Replicación Del DNA

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REPLICACIÓN DEL DNA

CONCEPTOS:

 Mecanismo y componentes moleculares por


el cual el DNA genómico se replica
 Comparación entre procariontes y
eucariontes
 DNA polimerasas estructura y actividad
 Componentes moleculares que determinan
el inicio, elongación término de la
replicación del DNA

REBECA ALDUNATE
La replicación del DNA es semiconservativa
1958 Meselson y Stahl

REBECA ALDUNATE
Cada hebra de la doble hélice del DNA actúa
como templado para su replicación

Figure obtain from Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Horquilla de replicación:

1. Ambas hebras de DNA se replican


simultáneamente en paralelo

2. La hebras son separadas por proteínas


específicas para transformarlas cada
una en templado para la síntesis de
una nueva hebra de DNA
Modelo de Replicación del DNA incorrecto

Ambas Hebras hijas


crecen continuamente y
simétricamente

Una hebra crece 5´--- 3´


y la otra 3´--- 5´

Figure obtain from Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Modelo de Replicación del DNA CORRECTO

 Ambas hebras de DNA son sintetizadas 5´--- 3´ simultáneamente y


bidireccional formado la Horquilla de replicación
 La Horquilla de replicación es asimétrica: Hebra líder es de polimerización
continua y una Hebra rezagada de polimerización discontinua fragmentos de
Okazaki
 fragmentos de Okazaki fragmentos pequeños de RNA/DNA 100 -400 nucleótidos
de largo en eucariontes y mas largos de 1000-2000 en bacterias

Figure obtain from Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
La DNA polimerasa solo puede
agregar nucleótidos
en el extremo 3´ de la nueva
hebra polimerizada

Crece en dirección 5´a 3´


La hebra que se copia es de 3´a 5´

Figure obtain from Molecular Biology of the Cell (©


Garland Science 2008)
Solo la replicación 5´---3´

?
Posibilita la
eficiente
corrección
de errores

Figure obtain from Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Horquilla de replicación
PROCARIONTES

Hebra nueva

Hebra parental

Figure obtain from Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

 En Procariontes hay 2 horquillas de replicación que se mueven en direcciones opuestas en un


cromosoma circular.
 La zona activa de replicación del DNA se mueve progresivamente a lo largo de una molécula de DNA
en replicación, creando una estructura de DNA en forma de Y conocida como horquilla de replicación.
Replicación de plasmidios en el sitio de origen ORI Hebra parental en azul hebra hija en rojo

Una vez que comienza la replicación esta se mantiene en ambas direcciones en dos horquillas
de replicación hasta se generan las dos moléculas.

 En E. coli la replicación de un cromosoma circular toma 42 min que contiene 4,639,221 base pairs y 1.4 mm de largo
(1000 base pairs per second per fork).
 En humanos se ha estimado que la horquilla de replicación crece 100 pares de bases por seg
 El genoma completo 3 × 109 pares de bases se replicará en 8 horas teóricamente se ha estimado que el genoma
humano contiene 10,000 100,000 replicons por lo que se podría demorar menos de 8 hr
Fragmentos de Okazaki (1968)
 Sequencia corta de DNA con un primer de
RNA en el extremo 5´
 Solo se crea en la hebra de retardo

 Cada fragmento de Okazaki se inicia cerca de la


horquilla de replicación en un cebador de ARN
primasa y extendido por la
creado por la
DNA polimerasa
 Posteriormente, el cebador es eliminado por
enzimas que tienen actividad endonucleolítica
como Ribonucleasa H (RNAsa H),

 Las bases de RNA cortadas se reemplazan con


DNA por DNA polimerasa.

 En procariontes solo participa una DNA


polimerasa

 Luego, los fragmentos se unen mediante DNA


ligasa, utilizando enlaces fosfodiéster, para
crear una hebra continua de DNA.
Acción de la DNA ligasa

 La ADN ligasa cataliza la unión de una hebra de ADN con un grupo 3-hidroxilo libre a otra
con un grupo 5-fosfato libre.

 En eucariotas y arqueas, el ATP se escinde en AMP y PPi para impulsar esta reacción.

 En las bacterias, NAD + se escinde en AMP y mononucleótido de nicotinamida (NMN).


