Título

Laboratorio enzimas

Autores
(Barrera, M. Valencia, M. Marulanda, L. Pérez, L.)

Resumen
Las enzimas son fundamentales para los procesos biológicos que ocurren en el
cuerpo humano, gracias a su capacidad de catalizar reacciones. Es importante que
se tengan condiciones de temperatura, pH y concentración de sustrato óptimas para
que funcionen correctamente. En el laboratorio realizado se extrajo fosfatasa
alcalina, una enzima de la sustancia del intestino delgado de cerdo y se evaluó su
actividad enzimática sometiéndola a pruebas de temperaturas, pH y
concentraciones de sustrato diferentes.

Palabras clave
Enzima, actividad enzimática, pH, temperatura, concentración de sustrato.

Abstract
Enzymes are essential for the biological processes that occur in the human body,
thanks to their ability to catalyze reactions. It is important to have optimal
temperature, pH and substrate concentration conditions for them to work properly. In
the laboratory carried out, alkaline phosphatase, an enzyme from the substance of
the small intestine of pigs was extracted and its enzymatic activity was evaluated by
subjecting it to tests of different temperatures, pH and substrate concentrations.

Keywords
Enzyme, Enzyme Activity, pH, Temperature, Substrate Concentration.

Objetivos
- Elaborar la curva patrón del p-nitrofenol.
- Determinar el cambio de velocidad o actividad enzimática respecto a la
concentración de la enzima (velocidad vs. concentración de enzima).
Elaborar gráfica.
- Observar el cambio de actividad o velocidad en una reacción enzimática
respecto al cambio de pH (velocidad vs. pH). Representar gráficamente esta
relación.
- Medir el cambio de velocidad o actividad enzimática con respecto a la
variación de la temperatura (velocidad vs. temperatura). Elaborar gráfica.
- Determinar el efecto de la concentración de sustrato sobre la velocidad de la
reacción.
Introducción
Las enzimas son moléculas compuestas de proteínas, y son fundamentales en el
cuerpo humano para catalizar numerosas reacciones esenciales para los procesos
biológicos, siempre y cuando las condiciones del cuerpo sean óptimas para su
correcto funcionamiento. La actividad enzimática se puede ver afectada por factores
ambientales como la temperatura, el pH y la concentración de sustrato. Esto debido
a la especificidad, una de las características más importantes, ya que una enzima
tiene su sitio activo disponible para un sustrato en específico, y si algún factor de los
mencionados anteriormente se altera, se podría afectar, en primer lugar, la actividad
enzimática por la cantidad de sustrato disponible en el medio, o, por otro lado, la
forma de la enzima, por lo que ya no sería posible obtener un complejo enzima
sustrato y por consecuencia su producto.

Métodos y procedimientos
Materiales
- Intestino delgado de cerdo sin lavar
- Arena de mar
- Buffer TRIS 20 mM pH 10.5
- Glicerol
- PNF 2 mM
- PNF 2 mM
- Buffer TRIS pH 11
- Buffer TRIS pH 10
- Buffer TRIS pH 8
- Buffer TRIS pH 5
- Centrífuga
- Espectrofotómetro
Procedimiento
Resultados
Enzimas parte I

Tubo Número concentración PNF (mM) ABS

1 0,01 0,044

2 0,02 0,262

3 0,03 0,394

4 0,04 0,455

5 0,06 0,603
 y = 10,557x + 0,0138
Patrón P-nitroferol R² = 0,9249
0,7

0,6

0,5
Absorbancia

0,4

0,3

0,2

0,1

0
0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07
Concentración PNF (mM)

Enzimas parte II

- Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática

Tubo Número Temperatura ABS

1 Hielo 0,576

2 Ambiente 0,701

3 37°c 0,794

4 50°c 0,734

5 100°c 0,339

Blanco A Ambiente 0

Blanco B 100°c 0
 Efecto de la temperatura
0,9

0,8

0,7

0,6
Absorbancia

0,5

0,4

0,3

0,2

0,1

0
0 1 2 3 4 5 6
Tubo de ensayo

- Efecto de la concentración de sustrato sobre la actividad enzimática

Tubo Número concentración de sustrato (Mm) ABS

1 0,017 0,401

2 0,067 0,321

3 0.225 0,560

4 0,337 0,218

5 0,064 0,291
 Efecto de la concentración de sustrato
0,6

0,5

0,4
Absorbancia

0,3

0,2

0,1

0
0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4
Concentración de sustrato

