BIOLOGIA MOLECULAR Y NEFROLOGIA

Análisis del DNA-I

E. Salido
Departamento de Anatomía Patológica. Facultad de Medicina. Universidad de La Laguna. Department of Pediatrics. University of California at San
Francisco (UCSF)

La respuesta a un gran número de problemas en Bio- promotores, que controlan la transcripción. Así, por ejem-
logía y Patología Molecular pasa por el análisis de DNA. plo, un cambio de A a G en el promotor del gen deI fac-
Dos características, en gran parte contrapuestas, definen tor IX de la coagulación hace que factores transcripciona-
funcionalmente el DNA: estabilidad y mutabilidad. La pri- les esenciales no se unan al promotor (fig. 1) y, por tanto,
mera es la base de la transmisión hereditaria de caracte- los niveles de transcripción son muy bajos; de ahí que Ios
rísticas y enfermedades. En la mutabilidad del DNA resi- pacientes sufran hemofilia B 1.
d e la capacidad de evolución y la flexibilidad de los seres 1.2. Con alteración del procesado del mRNA: En
VIVOS en su adaptación al medio ambiente. otros casos, cambios de una sola base afectan el proceso
En la práctica médica, el análisis de DNA va enfocado de «splicing», por el cual las regiones intrónicas son ele-
eminentemente a la detección de mutaciones responsa- minadas del mRNA nuclear. Este es el caso de las muta-
bles de enfermedades. En principio, cualquier diferencia ciones que afectan los dinucleótidos de los extremos 5’
en la secuencia de DNA distinta de la secuencia normal (siempre CT) y 3’ (siempre AG) de los intrones. En talase-
del genoma humano es una mutación. En términos coti- mias de origen mediterráneo se ha descrito una mutación
dianos, usamos «mutación» para cambios en la secuencia de A a G en el extremo 3’ (AG) del intrón 2 del gen de
de DNA asociados a una condición patológica. Ahora la cadena beta de la hemoglobina (fig. 2). Esto hace que
bien, la inmensa mayoría de cambios en la secuencia de el mRNA sea procesado de modo aberrante, incluyendo
nuestro genoma no implica enfermedad alguna, sino que porciones del intrón 2 en el exón 3 2.
son la base de la variabilidad dentro de la norma en nues- 1.3. Con alteración de la traducción y localización
tra especie; a estos cambios les llamamos polimorfismos. proteica: Otras veces, la mutación puntual afecta la tra-
La estrategia a seguir en el análisis de DNA depende ducción proteica, de modo que la localización celular de
lógicamente del objetivo del mismo: detectar un cierto la proteína se ve alterada. Así, un tercio de los pacientes
tipo de mutación en la mayoría de los casos. En función con hiperoxaluria primaria tienen una mutación en la por-
de esto se hace la elección de la técnica que más eficien- ción 5’ de la alanina-gliosilato aminotransferasa (AGT) 3
temente la detecta, dentro de las posibilidades tecnoló- que parece ser responsable de que la traducción proteica
gicas del laboratorio en cuestión. La técnica seleccionada del mRNA incluya varios codones adicionales en el extre-
determina a su vez qué grado de purificación e integri-
dad del DNA es preciso y, por tanto, qué muestra bioló-
gica es válida como fuente de DNA. Tabla I. Tipos de mutaciones
Cambios de base (mutaciones puntuales):
Tipos de mutaciones: - Con alteración de la transcripción.
- Con alteración del procesado del mRNA.
En la tabla I se recogen los tipos de mutaciones impli- - Con alteración de la traducción y localización proteica
- De sentido erróneo.
cados en patología humana. - Sin sentido.
1. Mutaciones puntuales: Los cambios de una sola
base son un tipo frecuente de mutación y tienen conse- Deleciones:
cuencias muy variadas. - Con cambio del marco de lectura.
1.1. Con alteración de la transcripción: En ciertos ca- _ Con pérdida de codones.
sos, las mutaciones puntuales afectan regiones críticas, - Deleción de todo un gen o genes contiguos.

-Con cambio de marco de lectura.

- Con ganancia de codones.
Correspondencia: Dr. Eduardo Salido Ruiz.
- Duplicación de todo un gen o región genómica.
Departamento de Anatomía Patológica. _ De elementos repetitivos.
Facultad de Medicina.
Universidad de La Laguna. DNA inestable.
La Laguna, Tenerife.

18
 ANALISIS DEL DNA-I

1.5. Sin significado o <nonsense>: En estos casos, las

FACTOR IX mutaciones puntuales transforman un codón codificante
de aminoácido en un codón de parada (TAG, TAA o TGA),
lo que resulta en una proteína truncada en ese punto. Así,
por ejemplo, una mutación puntual en el exón ll del gen
de la fibrosis quística (CFTR) consiste en un cambio de la
G a T en el codón 542, lo que conlleva una parada de la
traducción proteica en lugar de incorporar un aminoáci-
do glicina en este punto (fig. 5). La proteína CFTR, de 1.480
aminoácidos en condiciones normales, queda truncada a
Fig. 1.-Mutación A-G en la región próxima al inicio de transcripción (*) los primeros 541 aminoácidos, con pérdida de su función
del gen del factor IX de la coagulación, que resulta en unos n
de transcripción insuficientes. El rectángulo hace referencia al exón y en el transporte de cloro.
su parte sólida a la zona codificante para proteína. Aun cuando un cambio de base en la DNA puede dar
lugar a las mutaciones descritas previamente, en la mayo-
ría de los casos estos cambios son silentes, es decir, no
se asocian a enfermedad, sino que dan Iugar a polimor-
El E2 E3 fismos a nivel de DNA. Este es el caso de la mayoría de
los cambios que afectan a regiones no codificantes del ge-

ATG

Tri-CTrTCAC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . CGG CTC --‘- I) PEROXISOMA

