UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID

Tráfico a través del aparato de Golgi

y extensión apical en Aspergillus
nidulans

Memoria presentada por Miguel Hernández González para optar al grado de doctor.

Director:
Miguel Ángel Peñalva Soto
Profesor de Investigación del CSIC
Centro de Investigaciones Biológicas

Tutor: Jesús Pla Alonso, Catedrático de la Universidad Complutense de

Madrid, Facultad de Farmacia.

TESIS DOCTORAL
 MIGUEL HERNÁNDEZ GONZÁLEZ

Centro de Investigaciones Biológicas

CSIC

Esta Tesis Doctoral ha sido realizada en el Centro de Investigaciones Biológicas (CIB)

del Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) bajo la dirección del Dr. Miguel
Ángel Peñalva Soto, Profesor de Investigación del CSIC y coordinador de la Unidad de
Genética Molecular de Aspergillus nidulans.

El trabajo recogido en esta memoria ha sido financiado con fondos públicos del
Ministerio de Economía y Competitividad del Gobierno de España, a través de los proyectos
BIO2012-30965 y BIO2015-65090-R y un contrato predoctoral asignado al proyecto BIO2012-
30965.
A Alexandra
 AGRADECIMIENTOS

En primer lugar, quiero dar las gracias a Miguel por esforzarse cada día en dirigirme la
tesis. Gracias por enseñarme con el ejemplo que la constancia, el trabajo y el esfuerzo son el
único camino para progresar. Gracias por atender siempre a mis preguntas, consultas y demás
comentarios. Gracias por escuchar siempre con interés mis opiniones y por permitir que
mantuviésemos discusiones científicas como iguales. Gracias por tu comprensión y tu paciencia.

En segundo lugar, gracias Areti por enseñarme a trabajar en el laboratorio en mis

principios. Me enseñaste que el rigor científico y la organización en el laboratorio son
esenciales.

Agradezco al Profesor Herbert Arst su trabajo incansable y su continuo interés

científico en todos los proyectos en que hemos colaborado. Su trabajo y constancia durante
tantos años son un ejemplo para todos.

Gracias al resto de compañeros del laboratorio: gracias Mario por ayudarme diariamente
en todo lo que he necesitado, gracias Manuel, Dani, Víctor, Laura, Patricia, Erika, María
Villarino, María Manoli, Irene y Elena Requena por ser unos compañeros estupendos.
Agradezco especialmente a Manuel, Dani y Víctor su interés y ayuda durante los años en que ya
no estaban en el laboratorio, seguís formando parte del grupo. Gracias Elena por ser la mejor
técnico de laboratorio que podíamos tener. Gracias Eduardo por todos tus consejos y por tu
cercanía en el trato. Muchas gracias Ignacio, porque siento que he aprendido mucho más de ti
que lo que yo te haya podido aportar.

Gracias a todos mis amigos por preocuparse por mi todos estos años y por preguntarme
siempre con interés sobre mi tesis.

Gracias a mi familia por sus preocupaciones y desvelos y gracias por aguantarme.

Gracias Alexandra porque sin tu apoyo y confianza en mí no podría haber conseguido esto.
Abreviaturas
3'UTR: Región 3’ no traducida.
5'UTR: Región 5’ no traducida.
alcAP: promotor del gen de la alcohol deshidrogenasa (alcA).
ARF: ADP rybosilation factor.
BSA: albúmina de suero bovina.
cDNA: DNA complementario.
CMAC: 7-amino-4-clorometil cumarina.
COG: Conserved Oligomeric Golgi.
COPI: Coat protein complex I.
COPII: Coat protein complex II.
CORVET: Class C core vacuole/endosome tethering.
DNA: ácido desoxirribonucleico.
EDTA: ácido etilendiamino tetra-acético.
FM4-64: dibromuro de N-(3-trietilamoniopropil)-4-(p-dietilaminofenilhexatrienil) piridinio
GAP: proteína estimuladora de la actividad GTPásica.
GDP: guanosín difosfato.
GEF: factor intercambiador de nucleótido de guanina.
GFP: proteína verde fluorescente.
gpdAmini: fragmento del promotor del gen de la gliceraldehído 3-P deshidrogenasa.
GTP: guanosín trifosfato.
HA: residuos 98-106 de la hemaglutinina del virus de la gripe humana.
HOPS: Homotypic fusion and protein sorting.
LB: medio de Luria-Bertani.
MCA: medio completo de Aspergillus nidulans.
mCherry: proteína monomérica rojo-cereza fluorescente (monomeric cherry fluorescent
protein).
MMA: medio mínimo de Aspergillus nidulans.
mRFP: proteína monomérica roja fluorescente.
NCBI: National Center for Biotechnology Information.
niiAP: promotor del gen de la nitrito reductasa.
ORF: marco abierto de lectura.
p/v: peso / volumen.
PAGE: electroforesis en gel de poliacrilamida.
PAGE-SDS: electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes (con SDS).
PCR: reacción en cadena de la polimerasa.
pH: potencial hidrógeno.
PtdIns3P: Fosfatidilinositol 3 fosfato.
PtdIns4P: Fosfatidilinositol 4 fosfato.
pyrGfum: gen pyrG de Aspergillus fumigatus.
RE: retículo endoplasmático.
riboBfum: gen riboB de A. fumigatus.
rpm: revoluciones por minuto.
Sar: Secretion-Associated, Ras-related.
SDS: dodecil sulfato sódico.
SNARE: Soluble N-ethylmaleimide-sensitive-factor Attachment protein Receptor.
TGN: Golgi tardío o trans-Golgi.
TRAPPII: Transport Protein Particle II.
Tris: Tris (hidroximetil) aminometano.
v/v: volumen / volumen.
VPS: Vacuolar Protein Sorting.
wt: cepa silvestre.

Las abreviaturas que no se indican siguen el código de la IUPAC.

Las tablas y figuras contenidas en este trabajo se citan antecedidas de una letra, que
hace referencia a la sección en que aparecen: I: Introducción; M: Materiales y Métodos; R:
Resultados; D: Discusión.
ÍNDICE
RESUMEN _______________________________________ 1

SUMMARY ______________________________________ 13

1. INTRODUCCIÓN ______________________________ 25
1.1. La interfaz retículo endoplasmático/aparato de Golgi ................................... 29
1.1.1. Tráfico anterógrado: la cubierta COPII ........................................................... 29

1.1.2. Tráfico retrógrado: la cubierta COPI ............................................................... 32

1.2. El tráfico en el aparato de Golgi: modelos ...................................................... 34

1.3. La implicación de los lípidos en el tráfico de membranas ............................. 36

1.4. El proceso de N-glicosilación en la ruta secretora .......................................... 38

1.5. Control molecular de la ruta secretora: GTPasas de la familia Arf/Sar

en el retículo endoplasmático y el aparato de Golgi y sus proteínas
reguladoras ................................................................................................................ 39
1.5.1. Factores intercambiadores de nucleótidos de guanina (GEF) de la famila
Arf/Sar ...................................................................................................................... 41

1.5.2. Proteínas estimuladoras de la actividad GTPásica (GAP) de la familia

Arf/Sar ....................................................................................................................... 42

1.6. La salida de proteínas en la red del trans-Golgi (TGN) y las

diferentes rutas de secreción .................................................................................... 42
1.6.1. Tráfico a los endosomas .................................................................................. 43

1.6.2. Tráfico “directo” desde el TGN a la membrana plasmática ............................ 44

1.6.3. Tráfico “directo” de las proteínas ancladas a GPI ........................................... 45

1.7. Aspergillus nidulans como modelo para el estudio del tráfico

intracelular ................................................................................................................ 47
1.7.1. Endocitosis en A. nidulans .............................................................................. 49

1.7.2. Caracterización de la ruta secretora ................................................................. 50

1.7.2.1. Los reguladores del Golgi: Rabs, Arfs y sus reguladores ................ 52

1.7.2.2 El Spitzenkörper, el crecimiento polar y la síntesis de pared

celular ........................................................................................................... 53
2. ANTECEDENTES Y OBJETIVOS ________________ 55
3. MATERIALES Y MÉTODOS ____________________ 59
3.1. Medios de cultivo para Aspergillus nidulans ................................................... 61
3.1.1. Medio Completo (MCA) y Medio Completo de Regeneración (MCR) .......... 61

3.1.2. Medio Mínimo (MMA), Medio de Microscopía (WMM) y Medio

Mínimo de Regeneración (MMR) ............................................................................. 61

3.1.3. Solución de sales y suplementos ..................................................................... 61

3. 2. Cepas de Aspergillus nidulans utilizadas ........................................................ 62

3.3. Plásmidos y oligonucleótidos utilizados ........................................................... 68

3.3.1. Plásmidos......................................................................................................... 68

3.3.2. Oligonucleótidos ............................................................................................. 70

3.4. Manejo de Escherichia coli ............................................................................... 76

3.5. Manejo de Aspergillus nidulans ........................................................................ 76

3.5.1. Cultivo y mantenimiento de cepas .................................................................. 76

3.5.2. Transformación ............................................................................................... 76

3.5.2.1. Generación de protoplastos ............................................................. 76

3.5.2.2. Transformación................................................................................ 77

3.5.3. Extracción de DNA genómico......................................................................... 77

3.5.3.1. Método rápido, para PCR ................................................................ 77

3.5.3.2. Método elaborado, para Southern Blot ............................................ 78

3.5.4. Extracción de proteína total ............................................................................. 78

3.5.5. Cruces entre estirpes de A. nidulans por reproducción sexual ........................ 78

3.5.6. Precipitación de proteínas de medio de cultivo ............................................... 79

3.5.7. Genotipado de cepas transformantes ............................................................... 79

3.5.8. Inducción de la expresión a partir de genes integrados en el locus inuA ........ 79

3.5.8.1. Cultivo en matraz ............................................................................ 79

3.5.8.2. Cultivo para microscopía ................................................................. 80

3.6. Técnicas de biología molecular, biología celular y bioquímica ..................... 80

3.6.1. Obtención de casetes de transformación mediante PCR de fusión.................. 80
 3.6.2. Southern-blot ................................................................................................... 82

3.6.3. Electroforesis e inmunodetección de proteínas por western-blot .................... 82

3.6.4. Generación de mutantes de sarA ..................................................................... 83

3.6.4.1. Obtención y clonaje del casete de reemplazamiento génico de

sarA .............................................................................................................. 83

3.6.4.2. Generación de una mutateca de sarA............................................... 83

3.6.4.3. Transformación de A. nidulans .............................................. 84

3.6.5. Expresión de SarA en Escherichia coli, purificación y obtención de
anticuerpos ................................................................................................................ 84

3.6.6. Desglicosilación con PNGasa F ...................................................................... 85

3.7. Microscopía de fluorescencia in vivo ................................................................ 86

3.7.1. Especificaciones técnicas ................................................................................ 86

3.7.2. Condiciones de cultivo y experimentos de cambio de temperatura con

mutantes termosensibles ............................................................................................ 86

3.7.3. Utilización de colorantes fluorescentes ........................................................... 87

3.7.4. Utilización de las drogas Latrunculina B y Brefeldina A ................................ 87

3.7.5. Inducción del promotor niiA ........................................................................... 87

3.7.6. Análisis de colocalización: Li y Pearson ......................................................... 87

3.7.7. Cuantificaciones con imágenes de microscopía de fluorescencia ................... 88

3.7.7.1. Intensidad de fluorescencia de CopA-GFP en sarA6 ...................... 88

3.7.7.2. Cuantificación del área ocupada por cisternas y de la

fluorescencia citosólica de células sarA6 mRFP-PHOSBP ............................. 88

3.7.7.3. Gradiente deChsB en el TGN .......................................................... 88

3.7.7.4. Localización relativa de ChsB y AbpA ........................................... 89

3.7.7.5. Vida media de las cisternas del TGN con ChsB .............................. 89

3.7.7.6. Relocalización de ChsB en los mutantes nudA2 y nudA5 ............... 89

3.8. Herramientas informáticas ............................................................................... 89

3.9 Reactivos, enzimas y kits comerciales de biología molecular utilizados ........ 90

3.9.1. Kits .................................................................................................................. 90

3.9.2. Reactivos y enzimas de biología molecular .................................................... 90

4. RESULTADOS ________________________________ 91
4.1. Capítulo I. Bloqueo condicional del tráfico de COPII ................................... 93
4.1.1. Localización del homólogo de sar1 en el genoma de A. nidulans ................. 95

4.1.2. sarA es un gen esencial.................................................................................... 95

4.1.3. Diseño del método de generación de mutantes termosensibles ....................... 96

4.1.4. Construcción de la mutateca de sarA en Escherichia coli............................... 97

4.1.5. Selección y caracterización de 8 alelos termosensibles de sarA ..................... 99

4.1.6. La termosensibilidad de los transformantes estaba ligada genéticamente a

sarA ........................................................................................................................... 99

4.1.7. Los niveles de SarA no están alterados en la estirpe control sarA0 .............. 101

4.1.8. Los niveles de SarA de los mutantes sarA-ts disminuyen con el aumento de
la temperatura .......................................................................................................... 101

4.1.9. Análisis de las sustituciones resultantes de las mutaciones de sarA1-sarA8

en el contexto de la estructura de la proteína .......................................................... 102

4.1.10. Selección de los alelos termosensible idóneos para estudios por

microscopía ............................................................................................................. 104

4.1.11. La inactivación condicional de SarA detiene la secreción al nivel del

retículo endoplasmático ........................................................................................... 104

4.1.11.1. Deslocalización de Sec23 de los sitios de salida del retículo

endoplasmático ........................................................................................... 104

4.1.11.2. Deslocalización de la GTPasa exocítica RabE y de la v-SNARE

SynA ........................................................................................................... 105

4.1.11.3. RerA, que continuamente cicla entre el retículo endoplasmático

y el Golgi, se encuentra desplazada hacia el retículo en el mutante sarA6 106

4.1.12. Desorganización del Golgi por inactivación de SarA ....................... 108

4.1.12.1. El Golgi temprano pierde su identidad y sus membranas se
relocalizan al retículo endoplasmático ....................................................... 108

4.1.12.2. Las cisternas del trans-Golgi (TGN) se desorganizan y disipan .. 109

4.1.13. La inactivación de SarA tiene consecuencias morfogenéticas:

formación de globos apicales........................................................................ 112
 4.1.13.1. Los globos formados por sarA6 tienen una pared celular
engrosada, una gran vacuola, gran cantidad de retículo endoplasmático y
múltiples núcleos ........................................................................................ 114

4.1.13.2. Reorganización del Golgi y restablecimiento del crecimiento

morfológicamente normal .......................................................................... 117

4.1.14. Búsqueda de mutantes revertientes de la termosensibilidad de sarA6 y

sarA8 ....................................................................................................................... 117

4.1.14.1. Mutaciones intragénicas supresoras de la termosensibilidad de

sarA6 .......................................................................................................... 118

4.1.14.2. Mutaciones intragénicas supresoras de la termosensibilidad de

sarA8 .......................................................................................................... 119

4.2. Capítulo II. Análisis sistemático de la famila Arf/Sar y de sus proteínas

reguladoras GEFs y GAPs ..................................................................................... 121
4.2.1. Identificación bioinformática de las proteínas de la familia Arf/Sar, de sus
GEFs y de sus GAPs ............................................................................................... 123

4.2.1.1. Identificación de las GTPasas de la familia Arf/Sar...................... 123

4.2.1.2. Identificación de las GEFs de las GTPasas de la familia Arf/Sar . 127

4.2.1.2.1. GEF de SarA: Sec12 ........................................................... 127

4.2.1.2.2. GEFs de las GTPasas Arf ................................................... 129

4.2.1.3. Identificación de las GAPs de las GTPasas de la familia Arf/Sar . 133

4.2.2. Deleción sistemática de los genes de la familia Arf, de sus GEFs y de sus
GAPs ....................................................................................................................... 137

4.2.2.1. Las GTPasas SarA, ArfA y Arl2 son esenciales............................ 137

4.2.2.2. Sec12, HypB y GeaA son GEFs de Arf/Sar esenciales ................. 138

4.2.2.3. Age1a es la única GAP de Arf esencial en Aspergillus nidulans .. 138

4.2.2.4. Estudio preliminar de gcs1Δ.......................................................... 138

4.3. Capítulo III. Supresión de la letalidad de hypBΔ (SEC7Δ).......................... 145

4.3.1. Caracterización de geaA1, un supresor extragénico de hypBΔ (sec7) ........... 147

4.3.2. La sustitución Tyr1022Cys altera la localización subcelular de GeaA ......... 150

4.3.3. La mutación geaA1 no altera el reclutamiento de CopA ............................... 153

4.3.4. Implicación de arl1 y arl3 en la supresión de hypB5 por geaA1................... 154

4.4. Capítulo IV. Localización subcelular y caracterización de CopA, una
subunidad esencial de COPI .................................................................................. 157
4.4.1. La construcción copA-gfp es funcional ......................................................... 159

4.4.2. CopA-GFP se localiza en estructuras citosólicas dinámicas polarizadas

hacia el ápice ........................................................................................................... 159

4.4.3. CopA-GFP se localiza mayoritariamente en el Golgi temprano, donde

colocaliza con SedV ................................................................................................ 160

4.4.4. CopA-GFP no colocaliza con mRFP-PHOSBP (TGN) .................................... 161

4.4.5. CopA-GFP se acumula en los agregados de Golgi temprano tras el

tratamiento con Brefeldina A .................................................................................. 163

4.4.6. CopA se deslocaliza al alterar la organización del Golgi temprano, pero no

al alterar el TGN ...................................................................................................... 164

4.5. Capítulo V. Implicación del reciclaje endocítico en el mantenimiento de

la polaridad de ChsB .............................................................................................. 167
4.5.1. La enzima ChsB es esencial .......................................................................... 169

4.5.2. Localización subcelular de ChsB: membrana apical, vesículas de secreción,

estructuras citosólicas y septos ................................................................................ 169

4.5.3. La localización polarizada de ChsB en la membrana plasmática se

mantiene por endocitosis ......................................................................................... 173

4.5.4. La ChsB intracelular se localiza en las cisternas más apicales del TGN....... 175

4.5.5. El transporte basípeto de ChsB requiere la función de la dineína ................. 177

4.5.6. ChsB reside en el TGN de manera transitoria ............................................... 179

4.5.7. La función de TRAPPII es necesaria para el tráfico de ChsB ....................... 180

4.5.8. ChsB se acumula en el TGN por inactivación de Sec7 ................................. 181

4.5.9. La mutación geaA1 restaura la localización silvestre de ChsB en el mutante

hypB5 ....................................................................................................................... 183

4.5.10. RabO (RAB1) se requiere para el tráfico de ChsB ...................................... 184

4.5.11. La ausencia de la subunidad Chs5 del exómero no altera el tráfico de

ChsB ....................................................................................................................... 186

4.5.12. Implicación de la actividad flipasa en el tráfico de ChsB ........................... 187

4.5.13. La sinaptobrevina SynA no se requiere para el tráfico de ChsB ................. 187

 4.5.14. ChsB recicla al TGN desde un compartimento endosomal localizado
aguas arriba del dominio RabB (RAB5) ................................................................. 187

4.5.15. El reciclaje de ChsB depende críticamente de RabC y GARP .................... 189

4.5.16. En hifas silvestres, la síntesis de novo de ChsB no parece contribuir en

gran medida a mantener sus niveles estacionarios .................................................. 191

4.6. Capítulo VI. Estudio de la ruta de secreción de una enzima soluble:

InuA ......................................................................................................................... 193
4.6.1. InuA es una inulinasa esencial para el crecimiento en inulina ...................... 195

4.6.2. Detección de las formas intracelulares y extracelulares de InuA mediante

su etiquetado con HA3 ............................................................................................. 196

4.6.3. Regulación de la expresión de InuA mediante el uso de sacarosa ................ 199

4.6.4. Las especies moleculares GB y GA son intracelulares ................................. 201

4.6.5. La diversidad de especies moleculares de InuA se produce por

N-glicosilación ........................................................................................................ 201

4.6.6. Análisis de la glicosilación basal en el retículo endoplasmático ................... 203

4.6.7. El bloqueo de la salida del retículo con sarA8 impide la secreción de InuA
y la formación de las especies GA .......................................................................... 205

4.6.8. La alteración de la interfaz retículo-Golgi por inactivación de RabO o SedV

bloquea la secreción de InuA y la síntesis de las especies GA ............................... 207

4.6.9. Implicación del aparato de Golgi temprano en la glicosilación de InuA ...... 208

4.6.10. Papel esencial del TGN en la secreción de InuA: HypB/Sec7 y

HypA/Trs120 ........................................................................................................... 210

4.6.11. La integridad de los endosomas tempranos es un requisito para la

exocitosis de InuA ................................................................................................... 211

4.7. Capítulo VII: Análisis de la ruta de secreción de una proteína anclada a

GPI: EglC ................................................................................................................ 215
4.7.1. Análisis bioinformático de las proteínas ancladas a GPI en Aspergillus
nidulans ................................................................................................................... 217

4.7.2. Etiquetado fluorescente de EglC y GelE ....................................................... 220

4.7.3. Las quimeras fluorescentes de EglC y GelE se localizan en la periferia

celular ...................................................................................................................... 222
 4.7.4. La expresión de EglC-GFP-GPI bajo el promotor gpdAmini mejora su señal
fluorescente ............................................................................................................. 223

4.7.5. Expresión regulable de EglC-GFP-GPI mediante integración del gen

quimérico en el locus inuA ...................................................................................... 224

4.7.6. Análisis del patrón electroforético de EglC-GFP-GPI .................................. 225

4.7.7. Estudio de la ruta de exocitosis de EglC ....................................................... 226

4.7.7.1. Visualización de EglC-GFP-GPI acumulado en el retículo

endoplasmático por efecto de sarA6 ........................................................... 226

4.7.7.2. Bloqueo de EglC en estructuras intracelulares por inactivación de

SedV (Sed5)................................................................................................ 229

4.7.7.3. TRAPPII es necesario para el tráfico de EglC, mientras que

RabD (Sec4) regula su distribución en la superficie celular....................... 230

4.7.7.4. EglC no necesita endosomas tempranos funcionales para su

exocitosis .................................................................................................... 232

5. DISCUSIÓN __________________________________ 235

5.1. Bloqueo condicional del tráfico de COPII y localización de COPI ............. 237

5.2. Potencial morfogenético de la regulación de la salida del RE ..................... 238

5.3. Modelo de maduración de cisternas .............................................................. 238

5.4. Caracterización general de la familia Arf/Sar y de sus reguladores .......... 240

5.5. GeaA1 mantiene el crecimiento en ausencia de HypB ................................. 241

5.6. Cartografiado del tráfico de tres cargos de la ruta secretora: ChsB, InuA
y EglC ..................................................................................................................... 243
5.6.1. La ruta de reciclaje endocítico de ChsB ........................................................ 244

5.6.1.1. El requerimiento de dineína ........................................................... 245

5.6.1.2. El transporte de ChsB desde los endosomas al TGN mediado

por RabC/GARP ......................................................................................... 247

5.6.2. El tráfico y las modificaciones postraduccionales de InuA y EglC............... 247

5.6.2.1. La N-glicosilación de InuA ........................................................... 248

5.6.2.2. Las modificaciones postraducionales de EglC .............................. 249

5.6.2.3. La parte común de las rutas de exocitosis de InuA y EglC ........... 250

5.6.2.4. La rama específica de InuA en la ruta secretora ............................ 250

 5.6.2.5. La ruta directa de secreción de EglC: ¿secreción “basolateral”?... 254

5.7. Discusión general y perspectivas de futuro ................................................... 255

6. CONCLUSIONES _____________________________ 257

7. BIBLIOGRAFÍA ______________________________ 261
RESUMEN
 Resumen

INTRODUCCIÓN

La ruta secretora es un proceso celular por el que determinadas proteínas maduran

postraduccionalmente y son enviadas a los endosomas, al exterior celular o distribuidas en la
membrana plasmática. Esta ruta comienza con la entrada de las proteínas recién sintetizadas al
retículo endoplasmático (RE), donde se pliegan y sufren modificaciones postraduccionales,
como la N-glicosilación [1] o el anclaje a glicosil fosfatidilinositol (GPI) [2]. A continuación las
proteínas (cargos) viajan desde el RE al aparato de Golgi en vesículas recubiertas por el
complejo proteico COPII (coat protein complex-II) [3]. Los llamados factores de anclaje o
tethering las acercan a las cisternas en formación y la fusión de las vesículas con las cisternas
ocurre gracias a la función de proteínas SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor
attachment protein receptor). En el Golgi las cadenas de N-oligosacáridos se modifican y
extienden [4, 5]. El aparato de Golgi es un conjunto de cisternas que organizan el tráfico
intracelular, cuya identidad y funciones subyacentes están controladas por GTPasas pequeñas de
la familia Rab [6] y de la familia Arf / Sar [7, 8]. Estas enzimas se reclutan a la cara citosólica
de las membranas del Golgi al cargarse con GTP y se inactivan y liberan de dicha membranas al
hidrolizar el GTP. Estos dos eventos de carga e hidrólisis están regulados por los factores
intercambiadores de nucleótidos de guanina (GEF) y por las proteínas estimuladoras de la
actividad GTPásica (GAP), respectivamente. Cada GTPasa recluta un conjunto de proteínas
efectoras (factores de tethering, proteínas de cubierta y proteínas GEFs y GAPs, entre otros) a
través de los cuales se ejecutan diversas funciones. Después de pasar por las cisternas del Golgi
temprano o cis-Golgi, el cargo llega al Golgi tardío o trans-Golgi (TGN). Desde el TGN, el
cargo, posiblemente concentrado en subdominios especializados [9], es reconocido y enviado a
su destino final (los endosomas o la membrana plasmática) [10] en túbulos o en vesículas. Las
vesículas secretoras pueden dirigirse a una región concreta de la membrana plasmática, como
por ejemplo en los casos de las rutas de exocitosis apical o basolateral en células epiteliales [11]
o en la secreción apical en hongos [12]. También se ha demostrado que existen proteínas
específicas que llegan a la membrana plasmática o al exterior celular tras su paso por
endosomas [13]. En resumen, las proteínas sintetizadas y modificadas en el RE viajan al aparato
de Golgi, donde maduran y son clasificadas para su envío a su destino final, que puede ser,
principalmente, el exterior celular, la membrana plasmática o el sistema endosomal.

