LABORATORIO MICROBIOLOGÍA GENERAL 113

Práctica
Nombre3:delPreparación de material para
espacio pedagógogo
Microbiología, limpieza y esterilización.

Objetivos:
1. Conocer los aspectos básicos que se llevan a cabo en un Laboratorio de
Microbiología, en cuanto a las actividades de preparación de materiales.
2. Definir conceptos relacionados a los procedimientos de limpieza y
esterilización aplicables a otras áreas de trabajo.
3. Reconocer la importancia de implementar procedimientos
estandarizados en nuestro trabajo diario como parte de las medidas
para garantizar su efectividad.

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INTRODUCCIÓN
En el trabajo del laboratorio de Microbiología tienen una importante aplicación los
procedimientos, técnicas y productos que suprimen o disminuyen la vitalidad de los
microorganismos patógenos.

En los procedimientos microbiológicos es frecuente el empleo de material de vidrio y dado

que éste tiene una gran influencia en la calidad de los resultados, es muy importante tomar
en cuenta su adecuada limpieza y esterilización, es decir, se debe prestar un especial
cuidado a su preparación. Los métodos de limpieza del material deberán adaptarse al tipo
de sustancia que sea necesario remover. En principio vamos a tener dos tipos de materiales:
el contaminado (el que ha tenido contacto con microorganismos) y el no contaminado.
Cuando se trata de material contaminado, se deberá esterilizar en autoclave a 121ºC, 15
libras de presión, durante 20 a 30 minutos antes de someterlo al proceso de lavado. Para
llevar a cabo el proceso de lavado, se recomienda el empleo de detergentes biodegradables,
neutros, que no dejen residuos, de manera de no interferir con los resultados de los ensayos
analíticos. Se prepara una solución a la concentración indicada para remojar el material por
el tiempo necesario, siguiendo las instrucciones del fabricante, posterior a ello se enjuaga
con abundante agua potable hasta eliminar todo resto de jabón, luego se enjuaga 2 ó 3
veces con agua destilada, se deja secar en la estufa (de secado de material) a 60-70 ºC por
el tiempo necesario y finalmente se procede a su acondicionamiento de acuerdo al método
de esterilización a utilizar.

No existe un procedimiento de esterilización y desinfección aplicable a todos los casos. El

método de esterilización será seleccionado para cada caso teniendo en cuenta la naturaleza
física del objeto y la naturaleza biológica del contaminante. Como rara vez se conoce la
población de microorganismos sobre un objeto que debe ser tratado, debemos suponer
que se encuentran presentes las formas microbianas más resistentes: las endosporas. El
método de esterilización a emplearse debe ser previamente valorado. Actualmente existen
valores tabulados de tiempo de exposición, temperatura y concentración de principios
activos para los métodos de esterilización más usados que nos permiten elegir el más
adecuado para cada caso. En la elección debe tenerse en cuenta también el uso posterior
que le será dado (o no) al objeto a esterilizar.

CONCEPTOS BÁSICOS DE MICROSCOPIA

➢ ESTERILIZACIÓN: La esterilización es la muerte y/ o eliminación de todo
microorganismo. No existen grados de esterilidad, un objeto es estéril o no lo es.
➢ DESINFECTANTE: Agente usualmente químico, que mata las formas en crecimiento
de los microorganismos, pero no necesariamente las esporas. El término se refiere
a sustancias utilizadas sobre objetos inanimados.
➢ ANTISÉPTICO: Sustancia que impide el crecimiento o la acción de los
microorganismos, ya sea destruyéndolos o inhibiendo su crecimiento y actividad. Se
aplica sobre superficies corporales.
➢ SANITIZANTE: Agente químico (desinfectante) que reduce la población microbiana
a niveles seguros, según los requerimientos de salud pública. Se aplica en objetos

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inanimados de uso diario, por ejemplo, utensilios y equipos para

manipular alimentos, vasos, platos y otros objetos de uso similar.
➢ GERMICIDA: Agente que mata a los microorganismos, pero no necesariamente a sus
esporas.
➢ BACTERICIDA: Agente que mata a las bacterias.
➢ BACTERIOSTÁTICO: Agente que inhibe el crecimiento de las bacterias, mientras
permanece en contacto con ellas.
➢ FUNGICIDA: Agente que mata los hongos.
➢ FUNGISTÁTICO: Agente que inhibe el crecimiento de los hongos, mientras
permanece en contacto con ellos.
➢ VIRUCIDA: Agente que destruye los virus.

