UNIVERSIDAD DEL VALLE DE MÉXICO

“In vitro and in silico anti-dengue activity of compounds obtained from Psidium
guajava through bioprospecting”
“Actividad anti-dengue in vitro e in silico de compuestos obtenidos de Psidium guajava
mediante bioprospección”
Alumna: Cabrera Sánchez Areli,
Fecha de entrega: 14 de octubre del 2020
Asignatura: Química Farmacéutica
Docente: Tapia Martínez Jorge Alberto.

Espécimen biológico obtenidos de Psidium guajava se

encontraban sujetos al contrato de acceso
En este articulo utilizaron 12 plantas a recursos genéticos y productos
diferentes, siendo la principal para el derivados No. 130 de 2016 suscrito con el
enfoque de este artículo Psidium guajava Ministerio de Ambiente y Desarrollo
Sostenible de la República de Colombia.
Las otras 11 plantas utilizadas fueron:
Ambrosia cumanensis, Cavanilesia Caracterización de los extractos
platanifolia, Chenopodium ambrosioides,
Chrysobalanus icaco, Croton malambo, Se recolectaron 1000g de material
Cymbopogon citratus, Diospyros vegetal, se secó a temperatura ambiente,
inconstans, Mammea americana, se pesó, se molió y se maceró con etanol
Momordica charantia, Sarcostemma al 95% durante 72 horas. Posteriormente
clausum y Trichilia hirta. cada muestra se filtró y se concentró en
un evaporador rotatorio. Cada extracto
Proceso de selección de la planta seco se suspendió en una mezcla de
etanol-agua destilada y se sometió a un
El material vegetal fue seleccionado a reparto liquido-liquido con disolventes de
partir de datos obtenidos de una encuesta polaridad creciente en el orden siguiente:
etnobotánica realizada en la ciudad de diclorometano, acetato de etilo y butanol.
Cartagena, Colombia en 2009 y de una
búsqueda en literatura sobre extractos de Para la selección fitoquímica preliminar
plantas con actividad antiviral reportada de cada extracto, se realizaron pruebas de
contra virus que causan enfermedades identificación para diferentes metabolitos
febriles. de acuerdo con el siguiente método
descrito.
La recolección se realizó entre 2009 y Se realizó la preparación de los siguientes
2016 en la ciudad de Cartagena con el extractos:
permiso de CARDIQUE (Corporación  Extracto acuoso crudo no desgrasado
Autónoma Regional del Canal del Dique). (E1)
Además los compuestos derivados

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 Extracto acuoso crudo desgrasado

(E2) Para los ensayos de actividad biológica se
 Extracto de hidro-metanol (HM) utilizaron células epiteliales VERO
 Extracto de acetato de etilo (EA) (Cercopithecus aethiops) de la ATCC y
 Extracto de n-butanol (n-B) células C6/36HT de larvas de Aedes
albopictus mosquito donadas por el
Para el perfil fitoquímico los extractos departamento de virología del Instituto
acuosos E1 y E2, además de los extractos Pedro Kouri.
HM, EA y n-B fueron sometidos a un
cribado fitoquímico para detectar la 1. Determinación del índice de
presencia o ausencia de alcaloides con los selectividad (SI)
reactivos de Dragendorff y Mayer, azúcar
reductor con reactivo de Fehling, El IS se calculó a partir de la relación
flavonoides por la reacción de cianidina, entre la concentración citotóxica 50%
taninos con cloruro de hierro y (CC50) y la concentración efectiva 50
terpenoides por la reacción de (CE50). La CC50 se determinó mediante el
Liebermann Burchard. método de 3- (4,5-dimetil-2-tiazolil) -2,5-
difenil-2H-tetrazolio bromuro) (MTT,
Para la determinación del contenido total Sigma-Aldrich). Para ello, se sembraron
de polifenoles se llevó a cabo el método 2,5 x 104 células VERO en placas de 96
de Folin-Coicalteu mezclando alícuotas pocillos durante 24 h. Posteriormente, se
de 0.1mL que contenían 1.0/mg/mL de realizaron diluciones seriadas de los
cada extracto con 2.0mL de una solución extractos etanólicos (7.8μg / mL a 1000μg
de carbonato de sodio 20g/L y 0.1mL del / mL), fracciones (6.25 a 400μg / mL) y
reactivo de Folin-Ciocalteu 0.2 N, compuestos caracterizados (6.25 a
pasados 30 minutos de incubación a 400μg / mL) y se incubaron con las celdas
temperatura ambiente, se midió la durante 48h. Después del período de
absorbancia a 750nm. incubación, se añadió una solución de
MTT (0,5 mg / ml) a los cultivos, que
El contenido total de flavonoides se luego se incubaron durante 3 h
realizó mediante un procedimiento adicionales a 37 ° C. Finalmente, se
colorimétrico utilizando tricloruro de añadió dimetilsulfóxido y se leyó la
aluminio (AlCl3) e hidróxido de sodio absorbancia a 450nm. El CC50 se calculó
(NaOH). Se mezclaron alícuotas de como la concentración de extracto que
0.5mL que contenían 1.0mg/mL de cada redujo las células viabilidad en un 50%
extracto con 2.0mL de agua destilada, utilizando análisis de regresión.
0.15mL de una solución de 100g/L de
AlCl3·6H2O. Pasados 6 minutos de Para calcular la CE50, se sembraron 2,5 x
incubación a temperatura ambiente se 104 células VERO en placas de 96
añadieron 2.0mL de NaOH, se aforó a pocillos durante 24 h. A las 24 h, se
5.0mL con agua destilada, se incubó por mezclaron diluciones seriadas de cada
15 más y se midió la absorbancia a extracto etanólico (7.8μg / mL a 1000μg /
510nm. mL), fracción (6.25 a 400μg / mL) y
compuesto caracterizado (6.25 a 400μg /
Actividad biológica del metabolito mL) con el DENV- 2 / cepa NG (a una
obtenido multiplicidad de infección (MOI = 1) y se
añadió a las monocapas celulares durante

