UNIVERSIDAD NACIONAL DE PIURA FACULTAD

DE CIENCIAS DE LA SALUD
ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA

ALUMNO:
Cervantes Rodriguez Giorgio Steve

CURSO:
Microbiología y parasitología

DOCENTE:
Dr. Jorge Luis Bermejo Benites
TEMA:
Observación de Micobacterias, Yersinia, Bartonella

FACULTAD:
Ciencias de la Salud
ESCUELA:
Medicina Humana

CICLO:
2022-IV
INDICE:
1. Introducción
2. Objetivos
3. Material y métodos
3.1. Materiales
3.2. Observación de Micobacterias, Yersinia, Bartonella
4. Conclusiones
5. Referencias bibliográficas
1. Introducción
La Yersinia pestis es un microorganismo virulento, gramnegativo, móvil cuando se
le aisla del medio ambiente, pero que se torna inmóvil en los tejidos del huésped.
Tres especies de Yersinia pueden ocasionar enfermedades en el hombre: Yersinia
enterocolítica, Yersinia pseudotuberculosis y Yersinia pestis. Tambien tenemos que
La enfermedad de Carrión o Bartonelosis humana es una enfermedad infecciosa
cuyo agente etiológico es la Bartonella bacilliformis, que es transmitida por la
picadura de mosquitos del género Lutzomyia. Y por último, la tuberculosis es una
enfermedad infecciosa causada por un bacilo denominado Mycobacterium
tuberculosis, que se transmite a través de las gotas de saliva que los enfermos
eliminan al exterior cuando hablan, tosen o escupe. Esta enfermedad ataca
preferentemente a los pulmones, pero puede afectar también a otros órganos del
cuerpo humano.
2. Objetivos
 Observar Micobacterias, Yersinia, Bartonella, mediante coloración con
ayuda del microscopio.
3. Material y métodos
3.1. Materiales
 Materiales para la obtención de muestra.
 Láminas portaobjetos, que no estén rayadas,
 Aplicadores o palitos de madera (bajalenguas).
 Mechero de alcohol.
 Lápiz graso o para marcar vidrio,
 Papel periódico.
 Bandeja de acero inoxidable o fierro enlozado para
 recepción de muestras.
 Fenol al 5%
 Una serie de láminas portaobjetos con extendidos fijados.
 Dos varillas de vidrio unidas por sus extremos, por un tubo de goma.
 Fucsina básica fenicada
 Azul de metileno
 Fenol de cristales
 Ácido clorhídrico
 Alcohol de 95 °C y agua destilada
 Un microscopio binocular, con objetivo de 100x.
 Aceite de inmersión.
 Un soporte de madera para láminas portaobjetos
 Colorante Giemsa (stock).
 Solución de trabajo (colorante diluido).
 Metanol.
 Varillas de vidrio para coloración.
 Bandeja.
  Frascos gotero.
 Papel de filtro.
 Pinza.
 Embudo.
 Reloj.
 Tampón fosfato
3.2. Observación de Micobacterias, Yersinia, Bartonella
OBTENCION DE MUESTRAS
Esputo
a. Indicar al paciente que se ponga de pie
b. Solicitar que haga un movimiento inspiratorio profundo, llenado
de aire los pulmones
c. Indicar al paciente que vacié los pulmones con una sola
espiración, tosiendo tan fuerte y profundamente como pueda.
d. Asegurar que escupa dentro del recipiente rotulado.
e. Tapar el recipiente y llevar en una bolsa al laboratorio.