1 l
Extra E3 1 E3 t
T
;
-0 MITOCONDRIA
Fig, 2.-Mutación A-G en el duplete receptor AG del intrón 2, que
resulta en un splicing anormal, que usa una secuencia TTTCTTTCAG
SEC”&A SEÑAL
presente dentro del propio intrón 2 como receptor del fenómeno de
splicing. El resultado es que una porción del intrón 2 queda MITOCONDRIAL
englobada en el exón 3 (E3).
Fig. 3.-Mutación en la región 5’ del gen alanina- glioxilato
aminotransferasa, que resulta en la codificación de una secuencia
mo amino terminal de la AGT. Estos codones extra con- señal que dirige la proteína a la mitocondria en lugar de ir al
peroxisoma. Este defecto molecular de la hiperoxa una primaria
tienen una señal de localización mitocondrial, por lo que presenta puntos oscuros en su explicación que han sido omitidos en
la AGT es transportada a la mitocondria en lugar de ir a esta simplificación.
los peroxisomas (fig. 3). Como en el humano la mayor par-
te de la síntesis de glioxilato tiene lugar en los peroxiso-
mas hepáticos, la AGT es incapaz de llevar a cabo su fun-
ción destoxificadora de glioxilato si se encuentra localiza- Pro’ Gld CIU’
da en las mitocondrias. No obstante, existen aún puntos 6” CC3GAG-GAG
oscuros en la patogenia de esta mutación de la AGT.
1.4.Con significado erróneo o <missense>: Existen
numerosos ejemplos en patología humana en que una
mutación puntual supone un cambio de codón que hace
que la proteína tenga un aminoácido distinto de la se-
cuencia normal. De hecho, el primer ejemplo de patolo-
gía molecular consiste en una mutación puntual «missen- BA
/ I
1,15 /
se»: el grupo de Pauling4 demostró que la anemia falci- Mstll: CCT NAG G
BS 1,35
forme era el resultado de la presencia de una hemoglo-
bina anormal (HbS), y posteriormente se comprobó que
la HbS resulta de la presencia de valina en la posición 6 Fig, 4.-Mutación A-T en el codón 6 de la cadena beta de la
de la cadena beta de la hemoglobina, donde normalmen- hemoglobina, que resulta en la anemia falciforme. Esta mutación
afecta la diana del enzima de restricción Mstll (CCTNAGG), por lo que
te va glutámico5. Este cambio de aminoácido es el resul- el alelo mutado (Bs) es cortado por Mstll en un fragmento de
tado e una mutación puntual de A a T en el codón sex- 1,35 kb, mientras que el alelo normal (BA) lo es en dos fragmentos de
to del gen de la cadena beta de la hemoglobina 6 (fig. 4). 1,15 y 0,2 kb.

21
E. SALIDO

l
‘2% EXON ll

CGA

t
zyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA
1
después de cuatro codones en marco de lectura erróneo,
aparece un codón de parada (TGA).
2.2. Sin alteraciones del marco de lectura: Cuando el
número de bases implicadas en la inserción o deleción
es tres o un múltiplo pequeño de tres, el resultado es una
proteína con uno o varios aminoácidos de más o de me-
TGA nos. Estas modificaciones discretas de la estructura pro-
teica no se traducen siempre en pérdida de función, pero
SrOP ======- CFTRTRUNCADO
existen ejemplos donde la pérdida de un solo aminoáci-
do en una región crítica de la proteína anula la función
Fig. 5.-Mutación C542X del gen CFTR de la fibrosis quística, que de la misma. La mutación más frecuente del gen de la fi-
resulta del cambio C-T en el codón 542 (CGA), que se conviene en brosis quística CFTR consiste precisamente en la deleción
un codón de parada (TGA) y, por tanto, la proteína queda truncada de las bases CTT(fig. 7), con pérdida del aminoácido fe-
en este punto.
nilalanina-508, en una de los dominios de unión a ATP
del CFTR, lo que resulta en pérdida de función 9,10 .
2.3. Deleciones e inserciones grandes: Deleciones de
noma o bien implican la tercera base del triplete (codón), grandes porciones de un gen, la totalidad del mismo o in-
lo que en la mayoría de los casos no altera la traducción cluso varios genes contiguos resultan casi siempre en pér-
proteica o, incluso si el cambio de base se traduce en un dida de función. En determinadas enfermedades, la ma-
aminoácido distinto, la proteína en su conjunto funciona yoría de las mutaciones implicadas son del tipo deleción
normalmente. Uno de los cambios de base más frecuen- grande; tal es el caso de la distrofia muscular de Duchen-
tes es la mutación puntual de C a T, donde C forma par-
te de dupletes CC en los que C está metilada (metil-C).
Cuando metil-C pierde el grupo -NH, (deaminación es-
pontáneo o inducida por mutágenos), se transforma en
T. Este tipo de mutación se ha observado frecuentemen-
te asociada a enfermerdad, pero también es la base de @ LBL “al “BI Th, PI0
ABC3 'A CTC GTG GTG>CC CCT T
polimorfismos corrientes; de ahí que enzimas de restric-
ASO ‘0 CTC GTG GTA CCC WJ
ción (ver después) que incluyen la secuencia CC en su dia-
na -tales como Taql (T.CGA)- sean muy útiles en la de-
tección de polimorfismos.
2. Deleciones e inserciones: Un número importante
de mutaciones consisten en la pérdida (deleción) o ga- @ m lle ser TYi GIY Pi0 ASP
HEXA CGT ATA TCCZ GCC CCT GAC
nancia (inserción) de material genético.
TAY SACHS CGT ATA TCT ATC CTA TGC CCC TGA
2.1. Con alteración del marco de lectura: Cuando el A% 118 Ser ue Le” CYS PI0 SIOP
número de pares de bases perdido o ganado no es múl-
tiplo de tres, la consecuencia de deleciones e inserciones
Fig 6.-A) Deleción de una G en el gen de la glicosiltransferasa A,
es similar: alteración del marco de lectura del mRNA, de responsable del grupo sanguíneo A, que resulta en un cambio del
modo que la secuencia del mRNA 3’ a la mutación cam- marco de lectura que da lugar a una proteína no funcional propia del
bia totalmente de significado y la proteína tiene una se- rupo sanguíneo 0. B) Inserción de cuatro bases TATC en el gen de
cuencia de aminoácidos completamente distinta, apare- a hexosaminidasa A, que resulta en cambio del marco de lectura,
con aparición de un codón de parada (TGA) después de cuatro
ciendo con frecuencia codones de parada. Un ejemplo aminoácidos.
clásico de alteración del marco de lectura es el que da Iu-
gar al grupo sanguíneo 0 a partir del grupo A 7 (fig. 6A).
El antígeno de grupo A resulta de la glicosilación de la pro-
teína H por parte de la glicosiltransferasa A. La deleción
Ile Ile Phe G~Y Val
de una G en el gen de la glicosiltransferasa altera el mar-
co de lectura, de modo que la secuencia de la proteína, CFTR A T C - AT: - T;T - GGT - G T T
que en este caso se conoce como glicoproteína 0, es dis-
tinta e incapaz de glicosilar la proteína H. Si bien éste es 1l
un claro ejemplo de polimorfismo, ya que no conlleva en-
fermedad, los efectos de alteraciones del marco de lectu-
ra tienen una repercusión tan importante en la estructura
proteica que con frecuencia se asocian a enfermedad.
Fig. 7.-Deleción F508 del gen CFTR de la fibrosis quística, donde se
Este es el caso de la inserción de 4 bases (TATC) en el pierde el triplete m, pero el resto de la secuencia queda indemne.
gen de la hexosaminidasa A 8 (fig. 6B), que da lugar a una No obstante, la proteína CFTR sin el aminoácido fenilalanina 508, enn
proteína truncada en la enfermedad de Tay-Sachs,porque, la región de unión a ATP de la molécula, no es funcional.

