se procedió a la
generación de una línea clonal derivada de la línea original mediante separación de células activada
por fluorescencia (FACS sorting).

Para ello, se realizó la separación sobre el cultivo ∆plp1 T220.1 de manera de seleccionar y colocar 500
eritrocitos fluorescentes en un mismo pocillo de una placa de 96 pocillos. Los eritrocitos fluorescentes
serán aquellos infectados por parásitos ∆plp1 que expresan la proteína eGFP. Se generaron nuevos
cultivos a partir de esta selección, los cuales en primera instancia fueron analizados por microscopía
de fluorescencia. En la figura 34 se observa que previo al enriquecimiento existía en el cultivo una
subpoblación de parásitos WT que no expresan eGFP, coincidente con los resultados obtenidos en las
PCRs y el Southern blot, mientras que luego del enriquecimiento no se observa en el cultivo ningún
parasito de fenotipo WT.

89
 Resultados

Figura 34: Microscopía de fluorescencia de parásitos vivos marcados con Hoechst 3342, del cultivo de B. bovis
∆plp1 antes (T220.1) y después (eT220.1) del enriquecimiento por fluorescencia.

Por último, para confirmar el enriquecimiento del cultivo en parásitos Δplp1 se realizó un análisis por
citometría de flujo (Figura 35). Como controles se utilizaron un cultivo de parásitos de la cepa WT T3Bo
y de dos cultivos mixtos donde a la línea ∆plp1 eT220.1 se le adicionaron parásitos de la cepa T3Bo en
las proporciones 1:1 y 10:1. Los resultados de la línea enriquecida eT220.1 muestran que el 100% de
los parásitos expresan la proteína eGFP, mientras que en el control con la línea T3Bo no aparece ningún
parásito expresando eGFP. Al analizar los cultivos mixtos, las mediciones muestran que en el cultivo
1:1 efectivamente sólo la mitad de los parásitos analizados expresan eGFP, mientras que en el cultivo
mixto 10:1 del 100% de los parásitos, el 94% expresan eGFP, por lo que los resultados de este análisis
son completamente consistentes con la composición predicha de los controles. En conjunto, estos
resultados permiten confirmar que la línea enriquecida eT220.1 no contiene cantidades detectables
de parásitos no fluorescentes y por lo tanto puede ser utilizada para la caracterización fenotípica
subsiguiente.

90
 Resultados

Figura 35: Análisis por citometría de flujo midiendo células marcadas con hidroetidina que se intercala en el ADN
de los parásitos (amarillo) y células que expresen eGFP (verde) en la línea B. bovis Δplp1 enriquecida (eT220.1),
la cepa wild type (T3Bo) y las dos mezclas 1:1 y 10:1 de eT220.1 y T3Bo.

4.3.3 Caracterización fenotípica de la cepa ∆plp1

4.3.3.1 Análisis de la transcripción de plp1 y plp5

Se buscó determinar si ante la falta del gen plp1, el gen plp5 modificaba su patrón de transcripción en
la cepa Δplp1, con respecto a la WT. Se decidió analizar la transcripción de plp5 en particular dado que,
junto con plp1, presenta una transcripción estadio específica siendo mayoritariamente transcripto en
los merozoítos (Figura 24A).

Para evaluar si existían diferencias en la transcripción de los genes plp1 y plp5 entre las cepas WT T3Bo
y KO Δplp1, se realizaron amplificaciones de PCR en tiempo (qPCR) real sobre ADN copia obtenido de
la retro-transcripción de los ARN mensajeros de ambas cepas. Para esto, en primer lugar, se realizó
una optimización de las reacciones de qPCR de fragmentos de ≈150 pb de los genes para plp1, plp5 y
hsp20 (que fue usado como control endógeno) evaluando la eficiencia de amplificación a diferentes
temperaturas y concentraciones de cebadores.

91
 Resultados

Una vez que se determinaron las condiciones óptimas se procedió a la cuantificación relativa mediante
el método de curva estándar. Los ensayos se realizaron sobre ADNc de la cepa Δplp1 y fueron
relativizados a los valores obtenidos para ADNc de la cepa WT. Los controles realizados sobre las
muestras WT y Δplp1 sin tratar con la enzima retro-transcriptasa (controles RT-) no mostraron
productos de amplificación en ninguno de los casos (datos no mostrados), permitiendo confirmar que
las muestras a analizar no contenían trazas de ADN genómico que pudieran interferir con la
cuantificación de los transcriptos de plp1 y plp5.

Los resultados obtenidos para el gen plp1 demuestran que en la cepa Δplp1 no hay expresión de dicho
gen confirmando una vez más el fenotipo KO de la misma (Figura 36). Por su parte, al analizar la
transcripción del gen plp5 se puede observar una disminución importante de la cantidad de
transcriptos en la cepa mutada, aunque la significancia estadística (p<0.0597) indica una diferencia no
significativa entre las cepas WT y Δplp1

Figura 36: Cantidad relativa de amplicones de plp1 y plp5 entre las cepas WT y Δplp1 cuantificados mediante
qPCR usando el método de cuantificación mediante curva estándar relativa.

4.3.3.2 Curva de crecimiento

Para evaluar de qué manera la ausencia del gen plp1 impacta sobre el fenotipo de los parásitos ∆plp1
se realizaron curvas de crecimiento in vitro en cultivos de eritrocitos bovinos, comparando la tasa de
crecimiento entre la línea ∆plp1 enriquecida (eT220.1) y la línea WT. Partiendo de una parasitemia
inicial de 0.5% para ambas líneas, se observan diferencias significativas en la parasitemia alcanzada al
día 4, donde la línea ∆plp1 tuvo una velocidad de crecimiento significativamente menor (Figura 37).
Mientras que los resultados muestran que la línea WT tuvo un aumento de la parasitemia de 26 veces,

92
 Resultados

la ∆plp1 sólo logra un aumento de 19 veces, lo que indica una disminución del fitness replicativo de los
parásitos que carecen del gen plp1.

Figura 37: Curvas de crecimiento comparativas de cultivos in vitro de B. bovis T3Bo (WT) y B. bovis ∆plp1. Los
datos se expresan como medias aritméticas ± desviación estándar. *p < 0.05 con una prueba-T de Student.

A nivel morfológico, al examinar al microscopio extendidos del cultivo ∆plp1 se observan estructuras
en donde más de un par de merozoítos coexisten dentro de un mismo eritrocito (Figura 38). Dado que
lo que ocurre generalmente en B. bovis, B. bigemina, B. caballi y B. ovata, es que un merozoíto
atraviesa un solo ciclo de división por fisión binaria para luego egresar del eritrocito, en los cultivos de
cepas WT no se observan más de un par de merozoítos dentro de la misma célula hospedadora (Kawai
et al., 1999, 1986; Mehlhorn y Schein, 1985; Potgieter y Els, 1977). La observación de estas formas
múltiples (≈ 8% de los eritrocitos infectados) en los cultivos ∆plp1 sugiere que podría tratarse de un
fenotipo mutante en donde algunos merozoítos no logran egresar de forma eficiente del eritrocito y
continúan una segunda ronda de replicación dentro de la misma célula. Este aumento en la carga
parasitaria por eritrocito debido a un defecto en el egreso podría explicar la disminución parcial del
fitness de los parásitos que carecen del gen plp1, evidenciada por la menor tasa de crecimiento en el
cultivo in vitro.

93
 Resultados

Figura 38: Estructuras inusuales encontradas en los cultivos de B. bovis Δplp1. Los extendidos fueron teñidos con
Diff Quik y observados al microscopio óptico (1000X). Las flechas señalan los eritrocitos conteniendo más de 2
merozoítos intracelulares y abajo se muestra una ampliación del eritrocito conteniendo múltiples parásitos.

94
5 DISCUSIÓN

La vacunación de los bovinos con cepas atenuadas de Babesia, sumado a otras medidas de prevención
y tratamiento como el uso de acaricidas, rotación de pasturas y uso de razas bovinas con genética
adaptada son estrategias que de realizarse de manera integral permiten controlar la babesiosis bovina
y otras parasitosis transmitidas por garrapatas, aunque con un importante número de limitaciones. Es
por ello que para lograr un control sostenible de la enfermedad se necesitan desarrollar nuevas
medidas de prevención que eviten o minimicen estos inconvenientes. En este sentido, el estudio de la
biología básica de los patógenos que causan la babesiosis, y más específicamente de las proteínas
parasitarias involucradas en la invasión y posterior progresión del ciclo celular, es de especial interés
para comprender la interacción patógeno-hospedador y desarrollar métodos nuevos y más seguros
para el control de la enfermedad.

Los mecanismos por los cuales los merozoítos de Babesia spp. invaden y egresan de los eritrocitos son
mecanismos poco conocidos, pero hasta el momento se han reportado varias proteínas que están
involucradas en la invasión. Existen moléculas de superficie (MSA) que recubren los merozoitos
extracelulares e intervienen en la unión efectiva del parásito al eritrocito, y otras proteínas secretadas
por las organelas del complejo apical (RAP, TRAP, AMA) que desempeñan un papel central en la
secuencia de eventos de invasión y funcionan como ligandos para interactuar con las células
hospedadoras. En cuanto al egreso del parásito de la célula, si bien no hay reportes acerca de las
proteínas involucradas en el egreso eficiente de Babesia, los análisis por homología con otras especies
del phylum Apicomplexa son útiles para identificar nuevos candidatos dentro de este género para
iniciar los estudios.

