Instituto Politécnico Nacional

Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología

(UPIBI)

Departamento de Bioprocesos
Academia de Ingeniería de Biorreactores

Laboratorio de Biorreactores
Práctica 7

“Esterilización de medios de cultivo en biorreactores”

Grupo: 3BM3

Equipo: 5

Integrantes:
García Ibarra Andrea
Palacios Baltazar Nadia Aquetzalli
Palomo Pérez Fernando
Tello Yépez Marcos Radamés
Yepez Mendoza Karen

Profesores:

Altamirano Segovia Agustín

Martínez Limón Jonás

Fecha de entrega: 10 de abril de 2019

 ÍNDICE
OBJETIVO........................................................................................................................................3
INTRODUCCIÓN.............................................................................................................................3
MATERIALES Y MÉTODOS..........................................................................................................5
DESARROLLO EXPERIMENTAL.................................................................................................5
RESULTADOS.................................................................................................................................6
Tabla 1. Valores de temperatura y tiempo para el ciclo de esterilización...........................6
Gráfica 1. Perfil de temperatura vs tiempo del ciclo total de esterilización........................6
COMPARACIÓN DE RESULTADOS OBTENIDOS..............................................................7
Tabla 2. Criterios de diseño para cada una de las etapas del ciclo de esterilización por
el método experimental y método de Richards.......................................................................7
Tabla 3. Criterio total de diseño por el método experimental y método de Richards en
comparación del cálculo teórico................................................................................................7
DISCUSIÓN.....................................................................................................................................7
CONCLUSIONES............................................................................................................................8
REFERENCIAS...............................................................................................................................8
SECUENCIA DE CÁLCULO..........................................................................................................9
Criterio total de diseño............................................................................................................9
Método Experimental:..............................................................................................................9
Tabla 4. Valores experimentales de N0, N1, N2 y N.............................................................9
Método de Richards:.................................................................................................................10
Tabla 5. Valores acumulativos de para B. stearothermophilus con EA=67480 cal/mol
y A=4.93 x 1037 min−1...........................................................................................................10

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 Práctica 7

“Esterilización de medios de cultivo en biorreactores”

OBJETIVO
Aplicar los procedimientos para la esterilización en lote de un medio de cultivo en un
biorreactor, con calor húmedo y conocer la forma de calcular la efectividad del mismo. 

INTRODUCCIÓN
Los componentes que se utilizan en la formulación y preparación de los medios de cultivo
no están estériles y pueden llegar a contener una gran cantidad y variedad de
microorganismos que, de no eliminarlos del medio pueden a llegar a competir por el
sustrato con el microorganismo de interés y hacer que la biorreacción no alcance los
rendimientos óptimos o la productividad máxima.
Entre las razones que existen para realizar la esterilización de un medio de cultivo que se
empleará para la producción de algún metabolito están:

 Maximizar la productividad
 Evitar la dispersión al ambiente de microorganismos patógenos o potencialmente
patógenos.
 Evitar la contaminación del producto
En términos microbiológicos, la esterilización se entiende como todo proceso mediante el
cual se garantiza la “destrucción” de todos los microorganismos contenidos en un
determinado volumen de fluido o en una determinada superficie de un material. La
esterilización se puede llevar a cabo por varios métodos entre los que se encuentran:
calor seco o húmedo, agentes químicos, radiaciones de alta energía y vibraciones
sónicas.
Esterilización en lote de medios de cultivo
Cuando se esteriliza con calor húmedo un medio de cultivo contenido en un biorreactor en
un proceso por lote, el medio se calienta desde la temperatura ambiente hasta la
temperatura de esterilización, una vez que se alcanza esta se mantiene durante un
determinado tiempo y entonces se procede a enfriar el medio hasta la temperatura de la
fermentación. Así se distinguen las siguientes 3 etapas que componen al “ciclo de
esterilización”:
1. Calentamiento (desde la temperatura ambiente hasta la temperatura de
esterilización).
2. Mantenimiento de la temperatura de esterilización (durante un determinado
tiempo).
3. Enfriamiento (desde la temperatura de esterilización hasta la de operación de la
biorreacción).
Cinética de muerte térmica
La muerte de los microorganismos por calor húmedo sigue una reacción de primer
orden por lo que la velocidad de muerte térmica es proporcional al número de individuos
presentes.