Por último, el citoesqueleto juega un papel importante en la ruta secretora. En

mamíferos y hongos filamentosos los microtúbulos y los cables de actina cooperan en el tráfico
intracelular. Sin embargo, en S. cerevisiae, la exocitosis requiere únicamente cables de actina
[14]. Las vesículas secretoras se adaptan mediante Rabs, directamente o a través de sus

Página 3
Resumen
efectores, a los motores (dineína y kinesina-1 para microtúbulos, miosina-5 para actina) que les
permiten desplazarse a lo largo de los filamentos del citoesqueleto [14, 15].

Aspergillus nidulans es un organismo modelo del estudio de la ruta secretora [16, 17].
Se trata de un hongo filamentoso que crece exclusivamente por extensión apical gracias a la
fusión con el ápice de sus hifas de vesículas de secreción, lo que aporta las membranas
requeridas para el crecimiento celular y las enzimas necesarias para la síntesis de pared. El
modo de crecimiento polarizado de las hifas y su dependencia de la exocitosis representan una
ventaja experimental, ya que las mutaciones que perturban la exocitosis alteran el
establecimiento de la polaridad de crecimiento o lo imposibilitan, lo que provoca una alteración
morfológica en la región apical de las hifas [18].

OBJETIVOS
Los principales objetivos de esta tesis fueron:

1. Desarrollar herramientas genéticas para bloquear el tráfico de las vesículas COPII desde el
retículo endoplasmático al aparato de Golgi y determinar la influencia de este tráfico en la
organización del aparato de Golgi y la secreción.

2. Estudiar la relación funcional existente entre el Golgi temprano y el trans-Golgi a través de

los reguladores (GeaA/Gea1 y HypB/Sec7) y los efectores (el complejo proteico COPI) de Arf1.

3. Realizar una caracterización básica de las GTPasas de la familia Arf/Sar y de sus proteínas
reguladoras.

5. Determinar la ruta de exocitosis y los mecanismos por los cuales ciertas proteínas integrales
de membrana presentan una localización polarizada en el casquete apical de las hifas.

6. Determinar las diferentes etapas de las rutas de exocitosis de una proteína soluble y de una
proteína anclada a glicosil fosfatidilinositol.

Página 4
 Resumen

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

1. Bloqueo condicional del tráfico de COPII

Seleccionamos mediante mutagénesis al azar un total de 8 alelos termosensibles del gen
esencial sarA, que codifica la GTPasa que controla la formación de vesículas COPII, con el
objetivo de detener condicionalmente el tráfico de vesículas COPII desde el RE al aparato de
Golgi. Estas mutaciones (que denominamos sarA1-sarA8) causan una disminución de los
niveles de SarA con el incremento de temperatura, lo que sugiere que las cepas termosensibles
obtenidas expresan variantes mutantes de SarA que, a temperatura restrictiva, pierden su
conformación nativa y son degradadas por los sistemas de control de calidad. Nuestro propósito
era bloquear la formación de las vesículas COPII y visualizar, mediante microscopía de
fluorescencia in vivo, el efecto causado en los diferentes compartimentos exocíticos utilizando
proteínas fluorescentes. Dado que nuestro microscopio admite una temperatura máxima en la
pletina de 37-39ºC, debíamos seleccionar mutaciones termosensibles adecuadas a esta
limitación. Los mutantes sarA6 y sarA7 tienen un gran defecto en el crecimiento a 37ºC,
mientras que el resto de mutantes crecen bien a esta temperatura (sarA1, sarA2, sarA3 y sarA8)
o tienen un crecimiento deficiente a temperaturas incluso menores (sarA4 y sarA5). De entre
sarA6 y sarA7 elegimos sarA6 porque presenta una única mutación de cambio de sentido, a
diferencia de sarA7, y por tanto conocemos la sustitución concreta que causa la
termosensibilidad.

Primero, estudiamos el reclutamiento de COPII a los sitios de salida del retículo (ERES)
y comprobamos que en el mutante sarA6 a 37ºC los ERES se desorganizan formando grandes
agregados, como se ha determinado en otros mutantes que impiden la formación de vesículas
COPII [19, 20]. Una vez comprobado que la formación de vesículas COPII estaba alterada,
comprobamos que la exocitosis estaba bloqueada, al determinar la deslocalización de la
membrana plasmática de la SNARE SynA. Por otro lado determinamos que RerA, una proteína
que cicla continuamente entre el RE y el Golgi, se encontraba totalmente desplazada hacia el RE
en el mutante sarA6 a 37ºC, lo que indica que el tráfico desde el RE al Golgi estaba bloqueado.
Una vez establecido que sarA6 impide la adecuada salida de proteínas del RE, estudiamos su
efecto en el aparato de Golgi. Mediante microscopía de fluorescencia determinamos que el
aparato de Golgi se desorganiza en tan sólo 10-30 minutos después de la inactivación de SarA.
Esta desorganización la hemos visualizado por microscopía de fluorescencia in vivo, al observar
proteínas tanto periféricas (CopA, subunidad esencial de COPI, y PHOSBP, que reconoce Arf1 y
PI4P) como integrales de membrana (las t-SNARE del Golgi SedV y TlgB). Hemos demostrado
que el aporte continuo de membranas desde el RE al Golgi es una condición indispensable para
la organización y el mantenimiento de este último. Estos resultados son difíciles de reconciliar

Página 5
Resumen
con el modelo de cisternas estables y apoyan, en cambio, el modelo de maduración de cisternas
[21]. Además, la desorganización del Golgi tiene consecuencias diferentes sobre las membranas
del Golgi temprano y del TGN, ya que el primero se reabsorbe por el RE, mientras que el TGN
se disipa en el citosol. Este resultado es consistente con el hecho de que el Golgi temprano y el
Golgi tardío o TGN presentan diferencias composicionales y funcionales [22, 23]. Finalmente,
determinamos que la inhibición crónica de la salida del RE tiene consecuencias morfogenéticas,
ya que provoca la formación de un gran globo de ~10 µm de diámetro con una gruesa pared de
quitina en la región apical de las hifas.

2. Análisis sistemático de la familia Arf / Sar y de sus proteínas reguladoras GEF y

GAP
Mediante el análisis sistemático de las GTPasas de la familia Arf/Sar y de sus proteínas
reguladoras GEFs y GAPs identificamos, clasificamos y delecionamos, en A. nidulans, los
integrantes de dichas familias. Las características que estas GTPasas comparten con sus
homólogas en S. cerevisiae y humanos ponen de manifiesto el alto grado de conservación de
estos interruptores moleculares. La deleción de los genes que las codifican mostró una alta
proporción de genes esenciales, la mayoría de los cuales también son esenciales en S.
cerevisiae, lo que indica la conservación de sus funciones en eucariotas.

3. Supresión de la letalidad de hypBΔ (SEC7Δ)

HypB es una proteína GEF de Arf1 que se localiza en el TGN y es ortóloga de Sec7p y
BIG1/BIG2 en S. cerevisiae y mamíferos, respectivamente [24]. Es decir, HypB activa a Arf1
en el TGN. hypB5 es un alelo termosensible de hypB que impide el crecimiento a 42ºC [25].
Mediante mutagénesis con ultravioleta de una cepa hypB5 seleccionamos un revertiente
extragénico capaz de crecer a 42ºC. Por mapeo genético determinamos que el fenotipo de
supresión se encontraba ligado al gen AN0112, que denominamos geaA, el cual codifica la
putativa GEF de Arf1 en el Golgi temprano (Gea1p en S. cervisiae, GBF en mamíferos).
Secuenciamos geaA en la cepa revertiente y descubrimos una mutación que provoca la
sustitución Tyr1022Cys en GeaA (alelo geaA1, proteína mutante GeaA1). Posteriormente
demostramos que geaA1 es efectivamente causante de la supresión y que, de hecho, también
suprime la letalidad que causa hypBΔ. Tyr1022 está localizada en un motivo conservado Ser-Ω-
ϕ, presente en la subfamilia Gea/GBF (donde Ω es un aminoácido aromático y ϕ un residuo
hidrofóbico) y provoca que GeaA1 se redistribuya, en parte, a la región apical de la membrana
plasmática. El hecho de que una sustitución en GeaA permita el crecimiento fúngico en

Página 6
 Resumen
ausencia de HypB es de gran importancia, ya que GeaA y HypB son las dos únicas GEFs del
aparato de Golgi esenciales para el crecimiento. En cualquier caso, en el futuro será necesario
investigar en profundidad tanto el mecanismo molecular por el que Tyr1022Cys relocaliza
GeaA1 como el mecanismo de supresión subyacente.

4. Localización subcelular y caracterización de CopA, una subunidad esencial de

COPI
CopA es la subunidad α del complejo COPI de A. nidulans [26]. Para expresar una
versión fluorescente de CopA a niveles fisiológicos reemplazamos el gen copA residente por
una variante que codifica la proteína de fusión CopA-GFP, que representa la única fuente de
CopA en la cepa manipulada. CopA-GFP se localiza en estructuras polarizadas. Mediante
estudios de colocalización con mCherry-SedV (marcador del Golgi temprano) y mRFP-PHOSBP
(marcador del TGN), demostramos que dichas estructuras correspondían a cisternas del Golgi
temprano. Esta localización mayoritaria de CopA en el Golgi temprano subraya las diferencias
entre ambas partes del Golgi y es consistente con una mayor implicación de COPI en el Golgi
temprano, como previamente se había sugerido [27].

5. Cartografiado del tráfico de tres cargos de la ruta secretora: ChsB, InuA y EglC
En la última parte de esta tesis investigamos el tráfico de tres proteínas diferentes.
Primeramente, estudiamos la quitina sintasa integral de membrana ChsB, una proteína esencial
encargada de la síntesis de quitina en los sitios de extensión apical de las hifas [28]. En segundo
lugar, investigamos la exoglucanasa EglC, que es una proteína anclada a GPI (PA-GPI). En
tercer lugar, estudiamos la ruta de secreción de la inulinasa InuA, proteína soluble cuya
expresión se induce con sacarosa o inulina. En S. cerevisiae se habían descrito diferencias en las
rutas de exocitosis para enzimas solubles, PA-GPI y proteínas transmembrana [29-33]. Además,
existía evidencia adicional en mamíferos de que las rutas de exocitosis de distintos tipos
proteicos divergen [34, 35]. En resumen, tratamos de responder a la siguiente pregunta: ¿existen
diferentes rutas de exocitosis para proteínas con diferente estructura y función fisiológica? Al
final de este resumen, se trata de dar una respuesta razonada a la pregunta, a la luz de los
resultados de esta tesis.

Página 7
Resumen
5.1. La ruta de reciclaje endocítico de ChsB

Para visualizar ChsB reemplazamos el gen chsB silvestre con transgenes que expresasen
GFP-ChsB o mCherry-ChsB y comprobamos que el etiquetado no afectó a la función esencial
de ChsB. Mediante esta estrategia visualizamos ChsB en la región apico-proximal de la
membrana plasmática, formando un casquete semiesférico en la punta de cada hifa, donde
colocalizó con la SNARE SynA. A través de múltiples abordajes confirmamos que la polaridad
de ChsB en la membrana plasmática requiere de su endocitosis en un anillo subapical. Por otro
lado, ChsB también se localizó en el Spitzenkörper y en estructuras intracelulares.
Comprobamos, mediante colocalización con los marcadores fluorescentes pertinentes, que estas
estructuras intracelulares corresponden a las cisternas más apicales del TGN y no coinciden con
las cisternas del Golgi temprano. La presencia de ChsB en el TGN era transitoria ya que, como
cuantificamos, el tiempo medio de residencia de ChsB en el TGN fue de 58 ± 4 segundos (±
desviación estándar).

Hipotetizamos que ChsB viaja por endocitosis desde la membrana plasmática a las
cisternas del TGN en un proceso de reciclaje endocítico. Para comprobar si ChsB requería un
transporte activo sobre microtúbulos para llegar al TGN utilizamos nudA2 y nudA5, dos
mutantes termosensibles de nudA, que codifica la cadena pesada de la dineína [15]. En ambos
mutantes el reciclaje de ChsB se detuvo al incrementar la temperatura del cultivo y ChsB se
acumuló en un compartimento subapical intracelular que presentaba identidad endosomal,
puesto que se marcó con el trazador endocítico FM4-64. En su conjunto, los resultados indican
que ChsB es endocitada en el anillo subapical de endocitosis y que viaja desde compartimentos
endosomales al TGN en un proceso de reciclaje endocítico en el que participa la dineína.

¿Qué ruta sigue ChsB para volver desde el TGN a la membrana plasmática? En
Aspergillus nidulans, las cisternas del TGN, maduran a carriers exocíticos al adquirir la GTPasa
RabEYpt31 [36]. Hipotetizamos que ChsB utilizaría esta ruta. Dada la dificultad técnica de co-
visualizar RabE y ChsB nos centramos en un abordaje genético. hypA1 es un alelo
termosensible de hypA, gen esencial que codifica Trs120, una de las subunidades específicas de
TRAPPII necesaria para la activación de RabE [37]. Tras 25 minutos del cambio de la
temperatura del cultivo a 37ºC ChsB desapareció de la membrana plasmática en la cepa hypA1 y
se acumuló en estructuras intracelulares, lo que indica que RabE se requiere para el tráfico de
ChsB a la membrana plasmática. A continuación, demostramos que la inactivación de HypB
(GEF de Arf1 en el TGN) provoca que ChsB se acumule en estructuras internas con identidad
de TGN. Estos resultados demuestran que ChsB viaja por una ruta de reciclaje indirecto, a
través del TGN. Finalmente, para investigar la maquinaria molecular encargada de transportar
ChsB desde el compartimento endosomal hasta el TGN, nos centramos en la GTPasa
RabC/RAB6/Ypt6 [38] y en el complejo de tethering GARP (el ortólogo de RabC en mamíferos

Página 8
 Resumen
y levaduras recluta a GARP a las membranas del Golgi para mediar el transporte desde los
endosomas al Golgi [39]). Tanto rabCΔ como la deleción de vps52 (Vps52 es una subunidad de
GARP) provocaron la deslocalización de ChsB del casquete polar y desviaron su tráfico a las
vacuolas, lo que es indicativo de fallo en el reciclaje desde los endosomas al TGN.

En conclusión, hemos demostrado que la localización de ChsB en la membrana apical

de las hifas se mantiene por un reciclaje endocítico que requiere la endocitosis de ChsB en la
región subapical de la membrana, su reciclaje desde endosomas al TGN (mediado por la
dineína, RabC y GARP) y su vuelta a la membrana plasmática desde el TGN (lo que requiere
HypB y Trs120). Por tanto, la ruta de reciclaje de ChsB es similar a la seguida por Snc1 en S.
cerevisiae, la cual requiere Ypt6 (RabC en A. nidulans) y GARP [40]. Es importante subrayar
que el tráfico de ChsB a la membrana plasmática es independiente del exómero.

5.2. Estudio de la ruta de secreción de InuA

La inulinasa InuA es una enzima soluble que se secreta al exterior celular, donde
degrada el polisacárido inulina. Esta enzima sufre N-glicosilaciones en su viaje al exterior
celular que en este trabajo hemos aprovechado para determinar si InuA se encontraba bloqueada
en el RE o había sido modificada por las enzimas de glicosilación del aparato de Golgi. Los
resultados de esta tesis demuestran que InuA viaja desde el RE al Golgi en vesículas COPII,
donde se fusionan en un proceso que requiere la SNARE SedV y la GTPasa RabO, como
demuestra la inhibición de la secreción de InuA en los mutantes termosensibles de SarA, SedV
y RabO. Los resultados indican que InuA llega desde el Golgi temprano al TGN, dado que no se
exocita si se inactiva HypB (la GEF de Arf1 en el TGN). Sin embargo, el resultado más
destacable fue que RabB, el regulador maestro de los endosomas tempranos, y uno de sus
efectores (CORVET/Vps33) son esenciales para la secreción de InuA. Por el contrario, la
integridad de los endosomas tardíos y las vacuolas no es necesaria para su exocitosis. En S.
cerevisiae se ha descrito una ruta de secreción dependiente de endosomas [29, 30, 33]. Aunque
presenta características diferentes, consideramos plausible que InuA se secrete por una ruta
similar a la descrita en levadura y diferente a la ruta que toman EglC y ChsB desde el TGN
(EglC y ChsB se exocitan eficientemente en ausencia de RabB). Podría existir una secreción
directa de InuA desde los endosomas a la membrana plasmática, ya que es un proceso que se ha
descrito previamente en el reciclaje endocítico [41] y en la secreción apical [13] y basolateral
[34, 35, 42] de mamíferos.

Página 9
Resumen
5.3. Análisis de la ruta de secreción de EglC, una proteína anclada a GPI

Marcamos EglC con GFP en un punto “interno” de su secuencia proteica para no alterar
el péptido señal ni la señal de anclaje del GPI. EglC-GFP-GPI se localiza en la superficie celular
de manera “antipolarizada”, es decir práctica o totalmente excluida de las regiones apicales de
las hifas (salvo del Spitzenkörper). EglC-GFP-GPI, al igual que InuA, sufre modificaciones
postraduccionales que nos permitieron diferenciar las especies moleculares atrapadas en el RE
de aquéllas que habían transitado por el Golgi, además de que pudimos visualizar dichas
acumulaciones por microscopía de fluorescencia. A diferencia de InuA, EglC parece seguir una
ruta más directa de secreción que no implica a los endosomas. Además de requerir el tráfico en
vesículas COPII y la llegada al Golgi, como demuestra la acumulación de EglC en el RE en el
mutante sarA6, nuestros resultados sugieren que desde el TGN EglC llega a la superficie celular
en vesículas secretoras RabE, ya que EglC-GFP-GPI se acumula en estructuras intracelulares al
inactivar Trs120, subunidad de TRAPPII necesaria para la activación de RabE [36, 37]. En una
cepa silvestre EglC-GFP-GPI, además de localizarse en la superficie celular, también se
encuentra en el Spitzenkörper. Proponemos un modelo hipotético de tráfico por el cual EglC se
enviaría en vesículas RabE al Spitzenkörper y, desde éste (que actuaría como centro organizador
del tráfico), las vesículas RabE cargadas con EglC viajarían hacia regiones apico-distales, donde
EglC se exocitaría, dando cuenta de su localización “antipolarizada”. Esta hipotética ruta de
secreción sería semejante a la secreción basolateral que ocurre en células epiteliales de
mamífero [35] y explicaría el hecho de que el ~24% de las vesículas RabE que llegan al
Spitzenkörper se desplazan después en sentido basípeto, propulsadas por dineína sobre los
microtúbulos [15, 36].

6. Discusión general y perspectivas de futuro

En esta tesis hemos establecido que el aparato de Golgi es un orgánulo dinámico y
transitorio que se encuentra relacionado íntimamente con el RE, lo que refuerza los resultados
de investigaciones con levaduras [43, 44] y células de mamífero [45, 46]. Los resultados
obtenidos también subrayan las diferencias entre el Golgi temprano y el TGN; sin embargo las
proteínas GEF esenciales del Golgi temprano (GeaA) y del TGN (HypB) son, hasta cierto
punto, intercambiables, puesto que una sustitución en GeaA permite el crecimiento de A.
nidulans en ausencia de HypB. Por otro lado, la caracterización básica de las GTPasas de la
familia Arf/Sar y de sus proteínas reguladoras demuestra el alto grado de conservación de estos
interruptores moleculares.

Los resultados obtenidos a partir de la investigación del tráfico de ChsB, InuA y EglC
muestran las diferencias en la ruta que cada uno de estos cargos sigue para localizarse
adecuadamente. La localización de ChsB en la membrana apical se mantiene por un reciclaje

Página 10
 Resumen
endocítico indirecto que implica su transporte desde un compartimento endosomal
independiente de RabB al TGN en un proceso mediado por dineína, RabC y GARP. EglC, por
su parte, realiza una ruta que depende del transporte al aparato de Golgi de dicha enzima recién
sintetizada en el RE y de su exocitosis, hipotéticamente basolateral, en vesículas RabE. Por
último, InuA realiza una ruta de secreción “indirecta” que está supeditada a la integridad de los
endosomas tempranos, lo que sugiere que transita por éstos antes de secretarse. Estos resultados
sugieren que en A. nidulans podrían existir diferentes rutas de tráfico intracelular que
permitiesen la coordinación entre la obtención de nutrientes del medio extracelular, el
crecimiento por extensión apical y la síntesis de pared celular.

CONCLUSIONES
1. La α-hélice C-terminal de SarA es clave para su función/estabilidad.

2. La inactivación de SarA desorganiza los sitios de salida del retículo (ERES) y

provoca la agregación de Sec23.

3. El bloqueo de la formación de las vesículas COPII provoca la desorganización del

aparato de Golgi y la parada de la extensión apical. Este efecto es sólo compatible con el
modelo de maduración de cisternas.

4. La desorganización del aparato de Golgi causada por el bloqueo del tráfico de salida
del retículo endoplasmático (RE) provoca la reabsorción de las membranas del Golgi temprano
en el RE y la disipación de las membranas del trans-Golgi (TGN).

5. El bloqueo del tráfico COPII tiene consecuencias morfogenéticas en la región apical

de las hifas de Aspergillus nidulans, que se traducen en la formación de globos apicales de ~10
µm de diámetro.

6. Las proteínas de la familia Arf/Sar y sus reguladores realizan funciones esenciales y

se encuentran altamente conservadas en A. nidulans con las de levaduras y humanos.

7. COPI y GeaA se localizan predominantemente en el Golgi temprano, siendo apenas

detectables en el TGN.

8. Las proteínas de la familia GBF/Gea contienen un motivo serina-residuo aromático-

residuo hidrofóbico (SΩϕ) universalmente conservado en eucariotas. La sustitución Tyr1022Cys
en el motivo SΩϕ de GeaA provoca la relocalización parcial al TGN y a la región apical de la
membrana plasmática.

9. La sustitución Tyr1022Cys en el motivo conservado SΩϕ de GeaA permite la

exocitosis y el crecimiento en ausencia de HypB.

Página 11
Resumen
10. La quitina sintasa ChsB se mantiene polarizada en el casquete apical de la
membrana plasmática mediante una ruta indirecta de reciclaje endocítico que comporta su
endocitosis en un anillo subapical de parches de actina, su viaje desde un compartimento
endocítico al TGN mediado por dineína, RabC y el complejo GARP, y su salida del TGN en
vesículas secretoras, de manera dependiente de HypB y Trs120.

11. La GTPasa RabO, que colocaliza con ChsB en el Spitzenkörper, es crítica para que
ChsB se localice en la membrana plasmática.

12. La ruta de reciclaje endocítico de ChsB es independiente de RabBRAB5 y del

exómero.

13. InuA es una inulinasa que se secreta al exterior celular por una ruta que requiere la
formación de las vesículas COPII, su llegada al aparato de Golgi, su paso por el TGN y la
funcionalidad de los endosomas tempranos, pero no de los endosomas tardíos.

14. Las proteínas ancladas a glicosil fosfatidilinositol (GPI) EglC y GelE presentan una
distribución “antipolarizada” en la superficie de las hifas.

15. La proteína anclada a GPI EglC se exocita por una ruta que implica la salida del RE
en vesículas COPII, su paso por el Golgi temprano y el TGN y su exocitosis directa desde el
TGN a la membrana plasmática de manera dependiente de Trs120.

16. En ausencia de RabDSec4 EglC se polariza al casquete apical.

Página 12
SUMMARY
 Summary

SUMMARY
INTRODUCTION
The secretory pathway is a cellular process that is used to package certain protein
molecules that are synthesized inside of the cell and are shipped out of the cell, to the plasma
membrane (PM) or to the endosomes. Initially, newly synthesized proteins enter the
endoplasmic reticulum (ER) by a process known as translocation. In the ER, cargo proteins are
properly folded and some of them undergo N-glycosylation [1] or acquire a covalently attached
glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchor [2]. Next, cargoes exit the ER in COPII (coat protein
complex-II) vesicles bound for the Golgi apparatus [3]. The initial interaction of this vesicle
with a nascent cisterna of the Golgi is mediated by tethering factors and membrane fusion is
facilitated by SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)
proteins. Once in the Golgi the N-glycans bound to proteins are modified and extended [4, 5].
The Golgi complex consists of a network of compartments or cisternae that organize
intracellular traffic. The identity and functions of these cisternae are determined by small
GTPases; mainly members of the Rab [6] family or the Arf/Sar family [7, 8]. These enzymes
are recruited to the cytosolic face of the Golgi membrane and thus activated upon GTP binding,
and become soluble and inactive by hydrolysis of the GTP. GTP hydrolysis is stimulated by
interaction with a GTPase-activating protein (GAP) whereas GDP to GTP exchange is
stimulated by GTPase exchange factors (GEFs). Each GTPase recruits specific effectors to the
Golgi apparatus, such as tethering factors, coat complexes and GEF or GAP proteins, each of
them performing diverse functions. Cargo molecules traverse the Golgi eventually reaching the
late Golgi (also known as trans-Golgi, TGN) where proteins and lipids are sorted into distinct
transport carriers (such as tubules or vesicles) that are targeted to various destinations, such as
the endosomes or the PM. Secretory vesicles can be delivered to specific regions of the PM, as
it happens in polar secretion in fungi [12] or in the apical or basolateral exocytosis that takes
place in epithelial cells [11]. It is also known that at least one branch of the yeast secretory
pathway transits through endosomes before reaching the cell surface [13]. In summary, newly
synthesized proteins are modified in the ER before reaching the Golgi apparatus, where they
acquire more posttranslational modifications and are sorted to their final destinations:
extracellular space, PM and endosomes.

