Departamento de Infectómica y Patogénesis Molecular

Biología del Parasitismo I

Citólisis causada por Entamoeba histolytica

Presenta: Biol. Cynthia Lizete Hernández Rodríguez y QFB. Ricardo Jiménez Camacho

Maestría en Infectómica y Patogénesis Molecular

La amibiasis es una enfermedad parasitaria causada por el protozoario Entamoeba
histolytica, cuya característica más prominente es su capacidad para matar a las células del
tejido que invade dentro de su hospedero, resultando en una destrucción masiva de tejidos.
Este parásito cumple un proceso de invasión muy elaborado, en el cual se secretan y expresan
proteínas que le permiten adherirse al epitelio, degradar la matriz extracelular y producir
citólisis de las células epiteliales para lograr penetrar dentro de la mucosa, inducir la muerte
celular, fagocitar y diseminarse. Estos factores de virulencia, junto con su resistencia al estrés
oxidativo, permiten al parásito sobrevivir en el hospedador y se consideran los responsables
de la patogenia. La comprensión de estos factores de virulencia ha generado una diversidad
muy amplia de estudios en diferentes áreas de las ciencias biomédicas, así como métodos
diagnósticos cada vez más sensibles y específicos, hasta candidatos para vacunas, lo que
abre nuevas expectativas terapéuticas a raíz de estos estudios.

Se ha considerado en diversos trabajos1, que la virulencia de E. histolytica es intrínseca

y depende de la capacidad infecciosa (es decir, la capacidad de colonización intestinal), así
como de la capacidad invasiva (para diseminarse y destruir tejidos del huésped), lo que le
confiere su extraordinaria capacidad para invadir y destruir los tejidos del huésped. Esta
virulencia es el resultado de una compleja interacción hospedero-parásito que implica la
interacción de diversos factores. La invasión del parásito induce una respuesta proinflamatoria
y la destrucción del tejido del huésped, lo que exacerba la enfermedad.

Los trofozoítos han desarrollado un proceso de invasión muy elaborado, en el cual

secretan y expresan proteínas que les permiten adherirse al epitelio, degradar la matriz
extracelular y producir citólisis de las células epiteliales para penetrar dentro de la mucosa;
además, fagocitan activamente bacterias y desechos de las células del huésped que les sirven
de alimento. La adherencia de los trofozoítos a las células diana es un requisito para la
colonización e invasión, y está mediada por varias moléculas. Esta adherencia se realiza
gracias a la acción citolítica de las enzimas proteolíticas que el parásito posee, como proteasas
y amebaporos, cuya acción citolítica provoca la aparición de úlceras de diversos tamaños, las
cuales, generalmente, ocasionan la perforación de la pared intestinal2.

En este sentido, los amebaporos, que subyacen a este proceso, son capaces de
incorporarse espontáneamente a las membranas de la célula huésped. Allí inducen canales
iónicos que colapsan rápidamente el potencial transmembrana celular y conducen a un estado
pre-lítico, esto lo llevan a cabo induciendo un flujo selectivo de iones3. Los amebaporos están
1
Ravdin J. I. (1989). Entamoeba histolytica: from adherence to enteropathy. The Journal of infectious diseases, 159(3), 420–429.
https://doi.org/10.1093/infdis/159.3.420.
2
Carrero, J. C., Reyes-López, M., Serrano-Luna, J., Shibayama, M., Unzueta, J., León-Sicairos, N., & de la Garza, M. (2020). Intestinal amoebiasis: 160 years of
its first detection and still remains as a health problem in developing countries. International journal of medical microbiology: IJMM, 310(1), 151358.
https://doi.org/10.1016/j.ijmm.2019.151358.
3
Horstmann, Rolf D., Leippe, Mathias y Tannich, Egbert. (1992). Destrucción del tejido del huésped por Entamoeba histolytica: moléculas que median la adhesión,
la citólisis y la proteólisis. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, 87 (Suplemento 5), 57-60. https://doi.org/10.1590/S0074-02761992000900007.
presentes dentro de la amiba en un estado agregado dentro una partícula pequeña y densa. Se
vierten al medio en forma de partículas mediante un proceso mediado por diversos estímulos.
Según diversos autores, los amebaporos constituyen una familia de péptidos pequeños (de 5
a 30 kDa) que están contenidos en vesículas del citoplasma de las amibas.