En este sentido, varios estudios en Toxoplasma y Plasmodium han identificado un grupo de proteínas
líticas involucradas en la invasión y el egreso del parásito, las cuales poseen un dominio de ataque a
membrana llamado MACPF. Estas proteínas, conocidas como proteínas tipo perforina o PLPs, cumplen
diferentes funciones relacionadas con la interacción del parásito con la célula hospedadora, tales como
la migración y el egreso, lo que le permite al patógeno establecerse y mantener la infección. Si bien
existen estudios previos en especies del género Babesia donde se encontraron algunos genes que
codifican para proteínas con el dominio MACPF (Anderluh y Gilbert, 2014; Kafsack y Carruthers, 2010;
Petrigh, 2010), hasta el momento no se había realizado una caracterización profunda de esta familia
de proteínas.
 Discusión

En este trabajo, el análisis genómico mediante diferentes herramientas bioinformáticas permitió la

identificación y caracterización estructural de toda la familia de proteínas PLP en las especies de
Babesia cuyos genomas se encuentran secuenciados.

El análisis de la conservación aminoacídica de las proteínas PLP, tanto dentro del género Babesia como
en todo el phylum Apicomplexa, permitió concluir que las proteínas tipo perforina están altamente
conservadas a nivel de su estructura secundaria y terciaria, mientras que, a nivel de estructura
primaria, las mismas son divergentes, manteniendo conservados sólo los aminoácidos que
comprenden el motivo MACPFapi y los residuos cisteína que forman parte del dominio APC-β. La
predicción in silico de la estructura tridimensional de las proteínas PLP de Babesia mostró que todas
las proteínas presentan los elementos característicos de las proteínas formadoras de poro: dos grupos
de α-hélices rodeando cadenas antiparalelas que forman una hoja plegada β. Esta predicción permite
afirmar que las PLPs de Babesia poseen, al igual que otros miembros del phylum, la estructura
necesaria de acuerdo con el modelo de formación del poro. Este modelo propone que las proteínas
MACPF son secretadas como monómeros que después de la unión a la membrana, oligomerizan
formando complejos en forma de anillos o arcos y atraviesan una marcada reorganización estructural
donde los dos clusters de hélices se despliegan y se convierten en extensiones de las hojas β centrales
para crear un poro (Law et al., 2010).

En la mayoría de las PLPs de Babesia se encontró una secuencia péptido señal demostrando que estas
proteínas ingresan a la vía de secreción del parásito. La falta de esta secuencia en algunas proteínas
de Babesia y de otros géneros podría deberse a la dificultad en la predicción del inicio del primer exón
o las limitaciones de los programas de predicción que son entrenados mayormente con organismos
procariotas y con una restringida diversidad de eucariotas, ya que en base a los datos disponibles para
otras PLPs del phylum es de esperar que todas las PLPs sean secretadas.

Si bien la mayoría de las proteínas PLP identificadas presentaron solamente un dominio MACPF por
proteína, en la proteína PLP3 de B. bovis y su ortóloga en B. microti se encontraron tres dominios
MACPF dentro del mismo ORF, fenómeno que ya había sido descripto para una proteína del
hemoparásito bovino Theileria annulata (TaPLP5: TA18285; Kafsack y Carruthers, 2010). Teniendo en
cuenta el modelo de formación del poro de Law et al., 2010, el aumento en el número de dominios
funcionales en una única proteína minimizaría el número de monómeros necesarios para que se forme
el poro. Esta característica, presente en organismos donde evolutivamente se ha producido una
reducción genómica como B. bovis, permitiría inferir una selección positiva hacia proteínas con
múltiples dominios.

96
 Discusión

Al analizar los árboles filogenéticos construidos con la secuencia de los dominios MACPF de las
diferentes proteínas se pudo observar que el primer dominio de plp3 (PLP3.1) de las especies B. bovis
y B. microti agrupa con el dominio MACPF de PLP3 de las demás especies, mientras que los otros dos
dominios (PLP3.2 y PLP3.3) lo hacen con las proteínas PLP7 y PLP8 respectivamente. Además, al
analizar la sintenia de las regiones donde se encuentran estos genes se observa que plp3, plp7 y plp8
son adyacentes entre sí. A partir de estas observaciones planteamos la hipótesis de que el gen
multidominio plp3 de B. bovis y B. microti haya surgido como una fusión de plp3 con los genes
adyacentes plp7 y plp8 (Figura 39). Los genomas de B. bovis (8.2 Mpb) y B. microti (6.5 Mpb) se
encuentran, junto con el de B. canis (7 Mpb), dentro de los genomas de apicomplejos más pequeños
que han sido secuenciados hasta el momento. Además, el número de genes codificados por sus
genomas es más reducido que el de otros organismos del género Babesia (B. canis: 3467, B. microti:
3513, B. bovis: 3706, B. divergens: 4134, B. ovata: 5031, B. bigemina: 5079). Esta disminución en el
tamaño del genoma y el número de genes es probablemente el resultado de una evolución regresiva
a partir de un organismo ancestral con un genoma más grande, ya que la compactación de genomas
fue un evento frecuente a lo largo de la evolución de parásitos obligados. La reducción en el número
de plps en B. bovis y B. microti va en concordancia con este fenómeno y la fusión entre genes plp
adyacentes previamente mencionada podría ser un rasgo seleccionado evolutivamente ya que con
este ordenamiento se reduce el número de monómeros que se necesitan para la formación de un poro
funcional en la membrana blanco. Si este fuera el caso de las proteínas PLP con múltiples dominios de
Babesia y Theileria, sería un caso de paralelismo evolutivo ya que el rasgo debió aparecer de forma
independiente más de una vez en la evolución, lo que se confirma al observar que el dominio fusionado
aparece en diferentes ramas del árbol de los apicomplejos (Figura 2).

Figura 39: Esquema del modelo propuesto para la generación del gen multidominio plp3 de B. bovis y B. microti,
mediante fusión de genes plp adyacentes.

97
 Discusión

Además del dominio MACPF, en las PLPs de Babesia se identificó en el extremo C-terminal el dominio
APC-β característico de las proteínas formadoras de poro de apicomplejos. En la mayoría de las
proteínas de Babesia se encontraron las tres repeticiones directas en tándem que caracterizan a este
dominio, donde cada una contiene los 4 residuos cisteína altamente conservados que se cree
formarían puentes disulfuro estabilizando la estructura. El modelado de la estructura tridimensional
de este dominio mostró que la disposición que adquieren estos residuos es compatible con la
formación de puentes disulfuro entre ellos, y el modelo de plegamiento predicho está altamente
conservado con el dominio APC-β presente en la proteína de T. gondii TgPLP1.

Debido a sus características hidrofóbicas, este dominio es propuesto o bien como el responsable de
unión a la membrana de la célula blanco o como un dominio accesorio que mejore o regule la unión a
la membrana de la célula blanco (Guerra y Carruthers, 2017; Ni et al., 2018). Nuestros resultados
apoyan esta hipótesis en el sentido de que el programa usado para realizar los modelados predijo para
esta estructura APC-β un sitio de unión a Ca2+ que podría tener un efecto regulador de la actividad de
la proteína y cuyo rol se discutirá más adelante.

Al igual que en el género Plasmodium, en las distintas especies de Babesia se encontró un número alto
de genes que codifican para PLP (entre 6 y 8 dependiendo de la especie) mientras que en los coccidios,
que constituyen una rama diferente dentro del phylum Apicomplexa, está reportado un número
mucho más reducido de genes que codifican para esta familia de perforinas (Figura 40). En el caso de
B. canis, donde solamente se identificaron 3 genes plp, se asume que esto se debe a un problema
metodológico en el ensamblado del genoma ya que sólo se cuenta con datos preliminares donde el
genoma no está completamente cerrado y se encuentra fragmentado en 43 scaffolds (Eichenberger et
al., 2017). Al igual que para B. canis, la falta del gen plp5 en B. ovata podría deberse a un problema
metodológico ya que el genoma se encuentra fragmentado en 91 scaffolds (Yamagishi et al., 2017).

Del análisis de la distribución de las PLPs en diferentes especies del phylum Apicomplexa que se
muestra en la figura 40 se puede proponer que los integrantes de este grupo adquirieron un gen que
codifica para PLPs luego de la separación de las gregarinas y los criptosporidios, mientras que la
expansión de la familia de genes en Apicomplexa se dio cuando los parásitos se adaptaron a la
transmisión por vectores, pasando de un ciclo de vida monoxénico en los coccidios a uno dixénico en
Hematozoa, donde se alterna un hospedador intermediario mamífero con un hospedador definitivo
artrópodo. En este sentido, los datos de las proteínas PLP de Babesia generados en este trabajo avalan
la hipótesis planteada por Kafsack y Carruthers en 2010, que sostiene que la expansión en el número
de PLPs dentro del phylum pudo haber sido seleccionada positivamente ante la necesidad de adaptar
las funciones de estas PLPs al desarrollo de parte del ciclo de vida en el vector artrópodo.

98
 Discusión

Figura 40: Árbol filogenético del phylum Apicomplexa donde se muestra, para cada género, el número de PLPs
contenidas en cada genoma. Además, se indica si los parásitos presentan un ciclo de vida monoxénico o dixénico.
La flecha naranja muestra el momento de la evolución donde se podrían haber adquirido las PLPs, mientras que
la flecha verde indica el momento en el que se podría haber producido la expansión de la familia. Figura adaptada
de Jan Šlapeta (http://tolweb.org/Apicomplexa/2446).