Cytoskeleton plays an important role in the secretory pathway. In mammals and

filamentous fungi microtubules and actin cables cooperate to facilitate intracellular movement
of transport carriers. However, yeast cells do not seem to use microtubules for trafficking
functions, as they only require actin cables for efficient exocytosis [14]. Secretory vesicles are

Página 15
Summary
attached to cellular motors (dynein and kinesin-1 for microtubule interactions and myosin-5 to
interact with actin) by Rabs, directly or through their effectors, [14, 15].

The filamentous fungus Aspergillus nidulans is a well-suited model organism to study

the secretory pathway [16, 17]. Hyphal growth is driven exclusively by apical extension. Cell-
wall synthesizing enzymes and the membrane required for cell expansion are delivered to the
apex by exocytosis. This mode of growth and its heavy dependence on exocytosis represent an
important experimental advantage, because mutations impairing exocytosis delay or preclude
polarity establishment or result in a tip swelling [18].

OBJECTIVES
These were the main objectives of this thesis:

1. To develop genetic tools in order to block COPII traffic from the endoplasmic reticulum to
the Golgi apparatus and to determine the effect of this traffic on secretion and Golgi
organization.

2. To investigate the functional relationship between early Golgi and trans-Golgi by studing the
Arf1 regulators (GeaA/Gea1 and HypB/Sec7) and effectors (COPI complex).

3. To perform a basic characterization of Arf/Sar GTPases and their regulators.

5. To determine the exocytic route and the underlying mechanisms by which certain
transmembrane proteins are polarized in the apical dome of hyphae.

6. To determine the different stages of the exocytic route followed by a soluble cargo and a
glycosylphosphatidylinositol anchored protein.

RESULTS AND DISCUSSION

1. Conditional blocking of the COPII traffic

Following mutagenic PCR we selected 8 thermosensitive alleles of sarA encoding
SarASAR1, a conserved GTPase required for COPII vesicles biogenesis, in order to conditionally
impair COPII vesicles trafficking from the ER towards the Golgi apparatus. These mutations
caused a marked reduction in SarA levels at semi-restrictive temperatures, which indicates that
these SarA substituted proteins lost its conformation at high temperature and are degraded by

Página 16
 Summary
quality control systems. Our purpose was to block the formation of COPII vesicles to assess the
effects on the organization of the exocytic pathway. To that end, we studied the behaviour of
fluorescent protein markers of exocytic compartments. Because setting the microscope above
37-39ºC would damage it we had to choose the appropriate mutants. sarA6 and sarA7 strains
impair growth substantially at 37ºC, while sarA1, sarA2, sarA3 y sarA8 did not and sarA4 y
sarA5 mutants are affected even at 30ºC. We chose sarA6 because it resulted in just one
substitution in SarA.

We first studied whether sarA6 interferes with recruitment of COPII to endoplasmic

reticulum exit sites (ERES) and showed that ERES become disorganized by forming aggregates,
which has been described in other mutants that impair COPII vesicles formation [19, 20]. After
determining acute inactivation of ER exit we showed that SynA becomes cytosolic after the
temperature shift, which confirmed that exocytosis was arrested. Moreover RerA, which
continuously cycles between the ER and the Golgi, is displaced towards the ER by sarA6,
consistent with sarA6 preventing its exit from the ER. Once established that sarA inactivation
block ER exit, we studied its effects on the Golgi using integral (Golgi t-SNAREs SedV and
TlgB) and peripheral protein markers (CopA, a COPI subunit, and PHOSBP, that is recruited to
the late Golgi through coincidence detection of Arf1 and PtdIns4P). A rapid disorganization of
the Golgi apparatus was seen within 10-30 minutes after shifting sarA6 cells to 37ºC. We have
demonstrated that continuous transport of membranes from the ER to the Golgi is an
indispensable condition for Golgi biogenesis and organization. These results are incompatible
with the stable cisternae model, supporting instead cisternal maturation [21]. Moreover, Golgi
disorganization has different effects on early Golgi and TGN membranes, with early Golgi
membranes being reabsorbed by the ER and the TGN ones apparently dissipating. This result
underscores the asymmetry of Golgi organization [22, 23]. Finally, we determined the
morphogenetic potential of abrogating COPII traffic. Downregulation of ER exit causes the
formation of large balloons at hyphal tips, ~10 µm in diameter, delimited by a very conspicuous
layer of chitin.

2. Systematic analysis of the Arf/Sar family proteins and their regulators (GEFs
and GAPs)
To systematically analyze the Arf/Sar GTPases family and their regulatory proteins,
GEFs and GAPs, we identified, classified and deleted every member of these families in A.
nidulans. The shared characteristics of these proteins and their putative orthologs in S.
cerevisiae and humans revealed a high degree of conservation of these molecular switches.
Moreover, the deletion of their corresponding genes showed that a high proportion of them were

Página 17
Summary
essential genes, as they were in S. cerevisiae, which indicated functional conservation in
eukaryotes.

3. Sustainment of fungal growth in the absence of hypB (SEC7)

HypB is an Arf1-GEF that localizes the TGN (Sec7p and BIG1/BIG2 in S. cerevisiae
and mammals, respectively) [24]. hypB5 is a thermosensitive mutation that impairs growth at
42ºC [25]. After UV mutagenesis 40 revertant strains were selected for growth at 42ºC. In all
but one case, reversion occurred within hypB. Genetic mapping verified that this suppressor
mutation was linked to AN0112, encoding GeaA, an Arf1-GEF putatively located in the early
Golgi (Gea1p in yeast, GBF in mammals). Sequencing of this gene revealed the presence of a
missense mutation causing Tyr1022Cys substitution in GeaA (we named this mutant allele
geaA1, and GeaA1 to the mutant protein). We further demonstrated that geaA1 supresses hypB5
thermosensitivity and, indeed, geaA1 also supressed lethality caused by hypBΔ. Tyr1022 lies in
a previously unidentified Gea/GBF specific motif Ser-Ω-ϕ (where Ω indicated an aromatic and
ϕ an hydrophobic residue), causing GeaA1 redistribution towards the apex. The fact that GeaA
with a single substitution sustains growth in the absence of HypB is of great importante,
because GeaA and HypB are the only essential Arf1-GEF proteins. In any case, future research
addressing how the GeaA1 substitution has such an impact on its localization will be needed to
unveil the underlying suppression mechanism.

4. Subcellular localization and characterization of CopA, an essential subunit of

COPI
CopA corresponds to the α subunit of COPI in A. nidulans [26]. In order to express a
fluorescently tagged version of CopA at physiological levels we replaced the endogenous copA
gene with a copA version that encodes CopA-GFP, representing the only source of CopA in the
transformant strain. CopA-GFP localizes to polarized structures that correspond to early Golgi
cisternae, as determined by using mCherry-SedV as an early Golgi marker and mRFP-PHOSBP as
a TGN marker. This predominant location of CopA in early Golgi structures underlines de
Golgi apparatus asymmetry and is consistent with a main involvement of COPI in early Golgi,
as previously suggested [27].

5. Study of the exocytic pathway followed by three different cargoes: ChsB, InuA
and EglC
In the last part of this thesis we investigated the traffic of three different cargoes. Firstly,
we studied ChsB, an essential chitin synthase that is polarized to the apical dome, where
polarized growth takes place [28]. Secondly, we studied EglC, a GPI anchored exoglucanase.
Lastly, we tracked the secretory pathway of InuA a soluble extracellular inulinase.

Página 18
 Summary
In S. cerevisiae differences in the exocytosis of soluble enzymes, GPI-anchored proteins
and transmembrane proteins had been described [29-33]. Moreover, additional data described
different branches in the exocytic route for different cargoes in mammals [34, 35]. In summary,
we tried to address the following question: ¿are there different exocytic pathways for proteins
with different structure or physiological functions?

5.1. Endocytic recycling of ChsB

To track ChsB we tagged chsB endogenously to express N-terminal tagged fusion

proteins. gfp-chsB and mCherry-chsB strains grew like a wt one, indicating that this N-terminal
fusion proteins fulfil the physiological role of ChsB. ChsB can be seen at the Spitzenkörper
(SPK) and the PM, forming a conspicuous crescent at the tip and colocalizing with SynA, a
SNARE protein. We took several approaches to demonstrate that polarization of ChsB requires
its endocytosis in an endocytic collar located in a subapical region. In addition, ChsB localizes
to internal puncta, resembling Golgi cisternae. We studied the Golgi localization of ChsB with
the early Golgi SedV SNARE and with the TGN reporter PHOSBP. ChsB and PHOSBP showed
almost complete colocalization, whereas ChsB did not colocalize with SedV. Thus ChsB
localizes to the TGN. Moreover, most of ChsB localize to the most apical TGN cisternae and
resides at the TGN only transiently, 58 ± 4 sec S.D. The greater abundance of ChsB in the most
apical TGN cisternae suggested that retrograde transport connects the endosomal compartments
receiving traffic from the subapical collar with the TGN, and that such transport might involve
dynein. We investigated this possibility with two thermosensitive mutations, nudA2 and nudA5,
affecting the dynein heavy chain [15]. When nudA2 and nudA5 cells were shifted to 37ºC ChsB
delocalized to an intracellular aggregate at the tip region, at the expense of the PM pool. This
compartment in which ChsB stalls is readily accessible to the endocytic tracer FM4-64. Thus
the above results strongly indicate that traffic between endosome compartments to which
endocytosed ChsB arrives and the TGN involves dynein.

What pathway does ChsB recycling from the TGN to the PM follow to return to the
PM? In A. nidulans TGN membranes giving rise to secretory vesicles transit from Golgi to post-
Golgi identity following the recruitment of RabE mediated by its GEF, TRAPPII [36, 37]. The
observation that the acute inactivation of Trs120, a key component of TRAPPII, relocalizes
ChsB from the apical crescent to internal structures strongly suggests that ChsB follows this
RabE- dependent pathway. Next, we demonstrated that ChsB accumulates in membranes with
TGN identity after imposing a HypB/Sec7 block. Taken together all the above data strongly
indicated that the ChsB steady state localization at the tip crescent is maintained by endocytic
recycling through the HypB/Sec7-containing TGN.

Página 19
Summary
The Golgi-associated retrograde protein (GARP) complex is a key effector of
Rab6/RabC, mediating and tethering fusion between endosome-derived retrograde transport
carriers and the TGN [39]. Like rabC∆, vps52∆ diminished the amount of ChsB localizing to
the apical crescent at 28ºC, and did so to a similar extent than rabC∆. We shifted wt and vps52∆
cells to 37ºC and examined the fate of ChsB, using CMAC staining to detect late endosomes
and vacuoles. In rabC∆ and vps52∆ cells the internal ChsB pool was progressively displaced to
the abundant vacuoles that characterize these mutants, whereas localization to the apical
crescent was virtually abolished.

In conclusion, we demonstrated that ChsB polarization is maintained by an indirect

endocytic recycling pathway that requires ChsB endocytosis in the subapical collar of actin
patches, its transport from a sorting endosome to the TGN (mediated by dynein, RabC and
GARP) and its way back to the PM from the TGN, which requires HypB/Sec7 and Trs120.
Thus the cycling route followed by ChsB (and SynA) would be akin to that followed by Snc1 in
S. cerevisiae, which is Ypt6 (RabC)-dependent [40]. Finally it is important to highlight that
ChsB traffic is an exomer-independent process.

5.2. Study of the InuA secretory pathway

Inulinase InuA is a soluble enzyme that is secreted outside of the cell, where it degrades
the polymer inuline. This enzyme suffers N-glycosylation en route to be exocytosed. We have
taken advantage of this fact to determine if InuA was blocked in the ER or had yet entered the
Golgi. These thesis results demonstrate that InuA journeys from the ER to the Golgi apparatus
in COPII vesicles where they fuse in a SedV- and RabO-dependent manner, as shown by the
absence of secretion in SarA, SedV and RabO thermosensitive mutants. The results of this work
also show that the TGN is another stop in the InuA secretory pathway because InuA is not
secreted when HypB/Sec7 is inactivated. However, the most outstanding finding is that
RabB/RAB5, the major Rab acting in the early endosomes, and one of its effectors
(CORVET/Vps33) are essential for InuA secretion. On the contrary, late endosomes and
vacuole integrity is not a requirement for InuA exocytosis. It is known that in S. cerevisiae one
branch of the secretory pathway is endosome dependent [29, 30, 33]. We consider that the route
followed by InuA is similar to that one described in yeast and different from the pathway taken
by EglC and ChsB from the TGN (EglC and ChsB exocytosis do not require RabB). A direct
exocytosis of InuA from endosomes is a plausible explanation for this requirement as the
secretion directly from endosomes is a previously described process in endocytic recycling [41]
and in apical [13] and basolateral [34, 35, 42] secretion of mammals.

Página 20
 Summary
5.3. Tracking the secretory pathway of EglC, a GPI anchored protein

We tagged EglC with GFP in an internal position of the protein to avoid affecting the
N-terminal signal peptide and the C-terminal GPI anchor signal. EglC-GFP-GPI localized to the
cell surface in an “antipolarized” fashion, it is almost totally excluded from the most apical
regions of hyphae (except for its localization to the SPK). EglC-GFP-GPI, as InuA, is
posttranslationally modified, what allowed us to differentiate ER-trapped species from those
that reached the Golgi. As EglC was fluorescently tagged we could also visualize those internal
accumulations by fluorescence microscopy.

Unlike InuA, EglC seems to follow a more direct exocytic route that does not involve
early endosomes function. Apart from requiring COPII traffic and Golgi arrival, as shown by
EglC-GFP-GPI being accumulated in the ER in sarA6 cells, our results suggest that EglC exits
the TGN in RabE secretory vesicles because EglC-GFP-GPI accumulates in internal structures
after Trs120 inactivation, a TRAPPII subunit needed for RabE activation [36, 37].

The above results and the presence of EglC-GFP-GPI at the SPK led us to propose a
highly hypothetical model for EglC traffic. EglC would be carried in RabE secretory vesicles to
the SPK. Once in the SPK (that would be a secretion organizing centre) EglC/RabE vesicles
would travel basipetally where EglC would be exocytosed. This model would explain the
“basolateral” localization of EglC-GFP-GPI in the cell surface and the basipetal movement of
~24% RabE vesicles [15, 36]. This hypothetical route would be similar to the basolateral
secretion that takes place in mammalian epithelial cells [35].

6. General discussion and future perspectives

In this thesis we have established that the Golgi apparatus is a dynamic and transitory
organelle highly dependent on the ER, supporting previous finding in yeast [43, 44] and
mammals [45, 46]. Remarkable differences between early Golgi and TGN are also described in
this thesis; however, the essential early Golgi and TGN Arf-GEFs (GeaA and HypB,
respectively) are, to some extent, interchangeable because a substitution in GeaA bypass the
essential requirement of HypB. Additionally, the basic characterization of Arf/Sar GTPases and
their regulators showed a high degree of conservation of these molecular switches.

Finally we investigated the exocytic routes followed by three different cargoes: ChsB,
InuA and EglC. The results obtained from this study show the differences in the trafficking
pathway used by these cargoes. ChsB is polarized to the apical dome by indirect endocytic
recycling, such that the enzyme that diffuses away from the apex is internalized by the subapical
collar of actin patches, re-routed from endosomes to TGN cisternae in a dynein-, GARP- and
RabC-dependent manner and subsequently re-delivered to the apex. EglC travels through a

Página 21
Summary
pathway that involves ER exit, early Golgi and TGN function. Hypothetically EglC is finally
exocytosed far away from the apex in RabE secretory vesicles. Finally, InuA seems to follow a
different branch of the secretory pathway that requires early endosomes function, which
suggests that travels through endosomes before secretion.

These results suggest that different exocytic pathways coexist in A. nidulans that would
be essential for coordinating three key processes in the hyphal mode of life: nutrient uptake,
polar growth and cell wall synthesis.

CONCLUSIONS
1. The C-terminal α-helix of SarA is fundamental for its function/stability.
2. SarA inactivation disorganizes the endoplasmic reticulum exit sites (ERES) and
causes aggregation of Sec23.
3. The impairment of COPII vesicles formation disorganizes the Golgi apparatus and
arrests apical extension. This effect is only compatible with cisternal maturation.
4. Golgi apparatus disorganization caused by blocking COPII traffic leads to the
reabsorption of Golgi membranes by ER and to trans-Golgi (TGN) membranes dissipation.
5. COPII traffic impairment has morphogenetic consequences on the apical region of
hyphae, by forming apical balloons, circa ~10 µm in diameter.
6. The Arf/Sar family of proteins and their regulators perform essential functions and
are highly conserved in A. nidulans with respect to their yeast and human homologues.
7. COPI α subunit and GeaA mainly localizes to the early Golgi, being almost
undetectable in the TGN.
8. GBF/Gea family of proteins contains a universally conserved motif among
eukaryotes, serine / aromatic residue / hydrophobic residue (SΩϕ). Tyr1022Cys substitution in
this motif shifts GeaA localization towards the TGN and the apical plasma membrane.
9. Tyr1022Cys substitution in the conserved motif SΩϕ of GeaA allows exocytosis and
growth in the absence of HypB.
10. ChsB is polarized to the apical dome by indirect endocytic recycling, such that the
enzyme that diffuses away from the apex is internalized by the subapical collar of actin patches,
re-routed from endosomes to TGN cisternae in a dynein-, GARP- and RabC-dependent manner
and subsequently re-delivered to the apex in a process that requires HypB and Trs120.
11. RabO GTPase colocalizes with ChsB in the Spitzenkörper and is critical for ChsB
traffic to the plasma membrane.

Página 22
 Summary
12. Endocytic recycling of ChsB is RabBRAB5- and exomer- independent.
13. InuA is an inulinase that is secreted outside of the cell by a route that requires
COPII vesicle traffic, transit through Golgi apparatus and TGN and early endosomes function.
Late endosomes are not required for InuA secretion.
14- Glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchored proteins EglC and GelE display an
“antipolarized” distribution in the cell surface.
15. GPI-anchored protein EglC is exocytosed by a route that involves its exit from the
ER in COPII vesicles, its traffic through the early Golgi and the TGN. Finally it is exocytosed
directly from the TGN to the plasma membrane in a Trs120-dependent manner.
16. In the abscence of RabDSec4 EglC is polarized towards the apical dome.

Página 23
INTRODUCCIÓN
 Introducción
La ruta secretora es un proceso celular por el que determinadas proteínas maduran
postraduccionalmente y son enviadas al exterior de la célula o distribuidas en la membrana
plasmática. Por tramos intermedios de esta ruta también viajan las proteínas de la membrana o
del lumen del retículo endoplasmático (RE), del aparato de Golgi y del sistema endovacuolar. El
RE es la vía de entrada a la ruta secretora de las proteínas sintetizadas por los ribosomas
adheridos a este orgánulo (Figura I.1). Muchas de estas proteínas, entre ellas las proteínas
solubles, contienen, en su extremo N-terminal, un péptido señal que permite su entrada al RE:
este péptido señal es reconocido por un complejo multiproteico denominado translocón, que
forma un poro en la membrana del RE que permite la entrada de las proteínas, lo que ocurre
simultáneamente al corte por una proteasa del péptido señal antes citado [47]. Una vez en el
lumen del RE, las proteínas adquieren su conformación nativa con ayuda de chaperonas [48] y
sufren modificaciones postraduccionales. Estas modificaciones son, principalmente, la N y O-
glicosilación de algunos residuos de Asn o Ser/Thr, respectivamente; el corte de la señal C-
terminal de anclaje de glicosil fosfatidilinositol (GPI) y la subsiguiente unión covalente del GPI
en el sitio de corte; y, finalmente, la formación de puentes disulfuro. A continuación, las
proteínas que viajan en la ruta secretora (i.e. cargos) se incorporan en vesículas COPII, que
geman del RE y viajan al Golgi para fusionarse con sus cisternas (Figura I.1). Estas vesículas
están recubiertas por el complejo proteico COPII (coat protein complex-II), que recluta el cargo
y deforma físicamente la membrana del RE, promoviendo la formación de una vesícula que
contiene las proteínas que viajan al Golgi [49]. Las vesículas COPII se fusionan entre ellas o
con las cisternas del aparato de Golgi, una vez que los llamados factores de anclaje o de
tethering las acercan a la cisterna en formación. Las proteínas SNAREs median finalmente la
fusión de las membranas [50]. Existe un debate sobre si las cisternas del Golgi se forman de
novo por fusión de vesículas COPII o si las vesículas COPII se fusionan con cisternas
preexistentes. Este debate se concreta en dos modelos: de maduración de cisternas y de cisternas
estables (ver más adelante). En el aparato de Golgi, las cadenas de N-oligosacáridos se
modifican y extienden por enzimas residentes del Golgi y se producen O-glicosilaciones [4, 5,
51].

En mamíferos, el aparato de Golgi es un conjunto de cisternas apiladas y conectadas por

túbulos [52, 53], rodeado de vesículas próximas a las cisternas [54]. La identidad de las
cisternas del aparato de Golgi y sus funciones subyacentes están controladas por GTPasas
pequeñas de la familia Rab [6] y de la familia ARF (ADP ribosylation factor) / SAR (Secretion-
associated Ras-related protein) [7, 8]. Estas enzimas se activan y se reclutan a la monocapa
citosólica de las membranas del Golgi cuando se cargan con GTP, y se inactivan y liberan de la
monocapa al hidrolizar el GTP. Estos dos eventos están regulados por los factores
intercambiadores de nucleótidos de guanina (GEFs) y por las proteínas estimuladoras de la

Página 27
Introducción
actividad GTPásica (GAPs) correspondientes, respectivamente. Cada GTPasa recluta un
conjunto de proteínas efectoras (factores de anclaje o tethering, proteínas de cubierta y proteínas
GEFs y GAPs, entre otros), a través de los cuales se ejecutan diversas funciones, como por
ejemplo el reclutamiento del complejo de cubierta COPI, que media tráfico intra-Golgi y
retrógrado al RE [55]. Desde el Golgi, el cargo, posiblemente concentrado en subdominios
especializados [9], es reconocido y enviado en túbulos o en vesículas a su destino final (los
endosomas o a la membrana plasmática [10] (Figura I.1). En la salida de las proteínas del Golgi
también están implicados complejos de cubierta, como la clatrina o, hipotéticamente, el
exómero [56]. Además, el tráfico puede dirigirse a una región concreta de la membrana
plasmática, como por ejemplo en los casos de las rutas de exocitosis apical o basolateral en
células epiteliales [11] o en la secreción apical en hongos [12]. También se ha demostrado que
existen proteínas específicas que llegan a la membrana plasmática o al exterior celular tras su
paso por los endosomas [13]. En resumen, las proteínas sintetizadas y modificadas en el RE
viajan al aparato de Golgi, donde maduran y son clasificadas para su envío a sus destinos
finales, que son, principalmente, el exterior celular, la membrana plasmática y los endosomas.

Figura I.1. Rutas de tráfico intracelular en metazoos superiores. Se muestran la ruta secretora y el
tráfico a los endosomas. Las proteínas o cargos son sintetizados en el RE y, después de concentrarse
en los ERES, viajan en vesículas COPII al aparato de Golgi. En el Golgi las proteínas se glicosilan y
son enviadas, desde el TGN, a la membrana plasmática o a los endosomas. COPI dirige el tráfico
retrógrado entre el Golgi y el RE y dentro del Golgi. Adaptado de Szul et al. [53].

Página 28
 Introducción
Por último, el citoesqueleto juega un papel importante en la ruta secretora. En
mamíferos y hongos filamentosos los microtúbulos y los cables de actina cooperan en el tráfico
intracelular. Sin embargo, en S. cerevisiae, la exocitosis requiere únicamente cables de actina
[14]. Las vesículas secretoras se adaptan mediante Rabs, directamente o a través de sus
efectores, a los motores (dineína y kinesina-1 para microtúbulos, miosina-5 para actina) que les
permiten desplazarse a lo largo de los filamentos del citoesqueleto [14, 15].

1.1. La interfaz retículo endoplasmático/aparato de Golgi

El tráfico en la interfaz RE/Golgi está controlado por los complejos de cubierta COPII y
COPI [57]. Pese a que la organización de esta interfaz RE/Golgi varía enormemente en
diferentes especies, las funciones celulares de COPI y COPII están, en general, conservadas en
eucariotas [57].

1.1.1. Tráfico anterógrado: la cubierta COPII

Para salir del RE, las proteínas, adecuadamente plegadas y ensambladas, se concentran
en subdominios de la membrana del RE, denominados sitios de salida del retículo
endoplasmático o ERES (endoplasmic reticulum exit sites, Figura I.1). Los ERES son ricos en
COPII y se visualizan por microscopía de fluorescencia con componentes de COPII marcados
con proteínas fluorescentes [58]. Además, la proteína Sec16, que también se localiza en estos
subdominios, ayuda a su organización y mantenimiento [59]. Los cargos, concentrados en los
ERES por interacción con COPII se incorporan a las vesículas nacientes y viajan al Golgi.