La Replicación del DNA puede ser descrita en tres fases

1. Iniciación

2. Elongación

3. Término
DNA pequeños y circulares tienen un solo sitio de
origen de replicación

Cromosomas de mayor tamaño pueden tener mas


de uno
Iniciación
DNA Helicasas: las DNA helicasas se unen a las cadenas de DNA y, a través de los
cambios conformacionales causados ​por la hidrólisis del ATP, rompen los enlaces de
hidrógeno entre las bases del ADN de doble cadena.

El cuerpo humano tiene más de 200 tipos de helicasas involucradas en la replicación,


transcripción, reparación y otros procesos genéticos. Las helicasas defectuosas se han
relacionado con un mayor riesgo de cáncer y un envejecimiento prematuro.

Esta estructura cristalizada muestra seis proteínas


helicasa individuales ensambladas en un motor en
forma de anillo que desenrolla la hélice de ADN.

El motor pasa una hebra a través de su orificio central


y se abre paso a través de los pares de bases de la
doble hebra de ADN.

Las bolas rojas representan dTTP, la molécula de


combustible del motor, y el rizo rosado muestra el
área donde el motor se agarra al DNA
Figure 5-15 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
La síntesis de DNA es catalizada
por la DNA polimerasa
La DNA polimerasa requiere de
primer RNA o DNA en el extremo 3´-
OH

El nucleótido que se incorpora aporta


el fosfato 5‘
Sólo el a-fosfato se incorpora
en la nueva hebra

Ninguna DNA polimerasa puede


inicial la síntesis de novo
E. coli DNA Polymerase I
La DNA polimerasa I de E. coli fue la primera ADN polimerasa caracterizada. Hay
aproximadamente 400 moléculas de la enzima por célula. La enzima es una
única proteína grande con un peso molecular de aproximadamente 103 kDa

La enzima requiere un catión divalente (Mg ++) para su actividad y tiene tres
actividades enzimáticas asociadas:

1. 5'-to-3' DNA actividad de Polimerasa


2. 3'-to-5' exonucleasa (Proofreading activity)

Como todas las DNA polimerasas conocidas, la DNA polimerasa I requiere un


cebador a partir del cual iniciar la replicación y polimeriza
desoxirribonucleótidos en DNA en la dirección 5 'a 3' utilizando la hebra
complementaria como plantilla.
Una vez que la horquilla de replicación se establece
El primer de RNA se sintetiza por la DNA primasa

En eucariontes estos primer de la hebra de retardo , son de 10 nucleotidos y son


hechas en intervalos de 100 200 nucleótidos

Síntesis de cebadores de RNA.


La reacción es catalizada por DNA primasa, la
enzima que sintetiza los cebadores cortos de RNA
hechos en la hebra rezagada utilizando DNA
como plantilla.

A diferencia de la DNA polimerasa, esta enzima


puede iniciar una nueva cadena de
polinucleótidos uniendo dos nucleósidos
trifosfatos.

La primasa sintetiza un polinucleótido corto en la


dirección 5 'a 3' y luego se detiene, haciendo que
el extremo 3 'de este cebador esté disponible
para la DNA polimerasa.
DNA Polimerasas
Las enzimas que replican el DNA utilizando una plantilla de DNA se denominan DNA
polimerasas.

Sin embargo, también hay enzimas que sintetizan DNA usando una plantilla de RNA
(transcriptasas inversas) e incluso enzimas que producen DNA sin usar una plantilla
(transferasas terminales).
La mayoría de los organismos tienen más de un tipo de DNA polimerasa pero todas operan
con las mismas características:

 La polimerización ocurre solo de 5 'a 3'

 La polimerización requiere una plantilla para copiar: la hebra complementaria.