Los análisis de conservación de las PLPs dentro del género Babesia mostraron que existe una mayor
identidad entre proteínas ortólogas que entre parálogas (Figura 19). Esto mismo se observó para
distintas especies de Plasmodium (Kaiser et al., 2004) y puede responder a lo que se conoce como
conjetura de los ortólogos (ortholog conjecture). Esta hipótesis propone que luego de una duplicación
de genes, la función de la proteína codificada cambia rápidamente llevando a parálogos con funciones
diferentes mientras que los ortólogos mantienen la misma función ancestral (Altenhoff et al., 2012;
Peterson et al., 2009). Esto, sumado al hecho de que los parásitos que son transmitidos por vectores
tienen mayor número de PLPs que aquellos que no, permite postular que en un primer momento los
apicomplejos contaban con una o dos copias de un gen plp y que posteriormente en algún momento
de la evolución este gen se duplicó. Como resultado, uno de los genes conservó su función ancestral
de invasión al hospedador mamífero mientras que el parálogo sufrió modificaciones que llevaron a un
cambio en su función que permitió la adaptación a la transmisión por un artrópodo vector.

99
 Discusión

La marcada conservación estructural de las proteínas PLP de Babesia con las PLPs de otros parásitos
apicomplejos, tanto del dominio MACPF responsable de la formación del poro como del dominio APC-
β, demuestra una restricción evolutiva a la variación. Esto, sumado al hecho de que PLP1 y PLP2 de
Babesia spp. pertenecen al mismo grupo de ortología que otras proteínas tipo perforina previamente
caracterizadas de Plasmodium y Toxoplasma permite asumir que en el género Babesia estas proteínas
podrían estar también involucradas en alguna etapa de la progresión del ciclo celular tales como el
egreso o la migración por diferentes epitelios. Por ejemplo, la proteína PLP1 en T. gondii permite la
salida del parásito de la célula infectada (Kafsack et al., 2009; Roiko y Carruthers, 2013) mientras que
PLP1 y PLP3 en Plasmodium intervienen en la migración del parásito a través de diferentes tipos
celulares para alcanzar la célula blanco donde replican (Amino et al., 2008; Risco-Castillo et al., 2015).

Para aportar más evidencia sobre la función de esta familia de proteínas en Babesia spp. se continuó
con su caracterización funcional en B. bovis, considerando que esta es la especie que causa un cuadro
clínico con consecuencias más severas en los animales. El análisis de datos de transcriptómica de
diferentes estadios del parásito, tanto en el hospedador mamífero como en el vector, mostraron que,
si bien todos los genes se transcriben durante alguna etapa del ciclo de vida, en su mayoría estos genes
tienen una transcripción estadio específica excluyente. Es decir, aquellos que muestran altos niveles
de transcripción en el merozoíto tienen baja transcripción en el kineto y viceversa. Se observó que el
gen plp1 es aquel con el mayor nivel de transcripción en el estadio de merozoíto presente en el
mamífero mientras que su nivel de transcripción en el estadio del vector es mínimo. Además, este gen
es ortólogo a PLP1 de T. gondii por lo que podría plantearse que éste es el gen adquirido del ancestro
común entre Hematozoa y Coccidia y que a partir de su duplicación se dio origen a los demás plps.
Estas particularidades refuerzan la hipótesis planteada anteriormente sobre que la ampliación en el
número de genes en los Hematozoa responde a una adaptación de su función a la transmisión por
artrópodos.

Toda la evidencia obtenida con los análisis bioinformáticos sobre los datos de transcriptómica sugiere
que las proteínas PLPs de Babesia son, al igual que sus ortólogas en organismos relacionados, proteínas
formadoras de poros con un rol importante para la progresión del ciclo celular de los parásitos. Para
poder confirmar este rol en Babesia se realizó una caracterización funcional de PLP1 de B. bovis. Esta
proteína se seleccionó entre las otras de la familia en base a diversos criterios, entre los que se
destacan su alto nivel de transcripción en los merozoítos de Babesia y su ortología con las proteínas
PLP1 de T. gondii y PLP1 y PLP3 de Plasmodium spp. que demostraron ser importantes en la virulencia.
Estos factores apuntan a que la proteína PLP1 de B. bovis cumpliría un rol importante como factor de
virulencia en el hospedador mamífero.

100
 Discusión

En primera instancia se intentó obtener de forma recombinante la proteína PLP1 de B. bovis completa.
A pesar de que en un trabajo realizado sobre su ortóloga en T. gondii (TgPLP1: 125 kDa) lograron
obtener la proteína recombinante completa mediante la expresión en sistemas procariotas (Roiko y
Carruthers, 2013), en el presente trabajo resultó imposible en las distintas condiciones ensayadas. Es
posible que la dificultad en la expresión radique en su alto peso molecular sumado a la presencia de
dominios transmembrana en su secuencia, así como también al alto contenido de cisteínas presentes
en el dominio APC-β que pudieran formar puentes disulfuro y dificultar su expresión. Por otra parte,
en trabajos realizados sobre PLPs de Plasmodium sólo logran obtener la proteína recombinante
completa usando sistemas de expresión eucariotas (Garg et al., 2013; Wirth et al., 2014), lo que no fue
explorado en este trabajo.

Ante la dificultad de obtener la proteína completa en sistemas procariotas, se procedió a obtener de

forma recombinante el dominio MACPF aislado, teniendo como antecedentes trabajos en Plasmodium
spp. que demostraron que el dominio por sí solo tiene actividad membranolítica y que los anticuerpos
generados contra este dominio son capaces de reconocer a la proteína nativa completa (Deligianni et
al., 2013; Garg et al., 2013; Wirth et al., 2014).

La obtención del dominio MACPF recombinante permitió generar antisuero específico para analizar
tanto la expresión de la proteína PLP1 en el estadio de merozoíto de B. bovis como la presencia de
epítopes B en este dominio. Los experimentos de Western blot confirmaron que sueros de bovinos de
zonas enzoóticas de nuestro país y serológicamente positivos para B. bovis poseen anticuerpos de tipo
IgG capaces de reconocer el dominio funcional de PLP1, lo que demuestra que estos epítopes B son
inmunodominantes y están conservados en diferentes aislamientos. Experimentos futuros con un
mayor número de sueros permitirán determinar la tasa de positividad frente a esta proteína a nivel de
distintas regiones en nuestro país.

Se observó también que, al igual que lo que ocurre en Plasmodium, los sueros hiperinmunes generados
en ratones contra la proteína rPLP1_MACPF reconocen a la proteína completa en lisados de
merozoítos, indicando la conservación de epítopes B entre ambas formas de la proteína. Los bajos
niveles de detección de PLP1 que se obtuvieron con estos sueros murinos coinciden con la evidencia
ya publicada de que las PLP en otras especies de apicomplejos se expresan en bajas cantidades (Garg
et al., 2013; Kaiser et al., 2004). A esto se suma el hecho de que los anticuerpos generados en ratones
son anti rPLP1_MACPF y no contra la proteína completa, factor que podría también estar influyendo
en los bajos niveles de detección de PLP1. Los resultados de estos experimentos demuestran
nuevamente la expresión de la proteína PLP1 de B. bovis durante su estadio de merozoíto en la
infección en bovinos, y también que el dominio MACPF de la proteína PLP1 presenta epítopes B

101
 Discusión

inmunodominantes expuestos al sistema inmune el cual genera una respuesta de anticuerpos contra
ellos.

En relación con la caracterización funcional, el dominio MACPF demostró tener capacidad hemolítica
frente a eritrocitos bovinos en un amplio rango de condiciones. Al igual que se observó para el dominio
funcional de la proteína PfPLP1 ortóloga en P. falciparum (Garg et al., 2013), bajas concentraciones de
la proteína recombinante PLP1_MACPF no generan hemólisis, mientras que al superar una
concentración umbral se obtienen niveles máximos de daño en los eritrocitos. Es decir, no hay un
cambio gradual en la actividad en respuesta a pequeños cambios en la concentración de proteínas,
sino que se observa una curva de tipo sigmoidea donde una vez alcanzada una determinada
concentración el cambio es abrupto, pasando de valores de lisis menores al 10% a valores superiores
al 90%. Esta cinética es coincidente con el comportamiento observado para otras proteínas con
dominio MACPF, y no se limita a las PLPs de apicomplejos sino que también se observa este fenómeno
en la perforina secretada por los linfocitos T citotóxicos del sistema inmune (Baran et al., 2009; Dong
et al., 2007; Garg et al., 2013; Pipkin y Lieberman, 2007; Voskoboinik et al., 2005). Además, concuerda
con el mecanismo de acción propuesto para las proteínas formadoras de poro con dominio MACPF
que postula que las proteínas son secretadas como monómeros que se unen a la membrana de la
célula blanco, oligomerizan y sufren un rearreglo conformacional que da como resultado la formación
del poro. De ser así, es necesario alcanzar una cantidad crítica de proteínas unidas en la membrana
para que puedan oligomerizar y formar el poro que desencadena la hemólisis.

Resulta interesante destacar que el dominio MACPF de la proteína PLP1 de B. bovis por sí solo tiene la
capacidad de dañar membranas eritrocitarias bovinas, sin requerir del dominio APC-β para su unión a
la membrana. Este resultado demuestra que el dominio MACPF es el responsable de la formación del
poro y aporta evidencia a la hipótesis que plantea que los demás componentes de la proteína son
accesorios y podrían tener un rol regulatorio en la polimerización, la unión inicial a la membrana o la
sensibilidad a iones, por ejemplo el Ca2+ (Anderluh y Gilbert, 2014). Este mismo comportamiento del
dominio MACPF, capaz de tener actividad membranolítica aún aislado del resto de la proteína, se
observó con PfPLP1 (Garg et al., 2013) y pone en duda si el rol del dominio rico en hojas β en los
Hematozoa es el mismo que el que se asignó al dominio APC-β de la proteína TgPLP1, donde los autores
afirman que este dominio es indispensable para la formación del poro (Guerra et al., 2018; Roiko y
Carruthers, 2013).

