Cuantificación Organismos

Coliformes por la Técnica del

Número más Probable (NMP)
Debido a que hay enfermedades que son
transmitidas por la vía fecal-oral utilizando como
vehículo los alimentos y agua, es necesario contar
con microorganismos que funcionen como
indicador de contaminación fecal.

¿Por qué se emplean como indicadores?

• Se encuentran en la fuente de contaminación
• Son más resistentes que los organismos
patógenos.
• Su detección es relativamente fácil y confiable.
 Organismos coliformes
Coliformes totales
Bacilos Gram negativos, no
esporulados, aerobios o anaerobios
facultativos que a 35°C fermentan la
lactosa con producción de ácido y gas.

Representado por los géneros Coliformes totales

• Escherichia
• Enterobacter
• Citrobacter Coliformes fecales
• Klebsiella (termotolerantes)

El grupo de coliformes fecales, está

representado por bacilos Gram
negativos que fermentan la lactosa,
Escherichia
con producción de gas a las 48h de
coli
incubación a 44.5°C-45.5°C.
Ej. Escherichia coli
 Escherichia coli
ETEC Escherichia coli enterotoxigénica
EPEC Escherichia coli enteropatógena
EHEC Escherichia coli enterohemorrágica
EIEC Escherichia coli enteroinvasiva

Propiedades y síntomas causados por algunas cepas de Escherichia coli

ETEC EPEC EHEC EIEC
Toxina Lábil/estable - Shiga o Vero -
Invasiva - - - +
Enterohemolsinas - - + -

Aguadas Aguadas y muy Mucoides y

Aspecto de las heces Aguadas
sanguinolentas sanguinolentas sanguinolentas

Fiebre Baja + - +

Colon y parte baja del

Intestino involucrado Delgado Delgado Colon
intestino delgado

Dosis infectiva Alta 108 Alta 106 Baja (10-100) Alta 106
O157: H7, O26,
Serotipos varios O26, O111 Varios
O111,, O121
Cuando el recuento de organismos se realiza en
medios de cultivo líquidos (NMP).

La Técnica del Número Más Probable

El método es aplicable Se basa en la inoculación La densidad bacteriana se
a agua potable, hielo, de alícuotas de la muestra estima con base a tablas,
alimentos, suelo, sin diluir, o de diluciones considerando el volumen
aguas residuales. sucesivas de muestra, número de
tubos positivos y negativos
en cada serie de tubos
inoculados
 Técnica del Número Más Probable (NMP)

Es una técnica cuantitativa en tubo

que, proporciona una estimación
estadística de la densidad microbiana
presente en una muestra. Muestra

Con base a la probabilidad de obtener

10 mL 0.1 mL
tubos con crecimiento positivo el cual 1 mL
disminuye conforme es menor el
volumen de muestra inoculado.

Ventajas

• Capacidad de estimar tamaños 20 mL de CLST 10 mL de CLST 10 mL de CLST

Concentración sencilla Concentración sencilla
poblacionales por atributos Doble concentración

• Provee de una recuperación de

microorganismos
• Determina sólo microorganismos
vivos y activos
• Método confiable y sensible
 Fundamento
El método se basa en la inoculación de
alícuotas de la muestra, diluida o sin diluir,
Presuntiva en una serie de tubos en un medio de
cultivo líquido (caldo lauril sulfato triptosa).

Los tubos se examinan a las 24 y 48 horas

de incubación a 35°C.

Cada uno de los tubos que muestran

Confirmativa
turbidez y gas, se resiembran en un medio
confirmativo (Caldo bilis verde brillante al
2%, Caldo EC o EC-MUG)
Fundamento (continuación)
Se lleva acabo la incubación de estos medios
confirmativos hasta por 48 horas a 35°C ó
45.5°C

Revisar cada uno de los tubos que muestran

turbidez y gas.

Mediante tablas estadísticas se lleva a cabo el

cálculo del NMP de organismos coliformes que
pueden estar presentes en la muestra.
Determinación de Organismos Coliformes
Totales y Fecales

• Prueba presuntiva: caldo lauril sulfato triptosa incubando a 35°C

durante 48 horas.

• Prueba confirmativa: caldo bilis verde brillante al 2% incubando

a 35°C durante 24-48 h. Caldo EC o EC-MUG incubado a 44.5-
45.5°C durante 24-48h.

Prueba complementaria: se busca Escherichia coli a partir de los

tubos positivos de caldo EC, los cuales se siembran por estría cruzada
en medios selectivos y diferenciales (Agar Mac Conkey, Agar eosina azul
de metileno) y posteriormente realizan las pruebas bioquímicas básicas
(IMViC) a las colonias típicas.
 MEDIOS UTILIZADOS EN LA DETERMINACIÓN DE ORGANISMOS
COLIFORMES
PRUEBA PRESUNTIVA

CALDO LAURIL SULFATO TRIPTOSA

Cantidad de Cantidad de Volumen de medio Caldo lauril
muestra medio por tubo más inóculo Triptosa requerido
Ingrediente inoculada (mL) (mL) (mL) g/l
Triptosa………….20g 1 10 11 35.6
Lactosa……….…5.0g 10 10 20 71.2
Fosfato dipotásico…2.75g 10 20 30 53.4
Fosfato monopotásico..2.75g 20 10 30 106.8
Cloruro de sodio……..5.0g 100 50 150 106.8
Lauril sulfato de sodio…0.1g 100 35 135 137.1
Agua destilada……..1000mL 100 20 120 213.6
 OCT OCF
PRUEBA CONFIRMATIVA
CALDO LACTOSA BILIS VERDE BRILLANTE AL 2%
Ingrediente