22
 ANALISIS DEL DNA-I

radoja de Sherman (las madres y las hijas de varones asin-

tomáticos portadores del síndrome del X frágil tienen ries-
gos muy distintos de tener descendencia con retraso
mental). la mutación del síndrome del X frágil consiste en
una secuencia de DNA inestable debido a cambios en el
número de copias repetidas del trinucleótido CCC locali-
zados en la región 5’ del gen FMR-1 13. Curiosamente, el
número de repeticiones del trinucleótido aumenta cuan-
do la mutación es transmitida por mujeres, mientras que
permanece constante o se reduce cuando es transmitida
por hombres; retraso mental importante se asocia a nú-
meros elevados de secuencias repetidas. En los casos de
DELECION la distrofia miotónica y de la enfermedad de Kennedy, el
5232 trinucleótido que se repite es AGC, en los genes de la pro-
teín kinasa DM-114 y del receptor de andrógenos 15 , res-
pectivamente.
Fig. 8.-Deleción del gen de la sulfasa esteroidea (STS) por
recombinación homóloga desigual entre secuencias repetidas 5232 a
ambos lados del mismo. La flecha indica la recombinación que
genera la deleción que se muestra en la parte inferior del gráfico. Extracción y purificación de DNA

Dada la estabilidad de la doble cadena de DNA, nu-

ne (DMD) y del déficit de sulfatasa esteroidea (STS). Fenó- merosas muestras biológicas son útiles como fuente de
menos de recombinación genética entre varios genes de DNA. En principio, cualquier muestra que contenga célu-
una familia o entre secuencias homólogas no codifican- las nucleadas, desde un lavado bucal hasta un fragmento
tes se han visto implicados como mecanismo causal de tisular, pasando por la más frecuentemente usada mues-
estas deleciones. Así, por ejemplo, recombinación entre tra de sangre, es válida para análisis de DNA. De igual
los elementos no codificantes S232 localizados a ambos modo, líquidos biológicos son válidos para análisis de
lados del gen STS (fig. 8) resulta en deleciones de las casi DNA de gérmenes. En cuanto a la estabilidad de la mues-
dos mebagases comprendidas entre ellos11. tra una vez tomada, aunque el procedimiento ideal es ha-
2.4. Inserciones de elementos repetitivos: Un 15 % cer la extracción del DNA de inmediato y almacenarlo re-
de nuestro genoma consiste en DNA de secuencia repe- frigerado, es posible conseguir DNA útil para análisis a par-
titiva y se halla disperso, entremezclado con genes de se- tir de tejidos conservados en parafina. Es más, con la tec-
cuencia única. Existen dos familias principales de elemen- nología de que disponemos en la actualidad es incluso
tos repetitivos: Alu, elementos de unas 300 bases repeti- posible cierto tipo de análisis a partir de DNA anciano,
dos medio millón de veces en el genoma; y L1, elemen- conservado en momias de miles de años 16 .
tos de hasta 6.000 bases repetidos unas 10.000 veces en La calidad del DNA extraído tiene definida por el tama-
el genoma. El papel que los elementos repetitivos juegan ño medio de molécula obtenido. Teóricamente, todo el
en el genoma es desconocido y existe la sospecha de que DNA de un cromosoma podría obtenerse como una sola
se trata de secuencias «egoístas» sin otra función que la molécula de 50 millones de pares de bases (cromosoma
de perpetuarse a sí mismas. Tanto secuencias Alu como 21, el más pequeño) hasta 250 millones de pares de ba-
L1 pueden causar enfermedad por uno de estos meca- ses (cromosoma 1, el más grande). Sin embargo, la gran
nismos: recombinación entre secuencias homólogas con sensibilidad al cizallamiento debida a la propia estructura
pérdida, deleción, del fragmento de DNA intermedio; y del DNA (una cadena de hasta 15 cm de largo -cromo-
disrupción de un gen por inserción de elementos repeti- soma 1-, pero sólo 2 nm de diámetro) hace que normal-
tivos que interrumpen la secuencia. Este es el caso de cier- mente se purifique DNA de tamaño medio muy inferior
tas mutaciones de la hemofilia A, donde elementos L1 se a una megabase. Cuando el tipo de análisis requiere DNA
han visto insertados en el gen del factor VIII de la coagu- de alto peso molecular es preciso, pues, evitar el cizalla-
lación 12 . miento (usando pipetas de boca ancha y sin agitaciones
3. DNA inestable: En el último año se han descrito turbulentas) y la acción de enzimas que degradan DNA
los tres primeros ejemplos de mutaciones debidas a se- (DNasas). Puesto que las DNasas precisan cationes diva-
cuencias de DNA inestables, que contienen un número lentes (Ca++ o Mg*+), la degradación enzímática del DNA
variable de trinucleótidos repetidos n veces. El análisis mo- se evita bastante eficazmente incluyendo EDTA en las so-
lecular de las secuencias inestables ha permitido explicar luciones de purificación y almacenamiento de DNA. Las
fenómenos genéticos como el de anticipación (generacio- soluciones de DNA se mantienen rutinariamente en el de-
nes sucesivas en una misma familia tienen formas de la nominado buffer TE (10 mM TrisHCL, pH 8,0, 1 mM
enfermedad más severas o de aparición más temprana), EDTA).
que era bien conocido en la distrofia miotónica, o la pa- Existen numerosos métodos sencillos que permiten ais-

