INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE FARMACIA
LABORATORIO DE FARMACOLOGÍA GENERAL Y QUIMIOTERAPIA

PRÁCTICA 8

SECRECIÓN TUBULAR ACTIVA DEL ÁCIDO P-AMINOHIPÚRICO EN LAS REBANADAS DE LA

CORTEZA DE LA RATA

Grupo: 6FV1 Equipo: 3

DECLARATORIA DE NO PLAGIO

El presente avala que el reporte que se muestra a continuación es de nuestra autoría, sin plagio de ningún
tipo de información, ya sea de la publicada en la web, en fuentes escritas, o de reportes de otros
compañeros. Además de que todo lo escrito cuenta con las referencias correspondientes, las cuales se
incluyen completas. Estamos conscientes que, de detectarse algún tipo de plagio nuestra calificación será
automáticamente de cero.

Nombre Firma autógrafa

EVALUACIÓN

INDICADOR/ EXCELENTE SUFICIENTE DEFICIENTE INSUFICIENTE NULO

PUNTAJE
Hipótesis
Fundamento
químico
Resultados

Discusión

Conclusión(es)

Referencias
Calificación final

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I. OBJETIVO

Cuantificar la acumulación de p-aminohipurato en rebanadas de la corteza de riñón de rata y determinar

cómo dicha acumulación se ve afectada por la presencia de probenecid o por ausencia de energía
metabólica.

II. HIPÓTESIS

Si se sabe que uno de los mecanismos de eliminación de los fármacos en el riñón es la secreción tubular
activa, la cual requiere energía metabólica (ATP) y en presencia de dos o más analitos se vuelve
competitivo, entonces; cuando el PAH esté solo en solución ringer tendrá una relación tejido medio mayor
a 1, cuando el PAH esté en presencia de probenecid la relación tejido medio será igual o cercano a 1 y
finalmente cuando el tejido esté en ausencia de energía metabólica por efecto del 2,4-DNF o el nulo
suministro de oxígeno, la relación tejido medio del PAH será menor a 1

III. FUNDAMENTO QUÍMICO

Reacción de Bratton y Marshall El Fundamento Químico se basa principalmente en de diazotación de la

amina primaria del PAH en un medio ácido, se neutraliza el exceso de ácido nitroso con sulfamato de
amonio y después se da una reacción de acoplamiento con la N-1(-naftil)etilendiamina este acoplamiento

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da origen a una solución coloreada que se puede leer a 540 nm en el espectrofotómetro (Connors,1981).
*El diagrama fue elaborado en el programa ChemDraw.

IV. RESULTADOS

Figura 1. Gráfica de la relación t/m respecto a diferentes cámaras con rebanadas de corteza renal de
rata. Se muestra promedio ± EE. ANOVA unifactorial, S-N-K. P≤ 0.05. Donde B y B´= PAH, C=PAH +
probenecid, D= PAH + 2,4-DNF y E= PAH sin oxígeno.

En la figura 1, se representa en el eje de las abscisas las diferentes cámaras con las cortezas renales de
rata mientras que en el eje de las ordenadas se representa la relación tejido medio que corresponde a
cada una de ellas. Se observa, que para las cámaras B y B’ que contienen PAH y solución Ringer se
obtuvo un valor tejido medio mayor a 1, por lo que no presentaron diferencia significativa (P≤0.05)
respecto a las tres cámaras siguientes C, D y E, en donde la cámara C que tiene PAH, solución Ringer y
Probenecid se obtuvo un valor tejido medio cercano a 2, la cámara D que contiene PAH y 2,4-DNF
obtuvo un valor tejido medio cercano a 1, y por último la cámara E que contiene PAH se obtuvo un valor
tejido medio mayor a 1 muy parecido a B.

