Deshidrogenasa Láctica

DESHIDROGENASA LCTICA Antes
Al tubo #1 se le agreg 1 ml de lactato al 1%, 1 ml de KCN al 0.5%, 0.30 ml de azul de metileno 0.002M, 1 ml de la coenzima NAD+. Al tubo #2 se le agreg 1 ml de lactato al 1%, 1 ml de KCN al 0.5%, 0.30 ml de azul de metileno 0.002M, 1ml de agua. Al tubo #3 se le agrego 1 ml de KCN al 0.05%, 0.30 de azul de metileno 0.002M, 1 ml de agua y 1 ml de coenzima NAD+. Al tubo #4 se le agrego 1 ml de lactato al 1%, 1 ml de KCN al 0.5%, 0.30 ml de azul de metileno 0.002M, 1 ml de agua y 1 ml de coenzima NAD+. Al tubo #5 se le agrego 1 ml de lactato al 1%, 0.30 ml de azul de metileno 0.002M, 1ml de agua y 1 ml de coenzima NAD+. Ya que se agreg a cada tubo lo correspondiente, se les agreg 1 ml de la enzima LDH, solo al tubo #4 NO se le agreg la enzima, se mezclaron y se mantuvieron en hielo hasta que se les agreg una capa de aceite mineral de aproximadamente 0.5 ml. Posteriormente se incubo a bao mara a 37C y se anotaron los resultados conforme a la siguiente tabla.
TUBO No. OBSERVACIN INICIAL: 2 min 5 min
1
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2
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3
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4
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5
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++++
++++
++++
++++
7 min 10 min 15 min
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++ +
++ +
++++ ++++
+++ ++
Despus
La enzima deshidrogenasa lctica pertenece a la clase de las oxido-reductasas, en esta reaccin tuvimos como sustrato al lactato que con la enzima LDH y la coenzima NAD+ se oxidara a piruvato. El proceso se puede evidenciar mediante el uso de un aceptor electrnico artificial comoel azul de metileno, que es coloreado cuando se encuentra oxidado e incoloro cuando sereduce, en la medida en que se reoxida la coenzima NAD+.Cuando el azul de metileno seencuentra en contacto con el oxgeno del aire, se reoxida tomando la coloracin azul yformando perxido de hidrgeno, por esta razn el sistema se asla mediante una capa deaceite mineral. (UTADEO, 2005). En el tubo #1 agregamos la enzima, la coenzima, el sustrato, el azul de metileno y un inhibidor de la cadena respiratorio que es el KCN, por lo que la decoloracin del azul de metileno debi ser mnima. Esta coloracin debi ser igual para el tubo # 2, debido a que
no agregamos la coenzima NAD+, debido a que usamos unextracto en crudo de la LDH, puede haber ah mismo la coenzima NAD+, que permite el funcionamiento de la LDH. En el tubo nmero tres no debi de haber coloracin, ya que no haba sustrato, pero de igual forma, como se us un extracto crudo, pudo haber ms enzimas que permitieran la reduccin del azul de metileno. En el tubo #4, NO debe de haber reaccin porque NO hay enzima, y el color azul se mantiene durante toda la incubacin. Y en el tubo #5 es una reaccin normal donde el azul de metileno tiene que desaparecer ya que agregamos todos los elementos esenciales para que se lleve a cabo la reaccin. DESHIDROGENASA SUCCINICA Al tubo #1 se le agreg 0.50 ml de succinato de sodio, 0.30 ml de azul de metileno 0.002M y 1 ml de agua. Al tubo #2 se le agreg 0.50 ml de succinato de sodio, 0.30 ml de azul de metileno 0.002M, 3 ml de agua. Al tubo #3 se le agreg 0.30 ml de succinato de sodio y 1.5 ml de agua. Al tubo #4 se le agreg 0.50 ml de succinato de sodio, 0.30 ml de azul de metileno y 1 ml de malonato de sodio. Al tubo #5 se le agreg 0.50 ml de succinato de sodio, 0.30 ml de azul de metileno, 0.50 ml de malonato de sodio y 0.50 ml de agua. Al tubo #6 se le agreg 0.50 ml de succinato de sodio, 0.30 ml de azul de metileno, 0.25 ml de malonato de sodio, y 0.75 ml de agua. Al tubo #7 se le agreg 0.50 ml de succinato de sodio, 0.30 ml de azul de metileno, 0.25 ml de malonato de sodio y 0.25 ml de agua. A los tubos se les agreg 2 ml de SDH-CIT, solo al tubo #2 NO se le agrego la enzima, se mezclaron bien y se mantuvo en hielo hasta que se les agrego 0.5 ml de aceite vegetal. Posteriormente se incubaron a 37C conforme la siguiente tabla. TUBO NO. Observacin 0 min: 2 min 4 min 6 min 8 min + + ++ ++ +++ 1 + + ++ ++ +++ 2 + + ++ ++ +++ 3 + + ++ ++ +++ 4 + + ++ ++ +++ 5 + + ++ ++ +++ 6 + + ++ ++ +++ 7