23
 E. SALIDO

Enzimas de restricción
Tabla II. Extracción de DNA
1. Separar células blancas de hematíes o triturar muestra de te- El descubrimiento del fenómeno de restricción y la pu-
jido. rificación de los enzimas responsables de este mecanis-
2. Suspender núcleos celulares en solución de lisis: 100 mM
NaCI, 10 mM Tris HCI, pH 8.0, 25 mM EDTA, 0,5 % SDS con
mo de defensa bacteriano contra DNA foráneo supuso el
1 ug/ml de proteinasa K. Incubar a 55ºC x 2 h. principio de la denominada tecnología del DNA recom-
3. Extraer con 1 vol. Fenol-cloroformo dos veces. binante. Muchas bacterias tienen enzimas (endonuclea-
4. añadir 1/10 vol. 3M Na acetato y 2.5 vol. Etanol. sas: cortan el eje azúcar-fosfato de ácidos nucleicos
5. Tomar el precipitado y resuspender en Te (10 mM TrisHCI, -DNA- en puntos internos) que reconocen y cortan se-
pH 8,0, 1 mM EDTA).
cuencias de DNA invasor, al que reconocen como extra-
ño merced a un sistema complementario que marca (por
lar DNA de tamaño adecuado para análisis. Sólo en ca- metílación) el DNA propio; cada bacteria posee un siste-
sos en que el destino del DNA a aislar sea la clonación ma endonucleasa/metilasa propio, que se denomina sis-
de grandes fragmentos (alrededor de 1 megabase) en cro- tema de restricción (restringe el DNA que es tolerado por
mosomas artificiales de levadura (YACs), o de fragmentos la bacteria a aquel que es reconocido como propio), algo
por encima de 100 kilobases en cósmidos, se han de se- parecido al sistema inmune de organismos superiores.
guir protocolos especiales que reducen al mínimo el ci- Aunque hay varios tipos de endonucleasas, sólo las en-
zallamiento del DNA. El procedimiento habitual de extrac- donucleasas tipo ll son de interés práctico porque reco-
ción de DNA (tabla II) consiste en la homogeneización del nocen secuencias específicas en el DNA (a las que deno-
tejido o suspensión celular en una solución de lisis, que minamos «dianas») y lo cortan en ese punto o región in-
contiene el detergente SDS -rompe membranas celula- mediatamente adyacente.
res- y la proteinasa K -digiere proteínas-. Posteriormen- Las enzimas de restricción se denominan con una abre-
te se suelen separar los ácidos nucleicos del resto de los viatura de tres letras del nombre de la bacteria en la que
componentes celulares mediante extracción fenólica -a se encontró (ej.: Hin de Haemophilus influenzae); una le-
pH 8,0, el DNA particiona con la fase acuosa-, y a con- tra adicional identifica la cepa o serotipo, si es preciso (ej.:
tinuación se precipita el DNA con etanol. Si la concentra- Hind), y finalmente un número romano refleja el orden
ción de DNA es suficiente, el precipitado de DNA se ob- en que se identificó (ej.: Hindlll). Aunque en un principio
serva como una madeja filamentosa que se puede trans- los laboratorios tenían que purificar sus propios enzimas
ferir con la punta de una pipeta a un nuevo tubo. Este pro- de restricción a partir de cepas bacterianas, en la actuali-
tocolo básico proporciona DNA de hasta 100 kilobases dad existen varias casas comerciales que los proporcio-
en la mayoría de los casos, suficientemente bueno para nan. La lista de enzimas de restricción de que dispone-
análisis tipo Southern y para clonación en bacteriófago. mos está en continua expansión, existiendo muchos en-
En casos en que la muestra de partida es tejido inclui- zimas que reconocen secuencias específicas de 4-6 nu-
do en parafina, los cortes tisulares son desparafinados con cleótidos y algunos que lo hacen con secuencias mayo-
xilol e hidratados en una serie de soluciones de etanol res (7-8 nucleótidos, y excepcionalmente más). El tamaño
previamente a la digestión con proteinasa K. de la diana determina en gran medida con qué frecuen-
En el momento presente, la detección de mutaciones cia el enzima va a cortar un cierto DNA y, por tanto, el
puntuales y deleciones e inserciones pequeñas se tiende tamaño medio de los fragmentos generados. En el su-
a hacer mediante amplificación de DNA por la reacción puesto de que la secuencia de DNA sea totalmente alea-
en cadena de polimerasa (PCR). Aunque esta técnica será toria, con las cuatro bases representadas por igual, se po-
objeto de futuras presentaciones en esta serie de la revis- dría predecir que un enzima que reconozca 4 nucleóti-
ta NEFROLOGíA, conviene aquí adelantar dos características dos (un 4-cutter en el argot), como la Taql, cortará cada
de la PCR: 1) permite trabajar con cantidades mínimas de 256 bases (44); uno que reconozca 6 bases, como el po-
DNA, y 2) el DNA no tiene que ser altamente purificado. pular EcoR1, cortará fragmentos de unas 4 kilobases (kb).
Por tanto, si el objetivo es el análisis por PCR, se puede Pero en la realidad, las secuencias de DNA no son alea-
usar un método alternativo más simple (tabla III) para pre- torias, sino que la proporción de C+G en una región ge-
parar DNA a partir de tejidos o incluso de unas pocas cé- nómica puede ir de un 1/4 a 3/4. Alrededor de 500 en-
lulas descamadas (líquidos amnióticos, citologías aspirati- zimas de restricción han sido aisladas hasta el presente,
vas, frotis vaginales, lavados bucales, etc.). y se denominan isosquizómeros a aquellos enzimas que
reconocen la misma secuencia, aunque pueden cortar en
distintos puntos de la misma. Por ejemplo, Xmal
(C^CCGGG) y Smal (CCC^CGGG), donde (^) indica el pun-
Tabla III. Extracción de DNA para PCR
to de corte en la secuencia.
1. centrifugar las células. Las secuencias de nucleótidos habitualmente recono-
2. Resuspender el pellet en solución de lisis PCR: 50 mM KCI, cidas por los enzimas de restricción se denominan «Pa-
10 mM Tris HCI, pH 8.3, 2.5 mM MgCl 2, 0.5 % Tween 20 Iíndromes». De manera similar a su significado lingüístico,
con 0,1 ug/ml de proteinasa K. Incubar a 55 ºC x 1 h.
un palíndrome en bioquímica es una secuencia de DNA

