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    4 - Crecimiento Bacteriano

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    Alejandra Castillo
    El documento describe los procesos de crecimiento bacteriano. Se divide en tres etapas: 1) duplicación del ADN, 2) separación del ADN en dos células hijas, y 3) formación de dos células individuales idénticas a la célula original. El crecimiento bacteriano sigue una curva característica con cuatro fases: latencia, crecimiento exponencial, estacionaria y muerte. Diversos factores como la temperatura, pH y oxígeno afectan la tasa de crecimiento bacteriano.

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    4 - Crecimiento Bacteriano

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    El documento describe los procesos de crecimiento bacteriano. Se divide en tres etapas: 1) duplicación del ADN, 2) separación del ADN en dos células hijas, y 3) formación de dos células individuales idénticas a la célula original. El crecimiento bacteriano sigue una curva característica con cuatro fases: latencia, crecimiento exponencial, estacionaria y muerte. Diversos factores como la temperatura, pH y oxígeno afectan la tasa de crecimiento bacteriano.

    Título original

    4 -CRECIMIENTO BACTERIANO

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    El documento describe los procesos de crecimiento bacteriano. Se divide en tres etapas: 1) duplicación del ADN, 2) separación del ADN en dos células hijas, y 3) formación de dos células individuales idénticas a la célula original. El crecimiento bacteriano sigue una curva característica con cuatro fases: latencia, crecimiento exponencial, estacionaria y muerte. Diversos factores como la temperatura, pH y oxígeno afectan la tasa de crecimiento bacteriano.

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    4 - Crecimiento Bacteriano

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    El documento describe los procesos de crecimiento bacteriano. Se divide en tres etapas: 1) duplicación del ADN, 2) separación del ADN en dos células hijas, y 3) formación de dos células individuales idénticas a la célula original. El crecimiento bacteriano sigue una curva característica con cuatro fases: latencia, crecimiento exponencial, estacionaria y muerte. Diversos factores como la temperatura, pH y oxígeno afectan la tasa de crecimiento bacteriano.

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    CRECIMIENTO BACTERIANO

    Se requiere coordinación espacial y temporal


    (secuencial) en la síntesis de macromoléculas:
    — DNA
    — Proteínas
    — Hidratos de Carbono
    — Lípidos

    Reflejado (poblacionalmente) por un aumento


    en el número de organismos presentes.

    1. El primer paso es la duplicación del ADN.


    2. Posteriormente, la membrana
    citoplasmática y la pared celular se
    invaginan, separando en dos regiones el
    ADN cromosómico.
    3. Finalmente, las paredes en crecimiento se
    unen formando dos células individuales,
    cada una de las cuales es esencialmente
    idéntica a la célula parental.

    TIEMPO DE GENERACIÓN (G) / DUPLICACIÓN


    Es el intervalo de tiempo que transcurre en que una célula se divide y da origen a la formación de dos
    células.
    Ejemplo: Escherichia coli el G = 20 min. Se dice que las bacterias crecen en forma exponencial o
    logarítmica:

    N generaciones 2N
    1 generación 2 células
    2 generaciones 4 células
    3 generaciones 8 células
    4 generaciones 16 células
    5 generaciones 32 células
    6 generaciones 64 células
    CRECIMIENTO EXPONENCIAL (LOGARÍTMICO)

    MEDIDA DEL NÚMERO DE MICROORGANISMOS


    Métodos directos:
    — Recuentos de UFC = Variables por siembra de muestras de diluciones en placas de Petri
    — Recuento de UFC a partir de grandes volúmenes de suspensiones diluidas:
    › Se hacen pasar por filtros de nitrocelulosa o equivalentes (ejemplo: sistema millipore) y se
    incuban sobre medio sólido.

    MEDIDA DEL CRECIMIENTO POR MASA CELULAR


    Métodos directos:
    — Determinación del peso húmedo
    — Determinación del peso seco
    — Determinación del N total
    — Determinación de algún componente característico:
    › ADN, ARN
    › Proteínas
    › ATP
    › Clorofilas (en fotosintéticos)

    MEDIDA DEL CRECIMIENTO POR BIOMASA


    Métodos indirectos:
    — Consumo de nutrientes
    › Q02 (consumo de oxígeno)
    › QCO2 (consumo de dióxido de carbono)
    — Productos del metabolismo
    › Producción de ácidos orgánicos
    › Producción de CO2
    MEDICIÓN DEL CRECIMIENTO BACTERIANO

    1. RECUENTO TOTAL DE CÉLULAS


    Conteo directo bajo el microscopio usando una muestra (diluida) de cultivo bacteriano y una cámara
    de recuento calibrada (Petroff – Hausser).
    Este método no discrimina la viabilidad de las bacterias en la muestra

    14 células / Factor de dilución: 1.250.000


    Recuento total: 14 x FD = 17.500.000

    DESVENTAJAS:
    — Las células muertas normalmente no se distinguen de las células vivas (existen excepciones que
    requieren tinciones y microscopios especiales)
    — Las células pequeñas son difíciles de ver al microscopio y algunas de ellas probablemente no se
    cuenten.
    — Se requiere tiempo y habilidad para conseguir precisión por este método.
    — Se quiere un microscopio de contraste de fases cuando la muestra no está teñida.
    — No es un método recomendable cuando la suspensión de células está muy diluida.