3
La muerte térmica de los microorganismos ocurre en cada una de las etapas en que está
constituido el ciclo de esterilización. El valor del criterio total de diseño ( ▽tot) se ha
propuesto para obtener una baja "probabilidad" de sobrevivencia de las esporas de
Bacillus stearothermophilus. En realidad, en la industria de forma común ocurre que del 5
al 30% de los procesos no ocurren en completa esterilidad. Esto se debe a que el valor de
“N” no puede ser cero de acuerdo a la ecuación de diseño de ▽tot, por lo que la
probabilidad de una biorreacción contaminada en 100 biorreacciones es aceptable en
fermentaciones por lote. Una buena práctica de esterilización exige el cumplimiento de los
siguientes 2 puntos:
1. Que en la esterilización de 1000 lotes al menos 1 resulte contaminado (1/1000), o
lo que es lo mismo N = 10-3
2. La consideración de que el número de esporas (n0) de B. stearothermophilus
presentes en el material sea del orden de 10 4 a 106 esporas/ml (así el valor de N0
queda determinado como: “N0 = n0*Vop).
Cálculo de la efectividad de un proceso de esterilización en lote con calor húmedo
Para diseñar el proceso de esterilización de un biorreactor, se requiere saber
“cuantitativamente” que tan efectivo fue dicho proceso (conocer el valor obtenido de ∇tot).
Existen 4 formas de conocer dicha efectividad:
1. Método experimental
Consiste en inocular un determinado volumen de medio de cultivo contenido en un
biorreactor con una cierta cantidad de esporas de B. stearothermophilus, se procede a
realizar el proceso térmico de esterilización y se toman muestras al inicio y al final de cada
una de las etapas que componen al ciclo, para conocer el número total de esporas
sobrevivientes (N0, N1, N2 y N respectivamente) y así obtener el criterio total de diseño
(∇tot).
2. El método analítico
Consiste en resolver analíticamente las siguientes ecuaciones correspondientes.
3. Método gráfico
Consiste en graficar los valores de “K” en función del tiempo durante todo el ciclo de
esterilización. Las áreas bajo las curvas de cada una de las etapas son las soluciones de
las integrales de las ecuaciones respectivas a las etapas de calentamiento,
mantenimiento y enfriamiento.
4. Método de Richards
El autor, basado en la observación y análisis de distintos perfiles temperatura - tiempo
encontrados en la industria, realiza 2 suposiciones: 1) temperaturas menores a 100 ºC
tienen un efecto despreciable sobre la muerte térmica de B. stearothermophillus y sobre la
∇tot; 2) la velocidad de calentamiento y enfriamiento en los intervalos de temperatura
comprendidos entre 100ºC y la de esterilización tienen perfiles lineales con pendientes
absolutas de 1 °C/min. Con dichas consideraciones se puede construir una tabla de
valores de K y de valores acumulativos de ∇ para temperaturas mayores a 100 ºC y con
incrementos de 1 ºC por minuto. Lo anterior permite el cálculo de una forma rápida,

4
simple, pero muy aproximada de un proceso de esterilización con sólo conocer los
tiempos requeridos.

MATERIALES Y MÉTODOS
Biorreactor
 Biorreactor tipo tanque agitado de 15 L esterilizable in situ.
Instrumentación
 Placas
 Tubos
 Matraz
 Pipetas
 Medidor controlador de la temperatura.

DESARROLLO EXPERIMENTAL

5
RESULTADOS

Tabla 1. Valores de temperatura y tiempo para el ciclo de esterilización

Gráfica 1. Perfil de temperatura vs tiempo del ciclo total de esterilización.

6
 COMPARACIÓN DE RESULTADOS OBTENIDOS
Tabla 2. Criterios de diseño para cada una de las etapas del ciclo de esterilización por el
método experimental y método de Richards.
Criterio de diseño 
Método Calentamiento Mantenimiento Enfriamiento
( cal) ( man) ( enf )
Experimental 5.075 5.744 5.075
Richards 2.65 2.31 1.36

Tabla 3. Criterio total de diseño por el método experimental y método de Richards en

comparación del cálculo teórico.
Criterio total de diseño ( tot )
Teórico 25.33 – 29.93
Método Experimental 15.894
Método de Richards 6.32