PAUTAS PREVIAS.
Para asegurar el éxito de un proceso esterilizante es necesario considerar las siguientes
pautas:
1. Esterilización previa: Será necesaria cuando el material y/ o equipos hayan sido utilizados
con material infeccioso o presunto infeccioso, por ejemplo, placas de Petri inoculadas,
tubos conteniendo cultivos de microorganismos, frascos empleados en el cepario, etc.
2. Limpieza previa: Se realizará para eliminar las partes gruesas de suciedad o residuos no
infecciosos (resto de pegamento, cinta adhesiva, tinta de rotulado, etc.). Se empleará el
raspado con espátulas, cepillo, esponjas metálicas, paños, etc.
3. Preparación del material de vidrio: Este acondicionamiento debe realizarse de manera
tal de asegurar la perfecta esterilización del mismo en todos sus puntos y evitar la posterior
contaminación. Debe rotularse cada uno con la capacidad y/o graduación correspondiente.

PROCEDIMIENTOS EN LABORATORIO.
Los métodos de esterilización se clasifican en:
1-FÍSICOS:
A) CALOR: Actúa por desnaturalización de proteínas y contribuye a la fusión de lípidos de
membranas.
• CALOR HÚMEDO: La desnaturalización y coagulación se facilita en presencia de agua
pues se rompen los puentes de hidrógeno entre los grupos C = O----HN que
constituye la estructura secundaria y se agrega (también mediante puente de
hidrógeno) una molécula de agua a cada extremo de esas uniones rotas. Las
proteínas en soluciones más diluidas coagulan a menor temperatura que las
concentradas. Esterilizar exclusivamente en calor húmedo: medios de cultivos,
recipientes contaminados, material de goma, y todo elemento que no resista las
altas temperaturas del calor seco. El autoclave utiliza vapor a presión superior a la
normal. Así, la temperatura del vapor de agua asciende a 121ºC. El vapor saturado
penetra en los recipientes tomando contacto con los microorganismos a destruir,
allí se condensa liberando calor. El calentamiento es rápido por la gran cantidad de
calor latente del vapor de agua, que libera al condensarse sobre la superficie del
objeto.

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• CALOR SECO: Deshidrata las bacterias, virus, etc. y facilita la coagulación o

desnaturalización de las proteínas. Se requieren mayores temperaturas para
producir daño irreversible (muerte). Se acepta que el calor seco actúe oxidando los
constituyentes intracelulares. En el proceso de esterilización son prioritarios los
procesos oxidativos y de fusión de membranas por sobre la desnaturalización.
Resulta lento por la menor eficacia del calor seco y por la lentitud del transporte del
calor (convección y radiación).

B) RADIACIONES
• Luz ultravioleta: Solamente para aire o para superficie o capas muy delgadas de
líquidos pues no penetra. Se usa para consultorios, salas, laboratorios, cámaras,
quirófanos. No atraviesan el vidrio. Las ondas UV tienen suficiente energía para
causar roturas en el ADN, produciendo la muerte del organismo expuesto. Las
cámaras de siembra vienen equipadas con una lámpara de luz UV para mantener el
área estéril, la cual se debe apagar cuando se ingresa a la cabina por la peligrosidad
a la exposición de las radiaciones (quemaduras, eritemas, cáncer de piel)