Otra diferencia entre las PLPs de Hematozoa con las de Coccidia es que los dominios funcionales tanto
BboPLP1 como de PfPLP1 tienen capacidad hemolítica tanto en presencia como en ausencia de Ca2+.
En trabajos previos se demostró que la región C-terminal de la perforina de linfocitos es responsable
de la actividad membranolítica dependiente de Ca2+ (Voskoboinik et al., 2005) y en el trabajo de Garg

102
 Discusión

et al., 2013 demostraron que cuando la proteína PfPLP1 está completa presenta actividad dependiente
de Ca2+ mientras que cuando el dominio C-terminal es removido la proteína está activa tanto en
presencia como en ausencia del ion. Además, el modelado del dominio APC-β realizado en este trabajo
muestra un posible sitio de unión a Ca2+ en la región C-terminal de la proteína, al igual que lo
demostrado por Garg et al., 2015 que encontraron en el extremo C-terminal de PfPLP1 los residuos
responsables de unión a Ca2+. Esta evidencia permite hipotetizar que en B. bovis la proteína PLP1 actúa
de forma similar que en P. falciparum y que el dominio de unión de Ca2+ está por fuera del dominio
MACPF, presumiblemente en el dominio APC-β ubicado en el extremo C-terminal de la proteína,
regulando la actividad membranolítica del dominio MACPF.

Finalmente, para completar la caracterización funcional de la proteína PLP1 de B. bovis se generó una
cepa knock out para el gen plp1 por disrupción del gen nuclear. Un obstáculo importante que ha
demorado el estudio funcional de los genes de los parásitos del género Babesia es la escasez de
metodologías para su manipulación genética (Gohil et al., 2013). Los primeros KO en Babesia fueron
generados hace 10 años por Suarez y McElwain y recién en el año 2015, Asada y colaboradores
lograron el primer ensayo de KO y complementación funcional de estos parásitos. La puesta a punto
de estas técnicas resultó dificultosa por diversos motivos. Por un lado, dado que el plásmido de
transfección es introducido mediante electroporación, se debieron optimizar las condiciones para que
este pueda atravesar las tres membranas que lo separan del núcleo, es decir, la membrana plasmática
del eritrocito, la membrana plasmática del parásito y la membrana nuclear. Además, los cultivos de
Babesia tienen requerimientos muy estrictos ya que sólo crecen en eritrocitos bovinos frescos,
requieren de animales dadores controlados, pasajes cada 24 hs y no alcanzan parasitemias muy altas.
A pesar de estas dificultades, el sistema de generación de KO en B. bovis se encuentra hoy en día ya
establecido y hasta el momento se han obtenido varios mutantes en esta especie (Alzan et al., 2019,
2017; Asada et al., 2015; Hussein et al., 2017; Mack et al., 2019; Oldiges et al., 2016; Suarez et al.,
2015). Además, en el trabajo realizado por Oldiges et al., 2016, realizan una infección in vivo de bovinos
con una cepa de B. bovis modificada genéticamente y demuestran que es posible evaluar los parásitos
mutantes en el modelo animal ya que la línea mutante es capaz de generar una infección aguda y
persistente en los bovinos infectados, permaneciendo genéticamente estable y manteniendo la
capacidad de expresar la proteína de fusión GFP-BSD introducida en el genoma del parásito.

Las cepas KO de Babesia que resultan atenuadas en su fenotipo surgen como una alternativa novedosa
a las vacunas vivas tradicionales para el control de la babesiosis. Los parásitos KO que resultan
atenuados en su fenotipo tienen la ventaja de poder causar una enfermedad leve en los bovinos que
permite la inmunización del ganado mientras que la cepa KO permanece genéticamente estable. Esto
elimina el riesgo de reversión fenotípica que tienen algunas de las vacunas atenuadas tradicionales y

103
 Discusión

además los parásitos modificados genéticamente permiten que la vacuna sea rastreable por medio de
marcadores moleculares identificables que permiten discriminar entre animales vacunados e
infectados naturalmente en el campo (Florin-Christensen et al., 2014).

La cepa knock out B. bovis Δplp1 generada en este trabajo fue caracterizada genéticamente para
corroborar la deleción del gen de interés y dado que en primera instancia se constató que el cultivo
transfectado presentaba una población mixta de parásitos Δplp1 y WT, se generó una línea enriquecida
en parásitos Δplp1 mediante FACS sorting. Para confirmar que en este cultivo enriquecido no se
detectaran parásitos WT, se verificó que todos expresaran el gen reportero eGFP, lo que se realizó
mediante observación de los cultivos vivos al microscopio de fluorescencia y mediante citometría de
flujo. Además, ensayos de PCR en tiempo real sobre ADN copia sintetizado a partir de ARN mensajero
del cultivo enriquecido confirmaron, tal como se esperaba, que no hay transcriptos correspondientes
al gen plp1, validando una vez más la pureza del cultivo de Δplp1.

La cepa Δplp1 generada fue capaz de replicar y mantenerse en cultivo, lo que demuestra que el gen
plp1 no es esencial para la supervivencia del parásito. Para evaluar el impacto que tiene la falta de la
proteína PLP1 sobre los parásitos, se realizaron curvas de crecimiento para determinar la capacidad de
replicación de los parásitos en cultivos in vitro. Se pudo observar que los parásitos Δplp1 crecen
significativamente menos que los WT, ya que en un mismo período de tiempo alcanzan una
parasitemia menor. Esto pone en evidencia una reducción del fitness de los parásitos mutantes,
indicando que la falta de la proteína PLP1 tiene un impacto negativo parcial sobre los mismos.

Por otra parte, al monitorear los parásitos Δplp1 al microscopio óptico, se observaron con regularidad
formas tetraméricas, formadas por dos pares de merozoítos presentes en un mismo eritrocito. Éste es
un fenómeno que no se observa en las cepas WT de B. bovis ni tampoco de las especies B. bigemina,
B. caballi y B. ovata (Kawai et al., 1999, 1986; Mehlhorn y Schein, 1985; Potgieter y Els, 1977) donde
lo esperable es que los parásitos atraviesen un único ciclo de reproducción asexual dentro del eritrocito
para luego egresar y re-invadir una célula no infectada. De acuerdo con una publicación reciente
(Scudiero et al., 2018) el mecanismo actuante sería un diferencial de cargas eléctricas entre la
membrana del merozoíto y la del eritrocito previamente infectado con Babesia que produce una fuerza
de repulsión tal que previene que parásitos libres interactúen con la membrana de un eritrocito
infectado. Por lo tanto, se puede descartar que las formas tetraméricas se deban a que dos merozoítos
independientes hayan invadido un mismo eritrocito y cada uno haya atravesado un único ciclo de
replicación. La explicación más factible al fenómeno observado de formas tetraméricas es que la
invasión se haya producido por un único merozoíto que luego de la primera ronda de división celular
no fue capaz de egresar de la célula infectada tal como se espera, sino que atravesó una segunda ronda
de replicación dentro del eritrocito. Este defecto o demora en el egreso del parásito de la célula

104
 Discusión

hospedadora podría ser un fenotipo mutante de la cepa KO para plp1 ya que un fenómeno de
características similares se observa en el KO de T. gondii para el gen ortólogo plp1 (Kafsack et al., 2009;
Roiko y Carruthers, 2013). Esta cepa de T. gondii Δplp1 es capaz de sobrevivir en cultivo, pero tiene
una tasa de crecimiento menor, y al observar las células infectadas se ven vacuolas parasitóforas con
un mayor número de parásitos respecto a la cepa WT. Los autores del trabajo aseguran que los
parásitos KO perdieron su capacidad de egresar activamente de la célula hospedadora debido a la falta
de la proteína PLP1 y continúan replicando dentro de la vacuola parasitófora por más ciclos que lo
habitual, hasta que eventualmente la célula estalla liberando los parásitos (Roiko y Carruthers, 2013).

Toda la evidencia obtenida sobre la proteína PLP1 de B. bovis nos permite plantear la hipótesis de que,
al igual que su ortóloga en T. gondii, esta proteína está involucrada en el egreso rápido del parásito de
la célula hospedadora. Posiblemente, una vez que los merozoítos maduros están listos para egresar,
PLP1 es liberada desde los micronemas y se une a la membrana del eritrocito donde oligomeriza para
formar poros en las membranas. El mecanismo mediante el cual estos poros dan lugar a la salida del
parásito permanece desconocido, pero una posibilidad es que los poros cambien la permeabilidad de
la membrana generando una lisis osmótica del eritrocito, lo que va en concordancia con las video-
microscopias que muestran que el eritrocito bovino infectado con B. bovis estalla previo al egreso de
los merozoítos (Asada et al., 2012).

La falta de PLP1 en los parásitos mutantes hacen que el egreso del parásito no sea eficiente por lo que
los merozoítos maduros atraviesan una segunda fase de reproducción asexual dentro del eritrocito
que posiblemente ya esté agotado nutricionalmente, generando las formas tetraméricas que aparecen
en el cultivo Δplp1. Esto podría retrasar la multiplicación y proliferación del parásito generando una
reducción del fitness que se traduce en la disminución de la tasa de crecimiento con respecto a los
parásitos WT, que se pone en evidencia en la menor parasitemia que se observa en las curvas de
crecimiento.