- Efecto del pH sobre la actividad enzimática

Tubo Número pH ABS

1 11 0,041

2 10,5 0,546

3 10 0,803

4 8 0,554

5 5 0,382
 Efecto del pH
0,9

0,8

0,7

0,6
Absorbancia

0,5

0,4

0,3

0,2

0,1

0
0 2 4 6 8 10 12
pH

Análisis y discusión
Los seres vivos contamos con múltiples sustancias que ayudan a llevar a cabo el
correcto funcionamiento del metabolismo o en su defecto contribuyen acelerando el
mismo, hablando más específicamente de la digestión de los alimentos, se tienen en
cuenta diversas enzimas que lo que hacen básicamente es acelerar el proceso de
degradación de ciertas sustancias para su posterior aprovechamiento en el cuerpo o
para, por ejemplo, generar o acelerar la producción de energía en forma de ATP.

En este laboratorio, para poder analizar esta situación se contó con un intestino
delgado de cerdo esto ya que la digestión del alimento en el cerdo se logra
mediante el uso de las enzimas digestivas que el animal segrega naturalmente
desde su estómago, páncreas e intestino delgado, se hizo todo el énfasis en este
último órgano ya que el intestino delgado es el lugar principal de absorción de
nutrientes. En este lugar las enzimas digestivas segregadas, hidrolizan proteínas,
grasas, y carbohidratos en el quimo que es la masa homogénea en que se
transforman los alimentos dentro del estómago por efecto de la digestión. Además,
el bicarbonato de sodio tiene un papel vital en proveer alcalinidad para que el quimo
pueda ser transportado a través del intestino delgado sin causar daño a las células
debido al bajo pH después de salir del estómago. Algo importante para recalcar en
esta situación es el papel tan fundamental que juega el páncreas en este proceso,
ya que es el encargado nada más y nada menos que de la prevención del daño a
las células debido a las alteraciones del pH que puede causar el quimo, de este
modo se puede evidenciar la importancia del pH a la hora de una correcta digestión.
En cuanto al proceso que sucede en el intestino delgado del cerdo se puede resumir
en que una vez que el quimo pasa a través del duodeno, el proceso de digestión
está en pleno desarrollo. Después de salir del duodeno, ingresa a la parte media del
intestino delgado, el yeyuno. Esta porción del intestino delgado involucra tanto la
descomposición de nutrientes, así como el inicio de la absorción de nutrientes. La
absorción de nutrientes continúa hacia la sección final del intestino delgado, el íleon.
La absorción de nutrientes en el yeyuno y en el íleon ocurre en el área conocida
como borde cuticular, o mucosa intestinal, que fue la sustancia de mayor interés a la
hora de realizar la práctica en el laboratorio y de donde se extrajo la enzima a
estudiar. Esta mucosa está compuesta por proyecciones que parecen dedos
llamadas vellosidades, las cuales a su vez contienen más micro proyecciones
llamadas microvellosidades. Las puntas de las microvellosidades forman estructuras
tipo red llamadas glicocálix. Los aminoácidos y las azúcares simples son
descargados en la membrana del borde cuticular, son absorbidos primero por las
microvellosidades, luego por las vellosidades, y después pasan al sistema
circulatorio. Los aminoácidos y los azúcares simples absorbidos van directamente al
hígado vía la vena portal. En cuanto a la grasa de la dieta que es descompuesta y
absorbida hacia el borde cuticular, ingresa al sistema linfático y es descargada en la
circulación general vía el conducto torácico. [1]

Teniendo este conocimiento sobre la digestión de los alimentos por parte del cerdo y
viendo la importancia del intestino delgado y de las enzimas digestivas hay que
hacer mayor énfasis en la fosfatasa alcalina que fue la proteína de interés a lo largo
del laboratorio. Una de las principales funciones de la Fosfatasa Alcalina Intestinal
(FAI) es la detoxificación de los lipopolisacáridos (LPS) bacterianos para controlar la
inflamación intestinal. Diversas enfermedades intestinales, incluyendo enterocolitis
necrótica, enfermedad celíaca y la inflamación crónica intestinal están relacionadas
con disminuciones en la expresión y actividad de FA, de esta manera se puede decir
que la homeóstasis intestinal y la preservación de la salud dependen en gran
medida de la capacidad de FAI para detoxificar los LPS y suprimir la inflamación
metabólica inducida por estos. La fosfatasa alcalina intestinal circula dinámicamente
alrededor y a través del enterocito por los diferentes mecanismos, protegiendo la
mucosa intestinal (y el organismo) de estímulos proinflamatorios causados por LPS
bacterianos. [2]