 La polimerización requiere 4 dNTP: dATP, dGTP, dCTP, dTTP

 La polimerización requiere de un cebador de RNA o DNA


DNA Polimerasas
Other
Enzyme Template Primer Other features
activities

3'-5' exo,
E. coli DNA pol I DNA DNA/RNA monomeric
5'-3' exo

E. coli DNA pol I


DNA DNA/RNA 3'-5' exo C-terminal fragment
(Klenow fragment)

3'-5' exo (on a


E. coli DNA pol III DNA DNA/RNA multimeric structure
separate subunit)

extendase (adds thermostable, used in


Taq pol DNA DNA/RNA
3'-A overhangs) PCR

reverse
DNA/RNA DNA/RNA (ribonuclease H) used to make cDNA
transcriptase

terminal none will synthesize DNA in


DNA
transferase required non-templated reaction
Prokaryotic DNA polymerases Bacteria have 5 known DNA polymerases:

•Pol I: implicated in DNA repair; has both 5'->3'(Nick translation) and 3'->5'
(Proofreading) exonuclease activity.
•Pol II: involved in replication of damaged DNA; has both 5'->3'chain extension ability
and 3'->5' exonuclease activity.

•Pol IV: a Y-family DNA polymerase.


•Pol V: a Y-family DNA polymerase; participates in bypassing DNA damage

Eukaryotic DNA polymerases Eukaryotes have at least 15 DNA Polymerases:

•Pol α: acts as a primase (synthesizing a RNA primer), and then as a DNA Pol
elongating that primer with DNA nucleotides. After around 20 nucleotides elongation
is taken over by Pol δ and ε.
•Pol β: is implicated in repairing DNA.
•Pol γ: replicates mitochondrial DNA.
•Pol δ: is the main polymerase in eukaryotes, it is highly processive and has 3'->5'
exonuclease activity.
•Pol ε: may substitute for Pol δ in lagging strand synthesis, however the exact role is
uncertain.
La estructura
tridimensional de las DNA
polimerasas se asemeja a
una mano derecha.

En la parte de abajo, los


dedos y el pulgar están
formados por a hélices,
mientras que la palma está
tapada por el DNA (gris).

El nucleosido entrante
tiene color rojo y el
trifosfato es amarillo
Figure obtain from Molecular Biology of the Cell (©
Garland Science 2008)
Impedimento estérico para la incorporación
de ribonucleotidos por la DNA polimerasa
La adición de un nuevo nucleótido por la DNA polimerasa
requiere un correcto apareamiento de bases
Dos iones metálicos (verde en a y en b) unidos a la DNA polimerasa catalizan la adición de
un nuevo nucleótido. Uno de ellos interactúa con el 3’OH y el otro con el trifosfato
DOS funciones de la DNA POLIMERASA
DETERMINAAS POR SU ESTRUCTURA

Figure 5-9 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)


Table 5-1 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Figure 5-19a Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Inicio de la replicación
El cromosoma de la bacteria tiene un solo punto de inicio
para su replicación

El genoma de E. coli contiene un cromosoma


circular
(DNA molecule of 4.6 × 106 nucleotide pairs)

La replicación del DNA comienza en un punto y


es el único punto que puede controlar

Las horquillas leen a 500 -1000 nucleotidos por


segundos y en dirección opuesta a una velocidad
constante y no se detienen hasta el sitio de
término

Se inicia el proceso con el reconocimiento de


proteínas a sitios específicos
La iniciación de la síntesis del DNA en E. coli ocurre en el sitio oriC –
locus
(origin of chromosomal replication)

Región de 245 bp del cromosoma con 3 sets de secuencias conservadas


AT y 4 sitios de unión a DnaA-ATP
 Proteínas que participan
en la iniciación de la
replicación en bacterias

 Este mecanismo ha sido


demostrado in vitro

 dnaA principal proteína


que se une al DNA

 dnaB (DNA helicase)

 dnaG (DNA primase)

 En solución la helicasea
se une a un inhibidor
(dnaC protein),
 Que se activa con el
loop de DNA
Replicación Eucariontes en diferentes regiones
del mismo cromosoma

Tiene lugar solo en la fase S (DNA síntesis )


del ciclo celular
ORC = Origins of Replication Complex

Origen de replicación en levaduras

Involucra 150 bp se le unen complejos multiproteicos.


Sitios (B1, B2, and B3) también serian importantes dependiendo de tipo de
organismo
Elementos Funcionales (100bp) ARS Functional (11bp core) que se une a
un complejo de proteínas ( origin replication complex, or ORC).