24
 ANALISIS DEL DNA-l

tienen extremos compatibles con otras moléculas corta-

das con el mismo enzima o con otro que genere exten-
Y... ccc ccc . ..3’ siones monocadena idénticas. Por ejemplo, Sau3AI,
Smal
3’... CGG l l ccc . ..5’ ^GATC, genera extensiones 5’-GATC, compatibles con los
extremos 5’-GATC creados por BarmHl, G^GATCC. Estas
extensiones dan a los cortes cohesivos dos propiedades
importantes en clonaje: especificidad (sólo se pueden re-
ligar con extremos compatibles) y eficacia (las extensiones
monocadena compatibles establecen puentes de hidró-
geno que facilitan la reacción de ligación).
La especificidad de los enzimas de restricción por sus
secuencias diana es muy alta siempre que las condicio-
nes de la reacción sean óptimas. De no ser así, puede
que un determinado enzima corte DNA en secuencias
que no le son propias, a lo que se denomina «actividad
estrellan. EcoR1 (G^AATTC), por ejemplo, en condiciones
de baja concentración iónica, alto pH, presencia de sol-
ventes o de Mn++ en vez de Mg++, corta en múltiples se-
Fig. 9.-Cortes con enzimas de restricción tipo romo (como el de cuencias que contengan AATT. Dada la poca consistencia
Smal) y cohesivo, con extensión 5’ (como el de EcoRI) y con de la actividad estrella, se trata de un fenómeno sin apli-
extensión 3’ (como el de Pstl).
caciones prácticas y, en general, se debe evitar usando las
condiciones adecuadas para la restricción enzimática.
Determinados enzimas de restricción no cortan el DNA
simétrica en la que la sucesión de nucleótidos es idéntica si ciertas bases se encuentran metiladas en la secuencia
en las dos cadenas de DNA, leídas ambas en dirección diana, por lo que se denominan metilación-sensibles. Tal
5’-3’ (fig. 9). Las aplicaciones de los enzimas de restricción es el caso de Hpall (C^CGG), que no corta si existen ba-
caen en dos categorías: 1. Clonaje, a través de la cons- ses metil-citosina; por el contrario, su isosquizómero Mspl
trucción de moléculas recombinantes. DNA recombinado no es sensible a la metilación y corta siempre en esa se-
es un DNA híbrido obtenido in vitro mediante la combi- cuencia. Puesto que la inactividad transcripcional de de-
nación de dos DNA pertenecientes a dos especies dife- terminados genes va asociada a metilación de citosinas,
rentes: por ejemplo, un gen humano se «injerta» en un este fenómeno se puede explotar para analizar la inacti-
DNA bacteriano (vector). La replicación del DNA recom- vación del cromosoma X, por ejemplo.
binado da lugar a la obtención de numerosas copias idén- En la práctica, la digestión de DNA con enzimas de res-
ticas del DNA injertado (clonación). 2. Análisis, detección tricción se lleva a cabo en reacciones que incluyen el buf-
de secuencias diana con fines diagnósticos o de construc- fer idóneo, DNA y enzima (tabla IV). Cada enzima tiene
ción de mapas de moléculas. Una clasificación de los en- unas condiciones ideales diferentes, aunque se pueden
zimas de restricción relevante en clonaje molecular se re- agrupar en 4 grupos fundamentales, según la concentra-
fiere al tipo de extremos que quedan en el DNA cortado ción iónica. En la actualidad, la mayoría de los proveedo-
(fig. 9): res de enzimas de restricción regaan l el buffer idóneo al
a) Romo (blunt): numerosos enzimas cortan en el comprar el enzima, por lo que hemos dejado de prepa-
punto medio de la diana en ambas cadenas de DNA; por rar nuestros propios buffers en el laboratorio. La mayoría
ej.: Smal reconoce CCC^GGG, dejando dos extremos ro- de las reacciones se llevan a cabo a 37o C, pero existen
mos, que pueden ser ligados a otros extremos romos cua- excepciones, como Smal, que trabaja mejor a 25o C. Ade-
lesquiera. La reacción de ligación es de baja eficacia, no mas de elegir el buffer y la temperatura adecuadas, una
obstante. En resumen, enzimas de corte romo proporcio- reacción de restricción depende de la calidad del DNA.
nan alta versatilidad, pero baja eficacia a la hora de cons- Una de las causas más frecuentes de fracaso de la diges-
truir moléculas recombinantes. tión es la presencia de impurezas en la muestra de DNA.
b) Cohesivo (sticky): la mayoría de los enzimas de res-
tricción no cortan en el punto medio del palíndrome, sino
que generan cortes que se asemejan a «fracturas en tallo
verde» con extensiones de DNA monocadena bien 5’ Tabla IV. Digestión con enzimas de restricción (ECOR1
(como EcoR1, G^ATTC, que deja extensiones monoca- en 20 ul)
dena 5’-AATT en ambos extremos del corte) o bien 3’ - 15,2 pl de H,O.
(como Pstl) CTGCA.^G, que deja extensiones de DNA mo- - 2 ~1 de 10X EcoRl Buffer.
nocadena TGCA-3’ en ambos extremos del corte). Debi- - 0,8 pl de Sperdimina 100 mM.
do a estas extensiones monocadena que protruyen en el - 1 pl de DNA (1 @II)
- 1 PI e EcoRl (1 U/ml). Incubara 37” C x 1 h.
sitio de corte, fragmentos cortados con un cierto enzima

25
E. SALIDO

En general, extracciones fenólicas y precipitaciones con Tabla V. Condiciones de hibridación