Ejemplo de un cálculo

➢ Ecuación de la recta de la curva tipo

Y = 7.7933x10-3+ 0.03767X

➢ Ejemplo de densidad óptica de la cámara B = 0.364

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Se sustituye en la ecuación de la curva tipo

0.364−7.7933 x 10−3
Concentración (µM) = = 9.4559 µM
0.03767

➢ Obtención de μmoles

Se multiplica por el volumen que se utilizó para para precipitar proteínas en litros (0.005 L)

9.4559 x 0.005 L = 0.0473 μmoles litro μmoles

➢ Obtención de mmol/kg

Los 0.0473 se dividen entre el peso húmedo del tejido, que a continuación se convierten en mmol/ Kg de
tejido.

0.0473 μmoles μmoles 1000 g 1 mmol

= 2.05543478 x x = 2.05543478 mmol/kg
0.023 gramos g de tejido 1 Kg 1000 μmol

➢ Relación tejido medio (t/m)

Para obtener la relación tejido medio este valor se divide entre el valor de la constante de difusión del
agua a través del riñón que es de 0.75 mmol/kg
mmol
2.05543478
kg
t/m= = 2.74
mmol
0.75
kg

V. DISCUSIÓN

La secreción tubular activa es un fenómeno de transporte activo secundario que se caracteriza por el uso
de transportadores específicos para cada sustrato o grupo de fármacos, en este caso, puede tener la
modalidad de simportador (que dos moléculas se mueven en la misma dirección) o antitransportador (que
se mueven en direcciones opuestas) (Wilmer y col., 2005). En cualquiera de los dos habrá una molécula
que se mueve a favor de su gradiente electroquímico y la otra en contra. Para que haya transporte activo
secundario, primero debe de generarse un gradiente por medio de un transporte activo primario que
necesita de ATP para mover los iones o moléculas a través de la membrana.

Para evaluar la secreción tubular activa del PAH se utilizaron 5 cámaras con diferentes condiciones.
Cabe mencionar que a todas las muestras de las cámaras se les dió el mismo tratamiento antes de
cuantificar la concentración de PAH. La principal razón por la cual se realizó la cámara A fue para tener
un Background de la densidad óptica que aportan los residuos proteicos y de aminoácidos que también
puedan formar diazocompuestos en la reacción de Bratton & Marshall y descartarla en las otras muestras
para un resultado más preciso en la concentración de PAH/ Kg de tejido.

Como no se añadió ningún otro competidor o factor algún factor químico en la cámara B que pudiera
afectar la acumulación del PAH en la célula tubular, entonces, la función de esta cámara es la de servir
como referencia para los demás modificaciones al medio. En condiciones normales, a concentraciones
bajas de PAH, hay muchos transportadores y la secreción aumenta linealmente a medida que aumenta la

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concentración plasmática. Puede llegar un punto en el que los transportadores estén saturados, no
importa si aumenta más la concentración de PAH porque la tasa de secreción ya no puede aumentar más
(Costanzo L, 2018).

Debido a que el PAH se secreta por medio de transporte activo secundario es necesario que antes se
realice un transporte activo primario como se mencionó antes, para generarlo, se necesita la presencia de
⍺-Cetoglutarato (⍺-CG), éste ingresa a las células tubulares proximales por la membrana basolateral
mediante un sistema acoplado con sodio, NaDC3. El gradiente de sodio es mantenido por la Na +, K ´+ -
ATPasa en la membrana basolateral. El PAH es uno de los sustratos para el transportador AOT1
(transportador de aniones orgánicos) que entra a la célula en contra de su gradiente de concentración
mediante un antitransporte con el ⍺-CG (Dantzler y Wright, 1997). Gracias a la generación de un
gradiente a causa del antitransporte del PAH hacia las células, la cantidad de fármaco dentro de las
células es mucho mayor que en el medio y por tanto la relación t/m supera la unidad.