10 min 15 min 20 min
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++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ +++ + ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ +++ +
La succinatodeshidriogenasa es una enzima que se encuentra asociada a la membranainterna de la mitocondria, esta remueve 2 protones y 2 electrones del succinato para dar origenal fumarato, oxidacin asociada a la coenzima FAD, que transfiere los electrones a la cadenade transporte de electrones. Este proceso es inhibido en forma competitiva con la presencia deotros cidos dicarboxlicos como el malonato, malato, oxalactico y oxlico, los cuales se unenfuertemente al sitio activo de la enzima, lo que genera la acumulacin de succinato. En el tubo #1 no hay inhibidor que es el malonato de sodio, por lo que la coloracin, fue tornndose ms clara. En el tubo #2 la coloracin del azul de metileno se mantuvo ya que no se le agreg la enzima. En el tubo #3, tampoco se observ reaccin debido a que no hay sustrato. En el tubo #4, tampoco se observ la reaccin debido a la accin inhibidora del malonato de sodio, en el tubo #5 al agregar una cantidad igual de sustrato que de inhibidor, la reaccin se fue tornando un poco ms clara. En los tubos #6 y #7 se observ una coloracin an ms clara debido a que se agreg ms sustrato que inhibidor. CITOCROMOS Y CITOCROMO OXIDASA En el tubo #1 agregamos 1.1 ml de agua, 1 ml de SDH-CIT, y 1 ml de p-fenilndiamina 1%. En el tubo #2 agregamos 2.1 ml de agua y 1ml de p-fenilndiamina. En el tubo #3 agregamos 1 ml de KCN 0.5%, 0.1 ml de agua, 1ml de SDH-CIT y 1 ml de p-fenilndiamina 1%. Al tubo #4 le agregamos 0.1 ml de alfa-naftol 0.15% , 1ml de agua, 1 ml de SH-CIT y 1 ml de p-fenilndiamina 1%.
Al tubo #5 le agregamos 1 ml de KCN 0.5 %, 0.1 ml de alfa-naftol 0.15%, 2 ml de agua, y 1ml de p-fenilndiamina 1%. Al tubo #6 le agregamos 1ml de KCN 0.5%, 0.1ml de alfta-naftol, 1 ml de SDH-CIT y 1 ml de p-fenilndiamina. Al tubo #7 le agregamos 1ml de KCN 0.5%, 0.1 ml de alfa-naftol, 1 ml de agua y 1 ml de p-fenilndiamina. Al tubo #8 le agregamos 2.1 ml de agua y 1 ml de SDH-CIT. Incubamos a bao mara a 37c conforme a la siguiente tabla: TUBO NO. Observacin 0 min: 1 min 2 min 4 min 6 min 8 min 10 min 1 +++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ 2 3 4 5 6 +++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ + + + + 7 8
+++ +++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
La cadena de transporte de electrones o fosforilacin oxidativa es un proceso que se lleva acabo en la membrana interna mitocondrial y est constituido por una serie de complejosenzima-coenzima de oxidorreductasas y ferroprotenas. El complejo citocromo oxidasa es elcomponente final de la cadena y est constituido por el citocromo a y a3 y dos iones Cu (II).Esta enzima es sensible a la presencia de aceptores electrnicos ms fuertes comoel cianuro, azida y monxido de carbono, entre otros, los cuales inhiben irreversiblemente estecomplejo enzimtico y se interrumpe el transporte de electrones producindose una cianosiscelular.La actividad del complejo citocromo C oxidasa puede demostrarse mediante la oxidacin desustancias como la p-fenilendiamina (pFDH2) en presencia del sistema de citocromos. Estasustancia es muy reactiva as que se condensa y polimeriza fcilmente originando mezclas depigmentos oscuros.

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