Manual Laboratorio Bioquímica

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE GUADALAJARA
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO
BIOQUÍMICA
ELABORÓ: Revisó:
MC Araceli Escobedo Magallón Dra. Rosa María Muñoz Sauceda
Dr. Juan Villafaña Rojas ME María Eugenia Altamirano Loaeza

ÍNDICE
1. Identificación de propiedades de carbohidratos ……………………………… 1
2. Hidrólisis de disacáridos y polisacáridos ………………………………………. 7
3. Separación de carbohidratos por cromatografía de capa delgada ………… 12
4. Identificación de propiedades de lípidos ……………………………………… 15
5. Determinación de índice de acidez …………………………………………… 22
6. Identificación de propiedades de aminoácidos y proteínas ………………… 25
7. Separación de aminoácidos por cromatografía de capa delgada …………. 33
8. Titulación de aminoácidos ……………………………………………………… 36
1
BIOQUÍMICA
PARÁCTICA NÚMERO 1
“Identificación de propiedades de carbohidratos”
1. Objetivo
Aplicar diversas pruebas químicas para determinar las propiedades de los carbohidratos y
diferenciar los tipos de estas biomoléculas.
2. Prelaboratorio
Las pruebas químicas empleadas para detectar carbohidratos y para distinguirlos entre ellos,
pueden dividirse en dos categorías: a) pruebas basadas en la producción de furfural o un
furfural substituído y b) pruebas basadas en las propiedades reductoras de los azúcares.
Investigar el principio de dichas pruebas y cuales pruebas entran en la categoría a y cuales
en la categoría b.
3. Materiales equipos y reactivos

Gradilla metálica
Pinzas para tubo
Plancha de calentamiento
Recipiente para baño de agua
20 tubos de ensayo con tapón de rosca
Pipeta de 5 ml
Pipeta de 2ml
Pipeta de 1 ml
2
H2 SO4 concentrado
Soluciones de azúcares al 1% de: arabinosa, fructosa, glucosa, maltosa, almidón, sacarosa
(recientemente preparada) y xilosa.
Reactivo de Barfoed: disolver 13.3 g de acetato de cobre hidratado en 200 ml de agua (filtrar
si es necesario), añadir 1.8 ml de ácido acético glacial. El acetato de cobre se disuelve
lentamente.
Reactivo de Benedict: disolver 86.5g de citrato de sodio y 50 g de carbonato desodio anhidro

en 400 ml de agua, con calentamiento. Disolver 8.65 g de sulfato de cobre pentahidratado
en 50 ml de agua. Mezclar esas dos soluciones lentamente y añadir agua para producir 500
ml de solución.
Reactivo de Bial: Disolver 1.5 g de orcinol (5-metil-resorcinol) en 500 ml de HCl conc. y

añadir 1.5 ml de solución acuosa de cloruro férrico (FeCl3) al 10 %.
Reactivo de Molisch: disolver 2.5 g de α-naftol en 50 ml en 50 ml de etanol al 95 %.
Reactivo de Seliwanoff: disolver 0.5 g de resorcinol en 1000 ml de HCl 4M (333 ml de HCl

concentrado diluir a 1000 ml).
4. Seguridad y manejo de reactivos y residuos
Colocar los residuos de la prueba de Molisch y de Bial en el recipiente etiquetado como

ácidos y agentes oxidantes.
5. Introducción o fundamento teórico
Los glúcidos o carbohidratos son las biomoléculas más abundantes, son fundamentales en
la dieta humana, su oxidación es la principal ruta de obtención de energía en la mayoría de
las células no fotosintéticas. Los polímeros insolubles de glúcidos actúan como elementos
estructurales y de protección en las paredes celulares de bacterias y plantas y en los tejidos
animales, otros lubrican las articulaciones y participan en el reconocimiento y adhesión entre
las células. Los glucoconjugados actúan como señales que determinan la localización
intracelular o el destino metabólico.
3
Los carbohidratos son polihidroxialdehídos o cetonas de formas cíclicas o bien sustancias
que dan lugar a estos compuestos después de su hidrólisis. Muchos cumplen la fórmula
empírica (CH2O)n. Existen tres clases principales: monosacáridos o azúcares simples,
oligosacáridos formados por 2-10 moléculas de monosacáridos y los polisacáridos que son
polímeros de diversos tamaños de unidades de monosacáridos. Los mono y disacáridos
tienen nombres que terminan con el sufijo “osa”, si son aldehídos se denominan aldosas, si
son cetonas se llaman cetosas. La mayor parte de los oligosacáridos celulares que tienen
tres o mas unidades de monosacáridos no se encuentran libre sino que se unen a lípidos o
proteínas formando estructuras híbridas o glucoconjugado.
Durante la investigación bioquímica puede ser necesario establecer si una muestra dada,
particularmente de un preparación purificada contiene o no carbohidratos. Se dispone de
pruebas rápidas coloreadas que se basan en reacciones típicas para un grupo de azúcares
que se describen a continuación.
FUNDAMENTO DE LAS PRUEBAS
Prueba de Molish
Esta es una prueba general para carbohidratos, se basa en la formación de furfural o

hidroxifurfural cuando un carbohidrato reacciona con ácido sulfúrico concentrado. El furfural
reacciona con el reactivo de Molish, α-naftol, para producir compuestos de condensación
coloreados.
Prueba de Seliwanoff
Esta prueba distingue la fructosa, una cetohexosa, de las aldohexosas y disacáridos. La

reacción entre fructosa y el reactivo (resorcinol en HCl diluido) ocurre dentro de un minuto en
agua hirviendo. Se forma un producto coloreado rojizo; el color se intensifica con un
calentamiento posterior. Otros carbohidratos producen un color rojo pálido si el
calentamiento se prolonga, la formación de color es atribuible a la transformación de glucosa
a fructosa por la acción catalítica del ácido clorhídrico o por la hidrólisis de sacarosa para
producir fructosa.
Prueba de Bial
4
Esta prueba se usa para distinguir las pentosas de las hexosas. Las pentosas en encuentran
en plantas y animales, la ribosa y desoxirribosa se encuentran en los ácidos nucleicos. El
reactivo de Bial contiene orcinol (5-metil-resorcinol) se disuelve en HCl concentrado mas una
pequeña cantidad de FeCl3. Cuando se mezclan con el reactivo, las pentosas se convierten
a furfural, que reaccionan para producir un compuesto coloreado azul-verde.
Prueba de Benedict
En la prueba de Benedict el Cu+2 se reduce al Cu+, formando un precipitado rojo ladrillo de

