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    Biologia Molecular

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    Cristian Rojas
    Este documento compara 4 métodos para la extracción de ADN plasmídico de cepas de Rhizobium leguminosarum en diferentes fases de crecimiento. El método de Kronstad permitió visualizar 3 plásmidos en la cepa SEMIA 335 y 1 plásmido en la cepa B al usar cultivos en fase de crecimiento logarítmica temprana. Este método resultó ser el más efectivo para la extracción y visualización de plásmidos, especialmente plásmidos grandes, debido a su facilidad de implementación y bajo costo

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    Este documento compara 4 métodos para la extracción de ADN plasmídico de cepas de Rhizobium leguminosarum en diferentes fases de crecimiento. El método de Kronstad permitió visualizar 3 plásmidos en la cepa SEMIA 335 y 1 plásmido en la cepa B al usar cultivos en fase de crecimiento logarítmica temprana. Este método resultó ser el más efectivo para la extracción y visualización de plásmidos, especialmente plásmidos grandes, debido a su facilidad de implementación y bajo costo

    Título original

    Biologia Molecular (3)

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    Este documento compara 4 métodos para la extracción de ADN plasmídico de cepas de Rhizobium leguminosarum en diferentes fases de crecimiento. El método de Kronstad permitió visualizar 3 plásmidos en la cepa SEMIA 335 y 1 plásmido en la cepa B al usar cultivos en fase de crecimiento logarítmica temprana. Este método resultó ser el más efectivo para la extracción y visualización de plásmidos, especialmente plásmidos grandes, debido a su facilidad de implementación y bajo costo

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    Este documento compara 4 métodos para la extracción de ADN plasmídico de cepas de Rhizobium leguminosarum en diferentes fases de crecimiento. El método de Kronstad permitió visualizar 3 plásmidos en la cepa SEMIA 335 y 1 plásmido en la cepa B al usar cultivos en fase de crecimiento logarítmica temprana. Este método resultó ser el más efectivo para la extracción y visualización de plásmidos, especialmente plásmidos grandes, debido a su facilidad de implementación y bajo costo

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    de 7

    Universidad Pedagógica Nacional.

    Facultad de Ciencia y Tecnología.


    Licenciatura en Biología.

    Biología Molecular.

    Silva Gonzalez Daniela


    Millán Sainea Karen Daniella
    Moreno Prieto Jeisel Tatiana

    EXTRACCIÓN DE DNA PLASMÍDICO

    Los plásmidos son moléculas de ADN extracromosomal, es decir, cualquier ADN que se
    encuentra fuera de los cromosomas. Estas pequeñas moléculas por lo general van a
    presentar un tamaño circular, lineal o super enrollado (ver figura 1) y se van caracterizar por
    tener la capacidad de replicarse de manera autónoma, independientemente del cromosoma.
    Por lo general, son comunes en bacterias, sin embargo, también se han encontrado en
    hongos y levaduras, tanto así, que se han convertido en una herramienta fundamental en el
    desarrollo de la Biología Molecular y la Biotecnología, pues gracias a su pequeño tamaño
    en comparación con los cromosomas facilita su extracción y su manipulación, dándoles uso
    como “vectores” para introducir en ellos cualquier fragmento de ADN de interés y de esta
    forma amplificarlo de forma natural dentro de una bacteria en la que el plásmido se replica,
    es decir, clonar un fragmento de DNA.

    De igual manera, el uso de “vectores” también se


    resalta en la ingeniería genética, estos contribuyen a la
    síntesis de grandes cantidades de proteínas, como la
    insulina o los antibióticos, a partir de un proceso
    conocido como transformación. El proceso de
    transformación comienza con la selección de un
    plásmido adecuado, en el que se introducen los genes
    que se quieren expresar con protocolos específicos que
    usan enzimas de restricción y DNA ligasa.
    Posteriormente se transforma un tipo de bacteria con el plásmido modificado y se
    seleccionan las bacterias transformadas que produzcan las sustancias deseadas. Estas
    bacterias se cultivan en sistemas de tipo biorreactores para su crecimiento en grandes
    cantidades. En este proceso se eligen plásmidos con características que permitan
    seleccionar las bacterias transformadas en un medio de cultivo como por ejemplo plásmidos
    con genes de resistencia a antibióticos o con genes de enzimas que sintetizan compuestos
    coloreados.

    El tipo de genes que portan los plásmidos es variado, tratándose generalmente de genes
    que aportan ventajas adaptativas a la bacteria que los porta: genes de resistencia a
    antibióticos, genes de producción de sustancias tóxicas para otras bacterias o genes que
    codifican enzimas útiles para degradar sustancias químicas. Así mismo, surge un proceso
    de transferencia de estos genes de una bacteria a otra, desde una célula donadora a otra
    receptora mediante una estructura denominada pilus, a este fenómeno se le denomina
    “conjugación bacteriana”.