COPII es un complejo formado por tres componentes funcionales: Sar1 es la GTPasa

monomérica que activa el proceso [60], reclutando el resto de componentes; el heterodímero
Sec23/24 selecciona el cargo que se transporta y regula la hidrólisis de GTP por parte de Sar1; y
el heterotetrámero Sec13/31 deforma la membrana para la formación de la vesícula (ver Figura
I.2 y pie de figura) [49, 61]. Sar1 es citosólica e inactiva en su forma unida a GDP, pero cuando
se carga con GTP cambia de conformación y expone una α-hélice N-terminal anfipática que se
inserta en la membrana del RE, contribuyendo probablemente a su deformación [62]. La
actividad de Sar1 está restringida al RE porque Sec12 [63, 64], la GEF que activa a Sar1, es una
proteína transmembrana específica de dicho orgánulo [65]. Una vez reclutado Sec23-Sec24,
Sec24 es responsable de la interacción con el cargo. Existen señales específicas de exportación
en el dominio citosólico de muchas proteínas transmembrana. Entre ellas están motivos
aromáticos, hidrofóbicos en C-terminal, di-hidrofóbicos y di-ácidos [66], que pueden
interaccionar directamente con Sec24 [67]. Por otro lado, algunas proteínas interaccionan con
COPII de manera indirecta, a través de proteínas adaptadoras [68]. Se forman, por tanto,

Página 29
Introducción
complejos Sec23/24-Sar1-cargo. Seguidamente, se recluta el heterotetrámero Sec13-Sec31, el
cual concentra dichos complejos y completa la deformación de la membrana, formándose la
vesícula.

Figura I.2. Formación de vesículas COPII. Este proceso se inicia por la activación, mediada por
Sec12, de la GTPasa Sar1, que se carga con GTP y se inserta en la membrana del RE (ER en la
figura). En dicha membrana, Sar1-GTP recluta a Sec23/24, que difunde en el plano de la membrana y
reconoce proteínas específicas para su transporte al Golgi. Sec13/31 reconoce y agrupa los complejos
Sec23/24-Sar1 y deforma la membrana, hasta la formación de una vesícula independiente que se
dirige al Golgi. Adaptado de Sato et al. 2007 [61].

En algunos casos COPII debe adaptar su forma para permitir el transporte de cargo de
gran tamaño, como por ejemplo ocurre con las fibras de procolágeno en mamíferos [69]. Pese a
que COPII es relativamente flexible, en esta adaptación intervienen una serie de proteínas
moduladoras [3]. Una vez formada la vesícula, se produce la hidrólisis del GTP y,
presumiblemente, como consecuencia el complejo COPII se desensambla [70]. Las vesículas
COPII se envían al Golgi gracias a la acción coordinada de RAB1 (Ypt1p en Saccharomyces
cerevisiae [71], RabO en Aspergillus nidulans [18]) [72] y de complejos de anclaje, como
p115/Uso1p y TRAPPI (transport particle I) (este último actúa cono GEF de RAB1 / Ypt1p /
RabO [37, 73, 74]). La fusión está mediada por complejos SNAREs (Figura I.3). En S.
cerevisiae y A. nidulans la SNARE del tipo sintaxina que se encuentra en el Golgi y “recibe” el
tráfico del RE se denominan Sed5p [75] y SedV [18], respectivamente.

Página 30
 Introducción

Figura I.3. Formación y fusión de una vesícula de transporte. Los componentes de la cubierta son
reclutados por una GTPasa (en rojo), que interaccionan con el cargo y deforman la membrana (1),
para finalmente formarse una vesícula (2) que contiene v-SNAREs. El complejo de cubierta se
desensambla, junto con la hidrólisis del GTP por parte de la GTPasa (3). La vesícula viaja a la
membrana aceptora e interacciona con un factor de anclaje a través de una proteína Rab (5). La
aproximación de la vesícula permite la interacción entre la v-SNARE con las t-SNAREs, formando un
complejo trans-SNARE (6), lo que promueve la fusión de la vesícula con la membrana aceptora (7).
Esto provoca la liberación del cargo en el compartimento aceptor. Existen mecanismos de transporte
retrógrado para reciclar las SNAREs. Adaptado de Bonifacino et al. 2004 [50].

Es posible que el tráfico de las vesículas COPII al Golgi determine la formación de la

cisternas de dicho orgánulo, como propone el modelo de maduración de cisternas (ver más
abajo) [21]. De hecho, basándose en un estudio comparado de Pichia pastoris y S. cerevisiae,
Glick y colaboradores han propuesto que la disposición y abundancia de los ERES determina la
estructura del Golgi [58]. P. pastoris, al igual que las células de mamífero, contiene un número
relativamente bajo de ERES, lo que hipotéticamente sería la causa de la formación de un Golgi
apilado, como consecuencia de la fusión continua de las vesículas COPII en una misma
localización intracelular. En S. cerevisiae, al igual que en A. nidulans [24], los ERES son
numerosos y dispersos, lo que tendría como consecuencia que cada cisterna del Golgi se
formase en una localización diferente, dando lugar a un Golgi no apilado (Figura I.4). Por tanto,
este estudio comparado plantea que los sitios de formación de las vesículas COPII en el RE
determinan la distribución espacial del principal componente de la ruta secretora, que es el
aparato de Golgi.

Página 31
Introducción

Figura I.4. Distribución de los ERES en P. pastoris y S. cerevisiae. Las regiones sombreadas del
RE son las que pueden funcionar como ERES. Adaptado de Rossanese et al. 1999 [58].

1.1.2. Tráfico retrógrado: la cubierta COPI

Para mantener la identidad del RE y del aparato de Golgi es necesario que las proteínas
residentes de cada orgánulo permanezcan en su localización apropiada. De hecho, la
incorporación del cargo en vesículas COPII es altamente selectiva. Sin embargo, una
proporción de proteínas residentes del RE acaban incorporándose en dichas vesículas y viajan al
Golgi ya sea porque, aun no teniendo una señal de exportación, son arrastrados por el cargo
(transporte pasivo o bulk flow), o porque dichas proteínas forman parte de la maquinaria
requerida para el transporte y la fusión, como las SNAREs y las denominadas proteínas
adaptadoras de los cargos solubles [76]. Uno de los mecanismos para mantener la asimetría
composicional entre RE y Golgi es el transporte retrógrado al RE de proteínas que deben
permanecer en éste. En otras palabras, para que el sistema funcione, además de existir un tráfico
anterógrado que transporta el cargo, existe un transporte retrógrado de vuelta al RE para todas
aquellas proteínas que se escapan o que intervienen en el transporte dependiente de COPII.
Dicho transporte retrógrado es esencial para el funcionamiento de la ruta secretora [77].

El tráfico retrógrado GolgiRE está mediado por el complejo de cubierta COPI. El

complejo COPI, también denominado coatómero, está formado por siete subunidades (β, δ, γ, ζ,
α, β´, ε). Se localiza principalmente en el aparato de Golgi, en el compartimento intermedio RE-
Golgi que existe en mamíferos (ERGIC, endoplasmic reticulum Golgi intermediate
compartment¸ un complejo túbulo-vesicular entre el RE y el Golgi, que se puede ver como una
cisterna del Golgi con gran actividad de transporte retrógrado) y en vesículas de transporte [78].
Las subunidades del coatómero forman dos subcomplejos: el tetrámero β/δ/γ/ζ-COP, que es
estructualmente similar a los adaptadores de clatrina (las subunidades γ-COP y ζ-COP son
similares a βAP-2 y a σAP-2 [79, 80]); y el trímero α/β´/ε-COP, que es similar a las subunidades
de clatrina, y conforma la capa externa, de un modo semejante a Sec13/Sec31 en COPII [81].
(Véase la Figura I.5 para comparar las estructuras del tetrámero β/δ/γ/ζ-COP y de AP2). Tanto

Página 32
 Introducción
en el tráfico dependiente de clatrina como de COPII el reconocimiento del cargo tiene lugar en
la capa interna (AP o Sec23/Sec24), lo que también es cierto para COPI. Sin embargo en COPI
también existen señales de exportación que se reconocen en la capa externa.

Figura I.5. Comparación estructural entre la capa interna de COPI y AP2. A la izquierda, el
subcomplejo β/δ/γ/ζ-COP unido a una membrana por interacción con dos moléculas de Arf1-GTP.
Las subunidades γ/ζ-COP y Arf1 están cristalizadas. El resto (en gris) es un modelo. A la derecha se
muestra la estructura de la forma abierta de AP2. Nótese el gran parecido estructural de ambos
complejos proteicos. Adaptado de Yu et al. 2012 [83].

COPI se recluta a las membranas del Golgi por Arf1 [82, 83] y, además de mediar
tráfico retrógrado hacia el RE, realiza el transporte de proteínas entra las cisternas del Golgi
(Figura I.6). Sin embargo, a pesar del gran conocimiento bioquímico que existe tanto del
complejo COPI como de su funcionamiento en el transporte retrógrado al RE, no se ha
establecido claramente qué tipo de tráfico media dentro del aparato de Golgi, si anterógrado,
retrógrado o ambos (ver más adelante).

Mecanísticamente, COPI actúa de manera similar a COPII. Como su pariente Sar1, la

GTPasa Arf1, al cargarse con GTP, extiende una α-hélice anfipática, que se encuentra en
posición N-terminal. Esta hélice se inserta en la monocapa citosólica de la membrana del Golgi
[84]. A diferencia de Sar1, Arf1 tiene un grupo miristoilo unido covalentemente a dicha α-
hélice, que colabora en estabilizar la inserción en la membrana [85]. Una vez anclada en la
membrana, Arf1 recluta el tetrámero correspondiente a la “capa interna” de COPI (β/δ/γ/ζ-COP)
que, a su vez, reconoce el cargo [55]. Este subcomplejo puede, además, estimular la actividad
GAP de la proteína ArfGAP que intervenga [55]. Se forman, entonces, complejos COP-Arf1-
cargo. Seguidamente, se recluta a estos complejos el trímero α/β´/ε-COP, que conforma la capa

Página 33
Introducción
externa; varios de estos trímeros polimerizan, concentran el cargo, deforman la membrana y
generan una vesícula repleta de proteínas para su transporte [55, 86].

Figura I.6. Localización de las proteínas adaptadoras del cargo. Representación esquemática de
las rutas secretora y endocítica, mostrando las rutas controladas por los adaptadores de cargo. Se cree
que el tráfico a la membrana basolateral, que no se muestra, está controlado por adaptadores similares
a los del sistema endosomal. Nótese que el exómero existe en levaduras y no tiene un homólogo en
mamíferos. ERGIC: endoplasmic reticulum-Golgi intermediate compartment. Adaptada de
Paczkowski et al. 2015 [86].

1.2. El tráfico en el aparato de Golgi: modelos

Pese a que la descripción por Camilo Golgi de este orgánulo data de 1898, hasta la
introducción del microscopio electrónico en los años 1960 la existencia del aparato de Golgi no
fue ampliamente aceptada por la comunidad científica [87]. Los primeros estudios por
microscopía electrónica determinaron que el aparato de Golgi estaba formado por una serie de
cisternas apiladas, rodeadas de vesículas. Estas imágenes estáticas, junto a estudios inmuno-
histoquímicos y bioquímicos de aislamiento de fracciones del Golgi en los que se descubrió que
las diferentes cisternas tenían una composición diferente en cuanto a su contenido en enzimas de
glicosilación, llevaron a la elaboración de un modelo funcional del aparato de Golgi. Este
modelo concebía las cisternas como compartimentos estables con distintas enzimas residentes
[87]. Las proteínas cargo avanzarían en la ruta secretora, viajando de una cisterna a la siguiente
en las vesículas que por microscopía electrónica se ven rodeando al Golgi (vesículas COPI). En
su camino adquirirían las glicosilaciones que se realizarían en cada cisterna, en un proceso
similar a una cadena de montaje (Figura I.7). Este modelo se denomina modelo de cisternas

Página 34
 Introducción
estables [88]. Según una versión actualizada del modelo de cisternas estables, el complejo de
cubierta COPI es el encargado del tráfico anterógrado del cargo [89].

.
Figura I.7. Representación esquemática de los modelos de (A) cisternas estables y de (B) maduración
de cisternas. CCV: vesículas cubiertas de clatrina. Adaptada de Glick et al. 2009 [21].

Posteriormente se trataron de resolver una serie de inconsistencias del modelo de

cisternas estables. Entre ellas estaba el hecho de que el procolágeno, que, se sabía, se
preensambla en el RE, excede en tamaño a las vesículas de secreción visualizadas por
microscopía electrónica. Se determinó que el procolágeno avanza en la ruta secretora sin
abandonar la cisterna del Golgi donde se encuentra [69], abriéndose la puerta a un modelo en el
cual las cisternas del Golgi no son estables, si no que avanzan en la ruta con el cargo. Además
mediante microscopía in vivo en S. cerevisiae se confirmó que las cisternas del Golgi temprano,
a lo largo del tiempo, adquieren identidad de cisternas de Golgi tardío [43, 44]. Estos y otros
datos sugerían que las cisternas son las que, cambiando con el tiempo su composición de
enzimas residentes del Golgi, “avanzan” en la ruta a medida que el cargo se va modificando.
Las cisternas se formarían de novo por fusión de numerosas vesículas COPII y adquirirían las
enzimas de una cisterna temprana por transporte retrógrado. Cada cisterna iría avanzando en la
ruta por adquisición de nuevas enzimas y envío —por transporte retrógrado— de las enzimas ya
utilizadas a cisternas más tempranas para, finalmente, en la cara trans del Golgi, perder por
transporte retrógrado (en vesículas COPI) todas las enzimas propias del Golgi. En este punto, la

Página 35
Introducción
cisterna se fragmentaría en vesículas de transporte, que viajarían a su destino final, ya sea la
membrana plasmática o los endosomas (Figura I.7). De este modo, emergía una concepción del
aparato de Golgi como un orgánulo dinámico y transitorio en el que el tráfico entre cisternas se
da en dirección retrógrada transportando enzimas del Golgi desde una cisterna más tardía hacia
una más temprana [88]. Este modelo se conoce como modelo de maduración de cisternas.
Nótese que, tanto en el modelo de cisternas estables como en el modelo de maduración de
cisternas, el transporte mediante COPI es crucial ya sea para transportar el cargo (cisternas
estables) o para enviar en sentido retrógrado proteínas residentes del Golgi.

Posteriormente, se ha propuesto una variación del modelo de maduración que incluye

el transporte tubular entre cisternas heterotípicas y que explicaría las conexiones tubulares
visualizadas por microscopía electrónica [90] y la cinética exponencial de salida del Golgi de
cargos pequeños. Muy recientemente se han propuesto otros dos modelos. Según el modelo de
partición rápida en un Golgi mezclado [91], el Golgi funciona como un compartimento único
con un dominio de maduración de las proteínas y un dominio de exportación. Las proteínas
serían exportadas desde cualquier nivel del Golgi. Aunque este modelo explica la cinética
exponencial de salida del Golgi para cualquier cargo, no revela el papel que desempeñaría
COPI, pese a que está bien establecido que éste es un complejo esencial para la función del
Golgi. En segundo lugar, el modelo de cisternas progenitoras [92] propone que un dominio en
una determinada cisterna maduraría por cambio de Rab (Rab conversion) y dicho dominio se
fusionaría “homotípicamente” con una cisterna más madura, avanzando así el cargo en el Golgi.

Además de lo anteriormente discutido, todos estos modelos deben tener en cuenta la

maquinaria molecular que se ha demostrado que regula el transporte en el Golgi y que son,
principalmente, las GTPasas Arf y Rab y sus efectores. Gradualmente, a medida que se van
conociendo los procesos concretos que median dichas GTPasas, los modelos se van haciendo
más complejos.

1.3. La implicación de los lípidos en el tráfico de membranas

En las células eucariotas se pueden diferenciar dos territorios lipídicos principales, uno
de ellos formado por la ruta secretora temprana — el RE y el aparato de Golgi temprano (cis-
Golgi en mamíferos) —; y el otro constituido por la ruta secretora tardía, es decir la membrana
plasmática, el trans-Golgi (TGN) y los endosomas [22, 93]. Las membranas de la ruta secretora
temprana tienen poca carga aniónica y son bastante fluidas [93, 94]. Por el contrario, la ruta
secretora tardía presenta membranas enriquecidas en fosfolípidos aniónicos y con altos niveles
de esteroles y esfingolípidos, por lo que su fluidez está relativamente restringida [94]. De hecho,
el espesor de las membranas difiere entre ambos dominios, hasta tal punto que existe una

Página 36
 Introducción
dicotomía en la longitud de los dominios transmembrana de las proteínas que residen en ellas
[23, 95]. Este hecho tiene implicaciones en la regulación de la actividad de las proteínas y en la
clasificación del cargo y las membranas en la ruta secretora.

Además de las diferencias lipídicas de los diferentes componentes del tráfico de

membranas, los cambios en la composición y la organización lipídica de micro-dominios de
dichas membranas también contribuyen al transporte de lípidos y proteínas en la ruta secretora,
principalmente, de tres formas: (1) mediante la generación de deformaciones locales de la
membrana [96]; (2) a través de la organización de dominios de membrana, que promueven el
reclutamiento y la incorporación de proteínas específicas en las vesículas en formación [97]; y
(3) gracias a la iniciación de cascadas de señalización [98]. Por ejemplo, se ha propuesto que el
equilibrio dinámico que existe entre la producción y el consumo de diacil glicerol (DAG) está
implicado en la curvatura de membrana que inicia la formación de vesículas, dado que la forma
cónica del DAG afectaría a la curvatura local de las membranas del Golgi próximas a dominios
ricos en DAG [96, 99, 100]. Además, la deformación estructural de la membrana en dichos
sitios podría promover el reclutamiento de proteínas citosólicas implicadas en la formación o
escisión vesicular, como Gcs1, una GAP de Arf con capacidad para detectar curvatura de
membrana (ver más adelante). Por el contrario, la forma cilíndrica de la fosfatidil colina
impondría resistencia al proceso de deformación de la membrana. En general, existe un gran
número de enzimas que al controlar el incremento o la disminución de los niveles de los
distintos lípidos en las membranas regulan la ruta secretora [99]. Además de los cambios
regulados en el metabolismo lipídico, la propia asimetría de la membrana también influye en la
curvatura de dicha bicapa lipídica. Cuando la fosfatidil serina llega al aparato de Golgi, la
ATPasa Drs2p (DnfB en A. nidulans) mediante su actividad flipasa restringe su localización a la
monocapa citosólica [101] e hipotéticamente induce curvatura localizada [102]. La inducción de
curvatura por parte de Drs2p justificaría su implicación en la ruta secretora [103].

Como se indicó antes, la ruta secretora tardía es rica en esfingolípidos y esteroles (el
ergosterol es el equivalente fúngico del colesterol). Es más, las vesículas secretoras están
enriquecidas en ambos tipos de lípidos [104], en comparación con las membranas del Golgi de
donde dichas vesículas proceden. La generación de microdominios de esteroles y esfingolípidos
en la membrana del Golgi promueve la exocitosis de numerosos transportadores de la
membrana plasmática [105]. De hecho, se ha propuesto que las proteínas ancladas a GPI (PA-
GPI) segregan del resto de cargo gracias a su reclutamiento a dominios de membrana ricos en
esfingolípidos [2].

Finalmente, el fosfatidil inositol 4-fosfato (PtdIns4P) es quizás el lípido más importante

en el proceso de exocitosis, y es importante en la biogénesis de las vesículas exocíticas [99] y en
el reclutamiento de proteínas reguladoras del tráfico, como la miosina tipo 5 [106], necesaria

Página 37
Introducción
para el transporte a la membrana plasmática de dichas vesículas. La actividad PtdIns4P fosfatasa
de Pik1p y la PtdIns4-kinasa Stt4p controlan la exocitosis en levaduras mediante la regulación
de los niveles de PtdIns4P.

1.4. El proceso de N-glicosilación en la ruta secretora

La N-glicosilación es el proceso de unión de oligosacáridos al grupo amino de una
asparagina que forma parte de la secuencia Asn-X-Ser/Thr de una proteína. Dicho proceso se
inicia en el RE, cuando se cataliza la transferencia de un bloque de azúcares a cada una de estas
asparaginas N-glicosilables. La oligosacariltransferasa (OST), encargada de esta transferencia,
es un complejo enzimático que actúa en el lumen del RE [107] de manera cotraduccional y
reconoce una conformación específica que adquiere transitoriamente la secuencia Asn-X-
Ser/Thr nada más salir del translocón [108, 109]. Los glicanos añadidos son posteriormente
modificados en el RE antes de viajar al aparato de Golgi. En el aparato de Golgi, adquieren
estructuras más complejas por procesamiento y adición de más monosacáridos. Las primeras
investigaciones sugerían que la glicosilación no se requería para el transporte a lo largo de la
ruta secretora temprana [3]. Sin embargo, actualmente se sabe que los glicanos tienen un papel
importante en el plegamiento proteico [110, 111]. Aunque la unión de un N-glicano no induce
una estructura secundaria permanente, altera las preferencias conformacionales cerca del sitio de
glicosilación, provocando una conformación más compacta [111]. De hecho, cuando la
glicosilación se inhibe, el efecto más frecuentemente observado es la generación de agregados
de proteínas mal plegadas que, por ende, no son funcionales [112]. Sin embargo, la importancia
de la adición de glicanos varía entre proteínas; algunas proteínas dependen completamente de la
glicosilación, como por ejemplo la proteína G del virus de la estomatitis (VSVG) [113],
mientras muchas otras no muestran dependencia alguna. Además, el procesamiento secuencial
de los N-glicanos en el RE está coordinado con el adecuado plegamiento y la salida de las
glicoproteínas de dicho compartimento, mediante el llamado ciclo calnexina-calreticulina [114,
115].

Por otro lado, existe evidencia de que ciertas proteínas requieren N-glicosilación para
tomar una ruta de secreción apical [13] y, por ejemplo, la adición de sitios de glicosilación en la
hormona del crecimiento de Rattus norvegicus provoca su secreción polarizada [14]. Una
posibilidad, que explicaría la implicación de la glicosilación en el tráfico, es que existan
proteínas capaces de reconocer azúcares (lectinas) implicadas en la clasificación en el TGN,
como ocurre en el caso del epítopo manosa-6-fosfato presente en las enzimas destinadas al
sistema endosomal. Sin embargo, otra posibilidad es que los glicanos puedan cambiar las
propiedades generales de las proteínas y, por ejemplo, inducir co-agregación, como se ha

Página 38
 Introducción
propuesto en la incorporación de cargo en las vesículas implicadas en la secreción regulada
[116].

Mientras que en mamíferos los N-glicanos pueden contener una gran variedad de
azúcares, como fucosas, ácido siálico y galactosa, los cuales son añadidos en el Golgi, los N-
glicanos de S. cerevisiae sólo se modifican mediante adición de manosas. Sin embargo, en
hongos filamentosos, además de la unión de manosas, se produce la adición de galactosas en el
extremo no reductor de los N-glicanos, formándose un galactomanano [4]. Se ha propuesto que
estos residuos de galactosas actúan como una señal que detiene la adición de más manosas [117,
118]. Además, se ha descrito el anclaje de galactomananos a la membrana plasmática de hongos
filamentosos mediante un ancla de GPI [119]. Estos datos sugieren que los galactomananos
presentes en los N-glicanos de las glicoproteínas podrían servir para que estas proteínas
permanezcan unidas a la membrana por un anclaje de GPI.

1.5. Control molecular de la ruta secretora: GTPasas de la

familia Arf/Sar en el retículo endoplasmático y el aparato de
Golgi y sus proteínas reguladoras
Posiblemente, las principales proteínas reguladoras que dirigen el tráfico en el RE y el
aparato de Golgi son las proteínas G pequeñas de la familia Arf/Sar, que se describen a
continuación. Las proteínas Arf/Sar conforman una familia dentro de la superfamilia Ras [120].
Esta familia incluye proteínas Arf, Sar y Arl (Arf like protein). Se trata de una familia de
proteínas G pequeñas, conservada en eucariotas [7], cuyos miembros presentan dos
características estructurales únicas. La primera es la presencia de una α-hélice N-terminal
anfipática, que frecuentemente tiene unido un grupo miristoilo. La segunda es que el
intercambio de GDP por GTP no sólo desplaza las regiones switch, que interaccionan con los
efectores, sino que también cambia la posición relativa de dos β-láminas que se encuentran entre
las dos regiones del switch, denominadas el interswitch (Figura I.8). Este desplazamiento de la
posición del interswitch libera de un bolsillo hidrofóbico la α-hélice N-terminal anfipática, lo
que promueve la inserción de esta hélice en una membrana. Las proteínas Arf/Arl, junto a las
GTPasas de la familia Rab, median procesos de tráfico a todos los niveles del sistema de
membranas intracelulares [7]. Una característica importante de las Arf/Sar es que, cuando están
activas, sus dominios globulares se encuentran muy próximos a las membranas (1-2 nm), al
contrario que las Rabs, las cuales reclutan a sus efectores a mayor distancia de la membrana (7-
8 nm) [7]. La única GTPasa que actúa en el RE es Sar1p y su única función es la formación de
COPII [62]. Por otro lado, las que realizan su función en el aparato de Golgi son, en S.
cerevisiae, Arf1p (duplicado como Arf2p), Ar1p, Arl3p y Cin4p. Todas tienen su ortólogo

Página 39
Introducción
correspondiente en mamíferos, donde normalmente existen varios parálogos de cada una de
ellas [7]. Arf1p se considera el regulador clave del aparato de Golgi. Controla su organización y
su identidad dirigiendo procesos como la formación de las cubiertas COPI y clatrina [86]. Arl3p
(ARFRP1 en mamíferos) y Arl1p forman parte de una cascada de activación. Arl3p no tiene
diana de miristoilación y se localiza en las membranas del TGN gracias a una acetilación N-
terminal y a la interacción con una proteína transmembrana denominada Sys1p [121]. Arl3p,
desde su localización en el TGN, recluta quizá indirectamente a través de la GEF Syt1 [122] a
Arl1p [121]. Arl1p, una vez activa en el TGN, recluta factores de tethering con dominio GRIP
(golgin-97, RanBP2alpha, Imh1p and p230/golgin-245), como Imh1p en S. cerevisiae [123].
Finalmente, Imh1p media tráfico entre los endosomas y el aparato de Golgi. Además, Arl1p
mediante la interacción con la flipasa Drs2p y con la GEF Gea2p tiene la capacidad de alterar la
curvatura de la membrana del TGN, lo que facilitaría el inicio de la formación de una vesícula
[124]. Cin4p, que en mamíferos se corresponde al par de parálogos ARL2 y ARL3, se ha
relacionado con el ensamblaje de microtúbulos [125]. También en mamíferos participa en el
transporte de proteínas en las células fotorreceptoras [126]. De hecho, mutaciones en ARL3
provocan retinitis pigmentosa en humanos [127].