C) MECÁNICOS:
• Filtración: Para medios de cultivo, sueros y soluciones que se alteren con el calor.
En la mayoría de los filtros hay tres factores principales que intervienen en la
retención de partículas (bacterias, virus, proteínas, etc.): a) Efecto mecánico de
filtro, según el tamaño del poro. b) Repulsión o atracción eléctrica c) Absorción y
adsorción Por b y c pueden resultar que el filtro retenga partículas menores que el
diámetro del poro. La mayoría de los filtros bacterianos tienen cargas negativas igual
que las bacterias y los virus. Se disminuye la retención por ésta causa, trabajando a
pH entre 7 y 6.
• Ultrafiltración: Para separación y medición de virus. Membranas de ésteres de
celulosa biológicamente inertes que no retienen partículas por adsorción por lo
tanto la retención de partículas depende principalmente del tamaño de los poros.

2- QUÍMICOS:
• Esterilización por gas plasma: Es una de las tecnologías posibles para esterilizar
material termosensible. Consiste en crear un plasma (estado entre líquido y gas),
aplicando una radiofrecuencia a Peroxido de Hidrógeno que ejerce la acción biocida.
El plasma es considerado como el cuarto estado de la materia consistente en un
conjunto de iones, electrones y partículas atómicas neutras. Tiene la ventaja de no
dejar ningún residuo tóxico ya que se convierte en agua y oxígeno al final del
proceso. El material no precisa aireación. El ciclo de esterilización es corto, dura
entre 54 y 75 minutos.
• Esterilización con óxido de etileno: este método se aplica a materiales
termosensibles, sondas, instrumental vario. Este gas se administra mediante un
autoclave especial. Para ejercer su efecto necesita humedad y una temperatura
moderada (60ºC). La desventaja es que genera residuos contaminantes que deben
recibir tratamiento antes de ser desechados. El material tratado debe ser sometido

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a aireación forzada para eliminar los residuos tóxicos. El personal debe protegerse
adecuadamente.

MATERIAL PARA ENVOLTURA

El material que sirve de envoltura final, o que se emplea para su preparación, debe tener
las características siguientes:
• Ser adecuado para el proceso de esterilización. Por ejemplo, si va a ser utilizado para
envolver un material que va a ser esterilizado por calor húmedo, debe permitir la circulación
del vapor y a la vez deberá ser resistente a la humedad y la presión.
• Ser resistente a pinchazos y abrasiones.
• Permitir envolver el material completamente.
• Permitir la identificación del material estéril.
• Permitir retirar el material estéril con facilidad.
• Estar libre de colorantes y sustancias tóxicas.

Entre los materiales que más se emplean para envolver el material antes de su
esterilización, se encuentran:
• Para la esterilización por calor húmedo: papel Craft o papel crepado.
• Para la esterilización por calor seco: papel Craft o papel de aluminio.

PROCEDIMIENTO EN AUTOCLAVE:
Autoclave: (Vapor a presión)
Para lograr una esterilidad confiable el método estándar es el vapor saturado, en autoclave,
a una temperatura de 121 °C durante 15 minutos. En el caso de decontaminación el tiempo
puede extenderse a 30 minutos. Esta temperatura se logra por vapor de agua a una
atmósfera de presión sobre la presión atmosférica. Los recipientes a colocar en el autoclave
no deben estar totalmente llenos y deben tener tapas flojas o estar tapados con algodón
con una sobretapa para permitir la ebullición libre y la liberación del aire disuelto. Para
grandes volúmenes de líquidos se debe permitir un mayor tiempo de purgado. Este método
se utiliza para esterilizar medios de cultivos y soluciones. En el caso de líquidos, éstos no
deben formar emulsiones con el agua como Ej: aceite o vaselina. También se utiliza para
esterilizar ropa de cama o material textil en general, siempre que el autoclave esté provisto
de un sistema de secado por vacío.