    Existen diferentes mecanismos de de replicación del ADN tales como;Replicación por


    mecanismo de círculo rodante, Replicación mecanismo tipo theta, Replicación mecanismo
    por desplazamiento de cadena

    1. Información General

    Tipo de documento Artículo científico

    Acceso al documento Universidad Pedagógica Nacional. Biblioteca Central

    Título del documento EXTRACCIÓN DE ADN PLASMÍDICO DE CEPAS DE


    Rhizobium leguminosarum EN DIFERENTES FASES DE
    CRECIMIENTO

    Autor(es) M, Y. Cortés L, F. J. Vargas P. J. E. Pinilla C, G. Pérez G. y


    Y. N. de Navarro.

    Director Ninguno
    Publicación REVISTA COLOMBIANA DE QUÍMICA BOGOTÁ
    (COLOMBIA), VOLUMEN 23, No, 2 DE 1994

    Unidad Patrocinante REVISTA COLOMBIANA DE QUÍMICA BOGOTÁ

    Palabras Claves Rhizobium,leguminosarum, plasmid, DNA

    1. Descripción

    En este artículo se lleva a cabo una comparación simultánea de cuatro


    métodos para la extracción de ADN plasmídico. De los resultados
    experimentales se concluyó que únicamente con la técnica de Kronstad, en las
    condiciones ensayadas y con cultivos de cepas de Rhizobium leguminosarum
    bv Viceae en fase de crecimiento logarítmica temprana, se visualizaron 3
    plásmidos para la cepa SEMIA 335 y un plásmido para la cepa B.
    1. Fuentes

    15 referentes bibliográficos, las más importantes sobre extracción de DNA plasmídico :

    ● Hirsch, P. R.; Van Montagu, M.; Johnston, W. B, ; Brewin, N. J. Scheli,

    J. J. Gen. Microbiol. 1980. 120, 403-412.

    ● Adachi, T. and lyer, V. N. Aiud. Biochem. 1980. ÜU, 271-274.


    ● Kado, C. I. and Lui, S. T. J. Bacterial. 1981. 145. 1365-1373.
    ● Meade, H. M,; Long, S. R,; Ruvkun, G. B; Brown, S. E.; Ausubel, F. M.

    J. Bacterial. 1982. i49, 114-122.

    ● Mastenson, R. V.; Prakash, R. K.; Atherly A. G. J. Bacterial. 1985. 163.

    21-26.

    ● Breedveld, M. W.; Canter Cremers, H. C. J.; Batley, M.; Zevenhuzen; L.

    P. T, M.; Wijffelman, C. A.; Posthumus. M. A.; Zehnder. A. J. B.

    J. Bacterial. 1993. 175, 750-757.

    ● Ohno, N.; Morrison, D. C. J. Biol. Chem. 1988. 264, AA'iA-AAAX.


    ● Martínez, E.; Romero, D.; Palacios, R. Crit. Rev. Plant Sci. 1990. 9, 59-

    93.

    ● Nuti, M. P.; Lederboer, A. M; Lepidi, A. A; Schilperroort, R, A. J. Gen.

    Microbiol. 1977. 100, 241-248.

    ● Casse, F; Boucher, C; Julliot, J. S; Michel, M; Denarie, J. J. Gen.

    Microbiol. 1979. 113, 229-242.

    ● Kronstadt. J. W., Schnepf, H. E, Witheley, H. R. J Bacterial. 1983. 154.

    419-428.

    ● Maniatis, T.; Fritsch, E. F.; Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory

    Manual, 2 ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. 1989.


    2. Contenidos

    Introducción

    Por lo general la técnica más usada para efectuar la lisis celular de bacterias
    pertenecientes al género Rhizobium, aconsejan el crecimiento bacteriano en fase
    inflacionaria temprana, debido a que en esta fase el cultivo de Rhizobium se encuentra
    densa, debido a que estas bacterias producen grandes cantidades de lipopolisacáridos,
    fibrillas de celulosa, polisacáridos capsulares neutros. Razón por la cual, estos
    polisacáridos se encuentran en la pared celular dificultando de esta manera la lisis celular
    e interfieren en el aislamiento del ADN plasmático.

    De acuerdo a lo anterior, se han encontrado en diferentes cepas de Rhizobium plásmidos


    de gran tamaño (megaplasmidos) causando sensibilidad a la ruptura mecánica, dando
    origen así a una investigación metodológica que garantice la conservación de los mismo,
    entre estas diferentes técnicas, tales como: Hirsch et al (1); Meade et al. (4); Kronstad et
    al (11) y Maniatis et al (12) de las cuales la técnica de Kronstad et al. (11) permite una
    mejor extracción y visualización de los plásmidos, resaltando su facilidad a la hora de
    implementarla, su bajo costo y su papel de aislamiento de mega plásmidos.