El hecho de que se haya podido generar exitosamente el KO de PLP1 demuestra que la proteína no es
esencial para la supervivencia y el desarrollo del merozoíto en el eritrocito. Además, si bien se
observaron formas tetraméricas deficientes en el egreso, la frecuencia de esta observación no fue alta
lo que podría explicarse por la redundancia de PLP1 con otros miembros de la familia que podrían
haber compensado su ausencia. Al evaluar mediante PCR en tiempo real la transcripción del gen plp5
que, al igual que plp1, presentaba transcripción estadio específica se observó en la cepa Δplp1 una
disminución a la mitad en la cantidad de transcriptos de plp5. A pesar de que estadísticamente esta
diferencia resultó no significativa, sería interesante ahondar en este resultado dada la marcada
diferencia entre ambas cepas. Si bien los mecanismos de regulación de la expresión génica en
Apicomplexa no son completamente conocidos, se sabe que hay diversos mecanismos que intervienen

105
 Discusión

tales como la regulación a nivel transcripcional mediada por factores de transcripción,

postranscripcional regulando los niveles de ARNm y su traducción, y también mecanismos epigenéticos
(Gopalakrishnan y Lopez-Estrano, 2012; Hakimi y Deitsch, 2007).

Futuros ensayos permitirán confirmar la diferencia en la transcripción de plp5 y que implicancias tiene
en la biología del parásito. Además, ensayos que evalúen la transcripción y expresión de los otros
miembros de la familia PLP en la cepa Δplp1 y también la replicación in vivo de esta cepa en infecciones
experimentales de bovinos y garrapatas permitirán determinar si la proteína PLP1 es necesaria para la
replicación y el desarrollo de otros estadios de B. bovis y si la compensación funcional con otras
proteínas de la familia es capaz de suplantar su función en el fenotipo KO.

106
6 CONCLUSIONES

 El análisis genómico usando diferentes herramientas bioinformáticas permitió identificar y

caracterizar estructuralmente a la familia de proteínas tipo perforina del género Babesia.
 Las PLPs de Babesia están altamente conservadas a nivel de su estructura secundaria y
terciaria. Sin embargo, a nivel de estructura primaria sólo se conservan unos pocos
aminoácidos limitados al motivo MACPFapi y a los residuos cisteína del dominio APC-β.
 La marcada conservación estructural de las PLPs de Babesia con proteínas formadoras de poro
previamente caracterizadas sugiere una restricción evolutiva a la variación y permite asumir
que las PLPs de Babesia tienen la capacidad de formar poros en membranas de células blanco.
 El análisis de datos de transcriptómica permitió demostrar que, si bien todos los genes plp se
transcriben durante alguna etapa del ciclo de vida del parásito, en su mayoría presentan una
transcripción estadio específica excluyente, lo que sugiere que diferentes proteínas cumplen
diferentes roles en el progreso del ciclo de vida del parásito.
 En caso de PLP1 de Babesia bovis, se obtuvo de forma recombinante el dominio funcional
(MACPF) de la proteína y mediante ensayos de hemólisis in vitro con la proteína recombinante
se demostró su capacidad de causar daño en las membranas de los eritrocitos bovinos.
 Experimentos de Western blot con el dominio MACPF recombinante de la proteína PLP1
confirmaron la presencia de anticuerpos específicos contra dicha proteína en bovinos
naturalmente infectados con B. bovis demostrando que la misma presenta epítopes B
inmunodominantes que son expuestos al sistema inmune bovino durante la infección.
 Se generó y caracterizó genéticamente una cepa de B. bovis KO para el gen plp1 que resultó
viable en cultivo in vitro por más de 120 días, lo que demostró que este gen no es esencial para
la supervivencia y el desarrollo de los merozoítos en los eritrocitos. Esto puede deberse a la
redundancia del gen plp1 con otros miembros de la familia.
 A pesar de no ser esencial, la proteína PLP1 juega un papel importante en los estadios
sanguíneos de Babesia ya que los parásitos Δplp1 crecen significativamente menos que los WT
en cultivos in vitro. Esto pone en evidencia una reducción del fitness de los parásitos mutantes,
indicando que la falta de la proteína PLP1 tiene un impacto negativo parcial sobre los mismos.
 Posiblemente, PLP1 esté involucrada en el egreso rápido del parásito de la célula hospedadora,
al igual que su ortóloga en T. gondii. Una vez que los merozoítos maduros están listos para
egresar, PLP1 es liberada desde los micronemas y se une a la membrana del eritrocito donde
oligomeriza para formar poros en las membranas.
 Conclusiones finales

 La falta de PLP1 en los parásitos mutantes hacen que el egreso del parásito no sea eficiente
por lo que los merozoítos maduros atraviesan una segunda fase de reproducción asexual
dentro del eritrocito, como se observa en las formas tetraméricas que aparecen en el cultivo
Δplp1. Esta demora en el egreso podría ser la causal de la reducción del fitness que se observa
en los ensayos curvas de crecimiento en cultivos in vitro.
 Ensayos futuros de infección de bovinos con la cepa Δplp1 permitirán determinar si la menor
replicación observada in vitro se traduce en alguna diferencia en la virulencia de esta cepa y
permitirán evaluar su potencial uso como vacuna viva atenuada genéticamente.

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119
8 ANEXO I – FIGURAS SUPLEMENTARIAS

Figura Suplementaria 1: Análisis de la sintenia del gen plp2 entre las especies B. bovis (bbovT2Bo), B. bigemina
(bbigBOND), B. divergens (bdiv1802A), B. microti (bmicRI), B. ovata (bovaMiyake).

Figura Suplementaria 2: Análisis de la sintenia de los genes adyacentes plp3, plp7 y plp8 entre las especies B.
bovis (bbovT2Bo), B. bigemina (bbigBOND), B. divergens (bdiv1802A), B. microti (bmicRI), B. ovata (bovaMiyake).
 Anexo I – Figuras suplementarias

Figura Suplementaria 3: Análisis de la sintenia del gen plp4 entre las especies B. bovis (bbovT2Bo), B. bigemina
(bbigBOND), B. divergens (bdiv1802A), B. microti (bmicRI), B. ovata (bovaMiyake).

121
 Anexo I – Figuras suplementarias

Figura Suplementaria 4: Análisis de la sintenia del gen plp5 entre las especies B. bovis (bbovT2Bo), B. bigemina
(bbigBOND), B. divergens (bdiv1802A), B. microti (bmicRI), B. ovata (bovaMiyake).

Figura Suplementaria 5: Análisis de la sintenia del gen plp6 entre las especies B. bovis (bbovT2Bo), B. bigemina
(bbigBOND), B. divergens (bdiv1802A), B. microti (bmicRI), B. ovata (bovaMiyake).

122
9 ANEXO II – TÉCNICAS Y PROTOCOLOS DE BIOLOGÍA MOLECULAR

9.1 CEPAS Y MEDIOS DE CULTIVO BACTERIANOS

En el presente trabajo se utilizaron las cepas de Escherichia coli DH5α para la producción de ADN
plasmídico y BL21-AI para la expresión de proteínas recombinantes. Todos los cultivos bacterianos se
realizaron en medio Luria-Bertani (LB). En el caso de los medios LB líquidos, los cultivos fueron crecidos
en agitación (200 rpm) a una temperatura controlada de crecimiento de 37 °C, a menos que se indique
lo contrario. Los cultivos se agitaron en recipientes apropiados al volumen de cultivo, considerando
que el volumen total de cultivo no supere el 15% de la capacidad total del recipiente. En el caso de los
medios de cultivo semisólido se agregó 1,5 g de Bacto-agar (BD, Biosciences) por cada 100 ml de LB
líquido. Cuando fue necesario seleccionar las bacterias transformadas, se utilizaron las siguientes
concentraciones de antibiótico: ampicilina 100 µg/ml, estreptomicina 25 µg/ml, espectinomicina 100
µg/ml, kanamicina 15 µg/ml.

Los clones bacterianos se conservaron tomando un volumen del cultivo en fase estacionaria en glicerol
estéril al 50% y se los almacenó en freezer a -80 °C.

9.2 EXTRACCIÓN DE ADN GENÓMICO

En este trabajo se realizó extracción de ADN de las cepas de B. bovis S2P, T2Bo y T3Bo, que fueron
multiplicadas en cultivos in vitro de eritrocitos bovinos en el laboratorio de Inmunología de la Estación
Experimental Agropecuaria del INTA Rafaela (Santa Fe) o en el laboratorio del Dr. Carlos Suarez (USDA-
WSU; Pullman, Washington, EE. UU.). Para la extracción de ADN se utilizó un kit comercial de
extracción (ADN PuriPrep-S kit, INBIO-HIGHWAY), siguiendo el protocolo para extracción de ADN a
partir de sangre entera sugerido por el fabricante con la salvedad de que la elución del ADN se realizó
utilizando un volumen de 70 μl de buffer de elución. Las muestras fueron guardadas a -20 °C hasta su
utilización.