Se sabe que las enzimas son proteínas complejas y especializadas, conocidas

comúnmente por actuar como catalizadores biológicos; son unas proteínas que
aceleran la velocidad de una reacción química específica en la célula. La enzima no
se destruye durante la reacción y se utiliza una y otra vez. Pero al ser una proteína,
necesita ciertas condiciones específicos en su ambiente para poder realizar su
trabajo de manera correcta, de lo contrario, perderían su forma y por ende su
funcionalidad, entre estas condiciones que deben mantenerse óptimas dependiendo
el lugar del cuerpo y lo que suceda en este, se encuentra la temperatura, el nivel del
pH y hablando específicamente de las enzimas, una de estas condiciones también
es la concentración del sustrato.

Profundizando en la influencia de cada uno de estos factores sobre la actividad

enzimática se puede decir que; La mayoría de los enzimas son muy sensibles a los
cambios de pH. Desviaciones de pocas décimas por encima o por debajo del pH
óptimo pueden afectar drásticamente su actividad. Como ligeros cambios del pH
pueden provocar la desnaturalización de la proteína, los seres vivos han
desarrollado sistemas más o menos complejos para mantener estable el pH
intracelular: Los amortiguadores fisiológicos.

En general, los aumentos de temperatura aceleran las reacciones químicas: por

cada 10ºC de incremento, la velocidad de reacción se duplica. Las reacciones
catalizadas por enzimas siguen esta ley general. Sin embargo, al ser proteínas, a
partir de cierta temperatura, se empiezan a desnaturalizar por el calor. La
temperatura a la cual la actividad catalítica es máxima se llama temperatura óptima.
Por encima de esta temperatura, el aumento de velocidad de la reacción debido a la
temperatura es contrarrestado por la pérdida de actividad catalítica debida a la
desnaturalización térmica, y la actividad enzimática decrece rápidamente hasta
anularse.

Al aumentar la concentración de sustrato también aumenta la velocidad de reacción

hasta un cierto punto. Una vez que todas las enzimas se han adherido, cualquier
aumento de sustrato no tendrá efecto alguno en la velocidad de reacción, ya que las
enzimas disponibles estarán saturadas y trabajando a su máxima capacidad.
Principalmente, la velocidad de la reacción o catálisis varía de acuerdo a la
concentración del sustrato. Al aumentar la concentración de sustrato, la actividad
enzimática aumenta, hasta alcanzar la velocidad máxima, punto donde la enzima se
satura, debido a que las enzimas tienen todos sus sitios activos ocupados. [3]

Para finalizar, es importante mencionar que durante esta práctica también tuvo una
gran importancia el tema de las curvas de absorbancia y la elaboración de múltiples
espectrofotometrías, ya que realizando este ejercicio se podía llegar a conocer
datos como la concentración del sustrato, teniendo clara la absorbancia de la
sustancia a evaluar y de esa forma, analizar la actividad enzimática.

Conclusión
De la realización de este laboratorio se puede llegar a la conclusión de que se
cumplió con los objetivos planteados al inicio de la práctica de manera satisfactoria
que básicamente constaba en realizar curvas patrón sobre el comportamiento de las
enzimas frente a diferentes situaciones que alteran su acción, de igual manera, por
medio de estas situaciones diversas como lo son el cambio en las condiciones de
pH, variaciones en la temperatura y diferentes concentraciones de sustrato se pudo
determinar cómo varía la acción enzimática de la muestra a evaluar como lo era la
fosfatasa alcalina y pese al hecho de que no se extrajo directamente de un humano,
por medio de este laboratorio se pudo evidenciar de una manera muy similar cómo
funciona esta y de este modo también su importancia y la de las enzimas en
general, y entendiendo correctamente esto favorece el ejercicio médico.

Bibliografía
1. https://www.elsitioporcino.com/articles/2513/sistema-digestivo-del-
cerdo-anatomaa-y-funciones/
2. http://www.scielo.org.co/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1900-
96072014000100009#:~:text=Fosfatasa%20alcalina%20intestinal%3A%20
una%20enzima%20con%20propiedades%20antiinflamatorias
3. https://www.ehu.eus/biomoleculas/enzimas/enz22.htm