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2 h. A las 2 h después de la inoculación,

las mezclas se retiraron y las mismas Se sembraron un total de 2.5 × 104
diluciones seriadas de los extractos, células VERO en placas de 24 pocillos
fracciones , o los compuestos se durante 24 h, y luego se agregaron las
agregaron nuevamente y se incubaron fracciones (100μg / mL) o compuestos
durante 24 h Finalmente, los caracterizados (50μg / mL) y se incubaron
sobrenadantes se recolectaron y con las células para 24 h adicionales
almacenaron a -70 ° C hasta realizar el (estrategia previa al tratamiento) [16].
ensayo de enfoque en placa multipocillo. Posteriormente, se retiró el tratamiento y
se añadió un inóculo viral (DENV-2 / NG
2. Ensayo de enfoque en placa de a una MOI = 1) y se incubó durante 2 h.
pocillos múltiples. Posteriormente, se eliminó el virus y se
añadió medio fresco durante 48 h más,
Se sembraron un total de 2,5 x 104 después de lo cual se recogieron los
células / pocillo en placas de 96 pocillos. sobrenadantes y se almacenaron a -70ºC
Las células se inocularon al día siguiente hasta su posterior procesamiento
con diluciones en serie (10−1 a 10−6) de mediante el ensayo de enfoque en placa
los sobrenadantes de los experimentos de de múltiples pocillos. Para cada fracción
EC50 durante 2 h. A continuación, se y compuesto, se realizaron dos
retiró el inóculo y se añadió experimentos independientes cada uno
carboximetilcelulosa al 1,5% preparada con dos repeticiones (n = 4). La heparina
en DMEM suplementado con FCS al 2%, sirvió como control positivo para la
seguido de incubación a 37 ° C en un 5% inhibición viral.
de CO 2 atmósfera.
Al tercer día, las células se fijaron con 4. Determinación de los efectos
una solución de metanol-acetona (1: 1) antivirales de las fracciones y
durante 10 min, se lavaron tres veces con compuestos después de la entrada de
PBS y se permeabilizaron con Triton X- células virales.
100 al 0,1% durante 30 min, después de
lo cual se realizó un bloqueo del sitio Se sembraron un total de 2,5 x 104
inespecífico, con FBS al 10% en PBS. A células VERO en placas de 24 pocillos
continuación, se diluyó el anticuerpo durante 24 h, y luego se añadió un
monoclonal anti-envoltura (mAb) de inóculo viral (DENV-2 / NG a una MOI =
DENV 1: 500 con PBS que contenía FCS 1) y se incubó durante 2 h.
al 10%, seguido de incubación durante 1 Posteriormente, se retiró el inóculo y se
ha 37ºC. Después de lavar con PBS, las agregaron las fracciones (100μg / mL) o
placas se incubaron durante 30 min con los compuestos caracterizados (50μg /
un anticuerpo secundario IgG anti-ratón mL) y se incubaron con las células
conjugado con peroxidasa. Finalmente, durante 48 h adicionales (estrategia
las reacciones se tiñeron con 3-amino-9- postratamiento). A continuación, los
etilcarbazol y se contó el número de focos sobrenadantes se recogieron y
en cada pocillo. almacenaron a -70°C hasta su posterior
procesamiento mediante el ensayo de
3. Determinación de los efectos enfoque en placa de pocillos múltiples.
antivirales de las fracciones y Para cada fracción o compuesto, se
compuestos en la entrada de células realizaron dos experimentos
virales. independientes cada uno con dos