9.3 TÉCNICA DE REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) DE TIEMPO FINAL

Para la amplificación de los diferentes fragmentos génicos necesarios en este trabajo, se realizaron
reacciones de PCR en un volumen final de 50 µl, utilizando como templado 200 ng de ADN ya sea de
 Anexo II – Técnicas y protocolos de biología molecular

origen genómico o plasmídico. La mezcla de reacción y los perfiles de ciclado se detallan en las tablas
8 y 9 mientras que los cebadores o “primers” específicos utilizados en este trabajo son listados en el
anexo III. En todos los casos se usó la enzima Platinum™ Pfx DNA Polymerase (Invitrogen) que presenta
actividad proofreading (actividad exonucleasa 3’ 5’) que permite minimizar los errores en la
transcripción. Para todas las reacciones de PCR se incluyó al menos un control negativo (ddH2O) para
descartar contaminaciones y en los casos en los que fue posible, un control positivo para comprobar
el correcto funcionamiento de los reactivos. Una alícuota del producto de PCR fue analizada mediante
electroforesis en geles de agarosa.

Concentración final Vfinal 50 µl

10X Pfx Amplification Buffer 1X 5 µl
Mezcla de dNTPs 2,5 mM 0.2 mM 4 µl
MgSO4 50 mM 1 mM 1 µl
Cebador forward 20 µM 0.4 µM 1 µl
Cebador reverse 20 µM 0.4 µM 1 µl
Platinum™ Pfx DNA Polymerase 1U 0.4 µl
ADN 200 ng X µl
ddH2O - Hasta 50 µl
Tabla 8: Mix de reacción de PCR usadas en este trabajo.

Etapa Temperatura Tiempo Repeticiones

Desnaturalización
94 °C 5’ X1
inicial
Desnaturalización 94 °C 15’’
Dependiendo de la temperatura de
Hibridación 30’’ X 35
hibridación de cada par de cebadores
Extensión 68 °C 1’ por kb
Extensión final 68 °C 10’ X1
Tabla 9: Ciclado genérico utilizado en este trabajo. La temperatura de hibridación y la extensión específicos son
mencionados a lo largo del trabajo.

9.4 ELECTROFORESIS EN GELES DE AGAROSA

Se utilizaron geles de agarosa en concentración 0.8% - 1%, dependiendo del tamaño de la molécula
de ADN que se estuviera analizando. La electroforesis se realizó en buffer TAE 1X (Tris-acetato 10 mM,
EDTA 1 mM). Para visualizar las bandas de ADN, se adicionó 0.5 µg/ml de bromuro de etidio (Promega)
a la preparación del gel. Para sembrar las muestras, se utilizó el buffer de siembra (glicerol 50%, TAE
5X, azul de bromofenol 1%). Para identificar el tamaño de las bandas de amplificación se utilizó un

124
 Anexo II – Técnicas y protocolos de biología molecular

marcador de ADN (1Kb Plus DNA Ladder, Invitrogen). Los geles se fotografiaron utilizando un
transiluminador de luz ultravioleta y se digitalizaron utilizando el equipo GelDoc (BioRad) y el software
Quantity One 1-D Analysis Software (versión 4.6.3) provisto por el fabricante.

9.5 PURIFICACIÓN DE ADN A PARTIR DE GELES DE AGAROSA

Las bandas de ADN resueltas mediante geles de agarosa se escindieron del gel utilizando un bisturí y
se purificaron utilizado el kit Qiaex II purification system (Qiagen) siguiendo las instrucciones del
fabricante. El ADN obtenido se resuspendió en buffer Tris-HCl 10 mM, pH 8.

9.6 REACCIONES DE LIGADO MOLECULAR

Para el ligado molecular de un inserto a un plásmido se utilizó la enzima T4 DNA Ligasa (NEB). Se
preparó una mezcla de reacción en un volumen final de 10 µl conteniendo 1 µl del buffer de ligación
10X, 50 ng de vector linealizado y desfosforilado (previamente cuantificado mediante
espectrofotometría, Nanodrop ND-1000, Thermo Fisher Scientific), cantidad necesaria de inserto para
obtener una relación molar (3:1) inserto:vector, 0.5 µl de ligasa y agua hasta alcanzar el volumen final.
En todos los casos se realizaron controles de ligación del vector sin inserto para evaluar la tasa de
religación del vector. La mezcla de ligación se incubó a 16 °C durante 16 hs y luego fue inactivada por
calor a 65 °C por 10 minutos.

En los casos en los que los insertos fueron ligados en el plásmido comercial pGEM-T Easy (Promega) se
procedió según el protocolo sugerido por el fabricante.

9.7 TRANSFORMACIÓN DE BACTERIAS E. COLI COMPETENTES QUÍMICAS

Las bacterias E. coli de las cepas DH5α y BL21-AI se hicieron químicamente competentes para la
transformación mediante el método de Hanahan, 1985 y se mantuvieron congeladas en alícuotas a -
80 °C hasta su uso. Al momento de la transformación, se descongelaron en hielo y se agregó el
producto de la ligación a 50 µl de bacterias, se mezcló suavemente y se incubó en hielo 1 hora. A
continuación, se realizó un choque térmico a 42 °C por 90 segundos seguido de una incubación en hielo
por 5 min. Luego, se agregaron 200 µl de medio LB, se incubó a 37 °C con agitación suave durante 1
hora y se sembraron las bacterias transformadas en placas de LB-Agar con el antibiótico

125
 Anexo II – Técnicas y protocolos de biología molecular

correspondiente al gen de resistencia de cada vector utilizado. Las placas se incubaron a 37 °C toda la
noche.

9.8 TRANSFORMACIÓN DE BACTERIAS E. COLI POR ELECTROPORACIÓN

Para la construcción del plásmido de transfección se utilizó como método de transformación la

electroporación de bacterias para aumentar la eficiencia. En este caso se procedió según el método de
Lessard, 2013.

9.9 MINIPREPARACIONES DE ADN

Se utilizó el método de Birnboim y Doly, 1979 con algunas modificaciones. Se partió de 5 ml de cultivo
de bacterias en medio LB con el antibiótico correspondiente al gen de resistencia presente en el
plásmido, cultivadas toda la noche a 37 °C en agitación. Las bacterias se cosecharon por centrifugación
a 10000 x g en una microcentrífuga de mesada y se resuspendieron en 300 µl de Solución I (Tris-HCl 25
mM pH 8, EDTA 10 mM, glucosa 50 mM). Luego, se agregaron 300 µl de Solución II (NaOH 0.2 N, SDS
1%) mezclando suavemente por inversión y se incubó 5 min a temperatura ambiente. Finalmente, se
agregaron 400 µl de Solución III (acetato de potasio 5 M) y se mezcló por inversión. El floculado se
centrifugó a 10000 x g durante 10 min a 4 °C, se tomó el sobrenadante libre de floculado y se traspasó
a un tubo de 1,5 ml limpio, donde se precipitó el ADN plasmídico por el agregado de 1 volumen de
isopropanol y centrifugación a 10000 x g durante 15 min, a 4 °C. Se lavó el precipitado con etanol 70%,
se secó a 37 °C y finalmente se resuspendió en 50 µl de agua con ARNasa (100 µg/ml) y se incubó a 60
°C durante 5 min. Para verificar la presencia, integridad y orientación de los diferentes insertos en cada
estrategia de clonado, se digirieron de 5 µl de esta solución con las enzimas de restricción apropiadas.

Para la preparación de ADN plasmídico de alta calidad que luego fueron utilizados para la
secuenciación o para transfección de células, se usaron los kits comerciales Wizard Minipreps
(Promega) y EndoFree Plasmid Maxi Kit (Qiagen), respectivamente. La concentración de ADN y la
calidad y pureza del mismo fue determinada en un espectrofotómetro Nanodrop ND-1000 (Thermo
Fisher Scientific).

126
 Anexo II – Técnicas y protocolos de biología molecular

9.10 DIGESTIÓN DE ADN USANDO ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

En todos los casos en los que se utilizaron enzimas de restricción, se siguieron las instrucciones del
fabricante. Las enzimas utilizadas fueron de las marcas Promega y NEB.

9.11 SECUENCIACIÓN DE ADN

La secuenciación automática de las construcciones generadas en este trabajo se realizó en la Unidad

de Genómica del Instituto de Biotecnología (CICVyA, INTA), mediante la utilización del equipo 3130 xl
Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA).

9.12 EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES

Para la expresión de proteínas en este trabajo se utilizó principalmente la cepa E. coli BL21-AI. Esta
cepa posee el gen que codifica para la T7 RNA polimerasa ubicado río arriba del promotor araBAD
inducible por arabinosa.

En primer lugar, se realizó un cultivo inicial o “starter” de 5 ml de medio LB con el antibiótico

correspondiente, inoculado con una colonia aislada de la transformación de E. coli BL21-AI con el
plásmido conteniendo la secuencia de la proteína a expresar. El cultivo se incubó a 37 °C en agitación
durante 16 hs. Luego se realizó un cultivo de mayor volumen (10-100 ml) inoculado con el cultivo
“starter” en una dilución 1/20. Este se dejó crecer a 37 °C hasta alcanzar una OD560 de entre 0.4 y 0.6,
momento en el cual se procedió a su inducción con 0.1-0.2% de Arabinosa (Sigma – Aldrich) estéril y
se incubó a la temperatura de inducción apropiada para cada proteína. Se dejaron progresar los
cultivos durante 4-16 hs, se los centrifugó y se realizó una corrida en geles de poliacrilamida en
condiciones desnaturalizantes para evaluar la producción de la proteína de interés.

En este trabajo se realizaron pruebas de expresión de proteínas en otras cepas (Rosetta, BL21 inducible
por IPTG) y se siguió el protocolo anterior, usando el inductor apropiado.