Cu2O. Sin embargo, el color en una prueba de Benedict positiva puede aparecer como
verde, amarillo, anaranjado o rojo dependiendo de la cantidad de Cu 2O suspendido en el
reactivo azul. La cantidad de Cu2O formado depende de la concentración del azúcar en la
solución. Los azúcares reductores dan una prueba (+).
Prueba Barfoed
El reactivo de Barfoed se usa para distinguir entre mono y disacáridos. Esta prueba es
también una reacción de reducción del cobre pero difiere de la de Benedict en que el
reactivo está hecho en medio ácido (Cu(II), acetato y ácido acético). Dentro del tiempo
establecido, solo los monosacáridos reducirán los iones Cu+2. Si se calienta por tiempo
suficiente los disacáridos se hidrolizarán por el ácido presente y dan una prueba positiva.
6. Desarrollo experimental
Prueba de Molish
Correr esta prueba para cada una de las siguientes soluciones de carbohidratos al 1% y
agua como referencia blanco: (1) arabinosa, (2) glucosa, (3) fructosa, (4) maltosa, (5)
sacarosa, (6) almidón y (7) agua.
1. Colocar 5 ml de la solución en un tubo, añadir 0.2 ml del reactivo de Molish y mezclar bien.
2. Inclinar un poco el tubo y lentamente y con cuidado añadir 2 ml de H 2 SO4 concentrado por
las paredes del tubo de manera que forme una capa bajo la solución.
3. Mantener el tubo de prueba en la gradilla y observar la reacción en la interfase entre las dos
capas líquidas, un anillo violeta indica una prueba (+). Algunas reacciones pueden tomar
tiempos de hasta 15 a 20 minutos.
5
Prueba de Seliwanoff
Correr esta prueba para las siguientes soluciones: (1) arabinosa, (2) glucosa, (3) fructosa, (4)
maltosa, (5) sacarosa y (6) agua (blanco).
1. En un tubo mezclar 1 ml de la solución de carbohidrato y 4ml del reactivo de Seliwanoff.
2. Colocar los tubos en un baño de agua hirviendo por 2 minutos (no sobrecalentar). Un color
rojo indica prueba (+).
Prueba de Bial
Correr la prueba a: (1) arabinosa, (2) xilosa, (3) glucosa, (4) fructosa, y (5) agua (blanco).
1. Mezclar en un tubo, 2 ml de la solución de carbohidrato y 3 ml del reactivo de Bial.
2. Calentar en baño maría hirviente hasta que la mezcla esté en ebullición. Una coloración
verdosa indica prueba (+).
Prueba de Benedict
Correr esta prueba a: (1) arabinosa, (2) glucosa, (3) fructosa, (4) maltosa, (5) sacarosa, (6)
almidón (7) agua (blanco).
1. En un tubo mezclar 1 ml de la solución de carbohidrato y 5 ml del reactivo de Bendict.
2. Colocar los tubos en un baño de agua hirviendo por 5 minutos. Un precipitado amarillo
rojizo indica prueba (+).
Prueba de Barfoed
Correr esta prueba en: (1) arabinosa, (2) glucosa, (3) fructosa, (4) maltosa, (5) sacarosa y
(6) agua (blanco).
1. Mezclar en un tubo, 1 ml de la solución de carbohidrato y 5 ml del reactivo de Barfoed.
2. Colocar los tubos en un baño de agua hirviendo por 5 minutos. Un precipitado rojo indica
prueba (+).
6
7. Recolección de datos experimentales
Elaborar una tabla con los azúcares de prueba las técnicas aplicadas y la evidencia o
indicador de prueba positiva, para registrar y reportar los resultados.
8. Instrucciones de cálculos y resultados
En los anexos de este manual se describe las características del reporte.
9. Cuestionario
1. ¿Cual es la base química de la positividad de la prueba de Molish?
2. Describe el principio de la prueba de formación de osazonas, ¿Cómo se observa una
prueba positiva?
3. Explica y escribe la reacción de la prueba de Benedict.
4. ¿Qué son los azúcares reductores?
5. ¿La sacarosa es un azúcar reductor? ¿por qué?
6. Escribe la estructura de dos carbohidratos que den positiva la prueba de Bial.
10. Bibliografía
1. Hein, Morris; Peisen, Judith; Ritchet, James. Introduction to General Organic and
Biochemistry in the Laboratory. Eight Edition, John Wiley & Sons. U.S.A. 2005
2. Shankara,Shivalaja. Laboratory Manual for Practical Biochemistry. Jaypee Brothers

Medical Publishers. New Delhi. 2008
3. Sawhney, Singh. Introductory Practical Biochemistry. Alpha Science. India. 2006.
7
BIOQUÍMICA
“Hidrólisis de disacáridos y polisacáridos”
1. Objetivo
Aplicar las pruebas para azúcares reductores como indicadoras de la hidrólisis de

disacáridos y polisacáridos
2. Prelaboratorio
Investigar la estructura del almidón y el comportamiento de éste y otros polisacáridos con el

reactivo de yodo-ioduro de potasio.
Gradilla metálica
Pinzas para tubo
Baño maría
10 tubos de ensayo con tapón de rosca
Pipeta de 10 ml
Pipeta de 5 ml
Pipeta de 2ml
Pipeta de 1 ml
Gotero
H2 SO4 concentrado, HCl concentrado

8
Solución de Iodo al 1% en ioduro de potasio al 2% (I2-KI)
Sol. de Iodo al 1% en ioduro de potasio al 2% (I2-KI)
Sol. de NaOH al 10%
Jugos de frutas (naranja, limón, lima, manzana, uva...)
Disponer los residuos de hidrolizados en el recipiente etiquetado como ácidos no oxidantes.
Los disacáridos se forman por la unión de dos monosacáridos unidos por enlace
glucosídicos, pueden ser o no reductores dependiendo de la disponibilidad de grupo aldehído
o cetona potencialmente libre en su estructura. Los disacáridos mas comunes de importancia
biológica son maltosa, lactosa y sacarosa.
Los polisacáridos son polímeros de unidades de monosacáridos unidos por enlace

glucosídico, de acuerdo con el tipo de monosacárido presente se clasifican en
homopolisacáridos como el almidón, celulosa, glucógeno y en heteropolisacáridos que
tienen mas de un tipo de monosacárido como el ácido hialurónico, heparina, dermatán sulfato.
La prueba de Benedict y la prueba de Barfoed son pruebas de reducción. Ciertos

carbohidratos tienen capacidad reductora debido a que son capaces de formar, un grupo
aldehído o cetona libre en solución. En solución alcalina, los iones Cu(II) o Ag se reducen a
un precipitado característico de Cu2O o Ag libre. Todos los monosacáridos comunes son
azúcares reductores. Algunos disacáridos y polisacáridos pueden no ser reductores
inicialmente, pero muestran propiedades reductoras después de la hidrólisis por
calentamiento en solución ácida. Algunas pruebas extensamente usadas para azúcares se
basan en esta capacidad reductora de los carbohidratos.
9
Prueba de Yodo
La amilasa componente del almidón tiene una estructura helicoidal y cuando se trata con
solución de yodo, el yodo se atrapa en el interior de la estructura helicoidal dando a la
solución un color azul que indica la presencia de almidón. El color azul desaparece por
calentamiento y reaparece cuando se enfría.
Las dextrinas producen color rojo.
El glucógeno produce un color café.
El iodo reacciona con almidón para formar un complejo azul obscuro. Cuando se caliente una
solución de almidón acidificada, se hidroliza para producir glucosa. El color azul de la prueba
de iodo puede usarse para seguir el curso de esta hidrólisis.
Hidrólisis de Disacáridos
1. Colocar en un tubo con tapón de rosca 10 ml de solución de sacarosa y en otro tubo 10

ml de sol. de maltosa.
2. Añadir 5 gotas de HCl concentrado a cada tubo.
3. Colocar los tubos en un baño de agua hirviendo por 10 min.
4. Enfriar la solución y neutralizar el ácido con NaOH al 10% (requiere 18-20 gotas de base).
5. Correr las pruebas de Benedict y Seliwanoff usando 2 ml del hidrolizado y 5 ml del reactivo
de prueba.
Hidrólisis de Almidón
1. En un vaso de 100 ml mezclar 10 ml de solución de almidón al 1%, 10 ml de agua y 10

gotas de HCl conc.
2. Etiquetar 5 tubos como (1) blanco, (2) referencia, (3) 5 min, (4) 10 min, y (5) 15 min
3. Añadir 1 ml de agua destilada al tubo (1).