Normas de uso generales del autoclave

La utilización del autoclave comprende los siguientes pasos:
a. Controlar el nivel de agua: en caso necesario, completar con agua corriente
b. Mantener la posición abierta de la espita
c. Controlar las funciones de la válvula de seguridad
d. Introducir el material a esterilizar.
e. Cerrar la tapa
f. Encender la fuente de calor
g. Purgar para eliminar el aire de la cámara de esterilización
h. Cerrar la espita.

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i. Cuando se alcanza la presión (indicadora de la temperatura) deseada se comienza a contar

el tiempo de esterilización.
j. Una vez concluido el proceso, apagar la fuente de calor y dejar disminuir la presión
espontáneamente. No enfriar artificialmente el autoclave.
k. Cuando el manómetro indica que la presión ha llegado a cero abrir la espita a fin de
equilibrar la presión. Abrir el autoclave y retirar el material estéril.

Ventajas del calor húmedo:

1) Rápido calentamiento
2) Buena penetración
3) Corto tiempo de esterilización
4) Bajo deterioro del material expuesto (Por menor temperatura y menor tiempo)
5) No deja residuo tóxico
6) Económico.

OTROS PROCEDIMIENTOS DE ESTERILIZACIÓN COMUNES

Flameado
Pasar dos o tres veces por la llama del mechero de Bunsen varillas de vidrio, bocas de tubos,
frascos y similares. Las asas y otros utensilios metálicos se someten a la llama directa hasta
calentarse al rojo. Las pinzas se sumergen en alcohol y luego se secan a la llama. Estos
métodos son instantáneos y no mantienen la esterilidad en el tiempo.

Estufa de esterilización
El proceso de esterilización requiere mayor temperatura y tiempo que en el caso del vapor
saturado, ya que tiene una menor capacidad de tomar, transportar y ceder el calor. La
temperatura de esterilización puede variar entre los 160 °C, 2 horas a 180 °C 1 hora. El papel
y el algodón no deben esterilizarse a más de 170 °C, ya que se carbonizan.

Normas de uso generales de la estufa

Los materiales no deben colocarse superpuestos ni tocando las paredes, de manera que no
obstruya la circulación del aire.
1) Cargar la estufa de forma tal de no impedir la convección del aire y que el material no
toque las paredes.
2) Controlar la posición del termómetro: su tubo no debe tocar la carcaza metálica ni la
puerta, pues se podrían registrar temperaturas falsas (mayores a las reales).
3) Encender la fuente de energía.
4) Cuando se alcanza la temperatura deseada comenzar a contar el tiempo de esterilización.
5) Dejar enfriar antes de retirar el material.

GUIA A DESARROLLAR:
1. ¿Pasteurización es sinónimo de esterilización? Diga en qué casos se aplica la
Pasteurización. Fundamente la respuesta.

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2. Por qué es necesario purgar el aire de la cámara del autoclave. Relacione con la Ley
de Dalton de las Presiones Parciales.
3. ¿Cómo se realiza el control de la efectividad del proceso de esterilización?
4. Compare los métodos de esterilización por calor seco (estufa) y por calor húmedo
(autoclave) teniendo en cuenta: mecanismo de acción, tiempo, temperatura y tipo
de material a tratar.
5. ¿Qué método de esterilización se recomienda para materiales termolábiles? Cite
ejemplos.
6. Coloque fotografías de preparación de material diverso, para esterilización en
Laboratorio.

NOTA: Recordar realizar la estructura del Informe de Laboratorio conforme a lo establecido

en la rúbrica de evaluación que se detalla en el Documento -- Laboratorio Microbiología
General 113, Descripción General. --

BIBLIOGRAFÍA CONSULTADA
1. Acosta-Gnass, Silvia I. y Stempliuk, Valeska. 2008. Manual de Esterilización para
Centros de Salud. Organización Panamericana de la Salud (OPS). Disponible en:
https://www1.paho.org/PAHO-USAID/dmdocuments/AMR-Manual_Esterilizacion_Centros_Salud_2008.pdf
2. Preparación de Material para Esterilización. Disponible en:
https://youtu.be/Nw5DkCnVEWw

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