Figura I.8. Características estructurales de la familia Arf/Sar. A. Estructura de Arf1 unida a GDP
(izquierda) o GTP (derecha). Tras la unión de GTP, la región del interswitch (en rojo) se aleja de las
regiones del switch y desplaza la α-hélice N-terminal, que ocupaba un bolsillo de la proteína en la
conformación GDP. Esta hélice se insertaría en una membrana. B. Representación esquemática de la
secuencia de una Arf/Sar. Adaptada de Gillingham et al. 2007 [7].

Página 40
 Introducción
1.5.1. Factores intercambiadores de nucleótidos de guanina (GEF) de la famila
Arf/Sar
Las GTPasas adquieren el GTP por acción de sus GEFs, que desplazan el GDP unido
ávidamente al centro activo permitiendo la entrada del GTP desde el citosol. Esto provoca el
cambio conformacional de las regiones switch e interswitch, que a su vez trae consigo la unión
de la Arf/Sar a una membrana, por inserción de la α-hélice N-terminal. Por lo tanto, las GEFs
determinan la actividad y la localización de estas proteínas G pequeñas. La actividad GEF de
estas proteínas reside en el llamado dominio Sec7, consistente en un módulo de ~200
aminoácidos [128, 129]. Sec12, la GEF de Sar1, es una excepción, ya que no tiene dicho
dominio Sec7 y es la única proteína de esta clase que es integral de membrana.

Las GEFs de Arf/Sar, además del dominio Sec7, tienen dominios adicionales, que
facilitan su reclutamiento a las membranas del Golgi de una manera regulada, otorgándoles
especificidad espacio-temporal [130]. En hongos, las GEFs con dominio Sec7 se clasifican en
dos subfamilias: GBG (de GBF/BIG GEFs) y Syt1/Syt2 [130]. La clasificación varía
ligeramente entre autores [7, 130]. La subfamilia GBG consta de una serie de dominios
específicos [130] y se subdivide en los clados BIG/Sec7 y GBF/Gea. Respecto al grupo
BIG/Sec7, tanto BIG1 y BIG2 en mamíferos, como Sec7 en S. cerevisiae y HypB en A.
nidulans se localizan en el TGN [24] y, mediante la activación de Arf1, promueven el
reclutamiento de cubiertas de clatrina (con adaptadores GGA o AP-1) [7]. El segundo grupo
dentro de la subfamilia GBG (GBF/Gea) promueve la activación de Arf1 en el Golgi temprano,
para el reclutamiento de COPI [129, 131]. De hecho, Gea1p y Gea2p son esenciales para el
transporte retrógrado al RE [77]. En S. cerevisiae, en este transporte retrógrado no intervienen
ni Sec7p ni Syt1p, las otras GEFs del Golgi [77]. En resumen, BIG/Sec7 funcionaría en el TGN
y GBF/Gea en el Golgi temprano, ambos controlando la función de Arf1.

La familia Syt1/Syt2 es exclusiva de hongos y, en S. cerevisiae, está formada por Syt1p

y Yel1p. Otros autores [7] agrupan a estas proteínas en la familia PSD (PH and Sec7 domain),
dado que contienen un dominio PH (Plekstrin homology) de interacción con fosfoinosítidos. De
estas dos, Syt1p es la única que se localiza en el Golgi y, se cree, promueve la activación de
Arl1p [122].

La ruta secretora, lejos de estar formada por un conjunto de reacciones aisladas, está
compuesta por rutas bioquímicas interconectadas por bucles de retroalimentación y cascadas de
reacción. Una prueba clara de esto son las cascadas de activación de GTPasas, que ocurrirían
tanto en Rabs como en proteínas Arf o Arl [132]. De hecho, algunas Arf median el
reclutamiento de GEFs que, a su vez, reclutan y activan otras Arf distintas, como es el caso
descrito más arriba de Ar1p y Arl3p. Además, las GEFs pueden reclutarse por sus productos
(Arfs unidas a GTP), formando bucles de retroalimentación positiva. También se propone que

Página 41
Introducción
existe comunicación cruzada entre las proteínas Arf y las GTPasas tipo Rab, así como con las
GEFs correspondientes, estas últimas tendrían un rol en el tráfico más allá de la mera activación
de las GTPasas [133].

1.5.2. Proteínas estimuladoras de la actividad GTPásica (GAP) de la familia

Arf/Sar
Como muchas otras proteínas G pequeñas, las proteínas Arf/Sar hidrolizan GTP
ineficientemente. Por ello, necesitan una proteína GAP que facilite dicha hidrólisis. La GAP de
Sar1, Sec23, es diferente al resto. Por el contrario, todas las GAPs de Arfs y Arls contienen el
dominio Arf-GAP. Se trata de un dominio de ~140 residuos con cuatro cisteínas que forman un
dedo de zinc. Por otro lado, una arginina expuesta al exterior se insertaría en el sitio activo de la
Arf, para catalizar la hidrólisis del GTP [134]. Esto provocaría la liberación de la GTPasa de la
membrana y la inactivación de su capacidad para reclutar efectores. Aunque en mamíferos, estas
GAPs se han agrupado en diez familias distintas, en hongos no parece haber representantes de
todas ellas. Ciertas proteínas de la familia ArfGAP1 contienen un motivo denominado ALPS
(ArfGAP1 lipid packing sensor) [98], que permite el reconocimiento de membranas lipídicas
con curvatura. Se propone que la habilidad de estos motivos ALPS para actuar como sensores
de la curvatura de membranas permitirían que la GAP sólo se activase en vesículas cercanas a
sufrir la fisión, asegurando que la inactivación de la Arf se retrasase lo suficiente como para
permitir la generación de la vesícula. Los representantes de esta familia en S. cerevisiae son
Gcs1p (con motivo ALPS) y Gts1p. La familia ArfGAP3 contiene, además del dominio
ArfGAP, un motivo ISxxxFG duplicado, donde x es cualquier aminoácido. Tanto las proteínas
humanas como de levadura de esta familia interaccionan directamente con la subunidad γ-COP
de COPI.

Del resto de familias, solamente la familia SMAP tiene representante en S. cerevisiae

(Age2p). Cabe destacar que muchas familias de GAPs en mamíferos tienen dominios PH
(plekstrin homology) o BAR (Bin/Amphiphysin/Rv), de interacción con membranas [7].

1.6. La salida de proteínas en la red del trans-Golgi (TGN) y

las diferentes rutas de secreción
El TGN es el principal sitio de salida del cargo que atraviesa el Golgi hacia su destino
final. Se trata de una región del aparato de Golgi especializada en la clasificación del cargo y su
empaquetamiento en vesículas. A este respecto, Glick ha propuesto un modelo según el cual el
Golgi está organizado en tres fases funcionales: la primera, de ensamblaje de las cisternas; la

Página 42
 Introducción
segunda, de procesamiento postraduccional del cargo; y, la tercera, de concentración de dicho
cargo en vesículas de transporte [135] (Figura I.9). A esta última fase correspondería la función
del TGN. Desde el TGN las vesículas viajan a la membrana plasmática o a los endosomas
(Figura I.1).

Figura I.9. Representación esquemática del modelo del Golgi con tres fases funcionales. En la
fase I, las cisternas se ensamblarían. En la segunda fase ocurrirían las modificaciones
postraduccionales del cargo, principalmente glicosilaciones. Finalmente en la fase III, el cargo se
concentraría en túbulos o vesículas y se dirigiría a su destino final. Adaptada de Papanikou et al. 2014
[135].

1.6.1. Tráfico a los endosomas

En el TGN, las GTPasas tipo Arf y Arl inician el reclutamiento a la membrana de una
amplia variedad de adaptadores de cargos, en un proceso en el que también están implicadas
proteínas de la familia Rab. Por ejemplo, Arf1 interacciona directamente con el adaptador AP-1
[136] para el reconocimiento del cargo. De hecho, la interacción con este último induce la
oligomerización de AP-1, lo que contribuye al ensamblaje de la cubierta de clatrina [137].
También se requiere un incremento en los niveles de PtdIns4P para el reclutamiento de AP-1.
De esta manera, el efecto conjunto de Arf1, el cargo y los fosfolípidos en el reclutamiento de
AP-1 permite el ensamblaje de la cubierta de clatrina de una manera regulada. Estas vesículas
cubiertas de clatrina viajan para fusionarse con los endosomas (Figura I.6).

Página 43
Introducción
En S. cerevisiae, algunas proteínas, como la invertasa, utilizan una ruta para viajar a la
membrana plasmática que requiere que el transporte desde el TGN a los endosomas funcione
[29, 30, 33]. De hecho, estas proteínas, todas ellas enzimas solubles, se exocitan en vesículas de
secreción más densas que otros cargos que no requieren la función de los endosomas para su
secreción. Por ello, se ha propuesto que existen, al menos, dos rutas de secreción en S.
cerevisiae, una de ellas mediada por endosomas y otra, directa, que no requiere la función de
éstos. Además, la secreción basolateral en células epiteliales de mamífero parece ocurrir a través
de los endosomas [34].

Además de las proteínas AP, los adaptadores GGA (Golgi-localizing, Gamma-adaptin

ear homology, ARF-binding proteins) forman otra clase de adaptadores de cargo asociados a
clatrina, que regulan el reconocimiento del cargo para el transporte del TGN a los endosomas.
Al igual que AP-1, los adaptadores GGA se reclutan a las membranas por unión a PtdIns4P y a
Arf1. La tercera clase de adaptadores de cargo asociados a clatrina son las proteínas
relacionadas con epsina, que pueden participar junto con AP-1 y GGAs [138].

1.6.2. Tráfico “directo” desde el TGN a la membrana plasmática

Mientras que para el tráfico mediado por los complejos de COPI, COPII y clatrina se
conocen un gran número de los componentes involucrados en el mecanismo de formación de las
vesículas de transporte, en el caso del tráfico desde el TGN a la membrana plasmática el
conocimiento es muy limitado. En clara diferencia con el transporte a los endosomas, el tráfico
del TGN a la membrana plasmática parece no estar mediado por vesículas “convencionales”.
Por ejemplo, por microscopía in vivo se han visualizado túbulos formándose a partir del TGN
[139] y separándose de éste (Figura I.1). Estos túbulos, que transportan el cargo, se fusionan
directamente con la membrana plasmática, sin pasar por ningún otro compartimento. Su fisión
de la cisterna donadora depende de la presencia de determinados lípidos, como el diacil glicerol
[140]. Dichos túbulos miden del orden de micras, mientras que el diámetro de una vesícula
típica es de 50-100 nm. Se sabe que se requieren señales de reconocimiento del cargo para su
transporte a la membrana plasmática, al menos en células epiteliales [35]; sin embargo, no se
conocen los receptores que interaccionan con dichas señales. Tampoco se sabe el mecanismo
por el cual el cargo es clasificado para su transporte en los túbulos (el tráfico particular de las
PA-GPI se discute más adelante). De hecho, VSV-G (vesicular stomatitis virus G protein), un
cargo que viaja en esos túbulos no colocaliza con GGA en dichas estructuras, lo que indica que
los túbulos no contienen GGA [141]. El conocimiento de las proteínas que regularían la
formación de estos túbulos post-Golgi es escaso. En A. nidulans, se ha visualizado la
maduración de cisternas del TGN en vesículas secretoras y se ha demostrado que este tráfico es

Página 44
 Introducción
dependiente de RabE (RAB11 en mamíferos, Ypt31p en levadura) y su transporte requiere
miosina-5, kinesina-1 y dineína [15, 36].

Se conoce únicamente un hipotético complejo adaptador para el tráfico de cargo desde

el TGN a la membrana plasmática. Se denomina exómero, sólo se ha encontrado en hongos y
está formado por cinco subunidades [56]. El exómero es un efector de Arf1 [142] y regula el
tráfico de Chs3p y de Fus1p de S. cerevisiae. Se ha demostrado, in vitro, que el exómero puede
interaccionar con liposomas sin deformar las membranas. Dado el papel limitado del exómero y
la ausencia de equivalentes en metazoos, se ha considerado plausible que gran parte de las
proteínas que viajan a la membrana plasmática desde el TGN no requieran un complejo de
cubierta ni una señal de reconocimiento [140]. El Golgi es un orgánulo con un flujo continuo de
membranas y, de hecho, la retención de enzimas del Golgi requiere una señal específica. Por lo
tanto, las proteínas sin señal de retención podrían ser secretadas directamente sin otro
requerimiento. Sin embargo, esta condición no se daría en todos los casos ya que en
determinados cargos se conocen señales de secreción apical, principalmente en células
epiteliales de mamífero [11]. Para la secreción basolateral, que implicaría el transporte previo a
los endosomas, también se conocen señales específicas [140].

1.6.3. Tráfico “directo” de las proteínas ancladas a GPI

El tráfico de las PA-GPI es distinto al del resto de proteínas, probablemente por la
identidad lipídica que el GPI otorga. Aunque esta afirmación parece ser cierta para todos los
eucariotas, las PA-GPI toman un camino propio en la ruta secretora antes en levaduras que en
mamíferos (Figura I.10) [2]. En S. cerevisiae, donde la remodelación lipídica del GPI ocurre en
el RE, la concentración de las PA-GPI en los ERES ocurre de manera independiente a COPII
[143] y, de hecho, las PA-GPI viajan en vesículas COPII diferentes del resto de cargo [31]. Esta
remodelación implica el reemplazamiento del ácido graso insaturado que el GPI inicialmente
contiene por un ácido graso saturado largo. En levaduras, normalmente, una molécula de
diacilglicerol se sustituye por una ceramida (ácido graso saturado con 26 carbonos) [2]. Se cree
que, gracias a las propiedades físicas de la ceramida, las PA-GPI se reclutan a dominios de
membrana ricos en ceramida [2]. Estos dominios se concentrarían en ERES. De hecho, la
síntesis de ceramida es necesaria para el transporte de las PA-GPI [144]. Además, en S.
cerevisiae, las PA-GPI se concentran en ERES específicos, distintos de los ERES en que se
concentran otras proteínas [143]. Una vez en los ERES, el complejo p24, que actúa como una
lectina, reconoce específicamente el GPI remodelado. La interacción de p24 con las PA-GPI
promueve la interacción con una isoforma de Sec24 (Lst1p), que es una subunidad de la cubierta
COPII. De este modo, como se mencionó, las PA-GPI viajan en vesículas COPII especializadas

Página 45
Introducción
hacia el aparato de Golgi, después de un proceso de reconocimiento que parece implicar,
únicamente, la presencia de un GPI remodelado.

En mamíferos la remodelación del lípido del GPI ocurre en el aparato de Golgi [145] y,
al contrario que en S. cerevisiae, la segregación de las PA-GPI del resto de cargo no ocurre en
el RE [146], sino en el aparato de Golgi [147]. La salida del RE también depende de p24 y de
COPII; sin embargo, las PA-GPI viajan en las mismas vesículas que el resto de cargo y el
proceso de reconocimiento no parece ser dependiente de esfingolípidos. A su llegada al aparato
de Golgi, el GPI se remodela, convirtiéndose en un GPI con dos ácidos grasos saturados. Se
cree que el reconocimiento en el TGN estaría mediado por la segregación de las PA-GPI en
dominios ricos en esfingolípidos y colesterol [97]. Se postula que también son importantes la
oligomerización de las PA-GPI [148] y la N-glicosilación [149]. De este modo, en células
polarizadas de mamífero, la mayoría de PA-GPI son seleccionadas para secreción apical,
mientras que gran parte del resto de cargos se secreta basolateralmente (Figura I.10) [11]. La
secreción apical de las PA-GPI correlaciona con el hecho de que la membrana apical sea rica en
glicoesfingolípidos [150].

Figura I.10. Segregación de las PA-GPI en la ruta secretora. En levaduras, la separación ocurre en
la salida del RE (ER en la imagen), donde las PA-GPI son reclutadas a ERES diferentes del resto de
cargos. Desde los ERES viajan al Golgi en vesículas COPII diferentes. Es posible que, incluso, viajen
en cisternas diferentes dentro del Golgi. En el caso de mamíferos, las PA-GPI se concentran en
transportadores diferentes en el TGN, desde donde viajan a la membrana apical, en células
polarizadas. PM: membrana plasmática. Adaptada de Muñiz et al. 2016 [2].

Página 46
 Introducción

1.7. Aspergillus nidulans como modelo para el estudio del

tráfico intracelular
A. nidulans es un hongo filamentoso que presenta células tubulares y multinucleadas,
llamadas hifas. Durante su fase vegetativa, A. nidulans se propaga mediante esporas asexuales
(conidiosporas) que se forman en estructuras especializadas, denominadas conidióforos [151]
(Figura I.11). Las conidiosporas de A. nidulans son verdes y cubren la superficie de la colonia
(Figura I.11), aunque también se utilizan en el laboratorio mutantes de pigmentación cuyas
esporas son amarillas o blancas [152]. Las conidiosporas son uninucleadas y haploides, lo que
facilita su análisis genético. Durante la germinación, crecen isotrópicamente hasta alcanzar
cierto tamaño, para después establecer un eje de polaridad (Figura I.12). En este punto, la
maquinaria exocítica se polariza hacia el tubo de germinación y, desde su aparición, el
crecimiento celular ocurre exclusivamente por extensión apical [12]. Las largas cadenas de
células, denominadas hifas, pueden ramificarse o iniciar un proceso de desarrollo que culmina
en la formación de un conidióforo para la reproducción asexual (Figura I.12). Por otro lado, A.
nidulans también presenta reproducción sexual [153].

Como en otros hongos, la morfología de sus células tubulares viene dada por su rígida
pared celular [154], que es más débil en el ápice, lo que permite la extensión apical. La
remodelación y síntesis de la pared celular, que está coordinada con el crecimiento celular,
requiere un aporte apropiado mediante secreción apical de las enzimas y los precursores
necesarios. Esto sugiere que el crecimiento celular de los hongos filamentosos es muy
dependiente de la ruta secretora [17].

A. nidulans es un organismo modelo apropiado para el estudio de la ruta secretora [16],

dado que su utilización presenta ventajas específicas. El gran tamaño de la célula apical (~125
μm) y el hecho de que la maquinaria de secreción esté orientada hacia el ápice facilitan los
estudios de microscopía [24]. Además, una consecuencia práctica de su rápido crecimiento por
extensión apical es que las mutaciones que afectan a la eficiencia de secreción causan un
fenotipo detectable en placa, haciendo al hongo ideal para estudios genéticos del tráfico
intracelular [16]. A nivel celular, la interrupción, genética o por drogas, de la secreción es
fácilmente observable debido al engrosamiento del ápice de la hifa de un modo característico
[18]. Esto permite determinar de forma precisa, por ejemplo, el efecto en la secreción de un
mutante termosensible, mediante un cambio a la temperatura restrictiva de la propia cámara de
cultivo, acoplada al microscopio. Además, estas cámaras de cultivo permiten el intercambio del
medio, facilitando los estudios con colorantes fluorescentes, inhibidores y otras drogas [155].
Por otra parte, las ventajas específicas de A. nidulans en comparación con S. cerevisiae son las
siguientes:

Página 47
Introducción
1) A. nidulans no tiene redundancia genética, ya que no ha sufrido una duplicación
genómica;

2) crece exclusivamente por extensión apical, y no experimenta cambios en su eje de

polaridad;

3) es apropiado para microscopía in vivo porque: a) presenta una adhesión natural a la

superficie de la cámara de incubación y b) el gran tamaño de sus células permite obtener una
buena resolución de las estructuras citoplasmáticas.

Figura I.11. Aspergillus nidulans. A. Micrografía de barrido de un conidióforo, con la nomenclatura

de los diferentes tipos celulares. B. Una célula apical. Los núcleos están marcados con una versión
fluorescente del factor de transcripción PacC. C. Descendencia de un cruce entre una cepa rabCwt con
la mutación yA2, de esporas amarillas, y una cepa rabCΔ con conidiosporas wt (verdes). Las colonias
pequeñas son rabCΔ, cuya secreción está afectada. El rectángulo muestra una parte de la placa con
una magnificación del doble. Adaptado de Peñalva et al. 2012 [16].

Página 48
 Introducción

Figura I.12. Crecimiento vegetativo de A. nidulans. Cuando una conidiospora germina, crece
isotrópicamente durante un tiempo, después del cual se establece un eje de polaridad. Se forma un
tubo germinativo, donde varios núcleos migran antes de que el primer septo se forme. El eje de
polaridad se puede mantener indefinidamente, a medida que se van formando nuevos septos. Las
células subapicales pueden establecer nuevos ejes de polaridad, formando ramificaciones y dando
lugar a nuevas células apicales. Por ciertos estímulos el crecimiento vegetativo puede detenerse e
iniciarse la formación de un conidióforo, formándose tipos celulares especializados. Las flechas
verdes muestran la dirección del crecimiento polarizado. Adaptado de Peñalva et al. 2012 [16].

1.7.1. Endocitosis en A. nidulans

Inicialmente, en el campo del tráfico de membranas, A. nidulans sirvió como organismo
modelo en el estudio del proceso de endocitosis [156]. La endocitosis en A. nidulans predomina
en la región subapical de las hifas y parece estar acoplada al crecimiento por extensión apical,
ya que mutaciones que impiden parcialmente la endocitosis provocan defectos en el
establecimiento de la polaridad [156]. Los endosomas tempranos se desplazan sobre
microtúbulos a grandes distancias, gracias a la acción de los motores moleculares dineína y
kinesina. Las GTPasas RabA y RabB (homólogos de RAB5 en mamíferos) se localizan en los
endosomas tempranos [157, 158], donde RabB media el reclutamiento de la fosfatidil inositol
(PtdIns)-3-kinasa, lo que cataliza la síntesis de PtdIns3P. El incremento de los niveles de este
lípido inicia la biogénesis de los cuerpos multivesiculares. Además, RabB coopera con PtdIns3P
para reclutar a Vps19 y Vps45 [158], lo que permite la recepción de tráfico del Golgi, proceso
necesario para la maduración de los endosomas. RabA es incapaz de reclutar estos efectores
eficientemente y RabB es el principal determinante de identidad de los endosomas tempranos.
RabB también recluta al complejo CORVET [158], que media la fusión de los endosomas
tempranos, para su maduración a endosomas tardíos, estos últimos controlados por la GTPasa
RabS (RAB7 en mamíferos).

Página 49
Introducción
1.7.2. Caracterización de la ruta secretora
Las hifas de los hongos filamentosos crecen por extensión apical gracias a la fusión de
vesículas secretoras con el ápice de las hifas, lo que provoca la liberación de sustrato y enzimas
para la construcción de nueva pared celular, además de aportar las membranas necesarias para el
crecimiento de la membrana plasmática. Esta gran dependencia de la ruta secretora implica que
tanto la patogenicidad de Aspergillus como su uso como productor de enzimas industriales
requieran que la ruta secretora funcione eficientemente, para permitir la invasión del huésped y
la secreción eficiente de las enzimas con interés biotecnológico, respectivamente [17].

El RE de A. nidulans se ha estudiado mediante el uso de una versión fluorescente de la

subunidad Sec63 del translocón [159]. Las observaciones microscópicas muestran que el RE
consiste en una red de endomembranas formada por las envolturas nucleares y RE periférico. Ni
el RE ni el aparato de Golgi se desensamblan durante el proceso de mitosis, lo que es
consistente con que el hecho de que la extensión apical no se detiene [159]. También se han
caracterizado parcialmente los ERES [24], que son numerosos y dispersos, como en S.
cerevisiae.

Al igual que en S. cerevisiae, en A. nidulans las cisternas del aparato de Golgi no se

encuentran apiladas, como ocurre en mamíferos, si no que están dispersas en el citoplasma [87,
160]. Cuando se observa el Golgi mediante microscopía óptica de fluorescencia éste se muestra
como una red dinámica de cisternas, a menudo interconectadas por estructuras tubulares [24,
38], lo que concuerda con observaciones realizadas al microscopio electrónico [160]. También
se ha observado in vivo la maduración de cisternas del Golgi temprano en cisternas del TGN
(Pantazopoulou y Peñalva, sin publicar), lo que apoya el modelo de maduración de cisternas.

En A. nidulans, las funciones y componentes básicos del aparato de Golgi parecen estar
conservados respecto al resto de eucariotas [16, 17, 160]. Como se ha explicado antes,
diferentes proteínas que se envían al Golgi en vesículas COPII son devueltas al RE en vesículas
COPI [50]. Este es el caso, por ejemplo, de los receptores transmembrana que reconocen cargo
soluble y lo incorporan en vesículas COPII, como RerA de A. nidulans [18]. Otro ejemplo es la
sintaxina SedV, una SNARE clave para la fusión de membranas en el Golgi [38, 161]. RerA y
SedV se encuentran principalmente en las membranas del Golgi temprano, las cuales también
contienen un conjunto de proteínas periféricas de membrana, como GrhA [24], que se reclutan
por GTPasas específicas y facilitan procesos de fusión de vesículas. En la fase de glicosilación
del Golgi (Figura I.9) las cisternas tienen en su membrana los transportadores necesarios para
importar al lumen los monosacáridos precursores desde el citosol, como el transportador GmtA
de A. nidulans [162], homólogo Vrg4p de S. cerevisiae [43]. También el complejo de anclaje
COG (conserved oligomeric Golgi) [163] media la organización de esta fase, ya que una
función deficiente de COG provoca defectos en la glicosilación proteica [164]. Se ha

Página 50
 Introducción
demostrado la importancia fisiológica de dos componentes de COG en A. nidulans, PodBCog2 y
SwoPCog4, al comprobar que los mutantes termosensibles podB1 y swoP1 causan defectos en la
polarización de las hifas, en la pared celular y en la glicosilación proteica [165]. Finalmente, las
cisternas que progresan al estadio de TGN adquieren una composición que les permite la
generación de vesículas de secreción y de tráfico a los endosomas. Las membranas del TGN
contienen el fosfolípido PtdIns4P y la proteína Sec7, la GEF que activa a Arf1 específicamente
en el TGN [18, 166], que ha sido estudiada extensamente en A. nidulans y que constituye un
marcador prototípico del TGN [24]. Sin embargo, el marcador más robusto del TGN es la
proteína de fusión entre mRFP y el dominio PH de la proteína humana de unión a oxysterol
(PHOSBP). Esta proteína quimérica se recluta de manera eficiente y específica a las cisternas del
TGN por detección simultánea de Arf1 en su estado activo y PtdIns4P [167].