etanol son precisas para obtener DNA sustrato de enzi-
mas de restricción. Estabilidad Efecto en
Parámetro del híbrido el rigor
Temperatura.. .....................................
Hibridación molecular Cationes monovalentes .................... : :
Longitud .............................................
Relación C+G/A+T ............................ ; :
La interacción físico-química de cadenas de ácidos nu- Formamida.. ....................................... 1 t
cleicos con secuencias complementarias es el punto en
que pivota todo tipo de análisis molecular. En el capítulo
previo de «Introducción a la Biología Molecular» ya se pre- culas como doble cadena y el otro 50 % como monoca-
sentaron las bases conceptuales de la interacción entre dena; a ésta se denomina temperatura de fusión (Tm). La
moléculas complementarias, ejemplificado en la estabili- Tm de un híbrido se puede poner en función del resto
dad de la doble cadena de DNA. Usando los mismos prin- de los parámetros que controlan la estabilidad de la mo-
cipios, el establecimiento de puentes de hidrógeno entre lécula, resultando en la fórmula:
bases complementarias, se pueden generar moléculas «hí-
bridas» donde una cadena proceda del DNA (desnatura- Tm = 81,5 + 16,6 log [Na] + 41 [C+G/A+T]
lizado) o del mRNA la otra sea una herramienta de Ia- - 0,62 [FA] - 5OO/L
boratorio (sonda mol ecular o «probe»), de secuencia co- Donde [Na] es la concentración molar de cationes mo-
nocida y marcada convenientemente. A este proceso de novalentes, [C+G/A+T] es la fracción molar de bases C+G
formación de moléculas doble cadena de ácidos nuclei- (que establecen tres puentes de hidrógeno) versus A+T
cos mediante el apareamiento específico de monocade- (que establecen sólo dos puentes de hidrógeno), [FA] es
nas de secuencias complementarias se denomina hibri- el porcentaje de formamida y L es la longitud del hídrido
dación molecular. Conceptualmente, se trata de un pro- en pares de bases.
ceso análogo a la interacción antígeno-anticuerpo: de Para moléculas de menos de 50 pares de bases (bp)
modo similar a como utilizamos anticuerpos en el análi- esta fórmula no es válida, así, para hibridaciones con oli-
sis de proteínas concretas, podemos usar sondas mole- gonucleótidos de alrededor de 20 nucleótidos (nt) ,tales
culares para analizar DNA o RNA. Pero mientras que las como los primeros usados en PCR, la fórmula de la Tm se
bases de la interacción antígeno-anticuerpo son comple- simplifica, de modo que para [Na] = 0,9 M, Tm = 4 [C+G]
jas y sólo parcialmente conocidas, la interacción entre se- + 2 [A+T]
cuencias de ácidos nucleicos complementarias es simple Estas fórmulas han sido calculadas a partir de experi-
y bien definida experimentalmente. mentos de hibridación de DNA en solución 17 , pero son
El objetivo de la hibridación molecular es, pues, la de- esencialmente válidas para hibridaciones en membranas
tección de secuencias concretas de DNA o RNA. Como sólidas y otros tipos de hibridación. Los híbridos de RNA-
en cualquier otro sistema de detección, dos parámetros RNA son algo más estables, 10o C de media, que los de
resumen la utilidad del mismo: especificidad y sensibili- DNA-DNA, y RNA puede desplazar una cadena de DNA,
dad. Un buen conocimiento de las bases físico-químicas formando híbridos RNA-DNA.
de la hibridación permite el diseño de condiciones de óp- Es asimismo importante considerar el efecto de pares
tima especificidad y sensibilidad. El término rigor («strin- de bases no complementarios en la estabilidad del híbri-
gency»), muy usado en descripciones moleculares, equi- do. Se ha calculado que, para híbridos mayores de
vale a especificidad. 150 bp, la Tm de la doble cadena desciende 1 grado por
La estabilidad de una molécula doble cadena depen- cada 1 % de bases que no son complementarias (mismat-
de esencialmente de la interacción tipo puente de hidró- ching). Para híbridos pequeños, en torno a 20 bp, cada
geno entre bases complementarias de las fuerzas hidro- <mismatch> reduce la Tm en 5 grados. Es precisamente
fóbicas establecidas entre bases apiladas. Las condiciones en base a este efecto desestabilizante de pares no com-
que afectan la estabilidad de moléculas doble cadena plementarios que se pueden diseñar condiciones de hi-
quedan resumidas en la tablaV. Por tanto, podemos au- bridación específicas para secuencias de DNA que sólo
mentar la especificidad de la hibridación de una secuen- se diferencien en una base. Asimismo, eligiendo las con-
cia, de longitud y relación C+G/A+T determinadas, au- diciones lo suficientemente rigurosas, conseguimos que
mentando la concentración de formamida, disminuyendo la sonda marcada se hibride exclusivamente a secuencias
la concentración de Na+ o aumentando la temperatura. que son 100 % complementarias. Ahora bien, condicio-
Dejando el resto de los parámetros constantes, la estabi- nes muy rigurosas reducen la sensibilidad del test, por lo
lidad de una doble cadena disminuye conforme la tem- que, en general, las hibridaciones se llevan acabo en con-
peratura aumenta, de modo que alcanzaríamos una situa- diciones que favorecen la hibridación, unos 25o C por de-
ción en la que todas las moléculas son monocadena, a bajo de la Tm, y posteriormente se realizan lavados de los
lo que se denomina «DNA desnaturalizado». A una tem- filtros en condiciones crecientes de rigor hasta quedarnos
peratura intermedia encontraríamos el 50 % de las molé- en tomo a 5o C por debajo de la Tm o hasta las condi-

26
 ANALISIS DEL DNA-I

ciones que empíricamente nos den una mejor relación se- GTP, dGTP, UTP o dTTP) radiactivos, que contienen fósfo-
ñal/fondo inespecífico. ro-32 (“P) en la posición alfa. En ciertas aplicaciones, en
En la práctica, los protocolos de hibridación incluyen: que interesa el uso de isótopos de energía intermedia o
1) preparación de DNA o RNA en forma desnaturalizada: baja, se usan nucléotidos que contienen azufre-35 (35S) o
2) prehibridación: se busca equilibrar,el sustrato a hibri- tritio ( 3 H), respectivamente. Las sondas marcadas con isó-
dar con las condiciones de hibridación; 3) hibridación: topos se visualizan mediante autorradiografía, donde la
con la sonda marcada, a temperaturas 25o C por debajo energía radiactiva impresiona una película de rayos X. En
de la Tm, esto es, en torno a 65o C normalmente sí la so- general, si las condiciones del laboratorio lo permiten y
lución de hibridación no contiene formamida y 42oC si contando con personal entrenado para el uso de isóto-
la solución contiene 50 % formamida; 4) lavados posthi- pos radiactivos, el marcado de sondas por métodos ra-
bridación: con soluciones de creciente rigor -[Na] decre- diactivos no conlleva mayores riesgos y proporciona una
ciente- para limpiar el filtro de la sonda adherida ines- alta sensibilidad a los ensayos, por lo que es el método
pecíficamente; 5) revelado de la señal: bien por autorra- de elección en la mayoría de los centros. No obstante,
diografía o por reacciones calorimétricas, según el tipo de en sitios donde no existen contratos entre la institución y
marcaje de la sonda usado. el proveedor, como es el caso de la mayoría de los cen-
En apartados sucesivos se irán presentando los distin- tros en España, los isótopos resultan bastante más caros
tos tipos de hibridación utilizados, entre los que se en- que los métodos alternativos, debido a que al alto precio
cuentran: de catálogo se suman gastos adicionales, como el de eli-
minación de residuos radiactivos. Además, las sondas ra-
1. Hibridación en solución: tal como el ensayo de diactivas tienen una vida media corta, no sólo por la de-
protección de RNasa. sintegración del isótopo en sí, sino también por la ruptu-
2. Hibridación en fase sólida (filtro): ra de la cadena molecular por la energía radiactiva.
2.1. Con electroforesis previa: Varios métodos han surgido como alternativas al mar-
- Southern blot: DNA. cado ísotópico de las sondas18, de los cuales dos son los
- Northern blot: RNA. más usados: sondas biotiniladas y sondas con digoxige-
2.2. Sin electroforesis previa: tina. Ambas se basan en un principio similar: el uso de
- Dot (o Slot) blot: la solución de ácidos nucleicos a nucleótidos a los que se ha unido una molécula que pue-
analizar se pone directamente en un filtro, a modo de de ser reconocida específicamente en reacciones colori-
puntos (dot) o hendiduras (slot), usando como molde apa- métricas. Las moléculas de biotina interaccionan con altí-
ratos «manifold». sima afinidad con la proteína avidina, el uso de avidina
- Hibridación de colonias o placas: las colonias bac- conjugada con enzimas como la peroxidasa o fosfatasa al-
terianas o placas de virus se transfieren directamente por calina hace que allí donde se ha hibrídado la sonda mar-
contacto a un filtro (réplica) que se hibrida. cada con biotina exista actividad peroxidasa o fosfatasa,
3. Hibridación in situ: cortes tisulares en portas se so- que producen depósitos de color al actuar sobre sustra-
meten a hibridación de DNA o RNA en el propio porta y tos cromógenos. De manera análoga, las sondas se pue-
el resultado se visualiza al microscopio. den marcar con digoxigenina, que es reconocida especí-
ficamente por un anticuerpo conjugado a un enzima. Re-
cientemente se ha incorporado una modificación impor-
Sondas moleculares tante en el desarrollo de la señal que aumenta la sensi-
bilidad de las sondas no isotópicas: en lugar de usar un
Se utilizan tres tipos fundamentales de sondas -molé- sustrato cromógeno, el enzima se hace actuar sobre sus-
culas de ácidos nucleicos de secuencia específica, marca- tratos fotógenos, emisores de fotones que impresionan
das de modo que se pueden visualizar-, según el origen una película fotográfica.
de las mismas: DNA, RNA y oligonucleótidos sintéticos
(oligos).
En cuanto al marcaje de las sondas, hay dos paráme- b) Tipos de sonda y métodos de marcaje
tros a considerar: a) uso de isótopos radiactivos o bien
marcaje no isotópico; b) método de marcaje, que depen- Existen tres tipos de sondas moleculares, según su ori-
de esencialmente del tipo de sonda usada. En la presen- gen:
tación que sigue describiremos los métodos de marcaje
más usados para cada tipo de sonda. b.1. Sondas de DNA: consisten en fragmentos de
cDNA o DNA genómico que han sido clonados y, por tan-
to, se pueden purificar en cantidades necesarias. Existen
a) Sondas isotópicas y alternativas no-isotópicas variantes según el vector usado al clonar el DNA en cues-
tión, pero el método más usado consiste en escindir el
Tradicionalmente, las sondas moleculares se han pre- DNA clonado (inserto) del vector, mediante enzimas de
parado con nucleótido-trifosfatos (ATP, dATP, CTP, dCTP, restricción, y purificar el inserto mediante electroforesis.
 E. SALIDO