El complejo ORC recluta a otras proteínas incluida la helicasa

11-base-pair ARS consensus sequence (ACS),


ORC permanece unido
Como asegurarse que la replicación se realice solo en la fase S ?
durante todo el ciclo celular

• En G1 se asocia con Cdc6 y


Mcm que forma un anillo
que se une al DNA
formando el complejo pre-
replicativo

• S- Cdc6 se fosforila y
degrada liberando a ORC
activando la formación de
la horquilla de replicación
Elongación
Elongación y Síntesis del DNA
•Progresividad de la DNA polimerasa depende de la existencia de un factor adicional una pinza
tipo anillo que permite que el DNA sintetizado permanezca unido y la DNA pol no se separe

SLING CLAMP
O PINZA
ABRAZADERA
SLIDING CLAMP

Figure 5-18c Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)


Clamp loader
PCNA de eucariotas

 El canal interior del anillo está cargado positivamente y revestido con hélices alfa que
no hacen ningún contacto específico con el DNA, lo que permite que la abrazadera
deslizante se deslice libremente sobre el dúplex detrás de la polimerasa.

 La vida media del complejo PCNA-ADN es de 23 minutos y el PCNA se puede reutilizar


para múltiples rondas de síntesis de ADN.
Terminación
Terminación en procariontes
Cromosoma circular

El cromosoma de E. coli tiene siete términos de replicación


Estructura del complejo Tus-Ter.
“Terminator utilization substance”
En rojo esta destacado la superficie de contacto del
complejo con la helicasa B en amarilla bloqueando
su actividad
 El término de replicación en E. coli es una región
grande (350 kb) de DNA, flanqueada por 10 sitios
terminadores de 23 pb casi idénticos.

 Los de un lado (terA, terD, terE, terI y terH) están


orientados en una dirección; los del otro (terB,
terC, terF, terG y terJ) están orientados en la otra
dirección.

 Funcionan junto con una proteína, Tus - sustancia


de utilización del terminador - una proteína de 36
KDa que, dependiendo de la orientación, permite
que un replisoma pase en una dirección pero no
en la otra.

 Tus interactúa con DnaB y bloquea su actividad


helicasa. Tus es una contrahelicasa.
EUCARIONTES

Los cromosomas terminan en secuencias


ricas en G incorporadas en los telómeros

Las secuencias del telómero son


conservadas.

En humanos la secuencia es GGGTTA y se


extiende por 10000 nucleótidos
Telomeros son estructura únicas que determinan el
extremo terminal de un cromosoma lineal

Una de las hebras de DNA rica en G en su extremo 3´es mas larga que la otra
hebra (G-rich sequence is AGGGTT).

La estructura adoptada por los telómeros es de un loop que seria estabilizada por
proteínas específicas que se unen al telomero lo que da una estructura al extremo
del cromosoma
Replicación en el telómero.
Síntesis de la secuencia repetitiva de G. El extremo 3´del DNA parental es extendido por la
ENZIMA Telomerasa a partir de un templado de RNA
DNA Supercoiling y las enzimas que
controlan el supercoiling las

Topoisomerasas
Avance del frente de replicación
El problema topológico
Alivio del sobreenrollamiento al frente del
avance de la replicación.

Diapo modificada A .Venegas


Esta enzima forma
un enlace covalente
transiente con el
DNA

Las DNA topoisomerasa tipo I en eucariontes catalizan una reacción reversible


DNA Topoisomerases Previene el sobreenrollamiento del DNA durante su replicación

Topoisomerasa I
 La enzima corta una de las dos
hélice
 Luego la molécula de DNA gira en el
interior de la cavidad enzimática
 A DNA topoisomerasa puede ser
vista como una endonucleasa
reversible que se une
covalentemente al DNA
DNA topoisomerasa II
 A diferencia de la Topoisomerasa
tipo I utiliza ATP y se une
covalentemente en ambas hebras
de DNA

 Topoisomerases Tipo II se
encuentran preferentemente en
células que proliferan por lo que
ha sido blanco de drogas
anticancer
REPLICACIÓN DEL DNA

CONCEPTOS:

 Mecanismo por el cual el DNA genómico se


replica Horquilla de replicación
 DNA polimerasas estructura y actividad
 Componentes moleculares que determinan
el inicio, elongación y término
 Papel de Topoisomerasas

REBECA ALDUNATE

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