    Parte experimental

    Inicialmente se presenta un listado de las bacterias y plásmidos utilizados durante toda la


    investigación, de los cuales se resaltan los siguientes: R leguminosarum, Cepa, E coli
    entre otros plásmidos. Así mismo, se establecen las características relevantes de cada
    cepa, mencionando la relación efectiva (simbiótica) con otros patrones moleculares.

    Métodos de extracción de ADN plasmídico

    Ahora bien, para realizar la separación de ADN se ensayaron distintas técnicas


    anteriormente mencionadas las cuales son Hirsh, Maniatis, Meade y kronstad las cuales
    tuvieron distintas modificaciones como el cambio de algunas sustancias como el Sarkosyl
    por el SDS. De igual manera, en la mayoría de la técnicas se emplearon células en fase
    estacionaria a excepción kronstad dónde se hizo uso de la célula en todas sus etapas
    embrionarias. A su vez, las muestras extraídas se sometieron a electroforesis en geles de
    agarosa y corrido en cámara horizontal Buffer TBE 0,5X (12)

    Resultados y Discusión

    A partir de los métodos usados se hace una comparación donde la técnica Meade
    combina la acción de dos enzimas proteoliticas (lisozima y pronasa) junto con un
    detergente polar el cual produce una lisis completa y se evidencia que las bacterias de
    género Rhizobium son productoras de lipopolisacáridos, peptidoglucanos y gomas,
    actuando los primeros como inhibidores no competitivos frente a la lisozima proveniente
    de diferentes fuentes animales, con Maniatis permitió observar una banda ancha cerca al
    centro del gel .correspondiente al ADN linearizado (cromosómico y plasmídico).. Cada uno
    de los pasos en la técnica se controló electroforeticamente, no detectando plásmidos en
    ninguno de ellos.
    Luego, la técnica de Hirsch permitió observar un efecto de barrido ,que correspondió a
    ADN desnaturalizado o posiblemente a interferencia de proteínas u otras substancias
    presentes en alta concentración y las cuales no fueron totalmente eliminadas del lisado,
    en las condiciones de trabajo utilizadas. Finalmente, por el método de Krosntad los dos
    valores de pH ensayados para la solución de lisis alcalina permitieron la extracción de
    ADN plasmídico. Además observaron la reducción en intensidad de la banda de ADN
    cromosómico, en comparación con los métodos que no involucran desnaturalización -
    renaturalización.

    3. Metodología

    La metodología consistió en las siguientes fases:

    fase 1:Se cultivaron las cepas de Rhizobium leguminosarum en un medio de cultivo


    adecuado hasta alcanzar diferentes fases de crecimiento,posteriormente se recolectaron
    las células bacterianas por centrifugación

    fase 2:Se realizó una preparación de una solución de lisis que contiene lisozima con la
    finalidad de romper la pared celular y liberar el ADN

    fase 3: Se precipitó el ADN con alcohol y centrifugación

    fase 4:Se colocó el ADN en una solución adecuada para su almacenamiento y análisis
    posterior

    fase 5: finalmente al obtener el ADN plasmídico se puede analizar implementando diversas


    técnicas tales como la electroforesis en gel de agarosa,la espectrofotometría para
    determinar la cantidad y pureza del ADN ,y la la utilización del PCR para amplificar e
    identificar los genes específicos del plásmido
    4. Conclusiones

    Se concluye que la extracción y detección del ADN plasmídico de R. leg SEMIA 335 y
    cepa B se logra cuando se parte de cultivos en fase de crecimiento logarítmica temprana,
    con T inferior a 0.4 y utilizando la técnica de Kronstad. De igual manera, la extracción de
    ADN plasmídico de cepas de Rhizobium leguminosarum en diferentes fases de
    crecimiento puede proporcionar información valiosa sobre la dinámica del crecimiento de
    las bacterias y la presencia y la función de los plásmidos.

    Bibliografía.

    M, Y. Cortés L, F. J. Vargas P. J. E. Pinilla C, G. Pérez G. y Y. N. de


    Navarro(1994).EXTRACCIÓN DE ADN PLASMÍDICO DE CEPAS DE Rhizobium
    leguminosarum EN DIFERENTES FASES DE CRECIMIENTO.Revista Colombiana de
    Química. Bogotá, D,C.

    Repullo, J. L. C., Moyano, E., & Muñoz, J. 38. Purificación de ADN plasmídico y
    electroforesis del mismo en gel de agarosa.
    Labxchang https://www.labxchange.org/library/pathway/lx-pathway:98ae879b-b961-
    4537-ba45-c2e63a141b56/items/lx-pb:98ae879b-b961-4537-ba45-
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