9.13 ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS EN GELES DE POLIACRILAMIDA (SDS – PAGE)

Se utilizaron geles desnaturalizantes de poliacrilamida de concentraciones de 8 a 15%, dependiendo

del tamaño de la proteína a analizar. El grado de entrecruzamiento acrilamida:bisacrilamida utilizado

127
 Anexo II – Técnicas y protocolos de biología molecular

fue 29:1. Se utilizaron minigeles de 6 x 9 cm (Miniprotean III, Biorad), los cuales fueron sometidos a
una corriente constante de 100 V en buffer Laemmli 1X (Tris-HCl 25 mM pH 8.8, glicina 190 mM, SDS
0.1%). Antes de sembrar las proteínas, estas fueron hervidas en buffer de siembra (125 mM Tris-HCl
pH 6.8, 20% Glicerol, 4% SDS, 10% β-Mercaptoetanol, 0.5 mg/ml azul de Bromofenol) durante 10
minutos.

9.14 TINCIÓN DE PROTEÍNAS EN SDS- PAGE CON COLORANTE COOMASSIE BLUE

Los geles de poliacrilamida se incubaron en una solución de colorante Coomassie Brilliant Blue R250
0.05% (Sigma – Aldrich) en metanol 21% y ácido acético 7%, por 1-2 hs con agitación suave. Se retiró
la solución de tinción y se decoloró el exceso de colorante por incubación con solución de lavado
(metanol 21%, ácido acético 7%), en agitación.

9.15 ELECTROTRANSFERENCIA DE LAS MEMBRANAS DE NITROCELULOSA

Luego de la electroforesis, los geles de poliacrilamida fueron electrotransferidos. Para ello, se cortaron
rectángulos de nitrocelulosa (GE Healthcare) de tamaño algo mayor que el de los geles y se hidrataron
durante 5 min. Se dispuso sobre la cara del cassette de transferencia correspondiente al electrodo
negativo (Bio-Rad) una esponja de tipo Scotch Brite (BioRad), un papel de filtro Whatmann 3 mm, el
gel de poliacrilamida, el papel de nitrocelulosa, un papel de filtro Whatmann 3 mm y una esponja del
tipo Scotch Brite. Los cassettes se montaron dentro de la cuba de transferencia (Bio-Rad), se llenó con
buffer de transferencia (Tris-HCl 25 mM pH 8.8, glicina 190 mM, metanol 20%) y se transfirieron las
proteínas de los geles a los filtros de nitrocelulosa aplicando una corriente constante de 200 mA
durante 2 horas.

9.16 DETECCIÓN INMUNOLÓGICA DE LAS PROTEÍNAS POR WESTERN BLOT

Las membranas de nitrocelulosa se bloquearon durante 1 h a temperatura ambiente o 16 hs a 4 °C en

solución de bloqueo (PBS 1X, Tween-20 0.05%, leche descremada 5%). Luego, se lavaron con solución
de lavado (PBS 1X- Tween-20 0.05%) y se incubaron con diluciones apropiadas de los anticuerpos
específicos en PBS 1X Tween-20 0.05% leche 3%. Tras 1 h de incubación a temperatura ambiente con

128
 Anexo II – Técnicas y protocolos de biología molecular

agitación suave, se lavaron las membranas tres veces con solución de lavado por 10 min y se incubaron
con el segundo anticuerpo en PBS 1X Tween-20 0.05% leche 3%.

En los casos en los que se reveló con un método colorimétrico se usaron anticuerpos cabra anti-ratón,
cabra anti-conejo y cabra anti-bovino conjugados con la enzima fosfatasa alcalina (Sigma - Aldrich) en
una dilución 1:10000. Tras 1 h de incubación a temperatura ambiente con agitación suave, se lavaron
las membranas tres veces con solución de lavado por 10 min, una vez con el buffer de revelado de
fosfatasa alcalina (Tris-HCl 100 mM pH 9.5, NaCl 100 mM, MgCl2 5 mM) por 10 min y se agregaron 10
ml de solución de revelado conteniendo 10 ml de buffer de revelado, 66 µl de nitro blue tetrazolium
(NBT, 50 mg/ml en dimetilformamida 70%, Promega) y 33 µl de bromo-clorndoil-fosfato (BCIP, 50
mg/ml en dimetilformamida 100%, Promega). Se incubó con agitación suave por 10 min en oscuridad,
hasta visualizar las bandas. La reacción de revelado se detuvo por lavados con agua y las membranas
se secaron y se resguardaron de la luz.

Cuando se eligió cómo método de revelado el quimioluminiscente, como anticuerpo secundario se usó
un anticuerpo cabra anti-ratón conjugado con la enzima peroxidasa (HRP, abcam). Se incubó la
membrana con una dilución 1:10000 del anticuerpo durante 1 h a temperatura ambiente con agitación
suave. Luego la membrana se lavó tres veces con solución de lavado por 10 min y se procedió al
revelado con el kit Pierce™ ECL Western Blotting Substrate, siguiendo las instrucciones del fabricante.

9.17 PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES

Todas las proteínas expresadas en este trabajo fueron clonadas de manera tal que poseen un tag de 6
histidinas (6x-His tag) en el extremo N-terminal de la proteína, lo que permite su purificación con
resinas de níquel. Una vez comprobada la expresión de la proteína por SDS-PAGE se separó la fracción
soluble de los cuerpos de inclusión. Para esto se centrifugaron los cultivos bacterianos inducidos a
13000 rpm durante 10 minutos a 4 °C. El sobrenadante fue descartado y el pellet resuspendido en 4
ml de buffer de extracción (Tris HCl 100 mM, NaCl 1M, Glicerol 20%, Tween-20 1%, Imidazol 20 mM)
cada 100 ml de cultivo, durante 2 horas a 4 °C y en agitación suave. Posteriormente se sonicó la
muestra (Sonics vibra-cell VCX 750, Thermo Fisher Scientific) usando un ciclo de 1 min alternando 1’’
ON, 1’’ OFF a una potencia de 30%, tres veces. Luego se centrifugó a 10000 rpm durante 30 minutos a
4 °C. Tanto el pellet como el sobrenadante de esta centrifugación fueron analizados mediante SDS-
PAGE para determinar si la proteína a purificar se encontraba soluble (sobrenadante) o en cuerpos de
inclusión (pellet).

129
 Anexo II – Técnicas y protocolos de biología molecular

En los casos en los que la proteína se encontraba formando cuerpos de inclusión, la misma se purificó
en condiciones desnaturalizantes. Para esto se incubaron los cuerpos de inclusión en buffer de
extracción con urea 8 M para solubilizarlos, durante 2 hs a 37 °C. Luego se incubó la muestra con 2 ml
de resina de níquel (HisPur™ Ni-NTA Resin, ThermoFisher) previamente equilibrada, en agitación suave
y a temperatura ambiente. Una vez terminada la incubación, la suspensión se centrifugó a baja
velocidad para precipitar la resina y recuperar el sobrenadante. Luego de la salida del percolado, la
resina se lavó con 10 volúmenes de buffer de lavado (Tris HCl 100 mM, NaCl 500 mM, Glicerol 20%,
Tween-20 1%) con urea 8 M. Finalmente, la proteína se eluyó de la resina con buffer de elución (Tris
HCl 50 mM, NaCl 300 mM, Glicerol 20%, Tween-20 1%) conteniendo urea 8 M agregando
concentraciones crecientes de Imidazol (250 mM, 500 mM y 1 M). Todas las alícuotas, incluyendo el
percolado y los lavados, fueron almacenados y analizados mediante SDS-PAGE para evaluar en que
fracción se encuentra la proteína purificada.

Si por el contrario la proteína se encuentra en la fracción soluble, se procedió a su purificación en

condiciones nativas. Para esto se incubó el sobrenadante con la resina de níquel (HisPur™ Ni-NTA
Resin, ThermoFisher) previamente equilibrada, en agitación suave y a 4 °C para evitar la degradación
de la proteína. Luego el protocolo se continuó tal como se mencionó para la purificación de la proteína
desde los cuerpos de inclusión, con la diferencia de que no se agregó a urea 8 M y todas las
incubaciones y centrifugaciones se hicieron en frio, a 4 °C.

La concentración de la proteína en las fracciones eluidas se cuantificó por medio de una curva estándar
de seroalbúmina bovina utilizando el kit Micro BCA Protein Assay Reagent (Pierce). Las fracciones
eluidas se guardaron a -20 °C hasta su uso.

9.18 SOUTHERN BLOT

Para realizar el Southern blot, 1 µg de ADN genómico de cada muestra a analizar fue digerido con 1 µl
de la enzima de restricción apropiada (en este caso BglII) por 16 hs a 37 °C. A las muestras digeridas y
también una alícuota de 1 µg de muestra sin digerir se les agregó buffer de siembra (glicerol 50%, TAE
5X, azul de bromofenol 1%) y fueron separadas por electroforesis en un gel de agarosa 1% con SYBR-
Safe (Invitrogen). En el gel se incluyó una alícuota de xileno cianol FF (Sigma Aldrich) que permite
visualizar el frente de corrida, un marcador de tamaño molecular marcado con digoxigenina (DIG-
labeled DNA Ladder II, Roche 0.13 a 23.2 kb) y otro marcador de tamaño molecular estándar (1Kb Plus
DNA Ladder, Invitrogen) para visualizar los fragmentos con luz UV. El gel se dejó corriendo a 30 V
durante 12 a 16 hs.