Los amebaporos pertenecen a la familia SAPLIP (saposin-like proteins), la cual se

caracteriza por tener un motivo conservado de residuos de seis cisteínas unidas por tres
puentes de disulfuro4. Los amebaporos comprenden tres isoformas A, B y C, las cuales son
integradas por 77 aminoácidos y producidas en una proporción de 35:10:1. Estas proteínas
muestran, además, una identidad en sus secuencias de aminoácidos de 35% a 57%. Diversos
estudios, liderados principalmente por Babuta y Bhattacharya5, han demostrado que la muerte
celular de los tejidos del huésped en la amebiasis invasiva ocurre inicialmente, como ya se
mencionó, por necrosis lítica mediada por los amebaporos localizados en los gránulos
citoplasmáticos, secretados por la ameba después del contacto. Esta acción lítica es similar a
la de las perforinas de los gránulos de los linfocitos T citotóxicos y los gránulos de las células
asesinas naturales, así como a los mecanismos de acción de la saponina y de la proteína B
del surfactante B.

La secreción de ameboporos, cisteína proteasas y otros factores de virulencia trae como

resultado la destrucción de los neutrófilos y la consecuente liberación de sus productos tóxicos,
que pueden amplificar las lesiones causadas por las amebas, produciéndose áreas de necrosis
en la mucosa intestinal, focos de ulceración que condicionan los cuadros clínicos de mala
absorción y disentería. Además, se ha observado que la presencia de estos incrementa la
actividad de la fosfolipasa A, una enzima de E. histolytica dependiente de Ca2+ que hidroliza
los fosfolípidos de la membrana de las células del hospedador. Los ameboporos se encuentran
directamente relacionados con la formación del absceso hepático. Cuando los niveles de este
tipo de proteínas son bajos, la virulencia se encuentra a su vez reducida.

La lisis tisular ocurre gracias a que la ameba contiene enzimas, las llamadas
“formadoras de poros”, que son enzimas proteolíticas (colagenasas y proteasas) que facilitan
la invasión de los tejidos, permeabilizan la membrana y se insertan en la bicapa lipídica de la
membrana de la célula diana por la unión con fosfolípidos aniónicos a bajo pH; allí forma
oligómeros, proceso mediado por la interacción péptido-péptido, y se expanden lateralmente,
dando lugar a una molécula de mayor tamaño 6. Esto ocasiona la degradación del colágeno y
los oligosacáridos de la matriz celular, formándose canales por los que se difunden el agua,
los iones (salida de Na+ y K+ y entrada de Ca2+) y otras pequeñas moléculas; en consecuencia,
el medio celular interno cambia y se produce la lisis celular por choque osmótico. Las amibas
que no expresan ameboporos son incapaces de matar a las células del hospedero o producir
absceso hepático amebiano. Según Nakada y cols.,7 los hepatocitos afectados por el parásito
muestran procesos indicativos de que existe una activación directa de la maquinaria de la
apoptosis, que parecería activarse durante el contacto amiba-célula por la acción inicial del
ameboporo, aunque no está claro por qué esta molécula tendría que inducir apoptosis en una
célula ya condenada a muerte8.