    2. RECUENTO DE CÉLULAS VIABLES (O RECUENTO VIABLE)


    Dilución de la muestra y siembra (“plaqueo”) sobre medio sólido o siembra de la muestra incluida en el
    medio sólido dependiendo del volumen de la muestra.
    Una célula viable es definida como aquélla que es capaz de dividirse y formar una colonia en el medio de
    cultivo. El conteo en placas es el método más utilizado son:
    — Diseminación en placa (siembra en placa por extensión).
    Se asume que cada colonia surgió de una simple célula, contando el número de colonias uno puede
    calcular el número de células viables en la muestra.
    — Método de vaciado en placa.

    RECUENTO DE CÉLULAS VIABLES


    Dilución seriada de la muestra en medio o buffer estéril y “plaqueo” sobre medio sólido.
    VENTAJAS
    — En condiciones adecuadas, es un método sensible
    — Se pueden contar bacterias específicas gracias a los medios selectivos y diferenciales

    DESVENTAJAS
    — El número de colonias no depende sólo del tamaño del inóculo
    También depende de:
    — El medio de cultivo
    — Las condiciones de incubación
    — Tiempo de incubación
    — No siempre las colonias son del mismo tamaño: Las colonias pequeñas pueden ser ignoradas

    3. MEDICIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA, FOTOMÉTRICA O TURBIDIMÉTRICA DE UN CULTIVO


    BACTERIANO LÍQUIDO
    Este método no discrimina la viabilidad de las bacterias en la muestra
    VENTAJAS:
    — Esta técnica no distorsiona a las muestras
    — Generalmente muy precisas
    — Fácil, rápido y barato

    DESVENTAJAS:
    — No discrimina entre células vivas y muertas
    — El crecimiento celular es una estimación de la biomasa
    — A elevadas concentraciones celulares (alta turbidez) se pierde precisión

    TIPOS DE CULTIVO

    CULTIVO DE “BATCH” O DE MEDIO NO RENOVADO


    — Cultivo en tubos
    — Cambios notables en el medio de cultivo, sobre todo en estadios tardíos del crecimiento
    CURVA DE CRECIMIENTO
    — Se observa el crecimiento de una bacteria en un medio líquido (Batch), al que no se agregan ni se
    quitan sustancias
    — Está representado por una serie de fases o etapas
    — El período de tiempo que dura cada fase dependerá de las características de las bacterias y medio de
    cultivo.
    — Esta curva solo se produce en condiciones de laboratorio.

    En condiciones controladas, en el laboratorio, se puede seguir la evolución del número de células a lo


    largo del tiempo de un cultivo microbiano en un sistema cerrado. Si representamos los resultados
    obtendremos la denominada curva de crecimiento que comprende cuatro fases: fase de latencia o de
    adaptación, fase de crecimiento exponencial o logarítmico, fase estacionaria y fase de muerte.

    Fase de latencia:
    — Periodo de adaptación, gran actividad metabólica, las células no se dividen (minutos-horas).

    Fase exponencial o logarítmica:


    — Aumento regular de la población que se duplica a intervalos regulares de tiempo (G)
    — Los beta-lactamicos actúan en esta fase
    Fase estacionaria:
    — Cese del crecimiento por agotamiento de nutrientes, por acumulación de productos tóxicos, etc.
    — Número de células nuevas = células que mueren

    Fase de declinación o muerte:


    — El número de células que mueren es mayor que el número de células que se dividen
    — Disminuyen células viables

    Las propiedades de un microorganismo dependerán de la fase de la curva en la que se encuentren (la


    producción de antibióticos se lleva a cabo en la fase estacionaria).

    FASE DE LATENCIA O ADAPTACIÓN


    — Es un periodo de transición que dura aproximadamente 4 horas.
    — No hay crecimiento visible (no hay incremento en el número de células) y de hecho puede haber una
    reducción en el número de bacterias.
    — Es un período de adaptación, en el que las bacterias tienen una gran actividad metabólica pero no
    se dividen.
    — Nota: Se producen las enzimas necesarias para que las bacterias puedan crecer en un nuevo medio
    ambiente. Crecimiento lento.

    FASE LOGARÍTMICA
    — Después de 6 hrs., aproximadamente, de haber sembrado las bacterias en un medio óptimo, las
    bacterias comienzan a dividirse en forma constante y máxima.
    — El número de bacterias aumenta en progresión geométrica (se duplica) y la resultante es una línea
    recta ascendente.
    — Este período termina más o menos a las 12 horas, debido a la disminución de los nutrientes
    disponibles.
    — Crecimiento bacteriano a máxima capacidad.