Sangre

La muestra se obtendrá de pacientes febriles que se encuentran en la fase

septicémica de la enfermedad. A fin de obtener una mayor posibilidad de
aislar el agente etiológico, se obtendrá cuatro muestras seriadas de sangre
en un lapso de 90 minutos para cultivo. La primera muestra de sangre
deberá ser aproximadamente de 10 mL (5 mL para serología y 5 mL para
cultivo); las tres muestras restantes de 5 mL cada una para cultivo. Antes
de proceder a la extracción de la sangre, limpiar con algodón embebido
con alcohol yodado la tapa del frasco de cultivo; descartar el algodón y
colocar nuevamente otro algodón embebido en alcohol de 70°, el que
permanecerá hasta la obtención de la sangre. Localizar la vena y
desinfectar la piel por dos veces con alcohol yodado y una tercera vez,
con alcohol de 70°, realizando movimientos centrípetos y descartando
cada vez el algodón. Extraiga 10 mL de sangre en caso de adultos y 5 mL
en caso de niños. Retire el algodón del frasco de cultivo e inocule a
través del tapón de jebe 5 mI de sangre en caso de adultos y 2.5 mI en
niños.

Aspirado de Bubón
 Desinfecte dos veces la piel del bubón con alcohol yodado,
descartando el algodón cada vez, y una tercera vez con alcohol de 70°.
Antes de la punción debe haberse evaporado.

 Aspire con la aguja N° 20 y una jeringa de 10 cc., 0.5 mL de solución

salina estéril.

 Sosteniendo la jeringa entre el índice y el pulgar de la mano derecha

introduzca la aguja en el bubón.

 Con la mano izquierda, tire lentamente del émbolo de la jeringa.

Deberá entrar en ésta, un líquido que puede ser sanguinolento.

 En el caso de que no entre líquido alguno en la jeringa, inyecte la

solución salina en el bubón, empuje suavemente el émbolo con el pulgar.
Imprímase a la aguja introducida en el bubón un movimiento circular; a
continuación, tire lentamente del émbolo, para así obtener el líquido
seroso.

 Retire la jeringa y limpie con alcohol de 70° el sitio de la punción.

 Sostenga la jeringa en posición vertical, con la aguja hacia abajo e

inocule parte del aspirado del bubón en el medio de transporte CaryBlair.

 El resto del aspirado se usará para el frotis, para la prueba de

Inmunofluorescencia.

OBSERVACION DE MICOBACTERIAS

La baciloscopia un examen básico para el diagnóstico de la tuberculosis,

útil para el control de la evolución del tratamiento administrado al
paciente, por lo que su conocimiento debe alcanzar a los servicios de
salud del país de todos los niveles.

PREPARACION DEL EXTENDIDO Y FIJACION

PROCEDIMIENTO:

Organización de la mesa de trabajo:

Colocar sobre la mesa de trabajo una hoja doble de papel periódico o la

bandeja de fierro con papel periódico, humedecido con fenol al 5%.
Colocar los envases conteniendo las muestras de esputo previamente
rotuladas sobre la mesa de trabajo. Colocar las láminas portaobjetos
sobre el soporte de madera.

Identificación de muestras y laminas:

Numerar los envases y las láminas portaobjetos con el lápiz graso en

forma correlativa. Trazar una línea en el tercio inferior de cada lámina
portaobjetos en la cara opuesta del extendido empleando el lápiz graso, la
que dividirá la superficie de la lámina en una tercera parte destinada a la
numeración y dos terceras partes para hacer el extendido.

Realización del extendido:

Destapar cuidadosamente el envase de la muestra, manteniendo la boca

del envase cerca del mechero encendido.

Dividir el aplicador de madera (bajalengua) en dos o tres partes y

agarrarlo entre el pulgar y el índice de la mano, para luego seleccionar y
extraer la porción muco-purulenta de color amarillo verdoso del esputo,
enrollándola en el aplicador.

Colocar la porción elegida sobre el portaobjetos y extenderla, haciendo

movimientos en vaivén, hasta lograr que el extendido sea uniforme (ni
muy fino ni muy grueso), que no llegue a los bordes de la lámina, para
evitar que el laboratorista se contamine al manipularla.

Pasar por la llama del mechero los bordes de la lámina extendida, colocar
sobre el soporte de madera y dejar secar a temperatura ambiente.