10
4. Tomar 1 ml de la solución de almidón y colocarla en el tubo (2)
5. Cubrir el vaso de la solución de almidón con un vidrio de reloj y calentar a ebullición por
15 minutos. (considerar el tiempo 0 cuando se inicia la ebullición)
6. Durante el periodo de ebullición retirar 1ml de la solución cada 5 minutos y transferirla al

tubo correspondiente (3), (4) y (5).
7. Añadir 4-5 gotas de la solución de lugol (I2 - KI) a cada uno de los 5 tubos y mezclar.
Registrar tus observaciones.
8. Después que el calentamiento es completo, retirar 1 ml de la solución y transferirla a un

tubo de prueba. Neutralizar el ácido con NaOH al 10% y probar para la presencia de
azúcares reductores con reactivo de Benedict.
Jugos de Frutas
1. Probar en los jugos disponibles la presencia de azúcares reductores y fructosa con

reactivos de Benedict y Seliwanoff .
2. Usar 1 ml del jugo para cada prueba.
Elaborar una tabla con los azúcares de prueba las técnicas aplicadas y la evidencia o
indicador de prueba positiva, para registrar y reportar los resultados.
8. Cuestionario
1. Que se entiende por inversión de sacarosa.
2. Describe como reacciona la solución de lactosa con los siguientes reactivos: Benedict,
Barfoed, Seliwanoff.
3. Cual es el color producido por el glucógeno y las dextrinas en la prueba de yodo.
4. Una prueba para detectar azúcares reductores es utilizar plata en solución amoniacal,
¿cuál es la reacción que se lleva cabo? ¿Cómo se determina que la prueba es positiva
para un azúcar reductor?
11
5. La siguiente pregunta se limita a los siguientes carbohidratos: arabinosa, glucosa, fructosa,
maltosa, sacarosa y almidón. Una solución de carbohidratos da una prueba de Molisch (+)
y negativas las pruebas de Benedict, Barfoed, Bial y Seliwanoff. Cuando se trata con HCl y
se calienta a ebullición por varios minutos, la solución muestra un resultado (+) en las
pruebas de Benedict, Barfoed y Seliwanoff y una prueba de Bial (-). ¿Que carbohidrato
tiene la solución?
9. Bibliografía
2. Shankara,Shivalaja. Laboratory Manual for Practical Biochemistry. Jaypee Brothers

Medical Publishers. New Delhi. 2008
3. Sawhney, Singh. Introductory Practical Biochemistry. Alpha Science. India. 2006.
12
BIOQUÍMICA
“Separación de carbohidratos por cromatografía de capa delgada”
1. Objetivo
Aplicar la técnica de cromatografía en capa delgada para separar e identificar monosacáridos

y productos de hidrólisis de disacáridos.
2. Prelaboratorio
Investigar la diferencia entre la cromatografía de adsorción y de partición y que tipos de

técnicas se basan en dichos principios.
Cámara para cromatografía
Placas cromatográficas de sílica gel G
Micropipetas de 20 µl
Fase móvil: n-butanol-ácido acético- éter etílico-agua (9:6:3:1)
Solución reveladora : ácido sulfúrico al 20% y naftorresorcinol al 0.2% en etanol (1:1)
Soluciones de carbohidratos: glucosa, fructosa, sacarosa, maltosa o lactosa
Disponer el sistema de solventes en el recipiente etiquetado como alcoholes y aldehídos.

13
El término cromatografía incluye todas aquellas técnicas en las que varios componentes en
una mezcla se separan durante su paso a través de un medio poroso debido a las diferencias
en su velocidad de migración. La muestra se aplica en un extremo del soporte o fase
estacionaria que puede ser un sólido o un líquido, la fase móvil, líquido o gas se hace fluir
sobre ése. El movimiento de las sustancias en la muestra que tienen mas afinidad por la fase
estacionaria tienden a permanecer mas tiempo en esa fase, los compuestos con alta afinidad
por la fase móvil migran con mas velocidad acarreadas por la fase móvil, de esto resulta la
separación de los componentes.
En la cromatografía de capa delgada, un material de soporte inerte ya sea una placa de vidrio,
plástico o metal está cubierto por una delgada capa de la fase estacionaria, de 250μm para
separación analítica o mas gruesa, 2-5 mm para separación preparativa. Un agente enlazante
como CaSO4 o yeso se incorpora al medio cromatográfico para facilitar la adhesión del
adsorbente a la placa. El adsorbente mas utilizado es la Silica Gel G Merck que contiene 13%
de CaSO4 otro es la Silica Gel H Merck.
Los componentes separados se identifican en base a sus valores Rf, que denota relativo al
frente y se calcula:
Rf = Distancia recorrida por el componente desde la línea base
Distancia recorrida por el solvente desde la línea base
Ya que sobre el Rf influye el sistema de solvente, temperatura, pH, modo de desarrollo,

soporte, debe incluirse un estándar en la corrida.
1. Hidrolizar soluciones de disacáridos: colocar en cada tubo: 10ml de la solución de

disacárido, maltosa, sacarosa o lactosa + 5 gotas de HCl conc., colocar en agua hirviendo
por 10 min. Se puede utilizar las muestras hidrolizadas en la práctica 2.
14
2. Saturar la cámara con la mezcla de solventes durante 30 minutos.
3. Aplicar en la placa cromatográfica las siguientes muestras: glucosa, fructosa, sacarosa,

maltosa e hidrolizado. Tener cuidado que la aplicación tenga una distancia por encima del
nivel del solvente.
4. Colocar la placa en la cámara ya que las aplicaciones estén totalmente secas.
5. Desarrollar la cromatografía hasta aproximadamente un centímetro antes del borde, una

vez alcanzado el desarrollo sacar la placa y marcar con lápiz el frente del solvente.
6. Dejar secar la placa, atomizar la solución reveladora y calentar en horno a 105°C, hasta
aparición de las manchas.
7. Fase estacionaria: Sílica gel G.
Medir las distancias recorrida por cada componente separado, medir la distancia recorrida por
el solvente para calcular el valor de Rf para cada mancha.
8. Cuestionario
1. Explica el fundamento de la separación por cromatografía de capa delgada.
2. Explica el fundamento de la reacción base del proceso de revelado utilizado en esta

práctica.
3. ¿Que es el valor Rf?
4. Explica el principio de una técnica analítica para determinación de carbohidratos diferente

de las utilizadas en tus práctica de laboratorio.
9. Bibliografía
Sawhney, Singh. Introductory Practical Biochemistry. Alpha Science. India. 2006.
15
BIOQUÍMICA
“Identificación de propiedades de lípidos”
1. Objetivo
Aplicar pruebas sencillas para determinar las propiedades de lípidos con el fin de
identificación de distintos tipos de estas biomoléculas.
2. Prelaboratorio
Investigar las propiedades de solubilidad y punto de fusión de los lípidos e inferir la relación
de estas propiedades con las características estructurales.
3. Material equipos y reactivos
Para esta práctica se requieren tubos limpios (lavados con detergente, agua caliente,
enjuagados con agua destilada) y secos.
Gradilla metálica
Pinzas para tubo
Baño maría
Goteros de vidrio
Pipeta de 1ml
Pipeta de 5 ml
Bisulfato de potasio
Agua de bromo: añadir 5ml de bromo a 100 ml de agua, agitar la mezcla y mantener en un
frasco ámbar.
16
NaOH al 10%
Anhídrido acético
H2SO4 concentrado
Solventes: agua, acetona, alcohol etílico, éter etílico, cloroformo
Materiales de prueba: aceite vegetal, manteca vegetal, ácido oleico, ácido esteárico, glicerol,
colesterol