El modelo de maduración de cisternas implica que las cisternas del TGN se deben
disipar por descomposición en vesículas de transporte. En A. nidulans se ha descrito el proceso
por el cual las cisternas del TGN se convierten en vesículas post-Golgi que se dirigen a la región
apical de la membrana plasmática [36]. Durante este proceso, las cisternas del TGN pierden
progresivamente su identidad de Golgi (pierden PHOSBP y Sec7) a medida que adquieren la
GTPasa RabEYpt31/RAB11, el determinante de identidad post-Golgi [36]. Para cuando RabE
alcanza su máximo de intensidad en estas cisternas, la señal de Sec7/ PHOSBP ha desaparecido.
En este punto, las membranas ricas en RabE viajan rápidamente al Spitzenkörper gracias a su
transporte mediado por los motores kinesina y miosina-5 [36], lo que es consistente con un
modelo por el cual RabE participa directa o indirectamente en el reclutamiento de dichos
motores. La biogénesis de vesículas en el TGN y su transporte a los endosomas, que había sido
filmada en S. cerevisiae [168], se ha documentado recientemente en A. nidulans [169]. A
diferencia de las cisternas del Golgi temprano, las del TGN contienen la t-SNARE TlgBTlg2, que
colocaliza con PHOSBP [18]. La Figura I.13 muestra un modelo sobre la organización y la
maduración del Golgi en A. nidulans.

Existen proteínas transmembrana que se localizan exclusivamente en la región apical de

la membrana plasmática, como la SNARE SynA (Snc1p en S. cerevisiae) [12] y diversas
quitinas sintasas [28, 170]. Se ha propuesto que dichas proteínas mantienen su localización
polarizada en la membrana plasmática mediante reciclaje endocítico [12, 157, 171, 172]. Según
esta hipótesis, cuando estas proteínas se alejan de la región apical, por difusión en la membrana,
son endocitadas y exocitadas de nuevo en el ápice celular. Otro pasajero de esta posible ruta
sería la flipasa de fosfolípidos DnfA [173].

Página 51
Introducción

Figura I.13. Representación esquemática de la maduración de cisternas en A. nidulans. Se

indican las tres fases funcionales propuestas previamente [135]. Las vesículas COPII se forman en los
ERES y se fusionan formando una cisterna del Golgi temprano. El tráfico retrógrado de vesículas
COPII (violeta) envía al RE proteínas residentes. Las cisternas del Golgi temprano contienen enzimas
de glicosilación (t0). A medida que el tiempo avanza (flechas dobles) una cisterna del Golgi temprano
se enriquece en cargos y en componentes del TGN (rojo). Finalmente, los componentes del TGN son
predominantes (t3) y las cisternas se descomponen en túbulos o vesículas que viajan a la membrana
plasmática. La SNARE SedV (Sed5 en S. cerevisiae) son los marcadores prototípicos del Golgi
temprano en A. nidulans. TlgB (Tlg2), HypB (Sec7) y PH OSBP marcan, por su parte, el TGN.
Modificado de Pantazopoulou et al. 2016 [160].

1.7.2.1. Los reguladores del Golgi: Rabs, Arfs y sus reguladores

Las GTPasas de la familia Rab han sido estudiadas en detalle en A. nidulans, a

diferencia de las correspondientes a la famila Arf/Sar. De estas últimas se ha determinado
únicamente que el homólogo de Arf1, denominado ArfA, es una GTPasa esencial que se
localiza en cisternas intracelulares, probablemente correspondientes al Golgi [174]. En relación
a la familia Rab, se necesitan tres GTPasas tipo Rab para organizar el Golgi: RabO (Ypt1p en
levaduras, RAB1 en mamíferos), RabC (Ypt6p, RAB6) y RabE (Ypt31p, RAB11). RabO y
RabE son esenciales, mientras que la deleción de rabC, pese a no ser letal, provoca la formación
de colonias pequeñas, afecta morfológicamente a las células y da lugar a un Golgi con cisternas
de menor tamaño [38]. Además, rabCΔ también provoca la deslocalización de VpsTVps10p, un
receptor de hidrolasas vacuolares que recicla entre los endosomas y el Golgi [38], lo que
concuerda con la función en el tráfico entre endosomas y Golgi atribuida a los homólogos de
RAB6. Por otro lado, la inactivación condicional de RabO desorganiza rápidamente el Golgi
temprano y el TGN [18]. Además de su papel en la organización del Golgi, RabO tiene una
función esencial en autofagia [166]. Finalmente, RabE ha sido estudiado en profundidad [36,

Página 52
 Introducción
37]. Como se explicó antes, RabE no es una proteína residente del Golgi, sino que se recluta a
las membranas del TGN en el proceso de formación de vesículas de secreción. La unión de
RabE al TGN está regulada por su GEF, que es crucial para la exocitosis [37]. Existía un largo
debate en la literatura sobre la identidad de la GEF de RabE/Ypt31p y la función del complejo
TRAPP en la organización del Golgi. hypA1 es un alelo termosensible del gen que codifica
Trs120 en A. nidulans [175], una subunidad del complejo TRAPPII [37]. Mediante la
caracterización de supresores extragénicos de hypA1 y ensayos enzimáticos de actividad GEF de
Trs120 se estableció, en A. nidulans, que TRAPPII es la GEF que activa a RabE y TRAPPI es la
versión del complejo TRAPP encargada de activar a RabO [37]. Queda por establecer si
TRAPPII se ensambla de novo en el TGN o a partir de TRAPPI, el cual llegaría al TGN por
maduración de las cisternas del Golgi temprano. En la Figura I.14 se muestra la localización en
la ruta secretora de proteínas clave para el tráfico.

Figura I.14. Representación esquemática de la posición funcional de diferentes proteínas del

tráfico intracelular de A. nidulans. Entre paréntesis se muestra su homólogo correspondiente en S.
cerevisiae. En el caso de RabB y de RabO también se indica, en segundo lugar, el homólogo en
mamíferos. MP: membrana plasmática.

1.7.2.2. El Spitzenkörper, el crecimiento polar y la síntesis de la pared celular

Una estructura específica de los hongos filamentosos, denominada Spitzenkörper (SPK)

(Figura I.15), parece ser crucial para la eficiencia de la extensión apical y para el
establecimiento del eje de polaridad [176]. Se trata de una acumulación de vesículas secretoras
subyacente a la membrana plasmática del ápice de las hifas. Mediante autorradiografías de
Mucor indicus se detectó en la región apical una acumulación de N-acetil-glucosamina, la

Página 53
Introducción
unidad monomérica de la quitina, lo que indicó que el crecimiento apical estaba correlacionado
con un mecanismo polarizado de construcción de la pared celular [177]. Se han propuesto dos
modelos para la construcción de la pared celular en la región apical. Numerosos autores han
propuesto que la síntesis de la pared celular debe incluir la participación de enzimas líticas (para
“ablandar” la pared en el ápice y permitir el crecimiento) y sintéticas [178, 179]. En contraste, el
segundo modelo no implica actividad lítica, sino que propone que en el ápice se sintetizaría una
pared celular deformable, que se rigidificaría en la región subapical por acción de
glicosiltransferasas [180]. En relación a la función del Spitzenkörper, un modelo propone que
éste se comporta como un centro donador de vesículas, desde el cual éstas viajan y se fusionan
con la región apical de la membrana plasmática, aportando la maquinaria enzimática necesaria
para la síntesis de pared celular. De hecho, en N. crassa se han localizado enzimas biosintéticas
de la pared celular en el Spitzenkörper [181, 182] y en A. nidulans diversas enzimas
sintetizadoras de quitina se encuentran tanto en el Spitzenkörper como en la membrana apical de
las hifas [28, 170]. Las vesículas del SPK provienen, al menos en parte, del TGN a través de la
ruta mediada por RabE [15, 36]. Recientemente se ha determinado una correlación entre la tasa
de secreción y la acumulación de vesículas en el SPK [183], lo que apoya la idea de que se trata
de un estadio previo a la exocitosis. Además, en el SPK parece haber dos tipos de vesículas
[173], lo que sugiere que es un centro de organización de la secreción con diferentes regiones
especializadas [173, 184].

Figura I.15. Spitzenkörper. Modelo simplificado que muestra la recepción de vesículas exocíticas
por parte del Spitzenkörper (SPK), de camino a la membrana plasmática. Las vesículas, cargadas con
enzimas y componentes necesarios para construir la pared celular, viajan hacia el SPK en
microtúbulos y filamentos de actina gracias a los motores kinesina-1 y miosina-5, respectivamente.
Desde el SPK se fusionan con la membrana plasmática, aumentando la superficie de ésta y liberando
el contenido necesario para la construcción de la pared celular. De este modo, la extensión apical y la
síntesis de pared celular ocurren de manera coordinada. Adaptado de Taheri-Talesh et al. 2012 [176].

Página 54
ANTECEDENTES Y
OBJETIVOS
 Antecedentes y Objetivos
Durante los años previos al desarrollo de este trabajo, en el campo de los hongos
filamentosos se empezaron a investigar los componentes de la ruta secretora, descubriéndose su
alto grado de conservación [24, 26, 174], como se ha explicado en la Introducción. También se
describió que las cisternas del Golgi de A. nidulans no son apiladas y por tanto se podían
resolver mediante microscopía óptica [24]. Este hecho, sumado al gran tamaño de sus células y
a la facilidad de manipular genética y microbiológicamente este hongo, abría la puerta a la
utilización de microscopía de fluorescencia in vivo como método para investigar los procesos de
tráfico de membranas en este organismo [16, 17].

En el momento del inicio de esta tesis doctoral, en el laboratorio donde se ha

desarrollado se había puesto en marcha la caracterización general de los componentes del tráfico
intracelular de A. nidulans mediante una combinación de bioquímica, genética clásica y
microscopía de fluorescencia in vivo, así como la investigación de los principales procesos de
tráfico conservados en eucariotas [16]. En concreto, se estaba investigando el proceso de
maduración de las cisternas del aparato de Golgi; la formación y la salida de vesículas
secretoras desde el TGN a la membrana plasmática, mediado por el complejo TRAPPII y la
GTPasa RabE/RAB11/Ypt31 [15, 36, 37]; el proceso de autofagia a partir de las membranas del
retículo endoplasmático (RE) en el que es esencial la participación de la GTPasa
RabO/RAB1/Ypt1 [166]; los complejos de proteínas SNAREs que median la fusión de
membranas [161]; el papel del citoesqueleto de actina y de tubulina en la exocitosis [15, 36]; y
la implicación de la SNARE SedV/sintaxina-5/Sed5 y la GTPasa RabO en la organización del
aparato de Golgi [18]. Para conseguir estos objetivos se estaban desarrollando marcadores
fluorescentes de los principales componentes del tráfico y se habían reunido numerosos
mutantes termosensibles de genes implicados en tráfico, ya fuese mediante su construcción por
genética reversa [18] o a partir de colecciones de mutantes condicionales obtenidas hacía
décadas mediante genética clásica [18, 37, 165, 185].

A. nidulans crece por extensión apical y ciertas proteínas integrales de membrana, como
SynA/Snc1, la ATPasa DnfA/Dnf1 y varias enzimas encargadas de la síntesis de pared celular,
se localizan exclusivamente en el casquete apical de la membrana plasmática [28, 38, 157, 173];
sin embargo, no se conocía el mecanismo por el cual estas proteínas de membrana se mantienen
polarizadas en dicha región, aunque se proponía que podría ocurrir por un proceso de reciclaje
endocítico [12, 38, 157]. Por otra parte, pese a que se habían estudiado las principales GTPasas
de la familia Rab implicadas en tráfico [18, 37, 38, 166, 186, 187], existía un vacío de
conocimiento respecto a las GTPasas de la familia Arf/Sar, de gran importancia en el tráfico de
membranas [7]. Por último, aunque se estaban investigando los interruptores moleculares del
tráfico y los procesos más importantes de intercambio de membranas, no se había iniciado la
investigación de los protagonistas principales de la ruta secretora: las proteínas que viajan en

Página 57
Antecedentes y Objetivos
ella, es decir los cargos. De hecho se desconocía si todas las proteínas que iban a secretarse al
medio o a la membrana plasmática viajaban o no por la misma ruta o por rutas diferentes y, si
fuese así, cuáles eran los requerimientos para cada una de las rutas.

En este contexto se inició la tesis doctoral, cuyos objetivos fueron los siguientes:

1. Desarrollar herramientas genéticas para bloquear el tráfico de las vesículas COPII

desde el retículo endoplasmático al aparato de Golgi y determinar la influencia de este
tráfico en la organización del aparato de Golgi y la secreción.

2. Estudiar la relación funcional existente entre el Golgi temprano y el trans-Golgi a través

de los reguladores (GeaA/Gea1 y HypB/Sec7) y los efectores (el complejo proteico COPI)
de Arf1.

3. Realizar una caracterización básica de las GTPasas de la familia Arf/Sar y de sus

proteínas reguladoras.

5. Determinar la ruta de exocitosis y los mecanismos por los cuales ciertas proteínas
integrales de membrana presentan una localización polarizada en el casquete apical de las
hifas.

6. Determinar las diferentes etapas de las rutas de exocitosis de una proteína soluble y de
una proteína anclada a glicosil fosfatidilinositol.

Página 58
MATERIALES Y
MÉTODOS
 Materiales y Métodos

3.1. Medios de cultivo para Aspergillus nidulans

Los cultivos de Aspergillus nidulans se incubaron a 37ºC si no se indica lo contrario. A

continuación, se detalla la composición de los medios utilizados, descritos por Cove [188].

3.1.1. Medio Completo (MCA) y Medio Completo de Regeneración (MCR)

Para el medio completo (MCA) líquido, por litro: 20 ml de solución de sales, 10 ml de
solución de casaminoácidos, 10 g de D-glucosa, 2 g de bactopeptona, 1 g de extracto de
levadura y 10 ml solución de vitaminas. Para el medio sólido, además, agar al 1% (p/v). Se
ajustó el pH a 6.5 con NaOH. El medio completo de regeneración (MCR) es MCA con sacarosa
1 M.

3.1.2. Medio Mínimo (MMA), Medio de Microscopía (WMM) y Medio Mínimo de

Regeneración (MMR)
Para el medio mínimo (MMA) líquido, por litro: 20 ml de solución de sales, D-glucosa
1% (p/v), tartrato diamónico 5 mM y los suplementos necesarios; pH 6.5. Para el medio sólido,
además, agar al 1% (p/v). Para el test de detección de la mutación ureB3 en vez de tartrato
diamónico se añadió urea a una concentración final de 5 mM. Para microscopía se utilizó una
versión del MMA líquido denominada watch minimal medium (WMM), cuya composición fue:
solución de sales sin fosfato 20 ml/l, NaH2PO4 17.5 mM, Na2HPO4 7.5 mM, D-glucosa 0.1%
(p/v), tartrato diamónico 5 mM, ampicilina (100 μg/ml) y los suplementos necesarios. El medio
mínimo de regeneración (MMR) es MMA con sacarosa 1 M.

3.1.3. Solución de sales y suplementos

Solución de sales (50x): por litro: KCl 26 g, KH2PO4 76 g, Mg2SO4 x 7 H2O 26 g y 50
ml de la solución de elementos traza sin fosfato.

Solución de sales sin fosfato (50x): igual a la anterior pero sin KH2PO4.

Solución de casaminoácidos (10x): 150 g de hidrolizado de caseína por litro.

Solución de elementos traza sin fosfato (1000x): por litro: Na2B4O x 10 H2O 40 mg,
CuCl2 x 2 H2O 400 mg, FeCl3 800 mg, ZnCl2 8 g, MnCl2 x 4 H2O 800 mg.

Solución de vitaminas (100x): por litro: tiamina 50 mg, biotina 10 mg, ácido nicotínico
100 mg, D-pantotenato de calcio 200 mg, piridoxina-HCl 50 mg, riboflavina 100 mg, inositol
24 g y ácido p-aminobenzoico 100 mg.

Suplementos:
Piridoxina-HCl: concentración final 2,5 μM.

Página 61
Materiales y Métodos
Ácido p-aminobenzoico: concentración final 14 μM.

Uracilo y uridina: concentración final 56 μg / ml y 122 μg / ml, respectivamente.

3.2. Cepas de Aspergillus nidulans utilizadas

Todas las cepas utilizadas en esta tesis doctoral se encuentran detalladas en la Tabla
M.1. Todas ellas son portadoras del alelo veA1 de pérdida de función que permite la conidiación
abundante en ausencia de luz [189]. Los marcadores utilizados han sido descritos previamente
en [152] y sus referencias.

Cepa Genotipo Fuente

MAD2 biA1 Nuestra colección
MAD2013 wA4 inoB2 niiA4 pyroA4 [pyrotrunc::gpdAmini::mRFP-PH OSBP] [24]
nkuAΔ::bar
MAD2277 wA4 inoB2 nkuAΔ::bar pyroA4 niiA4 rabSΔ::pyro fum [186]
MAD2384 pyroA4 5'UTR(slaB)::pyrGfum::niiAp::slaB pyrG89 nkuAΔ::bar [190]
MAD2744 yA2 pantoB100 pyroA4::[pyroAt-gpdAmini-gfp-tlgB] [18]
MAD2808 pyroA4[pyroAt:gpdAmini-mcherry-sedV] inoB2 nkuAΔ::bar wA4 niiA4 [18]
MAD3349 wA4 pyroA4::[pyro gpdAminimRFP-PHOSBP] pyrG89 nkuAΔ::bar [24]
MAD3434 hypB5 yA2 pyroA4 Nuestra colección
fum
MAD3448 pabaA1 pyroA4? rabSΔ::pyro [186]
MAD3574 pantoB100 hypB5 Nuestra colección
MAD3575 pabaA1 yA2 argB2[argB*-alcAp::mcherry::rabE] [36]
MAD3822 pabaA1 copAts yA2 Nuestra colección
MAD3837 inoB2 wA4 pyroA4[pyroAt::gpdAmini::mrfp::tlgB] argB2[argB*- [18]
gpdAmini::gfp-sedV]
MAD3949 yA2 pyroA4 pantoB100 [pantoBt-gpdAmini::gfp-rerA] [18]
MAD3981 pyroA4[pyroAt::gpdAmini::mCherry-sedV] (nkuAΔ::bar?) [18]
MAD3983 inoB2 pyroA4 niiA4 pantoB100 [pantoBt-gpdAmini::gfp-rerA] [18]
(nkuAΔ::bar?)
MAD3987 wA4 pyroA4[gpdAmini::mRFP-PHOSBP] (nkuAΔ::bar?) [24]
MAD4202 yA2 rabOA136D::pyrGfum pantoB100 pyrG89? [18]
MAD4503 pyroA4 copA-gfp::pyrGfum pyrG89 nkuAΔ::bar Este trabajo
MAD4504 pyroA4 copA-gfp::pyrGfum pyrG89 nkuAΔ::bar Este trabajo
MAD4505 pyroA4 copA-gfp::pyrGfum pyrG89 nkuAΔ::bar Este trabajo
MAD4506 Diploide pyroA4 copA-gfp::pyrGfum pyrG89 nkuAΔ::bar Este trabajo
MAD4507 Diploide pyroA4 copA-gfp::pyrGfum pyrG89 nkuAΔ::bar Este trabajo
MAD4585 pyrG89 pyroA4 sarA::pyrGfum nkuAΔ::bar Este trabajo
MAD4586 pyrG89 pyroA4 sarA::pyrGfum nkuAΔ::bar Este trabajo
MAD4587 pyrG89 pyroA4 sarA::pyrGfum nkuAΔ::bar Este trabajo
MAD4588 DIPLOIDE pyrG89 pyroA4 sarA::pyrGfum nkuAΔ::bar Este trabajo
MAD4599 pantoB100 pyroA4 copA-gfp::pyrGfum hypB5 nkuAΔ::bar? pyrG89? Este trabajo
MAD4600 pantoB100 copA-gfp::pyrGfum hypB5 nkuAΔ::bar? pyrG89? Este trabajo
MAD4601 pyroA4 copA-gfp::pyrGfum hypB5 nkuAΔ::bar? pyrG89? Este trabajo
MAD4603 copA-gfp::pyrGfum pyroA4 [pyroAt::gpdAmini::mrfp-PH OSBP] Este trabajo
nkuAΔ::bar? pyrG89?

Página 62
 Materiales y Métodos
Cepa Genotipo Fuente
MAD4605 pyroA4::[pyroAt-gpdAmini::mCherry-sedV] inoB2 copA-gfp::pyrGfum Este trabajo
nkuAΔ::bar pyrG89?
MAD4676 pyrG89 pyroA4 sarA1::pyrGfum nkuAΔ::bar Este trabajo
MAD4677 pyrG89 pyroA4 sarA2::pyrGfum nkuAΔ::bar Este trabajo
MAD4678 pyrG89 pyroA4 sarA3::pyrGfum nkuAΔ::Bar Este trabajo
MAD4679 pyrG89 pyroA4 sarA4::pyrGfum nkuAΔ::Bar Este trabajo
MAD4680 pyrG89 pyroA4 sarA5::pyrGfum nkuAΔ::bar Este trabajo
MAD4681 pyrG89 pyroA4 sarA6::pyrGfum nkuAΔ::bar Este trabajo
MAD4682 pyrG89 pyroA4 sarA7::pyrGfum nkuAΔ::bar Este trabajo
MAD4683 pyrG89 pyroA4 sarA8::pyrGfum nkuAΔ::bar Este trabajo
MAD4835 pantoB100 hypB5 geaA (c.3636A>G = Y1022C) Este trabajo
MAD4836 pantoB100 hypB5 geaA (c.3636A>G = Y1022C) Este trabajo
MAD4837 pantoB100 hypB5 geaA (c.3636A>G = Y1022C) Este trabajo
MAD4838 pantoB100 hypB5 geaA (c.3636A>G = Y1022C) Este trabajo
MAD4909 sarA[sarA6::pyrGfum] pyroA4 [pyroAt::gpdAmini::mRFP::PHOSBP] Este trabajo
inoB2 nkuAΔ::bar pyrG89?
MAD4910 sarA[sarA6::pyrGfum] pyroA4 [pyrotrunc:gpdAmini::mRFP-PH OSBP] Este trabajo
nkuAΔ::bar pyrG89?
MAD4911 wA4 sarA[sarA6::pyrGfum] pyroA4 [pyroAt::gpdAmini::mRFP-PHOSBP] Este trabajo
nkuAΔ::bar pyrG89?
MAD4912 pyroA4 [pyroA::gpdAmini::mRFP-PH OSBP] nkuA::bar pyrG89? [24]
MAD4913 wA4 sarA[sarA6::pyrGfum] sec23-gfp::pyrGfum pyroA4 Este trabajo
[pyroAt::gpdAmini::mRFP-PHOSBP] inoB2 nkuAΔ::bar pyrG89?
MAD4924 pyroA4 sarA[sarA6::pyrGfum] nkuA::bar? pyrG89? Este trabajo
MAD4927 yA2 pyroA4[pyroAt gpdAmini::gfp-tlgB] sarA6::pyrGfum nkuAΔ::bar? Este trabajo
pyrG89?
MAD4928 pyroA4[pyroAt gpdAmini::gfp-tlgB] sarA6::pyrGfum nkuAΔ::bar? Este trabajo
pyrG89?
MAD4929 pyroA4[pyroAt gpdAmini::gfp-tlgB] sarA6::pyrGfum nkuAΔ::bar? Este trabajo
pyrG89?
MAD4933 wA4 pyroA4 pantoB100[pantoBt-gpdAmini::gfp-rerA] sarA6::pyrGfum Este trabajo
nkuAΔ::bar? pyrG89?
MAD4934 pyroA4 pantoB100[pantoBt-gpdAmini::gfp-rerA] sarA6::pyrGfum Este trabajo
nkuAΔ::bar? pyrG89?
MAD4935 pyroA4 pantoB100[pantoBt-gpdAmini::gfp-rerA] sarA6::pyrGfum Este trabajo
nkuAΔ::bar? pyrG89?
MAD4936 yA2 inoB2 pyroA4 [pyroAt gpdAmini mCherry-sedV] sarA6::pyrGfum Este trabajo
nkuAΔ::bar? pyrG89?
MAD4937 yA2 inoB2 pyroA4 [pyroAt gpdAmini mCherry-sedV] sarA6::pyrGfum Este trabajo
nkuAΔ::bar? pyrG89?
MAD4938 yA2 inoB2 pyroA4 [pyroAt gpdAmini mCherry-sedV] sarA6::pyrGfum Este trabajo
nkuAΔ::bar? pyrG89?
MAD4955 nudA2 pyrG89 wA3 chaA1 Nuestra colección
MAD4957 nudA5 pyrG89 wA3 chA1 Nuestra colección
MAD4976 rabE::rabEp::gfprabE::gfp-prabE::pyrGfum sarA[sarA6::pyrGfum] Este trabajo
nkuAΔ::bar? pyrG89?
MAD4982 pyroA4 inoB2 copA-gfp::pyrGfum sarA[sarA6::pyrGfum] nkuAΔ::bar Este trabajo
pyrG89?
MAD4983 wA4 pyroA4 pantoB100[pantoBt-gpdAmini::gfp-rerA] nkuAΔ::bar? [18]
pyrG89?
MAD5087 pyroA4 synA::pyrG fum::gfp-synA nkuAΔ::bar sarA[sarA6::pyrGfum] Este trabajo
pyrG89?
MAD5088 pyroA4 sec23-gfp::pyrGfum sarA[sarA6::pyrGfum] nkuAΔ::bar? Este trabajo
pyrG89? wA4?
MAD5097 wA4 pyroA4 [pyroAt gpdAmini mCherry-sedV] nkuAΔ::bar? [18]