130
 Anexo II – Técnicas y protocolos de biología molecular

Concluida la electroforesis, se visualizó el gel exponiéndolo brevemente a luz UV para corroborar la

presencia de los diferentes fragmentos de ADN genómico, tanto digeridos como sin digerir. El gel luego
se lavó en agua destilada estéril durante 2 min y posteriormente se lo incubó en una solución de HCl
0.25 M con agitación por 5 min y en solución de desnaturalización (1.5M NaCl / 0.5 M NaOH) en
agitación por 20 min, dos veces. El gel fue lavado en agua destilada estéril por 5 min y luego se lo
incubó en solución neutralizante (0.5 M Tris pH 7.0 / 1.5 M NaCl) por 20 min en agitación, dos veces.
A continuación, se procedió a la transferencia de los fragmentos presentes en el gel a una membrana
de nylon (Bright-Star membrane, Ambion) previamente equilibrada en solución 2X SSC (Saline sodium
citrate, Roche) por 3 min. Para la transferencia se puso en contacto el gel con la membrana y se realizó
la transferencia por difusión mediada por buffer 10X SSC durante 16 hs. Finalizada la transferencia se
enjuagó la membrana con agua para eliminar cualquier residuo del gel y se realizó el crosslinking del
ADN transferido a la membrana mediante exposición a luz UV.

Las sondas que se usaron para la hibridación fueron generadas por PCR y marcadas con digoxigenina
usando el kit comercial PCR DIG Probe Synthesis Kit (Roche) siguiendo el protocolo que se describe en
Suarez y McElwain, 2009. Para la hibridación de las sondas marcadas con el ADN fijado en la
membrana, en primera instancia se incubó la membrana con 10 ml de solución de hibridación (Roche
Easy Hybridization) dentro de una bolsa de hibridación, durante 2 hs a 45 °C en agitación. Luego se
agregó la sonda previamente desnaturalizada (95 °C por 10 min) a la solución de hibridación y se la
incubó a 45 °C por 16 hs en agitación.

Para los lavados y el revelado de la membrana se utilizó el kit comercial DIG Hybridization and Wash
buffer set (Roche) seguido de la solución de revelado CSPD ready-to-use (Roche) y se procedió según
las indicaciones del fabricante.

9.19 EXTRACCIÓN DE ARN

Los cultivos de las distintas cepas de B. bovis fueron centrifugados a 3000 x g durante 20 min a 4°C y
se descartó el medio para seguir trabajando con el paquete de glóbulos rojos infectados. El paquete
se resuspendió en 3 volúmenes de Trizol LS (Invitrogen) y la mezcla se homogeneizó y se incubó 5’ a
temperatura ambiente para lisar las células. Luego, por cada volumen de glóbulos rojos se le agregó
un volumen de cloroformo, se agitó vigorosamente durante 15’’ y se incubó durante 10’ temperatura
ambiente. A continuación, se centrifugó a 12000 x g durante 15’ a 4 °C. La fase acuosa que contiene el
ARN fue transferida a un nuevo tubo y el ARN fue precipitado con 2 volúmenes de isopropanol por
cada volumen de glóbulos rojos y se incubó durante 10’ a temperatura ambiente. Se centrifugó a 12000

131
 Anexo II – Técnicas y protocolos de biología molecular

x g durante 20’ a 4 °C. Se obtuvo un sedimento transparente correspondiente al ARN que fue lavado
dos veces con etanol 75% (1 volumen de etanol 75% por cada volumen de Trizol) y centrifugado a 7500
x g durante 5’ a 4°C. Luego de descartar el sobrenadante del segundo lavado, el pellet se dejó secar a
temperatura ambiente durante 10’. Finalmente, el ARN se resuspendió en 25 µl de agua tratada con
DEPC (pirocarbonato de dietilo) y por lo tanto libre de RNAsa incubándolo a 55°C por 10’. El ARN fue
cuantificado mediante espectrofotometría (Nanodrop ND-1000, Thermo Fisher Scientific) y guardado
a -80°C hasta su uso.

9.20 SÍNTESIS DE ADN COPIA (ADNC)

Para obtener ADN copia (ADNc), en primer lugar el ARN obtenido fue tratado con la enzima Ambion™
DNase I (libre de RNAsa), siguiendo el protocolo del fabricante. De esta manera se eliminó el ADN que
podría haber sido co-purificado con el ARN. Al finalizar el tratamiento, la enzima fue inactivada
incubándola 10’ a 75°C, habiendo previamente agregado EDTA en una concentración final de 5 mM
para evitar daños en el ARN.

La síntesis del ADNc se realizó usando el kit SuperScript™ First-Strand Synthesis System for RT-PCR
(Invitrogen) siguiendo las indicaciones del fabricante para la utilización de random primers. En paralelo
se realizó un control negativo al que se le agregaron todos los reactivos exceptuando la enzima retro-
transcriptasa (control RT-). El ADNc resultante fue guardado a -20 °C hasta su uso.

9.21 REACCIONES DE PCR EN TIEMPO REAL (QPCR)

Las reacciones de qPCR se realizaron usando el kit SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix
(Biorad), en un volumen final de reacción de 15 µl. La concentración óptima de cebadores y la
temperatura de amplificación fueron puestas a punto para cada fragmento a amplificar, de manera tal
de obtener una eficiencia de amplificación máxima. En todos los casos se realizaron tres replicas
técnicas para cada muestra a analizar, y se incluyeron los controles negativos (mix de reacción sin ADN)
y positivos apropiados. Las condiciones de ciclado que se detallan en la tabla 10. La temperatura de
hibridación fue determinada experimentalmente y coincide para los tres pares de cebadores usados
en este trabajo. Al finalizar el ciclado se realizó una curva de disociación (melting) para evaluar la
especificidad de la amplificación.

132
 Anexo II – Técnicas y protocolos de biología molecular

Los ensayos se llevaron a cabo usando el equipo StepOnePlus Real -Time System (Applied Biosystems)
y los datos fueron analizados usando el software StepOne™ v2.3 asociado al equipo, tanto para las
determinaciones de curvas estándar, como para la cuantificación relativa de los amplicones en las
diferentes muestras.

Etapa Temperatura Tiempo Repeticiones

Desnaturalización inicial 98 °C 10’ X1
Desnaturalización 98 °C 15’’
X 40
Hibridación + Extensión 62 °C 1’
Curva de melting
Tabla 10: Ciclado utilizado en este trabajo para las reacciones de qPCR.

133
10 ANEXO III – CEBADORES Y PLÁSMIDOS

Nombre del cebador Secuencia T° hibridación

BboPLP1_MACPF Fw ACTGATGCCGAAGGAAG 59.7 °C
BboPLP1_MACPF Rv TCAATCGCGGCGGTACAA 63.2 °C
M13 Fw GTAAAACGACGGCCAG 56.2 °C
T7 promotor TAATACGACTCACTATAGGG 47.5 °C
5’UTR_BboPLP1 Fw GCGTGCCTCGAGAAAACCGCTTGTGTTTAACG 52.1 °C
5’UTR_BboPLP1 Rv GCGTGCCTCGAGTGCGATAATAAGTGAAATGTGTC 51.3 °C
3’UTR_BboPLP1 Fw CGCTATGGATCCCAGACATGGTACCCCTGTAAC 52.4 °C
3’UTR_BboPLP1 Rv CGCTATGGATCCCTACCAGTAAGTAATCGGTTGTTTT 53.1 °C
5'UTR PLP1 external Fw CAAGCTATGCCACCTTCGTAA 55.1 °C
3'UTR PLP1 external Rv CGGTAGAGGACCCTTCCGTA 57.8 °C
bsd Fw ATGGCCAAGCCTTTGTCTCAAG 58 °C
egfp Rv CTTGTACAGCTCGTCCATGC 56 °C
PLP1 ORF Fw AAGAAGACAGGCATTAAAAGC 51.2 °C
PLP1 ORF Rv GCATACAGCACTTCCACCAG 56.1 °C
msa1 Fw ATGGCTACGTTTGCTCTTTTCATTTC 56.4 °C
msa1 Rv AAATGCAGAGAGAACGAAGTAGC 55.1 °C
plp1 qPCR Fw GTTGACCCAGGATACAGGCATC 57.6 °C
plp1 qPCR Rv GATCCATCCACCCTTAGGCTCT 58.2 °C
plp5 qPCR Fw GTTCGCAATGTCATCAGGTT 53.5 °C
plp5 qPCR Rv GCAGCTCATTCAACGCAATATC 54.8 °C
hsp20 qPCR Fw GAACCCGATTACTTTCAACCCA 55.1 °C
hsp20 qPCR Rv TGTCAGTGCTGCTGAAACCAG 57.9 °C
Tabla 11: Listado de cebadores o primers usados en este trabajo.
 Anexo III – Cebadores y plásmidos

Los diferentes vectores que se utilizaron en este trabajo se listan en la Tabla XXX.

Vector Descripción
pCR™8/GW/TOPO™ Vector de entrada del sistema Gateway
Gateway™ pDEST™17 Vector de expresión del sistema Gateway
pDEST17+PLP1_MACPF Plásmido de expresión de PLP1_MACPF generado con el sistema
Gateway
pGEM®-T Easy Vector de clonado tipo T
pGEM-T+5’UTR_PLP1 Plásmido pGEM-T con una porción de la región 5’UTR del gen plp1
pGEM-T+3’UTR_PLP1 Plásmido pGEM-T con una porción de la región 3’UTR del gen plp1
plásmido 3-177-042 Esqueleto del plásmido de transfección para B. bovis cedido por Dr.
Suarez
pBbo∆plp1 Plásmido de transfección completo conteniendo los extremos 5’ y 3’
UTR del gen PLP1 de B. bovis (esquema en figura 13)
Tabla 12: Listado de vectores usados en este trabajo.

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