4
Hecht, O., Van Nuland, N. A., Schleinkofer, K., Dingley, A. J., Bruhn, H., Leippe, M., & Grötzinger, J. (2004). Solution structure of the pore-forming protein of
Entamoeba histolytica. The Journal of biological chemistry, 279(17), 17834–17841. https://doi.org/10.1074/jbc.M312978200.
5
Babuta, M., Bhattacharya, S., & Bhattacharya, A. (2020). Entamoeba histolytica and pathogenesis: A calcium connection. PLoS pathogens, 16(5), e1008214.
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008214.
6
Leippe, M., Bruhn, H., Hecht, O., & Grötzinger, J. (2005). Ancient weapons: the three-dimensional structure of amoebapore A. Trends in parasitology, 21(1), 5–
7. https://doi.org/10.1016/j.pt.2004.10.009.
7
Nakada-Tsukui, K., Watanabe, N., Maehama, T., & Nozaki, T. (2019). Phosphatidylinositol Kinases and Phosphatases in Entamoeba histolytica. Frontiers in
cellular and infection microbiology, 9, 150. https://doi.org/10.3389/fcimb.2019.00150.
8
Olivos-García, Alfonso, Saavedra, Emma, Nequiz Avendaño, Mario, & Pérez-Tamayo, Ruy. (2011). Amibiasis: mecanismos moleculares de la patogenicidad de
Entamoeba histolytica. Revista de la Facultad de Medicina (México), 54(2), 10-20. Recuperado en 16 de marzo de 2021, de
http://www.scielo.org.mx/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0026-17422011000200003&lng=es&tlng=es.
Las tres isoformas de amebaporos se han aislado y caracterizado bioquímicamente, por Tillack
y Cols9, y su estructura primaria se ha dilucidado mediante la clonación molecular de los genes
de sus precursores. Las proteínas maduras constan de 77 residuos de aminoácidos cada una
y están localizadas dentro de los gránulos citoplasmáticos. A pesar de la divergencia sustancial
de secuencia, poseen un patrón de enlace disulfuro característico y un único residuo de
histidina C-terminal conservado. Se ha determinado que la estructura secundaria de la
isoforma principal A es exclusivamente α-helicoidal, y esto también se ha predicho para los
tipos B y C. Todos los amebaporos pueden formar poros en las membranas por
oligomerización y, por lo tanto, afectan la integridad de las membranas de las células diana.
En E. dispar se ha demostrado la presencia de los tipos A y B en menor concentración y con
menor actividad biológica, lo que se cree tiene un impacto en la carencia de capacidad
patógena de esta especie10. Durante la realización del proyecto genoma de E. histolytica, se
encontró que existía homología entre las secuencias de los amebaporos y la hemolisina III, lo
cual sugiere que las hemolisinas pueden tener un papel importante en la lisis de las células del
huésped.

Como se ha mencionado antes, los mecanismos implicados en la capacidad citolítica de

Entamoeba histolytica incluyen principalmente proteínas formadoras de poros (amebaporos) y
la producción de abundantes proteasas. Para que se produzca la citólisis de las células del
hospedero se ha demostrado que es necesario que ocurra primero la adherencia de E.
histolytica a las células. Posteriormente esta citólisis puede estar determinada por moléculas
hidrolíticas y tóxicas o estimulando la apoptosis de estas células11. Dentro de estas formas de
hacer daño están los amebaporos, descritos previamente, y, por otro lado, este parásito
produce muchas proteínas con actividad proteolítica dentro de las cuales se encuentran las
cisteínas proteasas (EhCP) que pueden degradar mucina, proteínas epiteliales, matriz
extracelular, inmunoglobulinas y complemento12.

Con base en esto, además de los amebaporos, nos enfocamos en este ensayo en dos de las
enzimas cisteína proteasas de Entamoeba histolytica, denominadas EhCP5 y EhCP112, las
cuales se encuentran en la superficie del parásito y por lo cual se cree pueden jugar un papel
fundamental para que se lleve a cabo la citólisis de las células del hospedador como parte de
los mecanismos de patogenicidad que posee Entamoeba histolytica. EhCP5 se localiza en la
superficie celular del parásito, aunque también puede ser secretada y en conjunto con que aún
no ha sido identificada y caracterizada una proteína similar en la especie que no es patógena
Entamoeba dispar, sugiere que esta proteasa puede participar en el proceso de daño celular
al hospedero, y que aporta a la característica de Entamoeba histolytica de ser patogénica13.
Como menciona Babuta y Cols5, cuando sucede la interacción entre Entamoeba histolytica y
las células del hospedero existe un aumento muy evidente de Ca 2+ y su inhibición puede
prevenir la citólisis por lo que parece que el calcio puede tener un papel muy importante para
que se lleve a cabo la citólisis de las células del hospedero, sin embargo, el mecanismo de
como participa el calcio en este proceso aún es desconocido. La última publicación donde se