Página 63
Materiales y Métodos
Cepa Genotipo Fuente
MAD5107 pabaA1 pyrG89 nkuAΔ::bar geaA1 Este trabajo
MAD5170 pabaA1 pyrG89 wA3 pyroA4 nkuAΔ::bar geaA1 Este trabajo
MAD5171 pabaA1 pyrG89 wA3 nkuAΔ::bar geaA1 Este trabajo
MAD5192 pyrG89 nkuAΔ::bar arl3 (AN0634)Δ::pyrGfum pyroA4 Este trabajo
MAD5193 pyrG89 nkuAΔ::bar arl3 (AN0634)Δ::pyrG fum pyroA4 Este trabajo
MAD5194 pyrG89 nkuAΔ::bar arl3 (AN0634)Δ::pyrG fum pyroA4 Este trabajo
MAD5228 pyrG89 nkuAΔ::bar arl1 (AN5912)Δ::pyrG fum pyroA4 Este trabajo
MAD5230 pyrG89 nkuAΔ::bar arfX (AN3934)Δ::pyrG fum pyroA4 Este trabajo
MAD5231 pyrG89 nkuAΔ::bar arfX (AN3934)Δ::pyrG fum pyroA4 Este trabajo
MAD5232 yA2 pyrG89? nkuAΔ::bar? [rabEp::rabE::rabEp::gfp-rabE::pyrGfum] Este trabajo
sarA[sarA6::pyrGfum]
MAD5253 pyrG89? hypB5 nkuAΔ::bar? geaA1-gfp::3utr::pyrG fum Este trabajo
MAD5254 pyrG89? inoB2 pyroA4 [pyroAt gpdAmini mCherry-sedV] nkuAΔ::bar Este trabajo
geaA::gfp::3utr::pyrG fum
MAD5255 pyrG89? inoB2 pyroA4 [pyroAt gpdAmini::mCherry-sedV] nkuAΔ::bar Este trabajo
geaA-gfp::3utr::pyrG fum
MAD5256 pyrG89? pyroA4 [pyroAt gpdAmini::mCherry-sedV] nkuAΔ::bar geaA- Este trabajo
gfp::3utr::pyrG fum niiA4
MAD5257 pyrG89? inoB2 pyroA4[pyroAt:: gpdAmini::mrfp-PHOSBP] nkuAΔ::bar Este trabajo
geaA-gfp::3utr::pyrG fum
MAD5258 pyrG89? pyroA4[pyroAt:: gpdAmini::mrfp-PHOSBP] nkuAΔ::bar geaA- Este trabajo
gfp::3utr::pyrG fum
MAD5259 pyrG89? pyroA4 [pyroAt gpdAmini mCherry-sedV] nkuAΔ::bar geaA1- Este trabajo
gfp::3utr::pyrG fum
MAD5260 pyrG89? pabaA1 pyroA4 [pyroAt gpdAmini::mCherry-sedV] Este trabajo
nkuAΔ::bar geaA1-gfp::3utr::pyrG fum niiA4
MAD5261 pyrG89? pyroA4[pyroAt:: gpdAmini::mRFP-PHOSBP] nkuAΔ::bar Este trabajo
geaA1-gfp::3utr::pyrG fum niiA4
MAD5262 pyrG89? pyroA4[pyroAt:: gpdAmini::mRFP-PHOSBP] nkuAΔ::bar Este trabajo
geaA1-gfp::3utr::pyrG fum niiA4
MAD5263 pyrG89? pabaA1 hypB5 nkuAΔ::bar? geaA1-gfp::3utr::pyrG fum Este trabajo
MAD5266 pyrG89? pyroA4 [pyroAt::gpdAmini mCherry-sedV] ¿nkuAΔ::argB ó Este trabajo
nkuAΔ::bar ó nkuAwt? sec63-gfp::pyrG fum
MAD5267 pyrG89? inoB2 pyroA4 [pyroAt::gpdAmini mCherry-sedV] Este trabajo
¿nkuAΔ::argB ó nkuAΔ::bar ó nkuAwt? sec63-gfp::pyrG fum
sarA[sarA6::pyrG fum]
MAD5278 pyrG89 wA4 inoB2 pyroA4 nkuAΔ::bar? pacC900? hhoA- Este trabajo
mCherry::pyroA sarA6::pyrG fum
MAD5279 pyrG89 wA4 pyroA4 nkuAΔ::bar? pacC900? hhoA-mCherry::pyroA Este trabajo
sarA6::pyrG fum
MAD5315 geaA1 pantoB100[pantoBt-gpdAmini::gfp-rerA] nkuAΔ::bar? Este trabajo [18]
MAD5316 geaA1 pantoB100[pantoBt-gpdAmini::gfp-rerA] pyroA4[pyroAt:: Este trabajo [18]
gpdAmini::mRFP-PHOSBP] nkuAΔ::bar?
MAD5323 arl3Δ::pyrG fum pyroA4 pabaA1 geaA1 pyrG89? nkuAΔ::bar? Este trabajo
MAD5324 arl3Δ::pyrG fum pabaA1 geaA1 pyrG89? nkuAΔ::bar? Este trabajo
MAD5325 arl1Δ::pyrG fum pabaA1 geaA1 pyrG89? nkuAΔ::bar? Este trabajo
MAD5326 pyroA4 pabaA1 geaA1 nkuAΔ::bar? Este trabajo
MAD5327 arl1Δ::pyrG fum pyroA4 geaA1 pyrG89? nkuAΔ::bar? Este trabajo
MAD5369 pyrG89 nkuAΔ::bar pyroA4 inuA-HA::3'utr::pyrG fum (AN11778) Este trabajo
MAD5394 pabaA1 wA3 sarA6::pyrG fum Este trabajo
MAD5395 pabaA1 sarA6::pyrG fum Este trabajo
MAD5396 pabaA1 wA3 sarA8::pyrG fum Este trabajo
MAD5397 pabaA1 sarA8::pyrG fum Este trabajo

Página 64
 Materiales y Métodos
Cepa Genotipo Fuente
MAD5433 AN6120Δ::pyrG fum pyrG89 pyroA4 nkuAΔ::bar Este trabajo
MAD5434 AN6120Δ::pyrG fum pyrG89 pyroA4 nkuAΔ::bar Este trabajo
MAD5435 AN6120Δ::pyrG fum pyrG89 pyroA4 nkuAΔ::bar Este trabajo
MAD5458 AN3438Δ::pyrG fum pyrG89 pyroA4 nkuAΔ::bar Este trabajo
MAD5459 AN3438Δ::pyrG fum pyrG89 pyroA4 nkuAΔ::bar Este trabajo
MAD5469 pyrG89 AN4274Δ::pyrG fum pyroA4 nkuAΔ::bar Este trabajo
MAD5470 pyrG89 AN4274Δ::pyrG fum pyroA4 nkuAΔ::bar Este trabajo
MAD5479 AN6033Δ::pyrG fum pyrG89 pyroA4 nkuAΔ::bar Este trabajo
MAD5480 AN6033Δ::pyrG fum pyrG89 pyroA4 nkuAΔ::bar Este trabajo
MAD5481 arl3Δ::pyrG fum hypB5 geaA1 pyrG89? nkuAΔ::bar? Este trabajo
MAD5482 arl3Δ::pyrG fum hypB5 pyrG89? nkuAΔ::bar? Este trabajo
MAD5483 arl3Δ::pyrG fum hypB5 pyrG89? nkuAΔ::bar? Este trabajo
MAD5484 arl3Δ::pyrG fum hypB5 geaA1 pantoB100 pyrG89? nkuAΔ::bar? Este trabajo
MAD5485 arl1Δ::pyrG fum hypB5 geaA1 pyrG89? nkuAΔ::bar? Este trabajo
MAD5486 arl1Δ::pyrG fum hypB5 pyrG89? nkuAΔ::bar? Este trabajo
MAD5487 arl1Δ::pyrG fum hypB5 pyrG89? nkuAΔ::bar? Este trabajo
MAD5488 arl1Δ::pyrG fum hypB5 geaA1 pyrG89? nkuAΔ::bar? Este trabajo
MAD5545 pyroA4 pabaA1 inuA-HA::3'utr::pyrG fum (AN11778) wA3 Este trabajo
sarA8::pyrG fum pyrG89? nkuAΔ::bar?
MAD5546 pyroA4 inuA-HA::3'utr::pyrG fum (AN11778) sarA8::pyrG fum pyrG89? Este trabajo
nkuAΔ::bar?
MAD5547 pabaA1 inuA-HA::3'utr::pyrG fum (AN11778) wA3 pyrG89? Este trabajo
nkuAΔ::bar?
MAD5548 wA3 inoB2 sarA60::pyrG fum Este trabajo
MAD5549 inoB2 sarA60::pyrG fum Este trabajo
MAD5550 pabaA1 sarA60::pyrG fum Este trabajo
MAD5558 AN4274Δ::pyrG fum pyrG89 pyroA4 nkuAΔ::bar Este trabajo
MAD5559 pyrG89 pyroA4 nkuAΔ::bar chsB-gfp::pyrG fum Este trabajo
MAD5560 pyrG89 pyroA4 nkuAΔ::bar chsB-gfp::pyrG fum Este trabajo
MAD5617 pabaA1 sarA8 v2 Este trabajo
MAD5620 pyrG89? nkuAΔ::bar pyroA4 inuA-HA::pyrG fum hypA1 pantoB100 Este trabajo
MAD5623 pyrG89 rabBΔ::riboB fum nkuAΔ::bar pyroA4 inuA-HA::3'utr::pyrG fum Este trabajo
riboB2
MAD5624 pyrG89 rabBΔ::riboB fum nkuAΔ::bar pyroA4 inuA-HA::3'utr::pyrG fum Este trabajo
riboB2
MAD5625 pyrG89 rabBΔ::riboB fum nkuAΔ::bar pyroA4 inuA-HA::3'utr::pyrG fum Este trabajo
riboB2
MAD5626 pyrG89 nkuAΔ::bar pyroA4 chsB-mCherry::3'utr::pyrG fum Este trabajo
MAD5627 pyrG89 nkuAΔ::bar pyroA4 gcs1Δ::pyrG fum (gcs1 es AN2222) Este trabajo
MAD5628 pyrG89 nkuAΔ::bar pyroA4 gcs1Δ::pyrG fum Este trabajo
MAD5629 pyrG89 nkuAΔ::bar pyroA4 AN1629Δ::pyrG fum Este trabajo
MAD5682 pyrG89? nkuAΔ::bar? inuA-HA::3'utr::pyrG fum pyroA4 vps33ts Este trabajo
MAD5683 pyrG89? hypB5 nkuAΔ::bar? inuA-HA-3'utr-pyrG fum Este trabajo
MAD5685 pyrG89 nkuAΔ::bar pyroA4 [upstream chsB::chsB- Este trabajo
gfp::3'utr::term::pyrG fum::downstream::plasmid::chsBp::chsB]
MAD5686 pyrG89 nkuAΔ::bar pyroA4 [upstream chsB-chsB- gfp::3'utr::term:: Este trabajo
pyrG fum::downstream::plasmid::chsBp::chsB]
MAD5687 pyrG89 nkuAΔ::bar pyroA4 [upstream chsB::chsB- mCherry::3'utr:: Este trabajo
term::pyrG fum::downstream::plasmid::chsBp::chsB]
MAD5688 pyrG89 nkuAΔ::bar pyroA4 [upstream chsB::chsB::3'utr::term:: Este trabajo
downstream::plasmid::chsBp::chsB-mCherry::3'utr::pyrG fum]

Página 65
Materiales y Métodos
Cepa Genotipo Fuente
MAD5689 pyrG fum::gfp-synA gcs1Δ::pyrG fum pyrG89? nkuAΔ::bar? Este trabajo
MAD5690 pyrG fum::gfp-synA gcs1Δ::pyrG fum pyroA4 pyrG89? nkuAΔ::bar? Este trabajo
MAD5691 pyrG fum::gfp-synA gcs1Δ::pyrG fum biA1 pyrG89? nkuAΔ::bar? Este trabajo
MAD5692 rabDΔ::pyrG fum gcs1Δ::pyrG fum pyroA4 pabaA1 pyrG89? Este trabajo
nkuAΔ::bar?
MAD5700 synAΔ::pyrG fum pyrG89? nkuAΔ::bar? gcs1Δ::pyrG fum (gcs1 es Este trabajo
AN2222)
MAD5701 synAΔ::pyrG fum pabaA1 pyrG89? nkuAΔ::bar? gcs1Δ::pyrG fum (gcs1 Este trabajo
es AN2222)
MAD5702 synAΔ::pyrG fum pyrG89? nkuAΔ::bar? pyroA4 gcs1Δ::pyrG fum (gcs1 Este trabajo
es AN2222)
MAD5703 pabaA1 pyrG89? nkuAΔ::bar? gcs1Δ::pyrG fum (gcs1 es AN2222) Este trabajo
MAD5765 pyrG89 wAΔ [chsB-gfp::pyrG fum] pyroA4 nkuAΔ::bar Este trabajo
MAD5804 pyroA4[pyroAt:: gpdAmini::sp-gfp-EglC] pantoB100 Este trabajo
MAD5805 pyroA4[pyroAt::gpdAmini::sp-gfp-EglC] pantoB100 Este trabajo
MAD5806 pyroA4[pyroAt:: gpdAmini::sp-HA-inuA] pantoB100 Este trabajo
MAD5807 pyroA4[pyroAt:: gpdAmini::sp-HA-inuA] pantoB100 Este trabajo
MAD5808 pyrG89 eglC::pyrG pyroA4 nkuAΔ::bar Este trabajo
MAD5809 pyrG89 eglC-gfp-GPIsp::pyrG fum pyroA4 nkuAΔ::bar Este trabajo
MAD5810 pyrG89 eglC-gfp-GPIsp::pyrG fum pyroA4 nkuAΔ::bar Este trabajo
MAD5816 AN4274Δ::pyrG fum pyroA4 wA3 Este trabajo
MAD5817 An2222Δ::pyrG fum wA3 pabaA1 Este trabajo
MAD5818 An2222Δ::pyrG fum wA3 pabaA1 Este trabajo
MAD5833 pabaA1 wAΔ [chsB-gfp::pyrG fum] Este trabajo
MAD5834 pabaA1 wAΔ [chsB-gfp::pyrG fum] pyroA4 Este trabajo
MAD5835 wAΔ [chsB-gfp::pyrG fum] sarA6::pyrG fum Este trabajo
MAD5851 pyrG89 nkuAΔ::bar pyroA4 pyrG fum::chsBprom-gfp-chsB Este trabajo
MAD5852 pyrG89 nkuAΔ::bar pyroA4 pyrG fum::chsBprom-gfp-chsB Este trabajo
MAD5853 pyrG89 nkuAΔ::bar pyroA4 pyrG fum::chsBprom-gfp-chsB DIPLOIDE Este trabajo
gfp-chsb / chsbwt
MAD5854 pyrG89 nkuAΔ::bar pyroA4 pyrG fum::chsBprom-chsB Este trabajo
MAD5855 pyrG89 wAΔ [gfp-chsB::pyrG fum] nkuAΔ::bar pyroA4 Este trabajo
MAD5856 pyrG89 wAΔ [gfp-chsB::pyrG fum] nkuAΔ::bar pyroA4 Este trabajo
MAD5882 pyrG89 gelE-gfp-GPIsp::pyrG fum pyroA4 nkuAΔ::bar Este trabajo
MAD5883 pyrG89 gelE-gfp-GPIsp::pyrG fum pyroA4 nkuAΔ::bar Este trabajo
MAD5884 pyrG89 pabaA1 nkuAΔ::bar? pyrG fum::gfp-chsB rabOts Este trabajo
MAD5885 pyrG89 nkuAΔ::bar? pyroA4 pyrG fum::gfp-chsB rabOts Este trabajo
MAD5886 pyrG89 pabaA1 nkuAΔ::bar? pyroA4 pyrG fum::gfp-chsB rabOts Este trabajo
MAD5887 pyrG fum::gfp-chsB sarA6 pabaA1 pyrG89? Este trabajo
MAD5894 hypB5 pyrG fum::gfp-chsB Este trabajo
MAD5895 pyrG89 nkuAΔ::bar pyroA4[gpdAmini::mRFP::PHOSBP] pyrG fum::gfp- Este trabajo
chsB
MAD5896 pyrG89 wA4 nkuAΔ::bar pyroA4[gpdAmini::mRFP::PHOSBP] Este trabajo
pyrGfum::gfp-chsB
MAD5897 hypA1 pyrGfum::chsBprom::gfp-chsB nkuA::bar? pyrG89? pabaA1 Este trabajo

MAD5898 pyroA4 pabaA1 wA3 nkuA::bar? pyrG89? hypA1 pyrG fum::gfp-chsB Este trabajo
MAD5924 pabaA1 pyrG89 yA2 pyrG fum
::gfp-chsB abpA-mRFP::pyrG fum Este trabajo
nkuAΔ::bar?
MAD5925 pyrG89 pyrG fum::gfp-chsB abpA-mRFP::pyrG fum nkuA::bar? Este trabajo

Página 66
 Materiales y Métodos
Cepa Genotipo Fuente
MAD5927 inuA-HA-3'utr::pyrG fum pyroA4 riboB2 sedVts::pyrG fum nkuAΔ::bar? Este trabajo
pyrG89?
MAD5928 pyrG89 nkuAΔ::bar pyroA4 pyrG fum::chsBprom::mCherry-chsB Este trabajo
MAD5929 AN4274Δ::pyrG fum AN2222Δ::pyrG fum wA3 pabaA1 Este trabajo
MAD5954 rabOts inuA-HA nkuAΔ::bar Este trabajo
MAD5962 sarA6::pyrG fum eglC-gfp-GPIsp::pyrG fum pyrG89? nkuAΔ:: bar? Este trabajo
MAD5963 wA3 sarA6::pyrG fum eglC-gfp-GPIsp::pyrG fum pyrG89? nkuAΔ:: bar? Este trabajo
pabaA1 pyroA4
MAD5965 nkuAΔ:: bar pyrG89 rabCΔ::riboBfum riboB2 [38]
MAD5979 inuA-HA-3'utr::pyrG fum podB1 wA3 riboB2 Este trabajo
MAD5980 inuA-HA-3'utr::pyrG fum podB1 wA3 Este trabajo
MAD5989 yA2 pyroA4[pyroAt::gpdAmini::eglC-gfp-GPIsp] pantoB100 Este trabajo
MAD6058 pyrG fum::mCherry-chsB pyrG fum::gfp-synA pyroA4 pyrG89? nkuAΔ:: Este trabajo
bar?
MAD6060 wA3 sarA6::pyrG fum pyroA4[pyroAt::gpdAmini::eglC-gfp-GPIsp] Este trabajo
pabaA1
MAD6065 wA3 sarA6::pyrG fum pyroA4[pyroAt::gpdAmini::eglC-gfp-GPIsp] Este trabajo
pabaA1
MAD6066 wA3 sarA6::pyrG fum pyroA4[pyroAt::gpdAmini::eglC-gfp-GPIsp] Este trabajo
pantoB100
MAD6115 pyrG89? wA3 inuA-HA-3'utr::pyrG fum nkuAΔ:: bar? vpsTΔ::pyrG fum Este trabajo
MAD6116 pyrG89? nkuAΔ:: bar? pantoB100 vps33ts pyrG fum::gfp-chsB Este trabajo
MAD6117 yA2 pabaA1 riboB2 inuA-HA-3'utr::pyrG fum sodVI (copA-ts) Este trabajo
MAD6124 pyroA4[pyroAt::gpdAmini::eglC-gfp-GPIsp] hypA1 wA3 pyrG89? Este trabajo
nkuAΔ:: bar? pantoB100
MAD6125 pyroA4[pyroAt::gpdAmini::eglC-gfp-GPIsp] hypA1 wA3 pyrG89? Este trabajo
nkuAΔ:: bar?
MAD6145 pyrG89? nkuAΔ::bar? pyroA4[pyroAt::rabOp-gfp-rabO] pyrG Este trabajo
fum
::mCherry-chsB pantoB100
MAD6152 pyrG89 pabaA1 nkuAΔ::bar pyroA4 pyrG fum::mCherry-chsB Este trabajo
geaA1::gfp::3’utr::pyrG fum
MAD6153 pyrG89 nkuAΔ::bar pyroA4 pyrG fum::mCherry-chsB Este trabajo
geaA1::gfp::3’utr::pyrG fum
MAD6158 pyrG89? nkuAΔ::bar pantoB100 pyrG fum::mCherry-chsB Este trabajo
MAD6159 pyrG89? dnfBΔ::pyrG fum pyrG fum-gfp-synA nkuAΔ::bar pyroA4 pyrG Este trabajo
fum
::mCherry-chsB
MAD6182 pyrG fum::mCherry-chsB synA::pyrG fum::gfp-synA sarA6::pyrG fum Este trabajo
pyroA4 pyrG89? nkuAΔ:: bar?
MAD6183 pyrG fum::mCherry-chsB synA::pyrG fum::gfp-synA sarA6::pyrG fum Este trabajo
pyroA4 pabaA1 pyrG89? nkuAΔ:: bar?
MAD6184 pabaA1 synAΔ::pyrG fum pyrG89? nkuAΔ::bar? pyrG fum::mCherry- Este trabajo
chsB
MAD6202 wA3 hypA1 copA-gfp::pyrG fum pyroA4 nkuAΔ::bar Este trabajo
MAD6204 pyrG fum::mCherry-chsB ΔdnfA::pyrG fum pyroA4? pyrG89? Este trabajo
nkuAΔ::bar?
MAD6210 pyrG89 nkuAΔ:: bar riboB2 chs5 (AN8710)Δ::pyrG fum Este trabajo
MAD6211 pyrG89 nkuAΔ:: bar riboB2 chs5 (AN8710)Δ::pyrG fum Este trabajo
MAD6220 pabaA1 pyrG89 nkuA::bar copA-gfp-pyrG fum geaA1 Este trabajo
MAD6221 pabaA1 pyrG89 nkuA::bar copA-gfp-pyrG fum geaA1 Este trabajo
MAD6222 nkuAΔ:: bar pyrG89 rabCΔ::riboB fum riboB2 pyrG fum-gfp-chsB Este trabajo
MAD6253 hypB5 geaA1-gfp pyrG fum::chsBp-mcherry-chsB pyroA4 pyrG89? Este trabajo
nkuAΔ::bar?
MAD6254 hypB5 geaA1-gfp pyrG fum::chsBp::mcherry-chsB pyroA4 pantoB100 Este trabajo
pyrG89? nkuAΔ::bar?