Disponer los residuos en un recipiente para grasas y aceites.
Los residuos del la prueba de saponificación pueden eliminarse en la tarja.
Los lípidos son sustancias que se encuentran en forma natural y que son arbitrariamente
agrupados en base a su solubilidad en solventes orgánicos como éter, benceno, cloroformo,
tetracloruro de carbono y por su insolubilidad en agua. Los lípidos se subdividen en clases
basadas en similitudes estructurales. Dos importantes clases son los lípidos simples y los
esteroides.
Lípidos simples. (a) Grasas y aceites; ésteres de ácidos grasos y glicerol. (b) Ceras:
ésteres de ácidos grasos de alto PM y alcoholes de alto PM.
Esteroides. Ésas son sustancias que poseen una estructura de 17 C, de 4 anillos

fusionados conocidos como núcleo esteroide. El colesterol y varias hormonas son de esta
clase. Los esteroides con un grupo –OH unido al anillo se conocen como esteroles, el
colesterol es un ejemplo de éstos.
La distinción entre grasas y aceites es que las grasas son sólidas a temperatura ambiente
mientras que los aceites son líquidos. Ambos tienen una estructura molecular similar, un
triéster de glicerol, triacilglicerol, cuyos ácidos grasos contienen entre 4 a 20 átomos de C o
más. El número de dobles enlaces en la cadena carbonada usualmente varía entre 0 y 4. El
ácido oleico, ácido de 18 C con un doble enlace es el ácido graso insaturado mas común. El
término poli-insaturado significa que la molécula contiene varios dobles enlaces.
17
Los halógenos se añaden fácilmente a los dobles enlaces C-C
X2 + -CH=CH-  -CHX-CHX-
Una solución de bromo en 1,1,1-tricloroetano se usa para detectar y estimar el grado de

insaturación en grasas. El color café-rojizo desaparece cuando se añade bromo a los
dobles enlaces.
Las grasas se saponifican cuando se calientan como una base fuerte como NaOH,
produciendo sales de sodio de ácidos grasos (jabones) y glicerol. Las grasas se hidrolizan a
ácidos grasos y glicerol en la presencia de enzimas lipasas o cuando se calientan con un
ácido fuerte.
Saponificación: Grasa + NaOH   Sal sódica de ácidos grasos + glicerol
Hidrólisis: Grasa + Agua Enzimas o H+  Ácidos grasos + glicerol
El bisulfato de potasio (KHSO 4) se usa para distinguir ésteres de glicerol de otros lípidos.
Es ambos, un ácido fuerte y un agente de deshidrogenación poderoso. Cuando el bisulfato
de potasio se calienta con una grasa, ocurre hidrólisis y el glicerol producido se deshidrata a
acroleína. La acroleína (CH2=CHCHO) es un aldehído insaturado con un olor irritante
característico.
Los esteroides se encuentran en plantas y animales y tienen una variedad de funciones.

Ejemplos de esteroides son el colesterol, hormonas sexuales, ergosterol (precursor de
vitamina D), sales biliares y cortisona. Tienen una estructura de 17 carbonos de cuatro
anillos fusionados. Este esqueleto hidrocarbonado puede tener varias instauraciones y
substituciones en varios puntos, especialmente en posición 3 y 17. El colesterol se
encuentra en alimentos de origen animal como huevos, mantequilla, carne y queso. El
colesterol no se encuentra en los tejidos vegetales pero tienen esteroides estrechamente
relacionados.
Pequeñas cantidades de colesterol y esteroides relacionados pueden detectarse por la

prueba de Lieberman-Burchard. Esta prueba involucra el tratamiento de una solución
18
clorofórmica del esteroide con anhídrido acético y ácido sulfúrico concentrado. La formación
de un color azul verde es una prueba positiva.
Prueba de solubilidad
1. Tomar pequeñas cantidades (0.5 ml, 0.1 a 0.5 g) de diferentes lípidos de prueba, colocarlas
en los tubos correspondientes, a un tubo añadir 2 ml de agua, agitar bien y observar la
solubilidad.
2. Colocar el tubo en baño de agua a 50° C por 5 minutos, anotar cualquier cambio en la
solubilidad.
3. Repetir la prueba de solubilidad con diferentes solventes, pasos 1 y 2.
4. Registrar las observaciones y concluir sobre las características de solubilidad de cada uno
de los lípidos probados.
Prueba de acroleína
1. Colocar aproximadamente 0.4g (no más de 0.5) de bisulfato de potasio en un tubo limpio y
seco, añadir 2 gotas (0.05 a 0.1g) del material a ser probado, asegurarse que esté en
contacto con el bisulfato de potasio. Calentar el tubo sobre la flama, inclinar el tubo en un
ángulo de aprox. 45° y agitar constantemente la mezcla, mover el tubo dentro y fuera de la
llama para controlar el calentamiento.
2. Precaución: no orientar la boca del tubo hacia ti ni hacia otra persona.
3. Continuar calentando hasta que el bisulfato de potasio se funda y un ligero

obscurecimiento del contenido del tubo es visible. Detener el calentamiento y
continuamente notar el olor del vapor. La acroleína produce un olor irritante característico.
4. Hacer la prueba de acroleína en los siguientes materiales. Describir y registrar las

diferencias cualitativas y las diferencias en la intensidad del olor producido.
a) Aceite vegetal
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b) Ácido oleico
c) Ácido esteárico
d) Glicerol
Reacción con bromo
1. Colocar tubos secos en una gradilla 3ml de las muestras de prueba: (1) aceite vegetal;
(2) glicerol; (3) 0.1g ácido esteárico; (4) ácido oleico; 0.05g colesterol; (5)manteca
vegetal fundida.
2. Añadir agua de bromo gota a gota y agitar el tubo después de cada adición, mantener la
adición hasta decoloración y la retención del color.
3. Anotar la cantidad de agua de bromo añadida, notar si el color del bromo disminuye en
los 10 a 30 segundos siguientes a la adición del reactivo. Registrar el resultado como:
0 = no desaparece el color
1= se nota la disminución del color
2= completa o casi completa desaparición del color.
Prueba de Lieberman-Burchard
1. Colocar 5 tubos limpios, secos en una gradilla y añadir el material a ser probado como
sigue: (1) ácido esteárico; (2) colesterol, ambos tamaño de cabeza de alfiler; (3) 0.5 ml
glicerol; (4) 0.5 ml aceite vegetal; (5) 0.5 ml manteca vegetal fundida.
2. Añadir 2ml de cloroformo, 10 gotas de anhídrido acético y 2 gotas de ácido sulfúrico

concentrado a cada tubo y mezclar.
3. Después de 5 minutos notar el color presente y su intensidad relativa en cada solución.