Terminado el extendido, descartar los aplicadores en el recipiente de

incineración y cerrar el envase que contiene la muestra.

Fijación del extendido:

Fijar cada lámina, una vez seca, mediante dos o tres pasajes rápidos sobre
la llama del mechero con el extendido hacia arriba.

Coloración de Zihel Neelsen

La técnica más recomendada es la tinción de Zihel Neelsen. Antes de su
uso todos los colorantes y soluciones a emplearse deben ser previamente
filtrados.

METODO:

PRIMER PASO:

Coloración de bacilos:

Colocar sobre los bordes del lavadero las 2 varillas de vidrio unidas por
sus extremos, por un tubo de goma.

Colocar sobre este soporte de varilla, la serie de láminas fijadas con el

extendido hacia arriba, el número hacia el lado del laboratorista.

Cubrir la totalidad de la superficie del extendido con la colorante fucsina

básica fenicada. No olvidar filtrar el colorante antes de efectuar la
tinción.

Calentar suavemente con la llama del mechero de alcohol, por debajo de

cada lámina portaobjetos, hasta la emisión de vapores, repetir el proceso
tres veces.

No debe hervir la preparación. Si el volumen del colorante disminuye por

evaporación, agregar más colorante hasta cubrir el extendido y dejar
enfriar. El tiempo mínimo de coloración con fucsina es de 5 minutos.
Eliminar la fucsina tomando la lámina por el extremo numerado, entre el
dedo pulgar y el índice o con una pinza, inclinándola hacia delante y
dejando caer agua corriente a baja presión sobre la parte que no tiene el
extendido.

SEGUNDO PASO: Decoloración

Cubrir la totalidad de la superficie del extendido con la solución de

alcohol ácido, durante 2 minutos, hasta obtener una coloración rosa
pálido. De ser necesario, decolorar nuevamente y dejar reposar I minuto.
Eliminar el alcohol ácido, lavar nuevamente la lámina con agua corriente
a baja presión, cuidando de no desprender la película que formó el
extendido.

TERCER PASO: Coloración de fondo:

Cubrir la superficie del extendido con el colorante azul de metileno,

durante 30 segundos a 1 minuto.

Eliminar el azul de metileno y lavar cada lámina con agua a baja presión,
por ambas caras de la lámina portaobjetos.

Colocar las láminas coloreadas en orden numérico sobre el soporte de

madera y dejar secar al medio ambiente. Verificar la numeración de la
lámina antes de su observación al microscopio.

OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE LA MUESTRA

COLOREADA

La observación microscópica tiene por objetivo:

 Determinar si en el extendido hay bacilos alcohol ácido resistentes

(BAAR).

 Establecer el número de estos BAAR.

 Se usa un microscopio con objetivo de 100x de aumento. Antes de

usarlo, se debe colocar una gota de aceite de inmersión sobre el
extendido.

En la observación microscópica los BAAR presentan las siguientes

características:

 Son de color rojo fuerte: destacan sobre un fondo azul.

 Tienen forma recta o como bastoncitos delgados, ligeramente curvos.

 Son muy pequeños (l - 4 pm).

 Son frecuentemente granulosos. Se disponen en grupos de 3 - 10

bacilos que asemejan trozos de hilo o parecen formas de letras torcidas
(con frecuencia se encuentran cerca de los hilos de fibrina).
 En la observación microscópica los BAAR se pueden confundir con:
Levaduras, que se tiñen más o menos de rojo. Al calentarlas se rompen y
forman grupos de gránulos voluminosos de color rojo. Manchas de
colorante, cuando el portaobjetos no se ha decolorado adecuadamente.

 No olvidar que otro bacilo patógeno resistente a los ácidos es el bacilo

de la lepra.

Yersinia (coloración Gram) Cultivo bacteriano

Yersinia es un cocobacilo gramnegativo con bordes redondeados,

aerobios y anaerobios facultativos, de amplia distribución mundial cuyo
reservorio natural se encuentra en una gran variedad de animales. La
transmisión a los humanos se realiza principalmente a través de la vía
fecal-oral, aunque también se han descrito casos de transmisión a través
de transfusiones sanguíneas.