Lactosa 10 g
Peptona de gelatina 10 g
Sales biliares 20 g
Verde brillante 0.0133 g
Agua destilada 1000mL

CALDO EC
Ingrediente
Digerido pancreático 12 g
de caseína
Peptona 8g
Lactosa 5g
Sales biliares 1.5 g
Fosfato dipotásico 4g
Fosfato 1.5 g
monopotásico
Cloruro de sodio 5g
Caldo lactosa bilis EC
Agua destilada 1000 mL verde brillante al
2%
 Cuantificación coliformes
Homogenizar la muestra Realizar diluciones
en 225mL de diluyente decimales
Pesar 25 g
de muestra
Sembrar por triplicado 1mL de
1mL 1mL cada dilución en tubos de caldo
lauril sulfato triptosa (1X)

10-1 10-2 10-3

Incubar a 35°C
Presuntiva
24-48h

10-1 10-2 10-3 10-1 10-2 10-3

Tubos de caldo lauril sulfato triptosa (1X) + 1mL de De los tubos que presentan turbidez y gas, transferir 2-
la dilución 3 asadas al medio de confirmación (Caldo bilis verde
brillante y caldo EC o EC-MUG)

Incubar a 35°C Incubar a 45.5°C

Confirmativa
24-48h 24-48h

10-1 10-2 10-1 10-2 10-1 10-2 10-1 10-2

Lectura de tubos positivos en Lectura de tubos positivos en tablas.
Tubos con 10mL de caldo lactosa Tubos con 10mL de
tablas. NMP de coliformes NMP de coliformes fecales/g de
bilis verde brillante al 2% caldo EC o EC-MUG
totales/g de muestra muestra.
Siembra en Mac Conkey y EMB para
búsqueda de E. coli
Presuntiva

Confirmativa
 Muestra

10 mL 0.1 mL
1 mL

20 mL de CLST 10 mL de CLST 10 mL de CLST

Doble concentración Concentración sencilla Concentración sencilla
Presuntiva
Confirmativa
 RESULTADOS POSITIVOS PARA TURBIDEZ Y GAS

CALDO EC

CALDO BILIS VERDE

CALDO EC-MUG
BRILLANTE AL 2%
 Muestreo de agua para uso y consumo humano
NOM-014-SSA1-1993.Procedimientos
Sanitarios para el muestreo de agua para uso y
consumo humano.

Frascos o bolsas estériles que contengan

0.1mL de tiosulfato de sodio al 3%
Resultados prueba confirmativa
10-1 10-2 10-3

3 1 0
43NMP/g ó ml
Resultados prueba confirmativa
10-2 10-3 10-4

3 1 0
43x10 = 430NMP/g ó ml
Resultados prueba confirmativa
1mL 10-1 10-2

3 1 0
43/10 = 4.3 NMP/g ó ml
Resultados prueba confirmativa
10-1 10-2 10-3
Resultados prueba confirmativa

10-1 10-2 10-3

Resultados prueba confirmativa de agua
 Identificación de Escherichia coli
Prueba complementaria: se busca Escherichia coli a partir de los tubos positivos de
caldo EC, los cuales se siembran por estría cruzada en medios selectivos y diferenciales
(Agar Mac Conkey, Agar eosina azul de metileno) y posteriormente realizan las pruebas
bioquímicas básicas (IMViC) a las colonias típicas.

Colonias con centro negro, Colonias típicas fermentadoras de

planas con o sin brillo metálico. color rosa intenso que pueden
estar rodeadas de un halo opaco
de precipitación de las sales
biliares.
 Identificación de Escherichia coli

Bacilos Gram negativos

Tinción de Gram

PRUEBAS BIOTIPO 1 BIOTIPO 2

INDOL + -
RM + +
VP - -
CITRATO - -

Pruebas bioquímicas
Escherichia coli en 25g: AUSENCIA O PRESENCIA
 Métodos rápidos para la detección de E. coli

DBC-Escherichia coli
Sustratos: 5-bromo-4-cloro-3-indoil b-galactopiranósido (X-Gal)
4-metil-umbeliferil b-D-glucorónido (MUG)

Enzimas: X-Gal b-Galactosidasa

MUG b-D- Gluronidasa

Colitag (Colilert)
Sustratos: orto-nitrofenil b- D- galactopiranósido (ONPG)
4-metil-umbeliferil b-D-glucorónido (MUG)

Enzimas: ONPG b-Galactosidasa

MUG b-D- Gluronidasa
Quanty-Tray de Colilert
 Organismos coliformes

Agar Rojo Violeta Bilis (ARVB)

Organismos coliformes
Petrifilm
 Determinar unidades formadoras de colonia (UFC)

UFC/mL ó g = no. colonias (1/alícuota) (1/dilución)

Para determinar el número de UFC en una muestra

procesada, se cuenta el número de colonias formadas en la
placa, de preferencia aquellas que contengan:
15- 150 colonias

Se calcula el número de UFC contenidas en un mililitro ó gramo de

muestra.
 Resultados
Cantidad de
Grupo a Prueba Prueba
Muestra muestra en los NMP
detectar presuntiva confirmativa
tubos
Agua de
OCT 5 tubos con 20mL 2 2
llave
Hielo de
OCF 10 tubos con 10 mL 6 4
raspado
Queso
OCT 10-1 10-2 10-3 333 110
fresco
Carne
OCF 10-3 10-4 10-5 333 321
molida
Agua de
OCT 1, 0.1, 0.01 300 100
Fresa
Agua de 5 tubos con 10mL
riego de OCF 5 tubos con 1mL 533 311
parque 5 tubos con 0.1mL