El color cambia de rosa  azul  verde en el curso de la reacción. La intensidad del
color es proporcional a la cantidad de esteroide presente.
Saponificación
20
1. Colocar 0.5ml de aceite vegetal o manteca vegetal fundida en el tubo de prueba y añadir
1 ml de NaOH al 10%. Inclinar el tubo a 45° y calentar sobre flama.
2. Agitar el tubo constantemente mientras se calienta. Controlar el calentamiento sacando

y metiendo el tubo a la flama. Continuar calentando con agitación constante hasta casi
sequedad o hasta que se empieza a formar un sólido.
3. Permitir que el tubo se enfríe y añadir 5 ml de agua destilada, tapar el tubo y agitar
vigorosamente por varios segundos. Registrar los resultados.
4. A otro tubo de prueba agregar 0.5 ml de aceite vegetal y 1ml de NaOH al 10%. No
calentar este tubo, añadir 5 ml de agua destilada, tapar y agitar el tubo vigorosamente
por varios segundos.
5. Comparar los resultados con los obtenidos con el primer tubo.
Elaborar una tabla para registrar los resultados, con los lípidos probados, las técnica
aplicadas y le evidencia o indicador de prueba positiva.
8. Cuestionario
1. Escribir la fórmula de triacilglicerol formado por glicerol y 3 moléculas de ácido esteárico.

2. Escribir la reacción que sucede en la prueba de acroleína.
3. Explicar por qué el gliceril tripalmitato y el colesterol producen resultados diferentes en
la prueba de acroleína.
4. Escribir la reacción que muestra la adición de bromo al ácido oleico.
5. Escribir los productos formados en la prueba de saponificación para los glicéridos de
ácido láurico, palmítico y oleico.
9. Bibliografía
2. Sawhney, Singh. Introductory Practical Biochemistry. Alpha Science. India. 2006
21
BIOQUÍMICA
“Determinación de índice de acidez”
1. Objetivo
Aplicar una prueba de titulación para determinar el ácido libre presente en una muestra de
aceite.
2. Prelaboratorio
Revisar el significado del índice de acidez, índice de yodo e índice de peróxido en grasas y
aceites.
3. Materiales, equipo y reactivos
Material
Matraz Erlenmeyer de 250 ml
Bureta de 25 o 50 ml
Probeta de 25 o 50 ml
Gotero
Pinzas par bureta
Soporte
Reactivos
Solución de hidróxido de potasio 0.1N
Etanol al 95%
Fenolftaleína al 1% indicador
4. Seguridad en manejo de reactivos y residuos
22
Colocar los residuos de la titulación en un recipiente para grasas y aceites R-9
Se entiende por grasa o aceite comestibles los alimentos que se componen de glicéridos de
ácidos grasos y son de origen vegetal, animal o marino. Podrán contener pequeñas
cantidades de otros lípidos tales como fosfátidos, de constituyentes insaponificables y de
ácidos grasos libres naturalmente presentes en grasas y aceites. Se entiende por grasas y
aceites vírgenes las grasas y aceites vegetales comestibles, obtenidos sin modificar la
naturaleza del aceite por procedimientos mecánicos, por ejemplo extrusión y prensado, y por
aplicación únicamente de calor. Podrán haber sido purificados por lavado, sedimentación,
filtración y centrifugación únicamente.
La acidez de grasas y aceites se expresa como valor o índice de acidez, que se define como
los mg de KOH (hidróxido de potasio) requeridos para neutralizar el ácido libre presente en 1
gramo de grasa o aceite. La cantidad de ácidos grasos libres presentes en la grasa es un
parámetro útil que da información sobre la edad y grado de deterioro. Debido a que la
rancidez ocurre por hidrólisis enzimática o química de los triacilgliceroles en ácidos grasos y
glicerol, la cantidad de ácidos grasos libres se estima con una titulación usando KOH.
Colocar 5 g de muestra en un matraz y añadir 25ml de etanol para disolverla. Agitr bien y
añadir unas gotas de fenolftaleína como indicador. Titular esta solución con KOH 0.1N
(estandarizado con ácido oxálico 0.1N). El punto final es la aparición de un color rosa que
persiste por 20-30 segundos. Anotar el volumen de KOH utilizado. Titular un blanco (solo el
solvente de la grasa) con KOH
7. Obtención de datos experimentales
Cantidad de KOH consumida por el blanco = x ml
Cantidad de KOH usada por la muestra de prueba = y ml
Título de la muestra = (y-x) ml

23
Índice de acidez (mg KOH /g grasa) = Título de la muestra x N del KOH X 56.1
Peso de la muestra (g)
De acuerdo a la NMX-F-101-SCFI-2012
En la mayoría de las grasas y aceites el porcentaje de ácidos grasos libres es calculado

como ácido oleico
Ácidos grasos libres como oleico en % = V x N x 28.2

Peso de la muestra (g)
meq del ácido graso de referencia = oleico 0.282
N = normalidad del KOH
V = ml título de la muestra
Para convertir el valor de % de ácidos grasos libres (como oleico) a índice de acidez,
multiplicar el %ácido x 1.99
8. Cuestionario
1. Definir índice de yodo e índice de saponificación de grasas y aceites.
2. Que información proporcionan los índices anteriores.
3. El porcentaje de ácidos grasos libres se expresan en aceite de coco como ácido láurico y en
aceite de palma como ácido palmítico, ¿Cuál sería el factor utilizado para calcularlos en cada
caso?
4. ¿Por qué el factor de conversión de %ácidos grasos libres a índice de acidez es 1.99?
5. ¿Cuál es el significado de ácidos grasos libres en el organismo humano? ¿Qué indica un

aumento de ácidos grasos libres en plasma?
9. Bibliografía
Anusha Bhaskar. Bichemicl Methods A Practical Approach. Alpha Science. 2014
NMX-F-101-SCFI-2012
24
BIOQUÍMICA
“Identificación de propiedades de aminoácidos y proteínas”
1. Objetivo
Aplicar pruebas sencillas para determinar las propiedades de los aminoácidos y las
proteínas con el fin de identificar sus características estructurales.
2. Prelaboratorio
Revisar las características estructurales de los alfa-aminoácidos y la clasificación de acuerdo
a la cadena lateral.
Gradilla metálica
Tubos con tapón de rosca
Pinzas para tubo
Recipiente para baño maría
Tirosina
Urea
Ácido acético glacial
Leche sin grasa (desnatada)
Soluciones:
Albúmina 2%
Sulfato de cobre (II) 1% .
Gelatina 2%
Glicina 1%
Ácido clorhídrico 6M
25
Acetato de plomo(II) 0.1M
Ninhidrina 0.3% en acetona
Fenol 1%
NaOH 10%
Ácido nítrico 6M
Ácido nítrico concentrado
1-nitroso-2-naftol 0.1% en acetona