Una vez identificada la banda de inserto en el gel de aga-

rosa teñido con bromuro de etidio, se corta con una hoja Tabla VII. Random primer
de bisturí y el DNA contenido en la banda se eluye. Una 1. Mezclar 0,1 vg DNA y 1,O pg hexanucleóticos en 14,O pl TE.
variante de obtención de sondas de DNA que se está 2. Hervir x 2-3 m. Poner en hielo.
usando frecuentemente consiste en la amplificación de
3 . Añaadir: 2,5 PI 0,5 mM dATP, dGTP, dTTP
fragmentos de DNA mediante reacción en cadena de po- 2,5 ~1 10X Random primer buffer.
limerasa (PCR), que será tratada en futuras revisiones. Exis- 5,O pl dCTP marcado.
ten numerosos procedimientos para eluir el DNA del frag- 1,O pl Klenow (3-8 U).
mento de gel aislado, desde la simple centrifugación has- 4. Incubar 2-4 h a temperatura ambiente.
ta la purificación con resinas de afinidad, pasando por la
electroelución. Con cualquiera de estos protocolos se ob-
tiene DNA doble cadena, que puede ser marcado in vitro
de varios modos, fundamentalmente dos: 2. Random primer (síntesis de DNA con Klenow y he-
xanucleótidos) (tabla VII): consiste en la síntesis de cade-
1. Nick translation (reparación con DNA polimerasa I) nas complementarias de DNA con el fragmento Klenow
(tablaVI): consiste en generar «mellas» en distintos pun- de la DNA polimerasa I, que, a diferencia del enzima com-
tos de la cadena de DNA con DNasa I que son repara- pleto, carece de actividad 5’-3’ exonucleasa. Esta síntesis,
das por la DNA polimerasa I utilizando nucleótidos trifos- que usa DNA desnaturalizado por calor como sustrato
fato de la mezcla, alguno(s) de los cuales están marcados monocadena, hace uso de una mezcla de oligonucleóti-
bien isotópicamente o bien con biotina o digoxigenina dos muy cortos (6,7) de todas las posibles secuencias,
(fig. 1). Además, las mellas producidas por la DNAasa son que actúan de cebadores (primers) de la reacción de po-
extendidas en sentido 5’-3’ gracias a la actividad 5’-exo- limerización que incorpora nucleótidos marcados (fig.11)
nucleasa (degradación del extremo 5’ del DNA) de la DNA a actividades específicas de 10 8 a 10 9 cpm/pg al usar 32P.
polimerasa (fig. 10). Con ello se consiguen sondas de una b.2. Sondas de RNA: consisten en fragmentos de
actividad específica en tomo a 10 8 cpm/pg al usar 32P. RNA monocadena generados mediante reacciones de
transcripción in vitro que incorporan nucleótidos trifosfa-
to marcados (tabla VIII). Se usan fragmentos de cDNA clo-
nados en vectores de expresión. Los vectores más fre-
Tabla VI. Nick translation cuentemente usados contienen secuencias promotoras
de la transcripción de la T7 o la SP6 RNA polimerasas in-
7.0 pl H,O mediatamente adyacente al inserto (fig. 12). Es importan-
2,5 pl 0,5 mM dATP, dGTP, dTTP
2,5 ~1 10X Nick translation buffer te tener en cuenta la orientación del inserto con respecto
10,O pl dCTP marcado al promotor, ya que de ello depende el que se obtengan
1,0 pl DNasa I (0,l n&l) sondas de RNA complementario (cRNA) útiles para hibri-
1,0 ~1 DNA (0,1 vgI dar mRNA celular o bien sondas de mRNA en sí, que no
1,O pl E. coli DNA polimerasa I (5-15 U). Incubar a 15 C x 1 hr
son complementarias al mRNA celular, obviamente. Así,

DNasa DNA
5’
3’ - 3’
5 ^ 5’ 3’
DNA -
3’- 3’ 5’ ^ 3’5’ - *****=******c*
5’ ^ 3’
Primers

DNA polimerasa 5’- \ 5’.