    FASE ESTACIONARIA
    — Debido a la acumulación de desechos metabólicos y disminución de los nutrientes, la actividad
    metabólica decae.
    — Las bacterias se dividen con menor frecuencia y el número total de bacterias vivas permanece
    constante puesto que el número de muertes de equilibra con el de multiplicación.
    — En la mayoría de las bacterias esta fase se produce entre 18 y 24 horas.
    — Sobre el final de esta etapa puede ocurrir la esporulación en aquellas bacterias que poseen este
    mecanismo de resistencia.
    — Nota: Las células generalmente agotan una serie de coenzimas esenciales u otros constituyentes
    celulares. Detención del crecimiento, no del metabolismo.

    FASE DE REGRESIÓN O DE MUERTE


    — Las bacterias dejan de multiplicarse (progresiva disminución en el número de células) y mueren con el
    tiempo, debido al término de nutrientes, acumulación de material de desecho y disminución del
    espacio físico.
    — No todas las bacterias del cultivo se encuentran en esta fase al mismo tiempo, por lo tanto, se
    representa como una pendiente, que no llega a 0.

    — Nota: Agotamiento de cultivo.

    FACTORES QUE AFECTAN EL CRECIMIENTO BACTERIANO


    Condiciones físico – químicas que proporciona el medio que influyen en el crecimiento bacteriano:
    — Temperatura
    — pH
    — Concentración de sales (concentración osmótica)
    — Oxígeno
    — Sustancias o agente antimicrobiano con características especificas

    Temperatura pH
    Psicrófilas: 0 – 15 °C
    Mesófilas: 25 – 42 °C Acidófilas: 1 – 6,0
    Termófilas: 50 – 70 °C Neutrófilas: 6,5 – 7,5
    Hiper-termófilas: 80 – > 100 °C Basófilas: 8,5 – 11,5

    Presión osmótica (salinidad) Oxígeno


    No halófilas: Aerobias estrictas: pO2: 20 %
    Halotolerantes: 1 – 6 % NaCl Microaerófilas pO2: 2 – 10 %
    Halófitas moderadas: 6 – 15 % NaCl Anaerobias facultativas
    Halófilas extremas: 16 – 30 % NaCl Anaerobias moderadas pO2: 2 – 8 %
    (arqueas) Anaeróbicas estricticas pO2: < 0,5 %

    TEMPERATURA:
    Consecuencias moleculares de la temperatura en el crecimiento bacteriano
    — Temperatura media: Las reacciones enzimáticas van aumentando su velocidad de reacción
    — Temperatura óptima: Las reacciones enzimáticas ocurren a la máxima velocidad posible
    — Temperatura mínima: Congelación de la membrana, el transporte es tan lento que no hay
    crecimiento.
    — Temperatura máxima: Desnaturalización de proteínas, colapso de la membrana citoplasmática, lisis
    térmica.

    Temperatura óptima
    — Psicrófilos: baja < 1 – 15 °C
    — Mesófilos: rango medio 25 – 42 °C
    — Termófilos: alta 50 – 70 °C
    — Hiper-termófilos: muy alta 80 – > 100 °C

    pH

    SALINIDAD
    — No halófilos: No toleran ni siquiera concentraciones moderadas de sal.
    — Halotolerantes: Toleran concentraciones moderadas de sal
    — Halófilos: Leves 1 – 6 % NaCl / Moderados 6 – 15 % Na Cl
    — Halófilos extremos: 15 – 30% NaCl

    ORGANISMOS SEGÚN SU REQUERIMIENTO DE OXÍGENO


    Grupo Relación con el O2 Metabolismo
    Aerobios
    Estrictos Requerido Respiración aeróbica
    Facultativos No requerido (mejor con O2) Respiración, fermentación
    Microaerofílicos Requerido (bajos niveles) Respiración aeróbica
    Anaerobios
    Aerotolerantes No requerido (no mejoran con Fermentación
    O 2)
    Estrictos Dañina o letal Respiración, fermentación

    Resazurina
    (indicador de presencia de oxígeno)
    (a) Aeróbica
    (b) Anaeróbica
    (c) Facultativa
    (d) Microaerofílica
    (e) Anaerobio aerotolerante

    Tioglicolato (reacciona con el oxígeno del aire y lo reduce a


    H20)
    Medio de cultivo con un poco de agar (semisólido), resazurina
    y tioglicolato

    ANAEROBIOSIS

    Jarra anaeróbica (GasPack)


    — Diseñada para el crecimiento de bacterias
    anaerobias.
    — Mecanismo hermético, que posee un
    catalizados químico que consume todo el
    oxígeno presente dentro del recipiente.

    CÁMARA ANAERÓBICA CAPNOFILIA


    MEDIOS DE CULTIVO
    Requisitos de los medios de cultivo y condiciones de cultivo:
    — Esterilidad
    — Tener todos los nutrientes esenciales (agua, fuente de nitrógeno, fuente de carbono, sales minerales,
    micronutrientes, vitaminas, etc).
    — Cumplir con requisitos físicos: temperatura (37°C), pH neutro (7,0 – 7,2), condición atmosférica (10%
    CO2)
    — Estar protegido del medio ambiente (evitar su contaminación con microbiota ambiental y/o comensal).

    FACTORES QUE AFECTAN EL CRECIMIENTO BACTERIANO

    Bactericidas en todas las fases


    Bacteriostáticos en fase exponencial solamente

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