9
Tillack, M., Biller, L., Irmer, H., Freitas, M., Gomes, M. A., Tannich, E., & Bruchhaus, I. (2007). The Entamoeba histolytica genome: primary structure and
expression of proteolytic enzymes. BMC genomics, 8, 170. https://doi.org/10.1186/1471-2164-8-170.
10
Shabardina, V., Kischka, T., Kmita, H., Suzuki, Y., & Makałowski, W. (2018). Environmental adaptation of Acanthamoeba castellanii and Entamoeba histolytica at
genome level as seen by comparative genomic analysis. International journal of biological sciences, 14(3), 306–320. https://doi.org/10.7150/ijbs.23869.
5
Babuta, M., Bhattacharya, S., & Bhattacharya, A. (2020). Entamoeba histolytica and pathogenesis: A calcium connection. PLoS pathogens, 16(5), e1008214.
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008214.
11
Petri, W. A., Jr, & Ravdin, J. I. (1987). Cytopathogenicity of Entamoeba histolytica: the role of amebic adherence and contact-dependent cytolysis in
pathogenesis. European journal of epidemiology, 3(2), 123–136.
12
SINGH, D., NAIK, S., & NAIK, S. (2004). Role of cysteine proteinase of Entamoeba histolytica in target cell death. Parasitology, 129(2), 127-135.
13
Tillack, M., Nowak, N., Lotter, H., Bracha, R., Mirelman, D., Tannich, E., & Bruchhaus, I. (2006). Increased expression of the major cysteine proteinases by
stable episomal transfection underlines the important role of EhCP5 for the pathogenicity of Entamoeba histolytica. Molecular and Biochemical Parasitology, 149(1),
58-64.
determina la expresión de EhCP5 es del año 2020 donde Gonzalez y Cols14, evaluaron la
expresión génica de Entamoeba histolytica con diferentes formas clínicas de amebiasis donde
entre todo se encontró la sobreexpresión de EhCP5 en dos formas de amebiasis estudiadas,
reafirmando y apoyando aún más el papel fundamental que tiene esta proteasa en la
patogenicidad de este parásito. Debido a diversos estudios que apoyan este rol de EhCP5 se
da por hecho que está cisteína proteasa es muy importante para que se lleve a cabo la
infección por Entamoeba histolytica y ahora la investigación parece estar encaminada a
encontrar o desarrollar moléculas que inhiban la virulencia de este patógeno que está
conferida, entre otras, por proteasas, por ejemplo, Rangel y Cols 15 , encontraron que la
curcumina disminuye la expresión de genes asociados con la virulencia de este parásito entre
los que se encuentra EhCP5 y se correlaciona con una invasión amebiana significativamente
menor.

Por otro lado, la EhCP112 es una cisteína proteasa que puede unirse a la EhADH o EhADH112
para formar un complejo de cisteína proteasa-adhesina denominada EhCPADH o
EhPADH112, formando así una proteína heterodimérica que tiene un importante papel en la
virulencia por parte del parásito ya que participa en la citólisis de las células hospederas y
como mencionan Betanzos y Cols16, el silenciamiento de los genes que codifican la proteína
EhCP112 o EhADH en trofozoitos de Entamoeba histolytica produce una reducción del efecto
citopático que causa el parásito sobre las células epiteliales, además de que anticuerpos
dirigidos contra el complejo EhCPADH pueden inhibir la destrucción de algunas líneas
celulares en estudios in vitro y reducir la capacidad de este patógeno para producir abscesos
hepáticos en hámsteres.