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repeticiones (n = 4). La suramina sirvió Los extractos obtenidos de las plantas

como control positivo para la inhibición empleadas, principalmente de Psidium
viral. guajava se evaluaron para su utilización
como tratamiento antiviral en
5. Ensayo de inhibición viral en células enfermedades como el dengue u otros
VERO virus que causan enfermedades febriles.

Se sembraron un total de 2,5 x 104 El extracto de Psidium guajava reportó

células VERO en placas de 24 pocillos y una CC50 de 1000µg/mL mientras que su
se añadió un inóculo viral a las 24 h, CE50 fue de 7.8µg/mL, por su parte el
seguido de incubación durante 2 h. extracto de D. inconstans presentó la CE50
Posteriormente, se retiró el inóculo y las más alta siendo de 538.6µg/mL.
células se trataron con una única Finalmente por medio de la
concentración no citotóxica de cada una determinación del índice de selectividad
de las cinco fracciones y compuestos se logró clasificar en 4 grupos con
obtenidos de la fracción con mayor respecto a sus valores de SI.
selectividad. A las 48 h, se retiraron los  El primer grupo contenía los extractos
sobrenadantes y se almacenaron a -70°C no selectivos (SI < 2.0): C. citratus SI
hasta su posterior procesamiento = 0.5, S. clausum SI = 1.2, D.
mediante el ensayo de enfoque en placa inconstans SI = 1.4 y C. icaco SI =
de múltiples pocillos. La suramina sirvió 1.7
como control positivo para la inhibición  El segundo grupo comprendía los
viral. extractos de baja selectividad (SI ≥
2.0 y <5): T. hirta SI = 3.4, C.
6. Inmunofluorescencia indirecta malambo SI = 4.1 y A. cumamensis SI
= 4.2
Algunas monocapas de células se lavaron  El tercer grupo abarcaba los extractos
con solución salina tamponada con de selectividad moderada (SI ≥5 y
fosfato pH 7,4 y se fijaron con <10): C. ambrosioides SI = 5.3, C.
paraformaldehído al 3,8% en PBS a 37°C platanifolia SI = 5.8, M. charantia SI
durante 30 min. A continuación, las = 7.9 y M. americana SI = 8.4
células se trataron con NH4Cl 50mM  El cuarto grupo englobaba los
durante 10 min a temperatura ambiente y extractos con alta selectividad (SI ≥
se permeabilizaron con Triton X-100 al 10): P. guajava SI = 128.2
0,3%, después de lo cual se bloquearon
los sitios no específicos con FBS al 5%. REFERENCIAS
Para detectar la proteína E, las monocapas 1. Trujillo-Correa, A. et al. (2019). In
se incubaron secuencialmente con un vitro and in silico anti-dengue activity
mAb primario de envoltura anti-DENV-2 of compounds obtained from Psidium
y un anticuerpo secundario anti-ratón guajava through bioprospecting.
conjugado con Alexa 488. Finalmente, las 19(1):298. doi: 10.1186/s12906-019-
placas se examinaron usando un 2695-1.
microscopio. 2. Benariba, N., Djaziri, R., Bellakhdar,
W., Belkacem, N., Kadiata, M.,
Uso farmacéutico Malaisse, W. J., & Sener, A.
(2013). Phytochemical screening and

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free radical scavenging activity of

Citrullus colocynthis seeds extracts.
Asian Pacific Journal of Tropical
Biomedicine, 3(1), 35–
40. doi:10.1016/s2221-
1691(13)60020-9 

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