DISCUSIÓN
Como era de esperarse, la presencia de agentes microbiológicos contaminantes, en este
caso evaluados como unidades formadoras de colonias (UFC), presentó las
características de una cinética de muerte dependiente de la temperatura.
Sin embargo, no se alcanzaron los valores considerados óptimos y aceptables dentro de
los estándares para un proceso de esterilización utilizando la cepa referida, Bacillus
stearothermophilus, ya que el criterio total de diseño debía encontrarse en un rango de
25.33 – 29.93, pero nuestros resultados no se encuentran dentro de este rango límite, ya
que en el método experimental se tuvo un valor de tot =15.89 y en el método de Richards
tuvimos un valor de tot =6.32. Con estos valores se ubica nuestro proceso en el rango de
los “subdiseñados”, y no sería viable comenzar una biorreación puesto que el riesgo de
contaminación y pérdida del lote de producción es muy alto.
Analizando más a detalle las temperaturas registradas durante todo el proceso podemos
observar que no se alcanza la temperatura establecida como temperatura de
esterilización, lo cual otorga lógica a los resultados experimentales obtenidos.
Pese a los resultados obtenidos no se consideraría prudente adjudicar la falla a los
cálculos sino al proceso en sí, objetivando que tal vez varianzas en los tiempos y las
temperaturas podrían optimizar el rendimiento de nuestro proceso. Sin dejar de tener en
cuenta que el error agregado por el factor humano, aumentado de sobremanera por el
número de individuos involucrados en cada etapa de este proceso, en el conteo de las

7
placas, la toma de muestras, el tratamiento de las muestras y el cultivo de las mismas;
juega siempre un papel muy importante en los resultados de un proceso.
Así mismo, podríamos proponer como alternativa cambiar el tiempo (prolongarlo) en la
etapa de mantenimiento, ya que este no depende de nada; también podríamos aumentar
la temperatura de esterilización y así podríamos tener un proceso viable.

CONCLUSIONES
 Se comprobó efectivamente que el grado de efectividad de un proceso de
esterilización dependen en mayor medida de los tiempos y temperaturas utilizados
considerados para el proceso.
 Los resultados obtenidos tanto del método experimental como el método de
Richards demuestran un proceso de esterilización “subdiseñado”.
 Para asegurar la efectividad del proceso de esterilización diseñado, una de dos:
o Es necesario aumentar la temperatura de esterilización, ya que la
temperatura de degradación de Bacillus stearothermophilus es de 121 °C.
o Es necesario aumentar el tiempo de mantenimiento para obtener una
adecuada esterilización.
 El medio de cultivo sometido al proceso de esterilización no resulto
adecuadamente esterilizado lo cual lo convierte inmediatamente en no viable para
su utilización.
 La diferencia abismal entre los resultados obtenidos y los establecidos por la teoría
denotan fallas múltiples durante la realización del proceso.

REFERENCIAS

 Lydersen B. K., D´elia N. A., Nelson, K.M.L.

1994. Bioprocess Engineering: Systems, Equipmentand Facilities. John Wiley and Sons,
Inc. New York. pags. 317-367. 
 Johnston P. R. 2004. Fluid Sterilization by Filtration. Interpharm, CRC Press LLC. pags. 25-
37. 
 Jornitz. M. W. 2006. SterileFiltration. Springer-Verlag, Berlin. pags. 143-180.
 Alvarenga, S. y Rivas, O. (s.f.). Cultivo de Geobacillus stearothermophilus ATCC 7953 en
un biorreactor de 2.5 litros bajo el sistema “batch”. Recuperado
de https://repositoriotec.tec.ac.cr/bitstream/handle/2238/2857/Informe_Final.pdf?
sequence=1&isAllowed=y
 Science Direct. (2012). Bacillus Stearothermophilus. Recuperado
de https://www.sciencedirect.com/topics/medicine-and-dentistry/bacillus-stearothermophilus
 Mateos, P. (2000). Esterilización Industrial. Recuperado
de https://www.researchgate.net/publication/261983198_ESTERILIZACION_INDUSTRIAL

SECUENCIA DE CÁLCULO

 Criterio total de diseño

Una buena práctica de esterilización exige el cumplimiento de los siguientes puntos:

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 1) Que en la esterilización de 1000 lotes al menos 1 resulte contaminado (1/1000), o
lo que es lo mismo N = 10-3
2) La consideración de que el número de esporas (n0) de B. stearothermophilus
presentes en el material sea del orden de 10 4 a 106 esporas/ml (así el valor de N0
queda determinado como: “N0 = n0*Vop).
Reactor R-14, Vop = 10 L
3 3
V op=0.01m V op=0.01m
4 6
n 0=10 esporas/ml n 0=10 esporas / ml

N 0= ( n 0 ) ( N 0 )=( 104 ) ( 0.01 ) ( 106 )=10 8 N 0= ( n 0 ) ( N 0 )=( 106 ) ( 0.01 ) ( 106 )=1010

N=10−3 N=10
−3

¿ ln ( N 0 / N ) =ln ( 10 /10 )=25.33 ¿ ln ( N 0 /N ) =ln ( 10 /10 ) =29.93

8 −3 10 −3

Por lo tanto, el valor del criterio total del diseño debe oscilar entre 25.33 y 29.93.
 Método Experimental:
Tabla 4. Valores experimentales de N0, N1, N2 y N

Para el cálculo de los criterios de diseño para cada una de las etapas del ciclo de
esterilización:

ln ( ) ( ) ( ) ( )
N0
N
=ln
N0
N1
+ ln
N1
N2
+ln
N2
N

Se tomaron en cuenta los primeros valores de cada dilución

7
N 0=80 x 10
5
N 1=5 0 x 10

N 2=16 x 103
1
N=10 x 10

cal=ln ( ) (
N0
N1
=ln )
80 x 107
50 x 105
=5.075

9
 ( ) (
N1
)
5
50 x 10
man =ln =ln =5.74 4
N2 16 x 10
3

( ) (
N2
)
3
16 x 10
enf =ln =ln 1
=5 .07 5
N 10 x 10
Para el cálculo del valor del criterio total de diseño tot :

tot = cal+ man + enf

tot =5.075+5.744+5.075

tot =15.894
 Método de Richards:
- Calentamiento de 18 a 110 °C = 39 min.
- Mantenimiento de 110 °C = 15 min.
- Enfriamiento de 110 a 30 °C = 20 min.

Para el valor del criterio de diseño para la etapa de calentamiento y enfriamiento se utilizó
la siguiente tabla:

Tabla 5. Valores acumulativos de para B. stearothermophilus con E A =67480 cal /mol y

37 −1
A=4.93 x 10 min .

Para el valor del criterio de calentamiento se tuvo que de 18 a 110 °C tardó 39 min y de
acuerdo a la Tabla 5, debió haber tardado 10 min y el valor acumulativo de es de 0.681.

( 0.681 )( 39 min )
cal = =2. 6 5
10 min
Para el valor del criterio de enfriamiento se tuvo que de 110 a 30 °C tardó 20 min y de
acuerdo a la Tabla 5, debió haber tardado 10 min y el valor acumulativo de es de 0.681.

10
 ( 0.681 ) ( 20 min )
enf = =1.3 6
10 min
El valor del criterio de diseño para la etapa de mantenimiento se puede calcular de la
siguiente manera:
Esporas de Bacillus stearothermophilus.

 A = Constante de Arrhenius para la velocidad de muerte térmica [=] 4.93 x 1037 min−1.
 E A = Energía de activación [=] 67480 cal/mol.
 R = Constante universal de los gases = 1.9872 cal/(Mol K).
 T = Temperatura absoluta [=] K.
 t = Tiempo [=] min.
Mantenimiento de 110 °C: 15 min

=A ( e ) t
−E A
RT
man

( )
cal
−67480
mol

=( 4.93 x 10 min
37 −1
) e
( 1.98 72
mol K )
cal
( 383 K )
( 1 5 min )
man

man =2.31
Para la tot :

tot = cal+ man + enf

tot =2.65+2.31+1.36

tot =6.32

 Memoria de cálculo para U.

Para calentamiento:
Con la ecuación de calentamiento por vapor en chaquetas:

11
Cp = 1930 J/(kg°C)

12
Grafica 2. Ln(T/TH) con respecto al Tiempo (min), para obtener la ecuación de la recta y
su pendiente, que es equivalente a α
Entonces tenemos que

Para enfriamiento
Con la ecuación de enfriamiento en chaquetas:

13
14
Gráfica 3. Ln(T/TH) con respecto al tiempo (min) para obtener la ecuación de la recta y su penden

15
16