Por lo mencionado anteriormente, EhCPADH y EhCP112 pueden provocar el daño del epitelio,
abriendo uniones estrechas y permitiendo el posterior alcance de otras uniones intercelulares,
como las uniones adherentes y desmosomas, donde EhCPADH y EhCP112 igualmente
participan provocando daño a estas uniones como se demostró en el estudio de Hernandez y
Cols 17 y otros; como los realizados por Betanzos y Cols 18,19 y 20 . Con respecto a la última
publicación donde se estudia al complejo EhCPADH es de Reyna y Cols21 en el año 2019, sin
embargo, nos informa sobre ella y su interacción con EhRabB en el proceso de fagocitosis de
Entamoeba histolytica y no específicamente en el proceso de citólisis. A propósito de lo
mencionado me parece que hay un campo de investigación muy interesante en la cual se
puede trabajar para seguir avanzando en la elucidación del mecanismo de citólisis mediada
por Entamoeba histolytica, encontrar otras proteínas que interaccionen con este complejo,
desarrollar métodos de diagnóstico con base en estas proteínas y posibles compuestos que
puedan inhibir al complejo EhCP112 o las proteínas formadoras de este (EhCP112 y EHADH),
sin olvidar a los ameboporos y la EhCP5, con el único objetivo de evitar la citólisis de las células

14
Gonzalez-Rivas, E., Nieves-Ramirez, M., Magana, U., Moran, P., Rojas-Velazquez, L., Hernandez, E., Serrano-Vazquez, A., Partida, O., Perez-Juarez, H., &
Ximenez, C. (2020). Differential Pathogenic Gene Expression of E. histolytica in Patients with Different Clinical Forms of Amoebiasis. Microorganisms, 8(10), 1556.
15
Azucena Rangel-Castaneda, I., Carranza-Rosales, P., Elena Guzman-Delgado, N., Manuel Hernandez-Hernandez, J., Gonzalez-Pozos, S., Perez-Rangel, A.,
& Castillo-Romero, A. (2019). Curcumin Attenuates the Pathogenicity of Entamoeba histolytica by Regulating the Expression of Virulence Factors in an Ex-Vivo
Model Infection. Pathogens, 8(3), 127.
16
Betanzos, A., Bañuelos, C., & Orozco, E. (2019). Host Invasion by Pathogenic Amoebae: Epithelial Disruption by Parasite Proteins. Genes, 10(8), 618.
17
Hernández-Nava, E., Cuellar, P., Nava, P., Chávez-Munguía, B., Schnoor, M., Orozco, E., et al. (2017). Adherens junctions and desmosomes are damaged by
Entamoeba histolytica: participation of EhCPADH complex and EhCP112 protease. Cell Microbiol. 19:e12761
18
Betanzos, A., Schnoor, M., Javier-Reyna, R., Garcia-Rivera, G., Bañuelos, C., Pais-Morales, J., & Orozco, E. (2014). Analysis of the Epithelial Damage Produced
by Entamoeba histolytica Infection. Jove-Journal of Visualized Experiments, 88, e51668.
19
Betanzos, A., Javier-Reyna, R., Garcia-Rivera, G., Bañuelos, C., Gonzalez-Mariscal, L., Schnoor, M., & Orozco, E. (2013). The EhCPADH112 Complex of
Entamoeba histolytica Interacts with Tight Junction Proteins Occludin and Claudin-1 to Produce Epithelial Damage. Plos One, 8(6), e65100.
20
Betanzos, A., Zanatta, D., Bañuelos, C., Hernandez-Nava, E., Cuellar, P., & Orozco, E. (2018). Epithelial Cells Expressing EhADH, An Entamoeba histolytica
Adhesin, Exhibit Increased Tight Junction Proteins. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology, 8, 340.
21
Javier-Reyna, R., Montano, S., Garcia-Rivera, G., Alberto Rodriguez, M., Gonzalez-Robles, A., & Orozco, E. (2019). EhRabB mobilises the EhCPADH complex
through the actin cytoskeleton during phagocytosis of Entamoeba histolytica. Cellular Microbiology, 21(10), e13071.
mediada por estas proteínas, el desarrollo de la infección y el consiguiente efecto dañino al
hospedero.

En la siguiente figura, mostramos y resumimos las principales moléculas implicadas en el

mecanismo de citólisis por Entamoeba histolytica.

Fig. 1 Principales moléculas implicadas en el proceso de citólisis por Entamoeba histolytica.