Cultivo:

- Flamear el asa de siembra en el mechero, dejar enfriar.

- Colocar una gota de suero fisiológico estéril sobre una lámina

portaobjetos.

- Coger con el asa de siembra 1 ó 2 colonias de la placa de Agar sangre y

colocarla sobre la gota de suero fisiológico.

- Homogenizar y extender la gota formando una capa bastante delgada;

dejar secar a temperatura ambiente.

Coloración de las láminas

- Cada prueba debe correrse paralelamente con controles preparados de

una muestra que se conoce que es positiva y una muestra negativa.

- Calentar la lámina en el mechero para fijar las muestras, dejar enfriar y

con el lápiz de cera, hacer un círculo en cada muestra.

- Agregar 25 uL del conjugado para cubrir cada muestra e incubar a

temperatura ambiente (23-29°C) durante 30 minutos en cámara húmeda.
Inoculación de muestra de esputo en Medio de Transporte Cary-Blair

- Lavar las muestras con buffer fosfato salino (PBS) por dos veces,
sumergiéndolas durante 10 minutos cada vez en las jarras de coloración.
Dejar secar las muestras a temperatura ambiente.

La lámina puede observarse, directamente, en el microscopio de

fluorescencia, agregando una gota de aceite de inmersión dentro del
círculo que contiene la muestra.

Alternativamente, algunos microscopios requieren de un montaje

especial, en tal caso, agregar una gota del líquido del montaje y cubrir
con una laminilla cubre-objeto. Examinar la muestra.
La presencia de organismos fluorescentes verdes ovoides pequeños o
partículas pequeñas se considera como una prueba positiva. Cuando los
pacientes sospechosos de Peste han recibido tratamiento antibiótico
previo a la obtención de muestra no se observa la morfología celular
característica, pero, partículas pequeñas de material celular disperso
pueden estar presentes debido a la lisis de las bacterias, por lo que, es
importante, que en la Ficha Clínico Epidemiológica se señale el esquema
de tratamiento recibido por el paciente a fin de poder interpretar el
resultado de la prueba.

BARTONELLA

Son agentes etiológicos de enfermedades emergentes u oportunistas,

distribuidas en todo el mundo y pueden ocasionar infecciones
intravasculares graves en el hombre y en los animales. Las
manifestaciones de las enfermedades son diversas, dependen de la
especie de Bartonella infectante y del estado inmunológico del paciente.

FROTIS SANGUINEO: (COLORACION WRIGTH)

La coloración de Giemsa es una modificación de la coloración de

Romanowsky, está disponible en cualquier laboratorio y nos permite
detectar los glóbulos rojos infectados por Bartonella bacilliformis en sus
formas bacilares, cocobacilares o cocoides. La muestra debe ser fijada
con metanol antes del proceso de tinción.
PROCEDIMIENTO DE LA COLORACIÓN DE LA MUESTRA
SANGUÍNEA

El frotis sanguíneo debe estar seco antes de la fijación, se puede acelerar

el secado empleando calor suave como el generado por una lámpara.
Evitar utilizar demasiado calor porque esto dificulta la coloración. Fijar
el frotis sanguíneo sumergiendo la lámina en un frasco con metanol por
tres segundos. Sacarlo y dejar secar o colocar la lámina sobre una varilla
de vidrio y cubrir la superficie con metanol y dejar que se evapore por
completo

Preparar el colorante diluido o solución de trabajo inmediatamente antes

de iniciar la coloración y asegurarse que el volumen preparado sea
suficiente para las muestras que se va a colorear (aprox.1 mL por
lámina).

Se debe evaluar y ajustar el colorante de trabajo enfunción al estado y

características del colorante madre. Filtrar la solución de trabajo con
papel filtro.