N
I, \
5 ’ 3 ’ ***** *--***** _I
*** - - - * * * * -
-5 \
-5’ I

Fig. 11.-Marcado de sondas por random primer. El DNA es

Fig. 10.-Marcado de sondas por nick translation. El DNA es« m e l l a d o » desnaturalizado por calor y’se hibrida con oligonucleótidos s de
por la DNasal y reparado por la DNA polimerasa, que, merced a sus secuencia al azar (- -). Estos oligos incitan la síntesis de cadenas de
actividades 5’-3’ exonucleasa y polimerasa, sintetiza cadenas DNA complementarias por la fracción Klenow de la DNA polimerasa
complementarias, usando los nucleótidos del medio, alguno de los (que carece de actividad 5’-3’ exonucleasa), incorporando los
cuales se encuentra marcado (*). nucleótidos del medio, alguno de los cuales está marcado (*).

28
 ANALISIS DEL DNA-l

TablaVlII. Transcripción in vitro Tabla X. Terminal-transferasa

1. Cortar (linearizar) el plásmido 3’ at inserto. 6.0 pl H,O.
1,0 pl (1 & oligo.
2. Mezclar (para 20 ~1): 4,0 pl 5X Buffer de transcripción. 4.0 ul 5X TdT buffer
2,0 pl 100 mM DTT. 8,0 ;l ddATP marcado en posición alfa.
0.8 PI RNasin. 1.0 pl TdT (10 U).
4.0 $ 2.5 mM ATP, UTP, GTP.
2,2 ~1 100 PM CTP. Incubar a 37 ºC durante 1 h.
1,O pl plásmido con inserto DNA
0 l@
5,0 pl CTP marcado.
1,O pl RNA polimerasa. forilados, con un grupo -OH libre en el extremo 5’. Por
3. Incubar a 37” C durante 1 h. tanto, se pueden usar directamente como sustrato de la
T4 polinucleótido-kinasa en presencia de ATP marcado en
el grupo fosfato gamma. La reacción de fosforilación trans-
fiere este fosfato gamma marcado al extremo 5’ del oligo.
2. Adición 3’ con transferasa terminal (TdT) (tabla X):
Tabla IX. Polinucleótido kinasa
esta enzima incorpora nucleótidos al extremo 3’, grupo
7,0 ~1 H,O. OH-, de una cadena sin necesidad de la existencia de una
2,0 pl 10X kinasa buffer. cadena complementaria como molde. Por tanto, TdT se
9.0 pl ATP marcado en posición gamma. puede usar para añadir nucleótidos marcados al extremo
1,0 I*I (1 pgl oligo.
1,0 gl T4 polinucléotido-kinasa (10 U). 3’ de un oligo. Cuando se usan deoxinucleótido-trifosfa-
tos, como dATP marcado, la TdT incorpora varias molé-
Incubar a 37” C durante 30 m. culas seguidas. En la práctica es generalmente preferible
incorporar sólo un nucleótido marcado por molécula de
oligo. Esto se consigue mediante el uso de análogos di-
cuando el inserto está dispuesto en el mismo sentido S-3’ deoxi-, como el ddATP marcado, que, por carecer del gru-
que el promotor (orientación denominada «sense»), se ge- po OH- 3’, no permiten la incorporación de nucleótidos
neran sondas de mRNA (útiles como control negativo o adicionales (de manera similar a lo que ocurre con la reac-
bien como fuente de mRNA para experimentos de tra- ción de terminación durante la secuenciación de DNA se-
ducción in vitro), las llamadas sondas sense. Por el con- gún el protocolo de Sanger).
trario, cuando el inserto está orientado en el sentido con-
trario al promotor (orientacion anti-sense), se generan
sondas de cRNA, conocidas también como anti- Análisis del DNA tipo Southem
sense, útiles para detectar mRNA.
b.3. Oligonucleótidos: consisten en sondas monocade- E. Southern describió en 1975 19 un método para trans-
na de 35-50 nucleótidos de secuencia específica que son ferir DNA, previamente fraccionado según tamaño en un
sintetizados in vitro. Existen varios protocolos de marcaje de gel y desnaturalizado, a una membrana que puede ser hi-
oligonucleótidos, de los que dos son los más usados: bridada con sondas para detectar secuencias concretas.
1. Fosforilación 5’ con T4 polinucleótido-kinasa (ta- Este procedimiento vino a ser conocido como «Southern»
bla IX): los procedimientos normales de síntesis (bien con y, posteriormente, a una variante del mismo concepto
fosforamiditas o con fosfotriésteres) generan oligos defos- para analizar RNA se denominó «Northern», jocosamen-
te. Siguiendo el mismo juego de palabras, «Western» se
usa para un análisis similar de proteínas. El principio físi-
co utilizado para transferir DNA del gel a la membrana es
eh******** cRNA la capilaridad, el mismo que se había utilizado durante
l ************ años para limpiar manchones de tinta con papel secante;
***************** de ahí que E. Southern usara los términos «blot» y «blot-
RNA polimerasa tingn» para referirse a su protocolo. Aunque algunos han
traducido literamente estas palabras al español, creemos
T7 cDNA que es más práctico seguir usando los términos «Southern
blot» o análisis tipo Southern. El término ha quedado tan
arraigado que se usa incluso en ocasiones en que un cam-
po eléctrico o la fuerza del vacío, en lugar de la capilar,
Fig. 12.-Marcado de sondas de RNA por transcripción in vitro. El es utilizada para transferir las moléculas a la membrana.
vector de expresión contiene la secuencia promotora (T7) que es El protocolo del Southem blot se incluye en la tabla XI.
reconocida por la RNA polimerasa para sintetizar RNA usando el
cDNA como molde e incorporando nucleótidos marcados del La esencia del análisis tipo Southern (fig. 13) es que los
medio (*). fragmentos resultantes de la digestión del DNA con un en-

29
 E. SALIDO

esencia de estudios genéticos con fines diagnósticos y de

TablaXI. Sothem blot construcción de mapas del genoma.
1. Digerir 10 p DNA con enzima restricción.
En lo que al diagnóstico de mutaciones se refiere, el
Southern es el método de elección para determinar de-
2. Separar fragmentos por electroforesis en agarosa.
leciones, inserciones, duplicaciones y otros reordena-
3. Desnaturalizar el DNA en el gel con solución alcalina. mientos genómicos que implican fragmentos grandes de
4. Transferir por capilaridad, vacío o campo eléctrico a mem. DNA. También es útil en la detección de mutaciones pun-
brana. tuales, siempre que afecten la diana de un cierto enzima
5. Fijar el DNA a la membrana por calor o luz UV. de restricción. Es asimismo la técnica fundamental en el
6. Hibridar con sonda específica. análisis de mutaciones por DNA inestable.

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30