Los residuos de las pruebas se pueden vaciar a la tarja.
Las proteínas son complejos de biomoléculas presentes en cada célula de todos los
organismos vivos. Funcionan como material estructural y como enzimas, catalizadores
biológicos que regulan una multitud de reacciones que mantienen la vida. Químicamente, las
proteínas son polímeros de α-aminoácidos unidos por enlaces peptídicos.
A. Aminoácidos.
Todos los aminoácidos son ácidos carboxílicos que tienen un grupo funcional amino (-NH 2)
unido al C-2 (carbono alfa) y son así llamados α-aminoácidos.
B. Polipéptidos y proteínas
Un enlace peptídico es una estructura amida, se forma por liberación de una molécula de
agua por la unión del grupo carboxilo de un aminoácido y el grupo amino de otro AA. Si se
unen 40-50 AA el polímero se denomina un polipéptido. En una proteína típica se unen,
cientos (o miles) de aminoácidos para formar la estructura primaria de la proteína.
Debido a que los aminoácidos en todas las proteínas incluyen un grupo amino, las proteínas
difieren de carbohidratos y grasas no solamente en sus funciones, sino también en la
composición elemental. Algunos AA en su grupo R incluyen azufre como la cistina, cisteína y
metionina. Otros elementos como P, Fe Cu, Zn, I, se encuentran en ciertas proteínas
complejas, pero no son parte de la estructura primaria sino que son constituyentes de
substancias combinadas con proteínas.
26
C. Pruebas para Proteínas y Aminoácidos.
Muchas pruebas han sido desarrolladas para detectar y distinguir entre aminoácidos,
péptidos y proteínas. Se producen colores característicos cuando ciertos reactivos
reaccionan con uno o más de los grupos constituyentes en una molécula proteica. El color
producido con un reactivo dado varía en intensidad con diferentes proteínas debido a que
todas las proteínas contienen diferentes aminoácidos o no contienen la misma cantidad del
grupo que produce el color. En esta práctica, se usarán reactivos productores de color para
obtener una información cualitativa acerca de la composición de las proteínas ensayadas.
Compuestos diferentes a los AA y proteínas pueden producir color con alguno de eso
reactivos.
FUNDAMENTO DE LAS PRUEBAS
Se experimentará en tres proteínas -caseína derivada de la leche, albúmina y gelatina-, en

moléculas no proteínas -urea, fenol- y en aminoácidos específicos.
Prueba de Biuret
Esta prueba involucra calentamiento de una solución fuertemente alcalina de sulfato de
cobre (II) con el material de prueba, es muy sensible para proteínas y polipéptidos que
contienen por lo menos tres unidades peptídicas. Se produce un color violeta.
Prueba de tirosina
Esta prueba es un método muy sensible para detectar la presencia del aminoácido tirosina
en forma individual o en una proteína.
Prueba de ninhidrina
Los alfa-aminoácidos reaccionan con ninhidrina para formar un complejo coloreado azul a
púrpura (la prolina forma un color amarillo). Esta reacción es la base para identificación de
aminoácidos por cromatografía y también para determinación colorimétrica de AA en
solución. Durante la reacción se libera amoniaco que reacciona con la ninhidrina para
formar el complejo coloreado.
Prueba xantoproteica
Esta prueba la presentan la mayoría de las proteínas y se debe a la presencia de grupo
fenilo (-C6 H5), que reacciona con ácido nítrico para formar nitro compuestos coloreados.
Pruebas para cistina y cisteína en proteínas
27
Cuando las proteínas que contienen cisteína se calientan con una solución de hidróxido de
sodio el azufre se convierte en iones surfuro (S-2). La presencia de iones sulfuro en solución
se detectan por reacción con acetato de plomo (II) para formar un precipitado blanco de
sulfuro de plomo.
D. Proteínas como fuente alimenticia

Nutricionalmente, la leche es un alimento casi completo que contiene proteínas, grasa,
carbohidratos, minerales y un número importante de vitaminas Las proteínas incluyen
caseína, lactalbúmina y lactoglobulina. La caseína constituye el 80% de la proteína en la
leche de vaca y alrededor del 40% en la leche humana. La caseína en la leche es una
fosfoproteína que contiene 0.7% de fósforo. Está presente como caseinato de calcio en
leche de vaca y como caseinato de potasio en leche humana.
La caseína se libera de la leche desde su forma salina y precipitada de leche sin grasa por
tratamiento con ácidos acético o clorhídrico diluídos. Sin embargo no debe usarse mucho
ácido porque la casina libre actúa como una base y se redisuelve en exceso de ácido.
Prueba de Biuret
Colocar 0.6 g de urea en un tubo seco y calentar cuidadosamente sobre la flama. Después
que la urea se funde, continuar calentando por alrededor de 30 seg. Detener el
calentamiento e inmediatamente notar el olor (PRECAUCIÓN) del gas emitido. Permitir que
el tubo se enfríe, añadir 8 ml de agua, mezclar para disolver el residuo. Mantener para la
prueba de Biuret
Procedimiento:
1. A un tubo limpio añadir 4.0 ml de la solución de prueba, 1.0 ml de solución de NaOH al
10% y 4 gotas de la solución de sulfato de cobre al 1%. Mezclar y anotar el color
desarrollado.
28
2. Hacer la prueba de Biuret sobre las siguientes soluciones. Registrar las observaciones en
una tabla.
(a) solución derivada del calentamiento de urea
(b) albúmina al 2%
(c) glicina al 1 %
(d) agua (blanco)
Prueba de Tirosina
Procedimiento:
1. A un tubo limpio añadir 0.5 a 1.0 ml de la solución a ser probada y 2 gotas de 1-nitroso-
2-naftol al 0.1% en acetona y mezclar. En esta etapa de la prueba, cada solución
probada debe mostrar un color ligeramente amarillo.
2. Añadir 3 gotas de HNO3 6M y mezclar. Calentar cada tubo en agua hirviendo por
aproximadamente 1 minuto. Anotar el color desarrollado. (una prueba positiva da un
color rosa a rojo).
Hacer la prueba a las siguientes soluciones: (registrar las observaciones)
(a) albúmina al 2%
(b) fenol al 1%
(c) glicina al 1%
(d) 5 ml de agua con un pequeña cantidad de tirosina (punta de la espátula)
(e) gelatina al 2%
(f) agua (blnaco)
Prueba de Ninhidrina
Procedimiento:
1. A un tubo añadir 5 ml de la solución de prueba y 10 gotas de solución de ninhidria.
Mezclar y calentar la mezcla en baso de agua hirviendo por 2 min.
2. Anotar el color desarrollado.
Hacer la prueba a las siguientes soluciones: (registras las observaciones)
29
(a) albúmina al 2% (d) gelatina al 2%
(b) glicina al 1% (e) agua (blanco)
(c) fenol al 1%
Prueba Xantoproteica
Procedimiento:
1. En un tubo limpio colocar 3 ml de la solución de prueba y 10 gotas de ácido nítrico
concentrado. Mezclar y anotar cualquier cambio.
2. Calentar el tubo 3-4 min en un baño de agua hirviendo y anotar cualquier cambio de
color.
3. Enfriar y añadir NaOH al 1% (3-4 ml) hasta que la solución sea alcalina. Notar el cambio
de color.
Hacer la prueba a las siguientes soluciones:
(a) Albúmina al 2% (d) Gelatina al 2%
(b) Glicina al 1% (e) Agua (blanco)
(c) Fenol al 1%
Prueba para azufre de cisteína en proteínas

Procedimiento:
1. Añadir a un tubo 3 ml de la solución de prueba y 2 ml de NaOH al 10%.
2. Calentar el tubo en baño de agua hirviendo por 1 a 2 min.
3. Remover el tubo del baño de agua y añadir 4 gotas de solución de acetato de plomo(II) y
anotar el resultado
4. Añadir HCl 6 M (2-3ml) hasta que el color obscuro desaparezca. Notar con cuidado el
olor de la solución.
Hacer la prueba a las siguientes soluciones:
(a) albúmina al 2%
(b) gelatina al 2%
(c) agua (blanco)
Precipitación y pruebas de caseína