Coloración sobre varillas de vidrio

Es la forma más rápida y se puede colorear hasta diez láminas al mismo

tiempo.

 Colocar la varilla de vidrio sobre un lavatorio o recipiente, para

facilitar la eliminación de los líquidos usados en la coloración.

 Se colocan las láminas con los frotis sanguíneos, previamente fijados

sobre la varilla, separadas una de otra para poder manipularlas con
seguridad.

Se cubre la extensión con el colorante de trabajo diluido 1:10 por 15

minutos. (La dilución y el tiempo de coloración se ajusta de acuerdo con
las características del colorante preparado).

Descartar el colorante y lavar la lámina a chorro suave y continuo de

agua de caño hasta que arrastre todo exceso de colorante.
Colocar las láminas inclinadas en una gradilla para que escurra el agua y
dejar secar a temperatura ambiente.

Proteger el frotis del polvo.

OBSERVACION

Para la lectura de las láminas es importante conocer el manejo y

limitaciones del microscopio y mantenerlo en buen estado.

En la lectura se debe tener en cuenta:

a) Índice de bacteriemia

b) Forma de las bacterias

En función a estos parámetros se deben emitir los resultados para el

pronóstico médico:

 Se lee de 50 a 100 campos por lámina con la muestra de frotis

 sanguíneo a 1000 aumentos (objetivo de 100x) con aceite de

inmersión, buscando la presencia de formas cocobacilares, bacilares o
cocoides que se encuentran dentro de los hematíes.

 Un frotis sanguíneo tiene tres partes cabeza, cuerpo y cola; entre el

cuerpo y la cola generalmente se encuentra una sola capa de células y los
hematíes están separados, buscar esta zona para la lectura de la muestra.

 Las formas cocoides se encuentran en pares o cadenas. Si se observa

un solo hematíe con forma cocoide es preferible revisar toda la lámina, es
posible que no sea la forma cocoide sino algún artefacto.

 En un frotis positivo, se observan hematíes deformados y muchas

veces toman la forma ameboide.

 El resultado de la lectura del frotis sanguíneo se expresa en porcentaje

de hematíes infectados, para lo cual se cuenta 100 hematíes y se
determina cuántos están infectados.

 Si se observa que las células infectadas son más del 50%, se leerán 50
campos.
 Si se observa que las células infectadas son menos del 50%, se leerán
100 campos.

 Si se observa que el porcentaje de hematíes infectados es menor a 5%,

se debe leer toda la lámina.

 En el reporte se debe colocar las formas bacterianas observadas, ya sea

bacilar, cocobacilar o cocoide.

 En la fase aguda de la enfermedad se observan predominantemente

formas bacilares de color rojizo o violeta, separadas o en grupos dentro
de los hematíes; con menos frecuencia se ven formas cocoides.
4. Referencias bibliográficas
1. Minsa. Diagnóstico bacteriológico de la Bartonelosis humana o enfermedad de
Carrión. [Internet]. Gob.pe. 2006 [citado el 28 de noviembre de 2022].
Disponible en: http://bvs.minsa.gob.pe/local/MINSA/1285_INS79.pdf
2. Minsa. Manual de procedimientos de laboratorio para el diagnóstico de la peste.
[Internet]. Gob.pe. 1997 [citado el 28 de noviembre de 2022]. Disponible en:
https://bvs.ins.gob.pe/insprint/SALUD_PUBLICA/NOR_TEC/12.pdf
3. Minsa. Manual de normas y procedimientos en bacteriología de tuberculosis
[Internet]. Gob.pe. 1995 [citado el 27 de noviembre de 2022]. Disponible en:
http://bvs.minsa.gob.pe/local/MINSA/2376.pdf
4. Minsa. Esputo [Internet]. Gob.pe. 1999 [citado el 27 de noviembre de 2022].
Disponible en: http://bvs.minsa.gob.pe/local/PSNB/704_MS-PSNB459-2.pdf