En el caso de la cámara C, donde se agregó probenecid, como se muestra en la figura 1, la relación t/m
está cercana a 2, esto es debido a que el probenecid es un inhibidor competitivo de la secreción activa,
por lo que al estar en mayor cantidad que el PAH y además al tener una alta afinidad por el OAT1, se une
al transportador impidiendo que el PAH se pueda transportar y por consiguiente no haya secreción activa
(Fromm y Kim, 2004). Finalmente, tiene como efecto incrementar la concentración de PAH en los
capilares peritubulares, de manera que hay menos cantidad en la célula tubular proximal. Sin embargo, a
pesar de que no hay secreción activa el PAH va a difundir por un transporte pasivo, aunque este será de
una manera más lenta.

La cámara D que contiene 2,4-DNF, presentó una relación t/m cercano a 1, el 2,4-DNF desacopla la
fosforilación oxidativa. Esto ocurre cuando el ion dinitrofenato acepta un protón para formar dinitrofenol, el
cual es liposoluble y difunde a través de la membrana interna mitocondrial. La presencia de este en la
membrana mitocondrial interna va a desacoplar la fosforilación oxidativa a partir del transporte electrónico
por descarga del gradiente electroquímico de protones que no requiere la síntesis de ATP y, en
consecuencia, se lleva a cabo una inhibición de los procesos, una pérdida de las reservas de fosfatos
ricos en energía, y la consecuente disipación de más energía como calor (Salway, 2012). En el caso de la
cámara E la cual fue la cámara en la que no hay presencia de oxígeno, no hay un aceptor final de
electrones en la cadena que genera ATP siendo este un factor muy importante para que se presentara
una mayor relación de t/m ya que para llevar a cabo como la secreción activa se necesita de energía
metabólica, por lo que al no haber ATP se debía obtener de igual forma una relación t/m alrededor de 1
pero se obtuvo mayor a 1 muy parecido a B debido a que se le suministro oxigeno por el cual E y B
quedaron en las mismas condiciones.

Como en las cámaras D, el resultado que tendríamos que obtener en la cámara E si el experimento
hubiera permanecido en condiciones ideales de acuerdo al manual de prácticas (sin presencia de
oxígeno), se retira e inhiben moléculas esenciales para la respiración celular, la falta de ATP
principalmente afecta a la bomba de Na + , K ´+ -ATPasa que se encarga de generar el gradiente para
llevar a cabo el transporte activo secundario del PAH mediante el transportador AOT1 con ayuda del ⍺-
CG, Si no hay ATP, no hay formación de gradiente que pueda llevar a cabo la secreción activa del PAH,
por tanto éste queda obsoleto y únicamente queda la opción de usar el mismo gradiente del PAH en el
medio para realizar la difusión simple que al final del experimento la concentración en el medio y en el
tejido sería la misma por tanto la relación t/m sería 1 o muy cercano a 1.

VI. CONCLUSIONES

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● El PAH en condiciones fisiológicas normales tiene un mecanismo de secreción activa cuya relación
tejido medio es mayor a 1.
● La secreción tubular activa de PAH en presencia de probenecid fue cercano a 2.
● El 2,4-DNF impide la secreción activa de PHA , obteniendo un valor tejido medio menor a 1.
 Debido a fallas en el proceso la relación tejido / medio en la cámara E fue mayor a 1

VII. REFERENCIAS ADICIONALES:

● Costanzo L. 2018. Fisiología. 6a Edición. ELSEVIER, España. pp 273

● Connors A.1981. Curso de Análisis:Ensayo del Medicamento. México. pp 247

● Dantzler WH, Wright SH. 1997. Renal tubular secretion of organic anions. Advanced Drug Delivery
Reviews, 25(2-3): 217–230.

● Fromm M, Kim R. 2014. Drugs Transporters. Handbook of Experimental Pharmacology. Springer. pp 49

y 50.

● Salway JG. 2012. Medical Biochemistry at a Glance. 3 rd edition. John Wiley & Sons. England. p 36.

● Wilmer P, Stone G, Johnson L. 2005. Environmental Physiology of Animals. Blackwell Publishing.

Australia. PP 65

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