Precipitación de caseína.
30
1. Mezclar 50 ml de leche sin grasa con 50ml de agua en un erlenmeyer de 250 ml.
2. Añadir ácido acético (1 volumen de ácido acético glacial + 9 volúmenes de agua) por
goteo, con agitación vigorosa hasta formar un precipitado floculento. Usualmente se
requiere de 2-3ml de ácido acético diluido. Evitar el exceso de ácido.
3. Permitir que la caseína sedimente por unos minutos. Filtrar a través de papel filtro,
remover el exceso de humedad presionando el precipitado entre el papel.
El proceso de filtración puede tomar algún tiempo. Hacer las otras pruebas mientras el
líquido se drena y completar la práctica con la caseína.
Pruebas de Caseína.
1. Para cada uno de las siguientes pruebas, mezclar una cantidad de caseína con 3-5 ml
de agua.
2. Desarrollar la prueba y registrar los resultados.
(a) Biuret, (b) ninhidrina, (c) tirosina, (d) xantoproteica

Registrar los resultados en una tabla con las sustancias de prueba, las técnicas aplicadas y
la observación indicadora del resultado.
8. Cuestionario
6. Escribir la estructura que debe estar presente en una proteína para una prueba de Biuret
(+)
7. Escribir la estructura del aminoácido que da una prueba de tirosina (+)
8. Escribir la estructura de un tripéptido que de una prueba de tirosina (+)
9. Que grupos en los aminoácidos o proteínas son responsables de la prueba de ninhidrina
(+)
10. Escribir el nombre y estructura de tres aminoácidos que den una prueba de ninhidrina
(+)
11. Que aminoácidos pueden estar presentes en una proteína que muestra una prueba
xantoproteica (+)
31
12. ¿Por qué la piel se mancha de amarillo cuando se pone en contacto con ácido nítrico?
13. Escribir la(s) estructura(s) de aminoácido que puede estar presente en una prueba de
sulfuro positiva.
14. Como se explica la presencia de color obscuro y el olor producido en la prueba de
cisteína. Escribe la reacción.
9. Bibliografía
Hein, Morris; Peisen, Judith; Ritchet, James. Introduction to General Organic and
32
BIOQUÍMICA
“Separación de aminoácidos por cromatografía de capa delgada”
1. Objetivo
Aplicar la técnica de cromatografía en capa delgada para separa una mezcla de

aminoácidos e identificación mediante comparación con aminoácidos estándar.
2. Prelaboratorio
Investigar dos sistemas de eluentes para separación de aminoácidos, diferentes del sistema
utilizado en esta práctica y los Rf de lo aminoácidos separados con estos sistemas.
Cámara para cromatografía

Micropipetas de 20 microlitros
Cromatoplaca de sílica gel G
Fase móvil: Ac. acético-1-butanol-agua (1:3:1)
Ninhidrina 0.3% en acetona
Soluciones:
Alanina 0.2M
Ac. aspártico 0.2M
Leucina 0.2M
Lisina 0.2M
Mezcla de los AA anteriores
Hidrolizado de proteína
33
Los residuos de la fase móvil disponerlos en el recipiente etiquetado como acloholes y
aldehídos R-3
La cromatografía es una técnica empleada para separar y/o identificar los componentes de
una mezcla. La cromatografía en capa delgada generalmente separa compuestos orgánicos
en base a la polaridad con el compuesto mas polar moviéndose a corta distancia. Los
compuestos polares son menos solubles en los solventes orgánicos, se enlazan más
fuertemente a la sílica gel, alúmina o papel que los compuestos no polares y así se mueven
más lentamente. La relación de la distancia recorrida por el compuesto con la recorrida por
el solvente es el valor Rf. El Rf es función de las características del solvente y de los
componentes. Mientras el valor sea más cercano a l.0, mas permanencia del compuesto en
la fase móvil.
La cromatografía de capa delgada tiene dos principales ventajas sobre la de papel: (1)
provee una mejor y más rápida separación y (2) los materiales adsorbentes pueden variarse
permitiendo una mayor flexibilidad en la separación.
Se separarán AA de la caseína -proteína de la leche-. La caseína se trata previamente con

agua, ácido y calor para hidrolizar la proteína en sus aminoácidos constituyentes. Para
identificar la posición de los aa se utiliza la reacción con ninhidrina que produce un color
púrpura, café rojizo o amarillo (dependiendo del tipo de AA). Cada AA es ligeramente
diferente químicamente de otro, como resultado migran sobre la placa a diferentes
velocidad y se adsorben a distancias diferentes del punto de aplicación. Es posible
identificar una mezcla desconocida comparando con los valores Rf de AA conocidos.
Hidrólisis de proteína:
Colocar en un tubo con tapón de rosca, 1 volumen de proteína (albúmina o caseína) con dos
volúmenes de HCl 6N, colocar en horno a 110°C por 24 horas.
34
Separación cromatográfica
1. Saturar la cámara de cromatografía por 45 min con la fase móvil.
2. Aplicar 20 μl de cada una de las soluciones de AA, la mezcla y el hidrolizado de
proteína, en la cromatoplaca. Dejar secar los puntos de aplicación antes de introducir la
placa en la cámara.
3. Colocar la placa y permitir y permitir el desarrollo hasta aproximadamente 1cm antes de
llegar al borde.
4. Al término de la corrida sacar la placa de la cámara, marcar el frente de solvente,
permitir que seque completamente colocándola sobre una planca de calentamiento o en
el horno a temperatura moderada.
5. Aplicar la ninhidrina en aerosol, dejar secar, calentar hasta que aparezcan las manchas.
6. Medir la distancia recorrida por la mancha y por el solvente.

Calcular los valores Rf de cada una de las manchas, registrar los valores Rf de cada una de
los aminoácidos separados y de los aminoácidos estándar en una tabla.
8. Cuestionario
1. Explicar el principio de reacción entre la ninhidrina y los aminoácidos.
2. Explicar el principio de la separación por CCF.
3. Explicar en que consiste la degradación de Edman para el estudio de proteínas.
4. Nombre tres agentes utilizados para segmentar proteínas con el fin de secuenciar los
fragmentos e indica sobre enlaces específicos actúan.
9. Bibliografía
Sawhney, Singh. Introductory Practical Biochemistry. Alpha Science. India. 2006
35
BIOQUÍMICA
“Titulación de aminoácidos”
1. Objetivo
Probar experimentalmente las propiedades ácido base de los amonoácidos mediante
titulación de un aminoácido de prueba-
2. Prelaboratorio
Investigar los siguientes conceptos que expresan las propiedades ácido base de los
aminoácidos: pKa, ecuación de Henderson-Hasselbach, punto isoeléctrico, zwiterión, par
conjugado antes del pK1 y antes del pK2

Potenciómetro
Agitador magnético
Bureta
Pipeta de 10 ml
Vaso de precipitado de 100 ml
Matraz volumétrico de 50 ml
Soluciones tampón para calibración
NaOH 0.1N
Soluciones 0.1M de los siguientes aminoácidos:
Glicina, alanina, cisteína, serina, lisina y treonina.

Los residuos de las titulaciones se pueden eliminar en la tarja.
36
La valoración ácido-base implica la adición o eliminación gradual de protones. En una curva
de valoración de un ácido diprótico, la gráfica tiene dos etapas que en los aminoácidos (AA)
corresponden a la desprotonación de los dos grupos, -COOH y NH3+. Cada una de las
etapas se asemeja en su forma a la curva de valoración de un ácido monoprótico, a un pH
muy bajo, la especie iónica predominante es la forma totalmente protonada, en el punto
medio de la primera etapa se encuentran presentes concentraciones equimolares del
donador de protones y del aceptor. En el punto medio de cualquier valoración se alcanza un
punto de inflexión en el que el pH es igual al pKa. A medida que la valoración avanza se
alcanza un punto de inflexión en el que la eliminación del primero protón es prácticamente
completa y se ha iniciado la eliminación del segundo protón, un AA se encuentra en forma
de ión dipolar. La segunda etapa de la valoración corresponde a la eliminación de un protón
del grupo -NH3+
A partir de la curva de valoración de un AA se puede deducir la siguiente información:

 Da una medida cuantitativa del pKa de cada uno de los grupos ionizables, lo cual permite
identificar al AA.
 Determinar las regiones con capacidad tampón, la porción relativamente plana de la
curva que abarca alrededor de una unidad de pH a cada lado del pKa.
 Se puede utilizar la ecuación de Henderson-Hasselbalch para calcular las proporciones
de especies donadora y aceptora de protones que se requieren para preparar un tampón
a un pH determinado.
 La relación entre la carga eléctrica y el pH, el punto de inflexión entre las dos etapas de la
valoración indica la forma dipolar totalmente ionizada del AA pero con carga eléctrica neta
de cero, lo que se denomina punto isoeléctrico pI.
Estandarización del potenciómetro
Titulación del aminoácido
1. Pipetear 10.0 ml del AA 0.1M en un vaso de 100 ml, agregar 30ml de agua destilada.
2. Colocar el vaso en el agitador magnético y poner en agitación la solución.
3. Introducir el electrodo con cuidado para no golpearlo con la barra magnética.
37
4. Registrar el pH inicial y ajustar el pH a 1.5.
5. Comenzar la titulación agregando 1.0 ml de NaOH 0.1N, permitir que se mezcle por
unos segundos y medir el pH.
6. Continuar la adición de incrementos de 1.0ml de NaOH, registrando el pH y el volumen
añadido.
7. Cuando el pH comience a cambiar rápidamente, agregar incrementos de 0.5ml de
NaOH.
8. Continuar la titulación hasta pH 11.5

Tabla que contenga: valor de pH y los correspondientes ml y meq de NaOH agregados.
8. Instrucciones de cálculos y resultados

Reportar los cálculos para la preparación de soluciones.
Gráfica de los datos: NaOH 0.1N (ml) vs pH.
Señalar en la gráfica: zona de capacidad tampón, pKa, pI.
Comparar con los valores correspondientes del AA ensayado.
Reportar la curva de la glicina y la del AA titulado.
9. Cuestionario
1. Escribe la disociación del aminoácido ensayado.
2. Explica que es un Zwiterión
3. Calcula el pI de los aminoácidos ensayados en esta práctica.
4. Explica por qué los aminoácidos pueden actuar como amortiguadores de pH.
5. De acuerdo al valor del pKa explica el papel de un aminoácido en un sistema biológico.
10. Bibliografía
Hein, Morris; Peisen, Judith; Ritchet, James. Introduction to General Organic and
Biochemistry in the Laboratory. Eight Edition, John Wiley & Sons.U.S.A.2005
38
39

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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE GUADALAJARA

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO

MC Araceli Escobedo Magallón Dra. Rosa María Muñoz Sauceda

Dr. Juan Villafaña Rojas ME María Eugenia Altamirano Loaeza

1. Identificación de propiedades de carbohidratos ……………………………… 1

2. Hidrólisis de disacáridos y polisacáridos ………………………………………. 7

3. Separación de carbohidratos por cromatografía de capa delgada ………… 12

4. Identificación de propiedades de lípidos ……………………………………… 15

5. Determinación de índice de acidez …………………………………………… 22

6. Identificación de propiedades de aminoácidos y proteínas ………………… 25

7. Separación de aminoácidos por cromatografía de capa delgada …………. 33

8. Titulación de aminoácidos ……………………………………………………… 36

“Identificación de propiedades de carbohidratos”

3. Materiales equipos y reactivos

Reactivo de Benedict: disolver 86.5g de citrato de sodio y 50 g de carbonato desodio anhidro

Reactivo de Bial: Disolver 1.5 g de orcinol (5-metil-resorcinol) en 500 ml de HCl conc. y

Reactivo de Molisch: disolver 2.5 g de α-naftol en 50 ml en 50 ml de etanol al 95 %.

Reactivo de Seliwanoff: disolver 0.5 g de resorcinol en 1000 ml de HCl 4M (333 ml de HCl

4. Seguridad y manejo de reactivos y residuos

Colocar los residuos de la prueba de Molisch y de Bial en el recipiente etiquetado como

5. Introducción o fundamento teórico

FUNDAMENTO DE LAS PRUEBAS

Esta es una prueba general para carbohidratos, se basa en la formación de furfural o

Esta prueba distingue la fructosa, una cetohexosa, de las aldohexosas y disacáridos. La

En la prueba de Benedict el Cu+2 se reduce al Cu+, formando un precipitado rojo ladrillo de

1. En un tubo mezclar 1 ml de la solución de carbohidrato y 4ml del reactivo de Seliwanoff.

1. Mezclar en un tubo, 2 ml de la solución de carbohidrato y 3 ml del reactivo de Bial.

1. En un tubo mezclar 1 ml de la solución de carbohidrato y 5 ml del reactivo de Bendict.

1. Mezclar en un tubo, 1 ml de la solución de carbohidrato y 5 ml del reactivo de Barfoed.

8. Instrucciones de cálculos y resultados

En los anexos de este manual se describe las características del reporte.

1. ¿Cual es la base química de la positividad de la prueba de Molish?

2. Describe el principio de la prueba de formación de osazonas, ¿Cómo se observa una

3. Explica y escribe la reacción de la prueba de Benedict.

4. ¿Qué son los azúcares reductores?

5. ¿La sacarosa es un azúcar reductor? ¿por qué?

6. Escribe la estructura de dos carbohidratos que den positiva la prueba de Bial.

2. Shankara,Shivalaja. Laboratory Manual for Practical Biochemistry. Jaypee Brothers

3. Sawhney, Singh. Introductory Practical Biochemistry. Alpha Science. India. 2006.

“Hidrólisis de disacáridos y polisacáridos”

Aplicar las pruebas para azúcares reductores como indicadoras de la hidrólisis de

Investigar la estructura del almidón y el comportamiento de éste y otros polisacáridos con el

3. Materiales equipos y reactivos

Pinzas para tubo

10 tubos de ensayo con tapón de rosca

H2 SO4 concentrado, HCl concentrado

Sol. de Iodo al 1% en ioduro de potasio al 2% (I2-KI)

Sol. de NaOH al 10%

Jugos de frutas (naranja, limón, lima, manzana, uva...)

4. Seguridad y manejo de reactivos y residuos

Disponer los residuos de hidrolizados en el recipiente etiquetado como ácidos no oxidantes.

5. Introducción o fundamento teórico

Los polisacáridos son polímeros de unidades de monosacáridos unidos por enlace

La prueba de Benedict y la prueba de Barfoed son pruebas de reducción. Ciertos

Las dextrinas producen color rojo.

El glucógeno produce un color café.

1. Colocar en un tubo con tapón de rosca 10 ml de solución de sacarosa y en otro tubo 10

2. Añadir 5 gotas de HCl concentrado a cada tubo.