Página 67
Materiales y Métodos
Cepa Genotipo Fuente
MAD6268 pyrG fum::chsBprom::mCherry-chsB pyroA4::[pyroAt::gpdAmini::gfp- Este trabajo
tlgB] pyrG89? nkuAΔ::bar? argB2[argB*-alcA-gfp-rabE]?
MAD6269 hypB5 pyrG fum::chsBprom::mCherry-chsB Este trabajo
pyroA4::[pyroAt::gpdAmini::gfp-tlgB] pyrG89? nkuAΔ::bar?
argB2[argB*-alcA::gfp-rabE]?
MAD6312 sarA8::pyrGfum inoB2 pantoB100 [pantoBt-gpdAmini::gfp-rerA] Este trabajo
MAD6313 sarA8::pyrGfum inoB2 pyroA4[pyroAt-gpdAmini::mCherry-sedV] Este trabajo
MAD6314 sarA8::pyrGfum pantoB100 [pantoBt-gpdAmini::gfp-rerA] Este trabajo
MAD6315 sarA8::pyrGfum pyroA4[pyroAt-gpdAmini::mCherry-sedV] Este trabajo
MAD6327 pyrG89 riboBfum-prom-gfp-chsB nkuAΔ::bar pyroA4 riboB2 Este trabajo
MAD6328 pyrG89 riboB fum-prom-gfp-chsB nkuAΔ::bar pyroA4 riboB2 Este trabajo
MAD6353 wA3 rabSΔ::pyroA fum inuA-HA::pyrG fum inoB2? niiA4? pyroA4? Este trabajo
riboB2? nkuAΔ::bar?
MAD6402 fimAΔ::tn31::pyr4 pyrG89? nkuAΔ::bar pyrGfum::chsBprom::gfp- Este trabajo
chsB pantoB100
MAD6405 yA2 pantoB100 sarA8::pyrG fum pyroA4::[pyroAt::gpdAmini::gfp-tlgB] Este trabajo
MAD6407 pyrG89 chs5 (AN8710)Δ::pyrGfum nkuAΔ::bar pyroA4 riboB fum:: Este trabajo
chsBprom::gfp-chsB riboB2
MAD6422 pyrG89 vps52::pyrG fum nkuAΔ::bar pyroA4 riboB fum::chsBprom::gfp- Este trabajo
chsB riboB2
MAD6495 pantoB100? pyroA4::[pyroAt::gpdAmini::gfp-tlgB] pyrG89? Este trabajo
rabBΔ::riboB fum nkuAΔ::bar? pyroA4? inuA-HA::3'utr::pyrG fum
riboB2?
MAD6496 pyrG89? riboB2 wAΔ [gfp-chsB::pyrG fum] nkuAΔ::bar pyroA4 Este trabajo
MAD6510 inoB2 niiA4 pyrG fum::chsBprom::gfp-chsB Este trabajo
pyroA4[pyroAt::gpdAmini::mCherry-sedV] nkuAΔ::bar pyrG89?
MAD6511 pyrG89 riboB fum-chsBprom::gfp-chsB nkuAΔ::bar pyroA4 Este trabajo
:pyrGfum::niiAp::slaB riboB2
MAD6552 nudA2 pyrG89? chaA1 nkuAΔ::bar? pyrG fum::chsBprom::gfp-chsB Este trabajo
pyroA4?
MAD6553 wA3 nudA5 pyrG89? nkuAΔ::bar? pyrG fum::chsBprom::gfp-chsB Este trabajo
pyroA4?
MAD6559 pyrG89? pabaA1 rabBΔ::riboB fum nkuAΔ::bar? pyroA4 inuA-HA:: Este trabajo
3'utr::pyrG fum ? riboB2? pyrGfum::chsBprom::gfp-chsB

3.3. Plásmidos y oligonucleótidos utilizados

3.3.1. Plásmidos
Todos los plásmidos fueron comprobados mediante digestiones analíticas y
secuenciación. El plásmido p1660 se utilizó para la obtención de plásmidos con los que
transformar A. nidulans e integrar transgenes en pyroA4, de tal manera que su expresión
estuviese controlada por una forma atenuada del promotor del gen gpdA, denominada gpdAmini.

pgpdAmini::inuA-HA (p2047)

La secuencia codificante del gen inuA se amplificó con oligonucleótidos en cuyos

extremos se habían introducido las dianas de NcoI y EcoRI. El producto de la amplificación y el
plásmido p1660 se digirieron con NcoI y EcoRI y se ligaron ambos fragmentos. Después se

Página 68
 Materiales y Métodos
introdujo HA3 mediante ligación EcoRI/XmaI, obteniéndose el plásmido p2047, para la
obtención de una estirpe con el transgén inuA-HA3 integrado en pyroA4, con el gen pyroA
silvestre reconstruido.

pgpdAmini::HA-inuA (p2250)

Se realizó una PCR de fusión de tal manera que se obtuviese un transgén que codificase
el péptido señal de inuA en primer lugar, seguido de tres copias de HA y del resto de la
secuencia codificante de inuA. Esta fusión se clonó mediante digestión NcoI/XmaI en p2047,
después de eliminar el inserto NcoI/XmaI que éste contenía.

pgpdAmini::gfp-gelE y pgpdAmini::gfp-eglC (p2247)

Se realizó una PCR de fusión para unir la región 3’del promotor gpdAmini, la secuencia
del péptido señal de eglC o gelE, la secuencia de GA5 (5 x Gly-Ala) -GFP-GA5 y el resto del
ORF de eglC o gelE, en el orden enunciado. Esta PCR de fusión se amplificó con
oligonucleótidos que contuviesen en los extremos las dianas KpnI y XmaI y se clonó en p1881,
después de eliminar el inserto KpnI/XmaI que el plásmido contenía. p1881 es un derivado de
p1660 (descrito antes).

pgpdAmini::eglC-gfp-gpi (p2259)

Mediante PCR se fusionaron la región 3’ del promotor gpdAmini, los primeros 1077
nucleótidos del ORF de eglC, la secuencia de GFP y el resto del ORF de eglC, en este orden.
Este producto de fusión se amplificó con oligonucleótidos que contuviesen en los extremos las
dianas KpnI y XmaI y se clonó en p1881 mediante digestión KpnI/XmaI. p1881 es un derivado
de p1660.

pchsB-gfp (p2241) y pchsB-mcherry (p2242)

Estos plásmidos se utilizaron para integrar en el locus chsB el transgén chsB-gfp o chsB-
mcherry sin eliminar el gen chsB endógeno. De esta manera se comprobó que los alelos chsB-
gfp y chsB-mcherry eran recesivos (ver Resultados). Para obtener dichos plásmidos, se
amplificó la región codificante de chsB y los 711 pb anteriores a ella, que debían de contener la
región promotora de chsB. Posteriormente se amplificó la secuencia de GA5-GFP o GA5-
mCherry, el marcador de selección pyrGfum y los 800 nucleótidos aguas abajo de la región
codificante de chsB. Estos fragmentos se unieron por PCR de fusión para generar un producto
promotor-chsB-GA5-GFP-pyrGfum-3’ chsB. Este producto se clonó en pGEM-T Easy (Promega).

Página 69
Materiales y Métodos
3.3.2. Oligonucleótidos
Los oligonucleótidos utilizados en este trabajo (Tabla M.2) fueron sintetizados por
Sigma-Aldrich.

Tabla M.2. Oligonucleótidos utilizados en esta tesis.

Código Nombre Secuencia
MHG_8 GeaA-Rev4 GATCCGCGCTATAAATGCCC
MHG_9 GeaA-Fw4 GCCCCTTGACTCGCTCAACG
MHG_10 GeaA-Rev3 CCTTGACAATAGGCACCGCG
MHG_11 GeaA-Fw3 GCCCAGCCTTCTGAGGTTGC
MHG_12 GeaA-Rev2 CGGGGGCAAA GTCCTGGC
MHG_13 GeaA-Fw2 GTCTCTCGGAAGTGCTGCGG
MHG_14 GeaA-Rev1 GCGACTGTGG TTCCGTCCAC
MHG_15 GeaA-Fw1 CTGAAGCAAGGAGCTGCACG
MHG_16 Fw sar1 CCCAACCCTTTCTTCGCAAT
MHG_17 Rev sar1 GGGAACTGACGGCTATGGTTG
MHG_18 Fw mutag. Sar1 GCTCTGACTCGATTTCAAAATGTGG
MHG_19 Rev mutag. Sar1 GCGGCACAGGTTGGTAGCTAGC
CACAACCATAGCCGTCAGTTCCCACCGGTCGCCTCA
MHG_20 Fw sarA-pyrG fusion
AACAATGCTCTTCA
GCGTTGCGGCACAGGTTGGTAGCCTGTCTGAGAGGA
MHG_21 Rev pyrG-down.Sar1
GGCACTGATGCG
MHG_22 Fw down. Sar1 GCTACCAACCTGTGCCGCAAC
MHG_23 Rev down. Sar1 CCCGGCAAAGTTATGTACGTACG
MHG_24 Rev upstream sar1 GGCGGGCTATGGTTGTCTG
CCAGCACAGACAACCATAGCCCGCCACCGGTCGCCT
MHG_25 Fw up. sar1-pyrG fusion
CAAACAATGCTC
CTGCACAACCATAGCCGTCAGTTCCCACCGGTCGCC
MHG_26 Fw sarA-pyrG fusion (BIS)
TCAAACAATGCTCTTCA
Rev pyrG-down sar1 fus. CCGTTCTGAGGGGTGATGAGGTAGACCTGTCTGAGA
MHG_27
(BIS) GGAGGCACTGATGCG
MHG_28 Fw down. Sar1 (BIS) GTCTACCTCATCACCCCTCAGAACG
MHG_29 Rev 3'ORF copA GAGTTGGCTAGGGACATACAACCG
GCGGTTGTATGTCCCTAGCCAACTCGGAGCTGGTGC
MHG_30 Fw 3'ORF copA GFP fus.
AGGCGCTGGAGCC
CATAACCCATCACACGTCGTCAGGGGAGTCTGAGAG
MHG_31 Rev 3'UTR pyrG fus.
GAGGCACTGATGCG
MHG_32 FW 3'UTR copA TCCCCTGACGACGTGTGATG
MHG_33 Rev 3'UTR copA CGCCGCATGGCGTAACTTG
MHG_34 Fw sar1 exterior TCGCACAAAGTCACTCCCTCG
MHG_35 Rev sar1 exterior TGTTCATCCACAACGGCCAAG
MHG_36 Fw copA exterior GCCATCCCCAGGGACCTTG
MHG_37 Rev copA exterior CAGATGCCGTCTCTGCACTTCC
MHG_38 sec.5'ORF sar1 AGCGCCCGGTCTCAACGTC
MHG_39 Rev sar1 con 3'utr AAATCCGGGGAGGTGCGAT
MHG_40 Rev down. Sar1 TCCATATTGCTCCCTACGAGACTTA
MHG_41 fw down. Sar1 CTGTTGCAGCTCAGATTTGCAATG
CACCCCCTTATCGCACCTCCCCGGATTTACCGGTCGC
MHG_42 Fw fusion sar1-pyrG
CTCAAACAATGCTCTTCA
CCATTGCAAATCTGAGCTGCAACAGCTGTCTGAGAG
MHG_43 Rev fusion sar1-pyrG
GAGGCACTGATGCG
MHG_48 fwNcoI(met-GLY*)Sar1 ATATCCATGGGCTGGATTATCAACTGGTTTTACGAC
ATATCCATGGCGACATATTGAGATAGCCACCTTATA
MHG_49 MHG_49 rev (NcoI) Sar1
CCTTC
MHG_54 Fw1 hypB5 CATACTCCGGACTATCGCAAGG
MHG_55 Rev1 hypB5 CCTGTTGCTGCTCGTGGCTG

Página 70
 Materiales y Métodos
Código Nombre Secuencia
MHG_56 Fw2 hypB5 GTAACGAAGACGATGTGGACGAG
MHG_57 Rev3 hypB5 TGGCCAGAAGACTGAATCTCTTG
MHG_58 Fw3 hypB5 GGTGAAGGGTGTAGACCGGATC
MHG_59 Fw4 hypB5 TCATGACTGGCGATGATCTTGAG
MHG_60 Rev4 hypB5 TGCCTCCAGAGGACATCCCA
MHG_61 Fw5 hypB5 TCCAGCCTCTGCGTCGACATC
MHG_62 rev5 hypB5 CAGCAAACCTCTCACGGAGAGG
MHG_63 Fw. Up arfX (3934) CCTTTCCAACTGCTCAGCGAC
MHG_64 Rev. Up arfX (3934) GTTCGTGACGTTTCAATGAGAAC
TGGTTCTCATTGAAACGTCACGAACACCGGTCGCCT
MHG_65 Fw. Fusion up arfX pyrG
CAAACAATGCTC
ATGTTAGGACAAGGACGTTAGCTGCTGTCTGAGAGG
MHG_66 Rev. Fus dwn arfX pyrG
AGGCACTGATGCG
MHG_67 Fw. down arfX (3934) CAGCTAACGTCCTTGTCCTAAC
MHG_68 Rev. down arfX (3934) GCTGCTAGGGCTATATGTCTTC
MHG_69 Fw. Up arl1 (5912) TGAGTAAGGTTAGGGCATGCAG
MHG_70 Rev. Up arl1 (5912) GTAGTAGATGCGGCGATACTCTG
ACAGAGTATCGCCGCATCTACTACACCGGTCGCCTC
MHG_71 Fw. Fusion up arl1 pyrG
AAACAATGCTC
TGCGTTCTCGGACTGAAGGGTTTCTGTCTGAGAGGA
MHG_72 Rev. Fusion down arl1 pyrG
GGCACTGATGCG
MHG_73 Fw. down arl1 (5912) AAACCCTTCAGTCCGAGAACG
MHG_74 Rev. down arl1 (5912) TCAGCTGTGGTACCTACCTTTG
MHG_75 Fw up arfA ATGTTGTCCTAGTTGTTCCCGAG
MHG_76 Rev arfA GAGCAAGCGATATACAAGTCCTAC
GTAGTAGGACTTGTATATCGCTTGCTCACCGGTCGC
MHG_77 Fw. Fusion arfA pyrG
CTCAAACAATGCTC
ACTGCACGTTGGACTGCATGTTCCTGTCTGAGAGGA
MHG_78 Rev. Fusion down arfA pyrG
GGCACTGATGCG
MHG_79 Fw. down arfA GAACATGCAGTCCAACGTGCAG
MHG_80 Rev. down arfA TTTCTACCTCATCCACAGCATCC
MHG_81 Fw cin4 sonda down TGAGCGTACCATCCACACAAC
MHG_82 Rev. cin4 sonda down GATTGCCATATAGTCAGACTGG
MHG_83 Sec. ORF arfA CTGTTCGCCTGTGCTCGCAC
MHG_84 Fw arfA medioORF TGCGAATTCTGATGGTCGGTC
MHG_85 Rev orf arfA GTCGCGGCCAGTCTTCCGCAG
GACGCTGCGGAAGACTGGCCGCGACGGAGCTGGTG
MHG_86 Fw gfp fusion arfA
CAGGCGCTGGAGCC
CCATTCATCACAACTACCGCAATTATTATTTGTATAG
MHG_87 Rev gfp fusion3utr arfA
TTCATCCATGCC
MHG_88 Fw arfA 3utr TAATTGCGGTAGTTGTGATGAATG
MHG_89 rev. sec pyrGAf
MHG_89 AAGTCTTGCGCAGATGCGGTC
medio
MHG_90 rev sec pyrGAf
MHG_90 CACATCGGTGCTGTATTCCTC
ppio
MHG_91 fw sucA ORF end AAAGAATGGCGTGACCCTAATG
MHG_92 rev sucA_ORF GTTCCAAACAGACCCAACCTTA
GTGAGTAAGGTTGGGTCTGTTTGGAACGGAGCTGGT
MHG_93 fw fusion sucA-ga5-HA
GCAGGCGCTGGAG
CCAAACAACAAAACATCTAGCTAGATCCTTCACTGA
MHG_94 rev fusión 3'utr-sucA-HA
GCAGCGTAATCTGG
MHG_95 fw 3'utr sucA AGGATCTAGCTAGATGTTTTGTTG
MHG_96 rev terminator sucA TCGCCCTACTGGAGCTTTCAC
TGGTGAAAGCTCCAGTAGGGCGAACCGGTCGCCTCA
MHG_97 fw fusión sucA-pyrG
AACAATGCTCTTCA

Página 71
Materiales y Métodos
Código Nombre Secuencia
GCAACGTATCATAGTCGTGGGTGATGTCTGAGAGGA
MHG_98 rev fus downsucA-pyrG
GGCACTGATGC
MHG_99 fw down sucA ATCACCCACGACTATGATACG
MHG_100 rev down sucA GAGATCTATAGAAGGGAGGTTG
MHG_104 XmaI-Rev-pyrG ATATCCCGGGCTGTCTGAGAGGAGGCACTG
MHG_111 Fw sonda AN6120 AGACTTTCCTTCCAGTCGACC
MHG_112 Rev sonda AN6120 GTACTCAGGCGGTATATCAGC
MHG_113 Fw ATG1 GCCGCAAATGAACCAACAAAATG
MHG_114 Fw ATG2 AAGTTAACTCAAGCGTATGAAATG
MHG_115 Rev para ATG GCCTTGCAGAGAGATATCAAG
MHG_116 Fw cDNA control TCTGGATATCAAAGGCCTTCTTC
MHG_117 Rev cDNA control AGTATTGTCGGCTCCAATTTGG
MHG_118 AN3438 Fw sonda AGTCGTGAGCCTCTCAGATGC
MHG_119 AN3438 Rev sonda GAGATTGTTCTCCGTAGTTCCG
MHG_120 5'utr an11127 ACTCCTCATTCAATCTACGGTC
MHG_121 Rev orf an1127 GTGTGCACGACGACAGTGTTG
MHG_122 Fw orf an1127 ACTCAAGCCGACAGTATCGAG
MHG_123 3'utr rev an11127 CAGAGGGAGGCTGATACTAAG
MHG_124 Rev stop2 an11127 CTACCCTTTCATCGGCATG
MHG_125 Fw sonda AN1931 GACTATGGTGGGTGTCATTCC
MHG_126 Rev sonda AN1931 TGCTGGTTCTGCAACGCTAAC
MHG_127 Fw sonda AN4274 TTGCCTCGCTAGGGATTGATC
MHG_128 Rev sonda AN4274 AGGACCGTAGGGATTCCCAC
MHG_129 Fw sec p2164 TACGAGGGCACCCAGACCG
MHG_130 Rev sec p2164 AATGAACCAACGTAATTTGTAGC
MHG_131 Fw s. AN1629 AACCTCTCTACGACTTCTACTC
MHG_132 Rev s. AN1629 AGAATCAGCACCTGCAACGAC
MHG_133 Fw s. AN6033 TCAACAGCTAAACGAGTGCAAG
MHG_134 Rev s. AN6033 GTCCATTGAGGTCAGTCTCGG
MHG_135 Fw s. sec12 TAGATAGTCGCGAAGAAAAGGC
MHG_136 Rev s. sec12 ACAGAGGCCTGGAGACTATTC
MHG_144 Fw chsB orf medio TACATCTACCTTGCGTTCCTGC
MHG_145 Rev chsB final CCGACGGGCGAAGCAGCAG
CTGCTGCTTCGCCCGTCGGGGAGCTGGTGCAGGCGC
MHG_146 Fw fus chsB-gfp
TGGAGCC
CCATTAGGCAAAGCATGCTCTTATTATTTGTATAGTT
MHG_147 rev fus gfp-3utr chsB
CATCCATGCC
MHG_148 Fw 3'utr chsB TAAGAGCATGCTTTGCCTAATGG
MHG_149 rev chsB final transcrip TACAGTACGGGATTAGAGTAAAG
CTTTACTCTAATCCCGTACTGTAACCGGTCGCCTCAA
MHG_150 fw fus chsB dwn-pyrG
ACAATGCTC
CTTGTACACAAGCCATCGCCTCCTGTCTGAGAGGAG
MHG_151 rev fus pyrG-down chsB
GCACTGATGCG
MHG_152 fw chsB down GAGGCGATGGCTTGTGTACAAG
MHG_153 rev chsB down GGTAAATCTTTTGCGTGCACTTG
GCTCATTGTCCAACCGTCCCCATCAAGAGGCCGTTC
MHG_154 Fw fus uprabB-riboB
AGGAGTCTGG
CGGACGGATCGAATAGGCTCAGAACGTTTGCGCTGC
MHG_155 Rev fus downrabB-riboB
AGAAC
MHG_156 Fw up an2222 ATTGCTGTCAAGGTCGCCATTG
MHG_157 Rev up an2222 GGCGTATAAAAGCTGCAAGACG
MHG_158 Fw dwn an2222 TTTGACATAGATATGGTAAGGCTAG
MHG_159 Rev dwn an2222 ACATGCCTCATGGAACCCCTC
CGTCTTGCAGCTTTTATACGCCACCGGTCGCCTCAA
MHG_160 Fw fus pyrG-2222
ACAATGCTC
CTAGCCTTACCATATCTATGTCAAACTGTCTGAGAG
MHG_161 Rev fus pyrG-2222
GAGGCACTGATGCG

Página 72
 Materiales y Métodos
Código Nombre Secuencia
MHG_162 fw up an1629 ACTTGCCCATCAGAATTCGCAC
MHG_163 rev up an1629 GTCGAATTATGGAGAGCTTTATTTA
TAAATAAAGCTCTCCATAATTCGACACCGGTCGCCT
MHG_164 Fw pyrG-1629 fus
CAAACAATGCTC
GAGTAGAAGTCGTAGAGAGGTTCTGTCTGAGAGGA
MHG_165 rev pyrG-1629 fus
GGCACTGATGCG
MHG_166 fw chsB up TTGGTGCTCAATAAGATTGGCTG
MHG_167 rev chsB up GGTTAAACTGGTAGTATGTGCG
CGCACATACTACCAGTTTAACCACCGGTCGCCTCAA
MHG_168 fw fus up chsB-pyrG
ACAATGCTC
CTTTCCATTAGGCAAAGCATGCTCCTGTCTGAGAGG
MHG_169 rev fus down-chsB pyrG
AGGCACTGATGCG
MHG_170 fw chsB up GAGCATGCTTTGCCTAATGGAAAG
CCATTAGGCAAAGCATGCTCTTATTACTTGTACAGC
MHG_171 rev fus mcherry-3utr chsB
TCGTCCATGC
MHG_172 rev externo chsB ATGACTGCATTCAGATTCAGCAC
MHG_173 fw2 sacII-up chsB ATATCCGCGGGAACTAAATTACCGCCAGGCCG
MHG_174 rev medio orf chsB CAAGGATAAACTGCAAGAGCAGG
MHG_175 rev NsiI-chsB dwn ATATATGCATGGTAAATCTTTTGCGTGCACTTG
MHG_176 fw up rabB ext GCAGTTCCTTCAACATAGTCAAG
MHG_177 rev dwn rabB ext TGTTTCGTCACCATACCTGACC
MHG_178 fwBIS sacII-up chsB ATATCCGCGGCTTGGTGCTCAATAAGATTGGC
MHG_179 Fw up eglC TGAAGGGAAGCAGAGGGGATC
MHG_180 Rev up eglC TGATTAGTCCATTGATTAGTCACG
CGTGACTAATCAATGGACTAATCAACCGGTCGCCTC
MHG_181 Fw pyrG fus eglC
AAACAATGCTC
GTACTACCATACGCCGTCTATCTGTCTGAGAGGAGG
MHG_182 Rev pyrG fus eglC
CACTGATGCG
MHG_183 Fw promotor eglC ATAGACGGCGTATGGTAGTAC
MHG_184 Rev s.p. eglC GGAGACGGCCTCAGCGGAAG
CTTCCGCTGAGGCCGTCTCCGGAGCTGGTGCAGGCG
MHG_185 Fw fusion gfp
CTGGAGCC
CCGGCTCCAGCGCCTGCACCAGCTCCTTTGTATAGTT
MHG_186 Rev fusion gfp
CATCCATGCCATG
GAGCTGGTGCAGGCGCTGGAGCCGGTGCCAAGGGC
MHG_187 Fw dwn eglC fus
TTCAACTATGGAGCC
MHG_188 Rev dwn eglC AGTCACCAGAGGTGCTGGTG
MHG_194 Rev GFPmejorado TCACTTGTAGAGCTCGTCCATG
CATGGACGAGCTCTACAAGTGAACCGGTCGCCTCAA
MHG_195 Fw fusion GFPmej-pyrG
ACAATGCTC
GGAGCTGGTGCAGGCGCTGGAGCCGGTGCCGTGAG
MHG_196 Fw 5xGA-eGFP
CAAGGGCGAGGAGCT
MHG_197 Rev eGFP-stop CTACTTGTACAGCTCGTCCATG
CTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAGACCGGTCGC
MHG_198 Fw fusion eGFP-pyrG
CTCAAACAATGCTC
GGACTTGACTCTCCTTCTCCTGATCACCGGTCGCCTC
MHG_199 Fw fus wA-pyrG
AAACAATGCTC
GAAACGGGAAAGTAAAACCTTATGAGCCTGTCTGA
MHG_200 Rev fus wA-pyrG
GAGGAGGCACTGATG
MHG_201 fw AN4274 TCTCCGGACTTAATCATCTAAGC
MHG_202 rev AN4274 ACCGGGGATCGAAGACTCATC
GAATCTGGGTCTTGGTGAACATGGTGATGTCTGCTC
MHG_204 rev gpda-eglc fus
AAGCGG
CAATCGACAGAGCGAGGGCGAGAATCTGGGTCTTG
MHG_205 rev2 gpda-eglc fus
GTGAACATGGTG
AGATTCTCGCCCTCGCTCTGTCGATTGCTTCCGCTGA
MHG_206 Fw2 fus sp-gfp
GGCCGTCTCC

Página 73
Materiales y Métodos
Código Nombre Secuencia
MHG_207 Rev XmaI-EglC TATACCCGGGTTAGAGAGCGACCGCGAGGG
MHG_209 fw genotip gcs1 TCCTAGGTGCCGTCTTGCAGC
MHG_210 rev genotip gcs1 TGTCTAGCCTTACCATATCTATG
MHG_213 Fw NcoI-sucA ATATATCCATGGCGCGCGCCCGCAC
ATCGTATGGGTAAAAGATGCGGCCTGGTGCTGATGG
MHG_214 Rev fus s.p. sucA-ha
TTGAAGAGCG
TCGCTCTTCAACCATCAGCACCAGGCCGCATCTTTTA
MHG_215 Fw fus s.p. sucA-ha
CCCATACG
CACCGGCTCCAGCGCCTGCACCAGCTCCCTGAGCAG
MHG_216 Rev fus HA-ga5
CGTAATCTGGAACG
GGAGCTGGTGCAGGCGCTGGAGCCGGTGCCGGCCC
MHG_217 Fw fus ga5-sucA
AGCTCCTTACACCG
MHG_218 XmaI Rev sucA ATATCCCGGGTCAGTTCCAAACAGACCCAACC
CTTGACTCTCCTTCTCCTGATCCTTGGTGCTCAATAA
MHG_220 Fw fus up wA-chsB
GATTGGC
MHG_221 rev 5' coil eglC GCCGAGGGAGCCGCCGTGG
TCTCGGCCACGGCGGCTCCCTCGGCAGCAAGGGCGA
MHG_222 Fw fus eglC coil-GFP
GGAGCTCTTC
TGGCCTCCAGAGAACGAGCCAGAGGACTTGTAGAG
MHG_223 rev fus eglc coil-GFP
CTCGTCCATGCCG
MHG_224 Fw 3'coil EglC TCCTCTGGCTCGTTCTCTGG
MHG_225 rev 3'utr eglC CTCAAGCTAAAGTTTCTTTTATTTTCC
GGAAAATAAAAGAAACTTTAGCTTGAGACCGGTCG
MHG_226 fw fus eglC-pyrG
CCTCAAACAATGCTC
CTAGTAATACGAAAATGAGGAGAAGAACGACTGTC
MHG_227 rev fus pyrG-down eglC
TGAGAGGAGGCACTG
MHG_228 fw down eglC TCGTTCTTCTCCTCATTTTCGTATTAC
MHG_229 rev down eglC CATTTTCGCCGACAGTCTGTCC
MHG_230 Fw up eglC TTAGGGAGCATATGCTCTGCAG
MHG_231 Fw upstream real chsb AAGAATAGGAACAAAGACCGCTAG
MHG_232 Rev up chsb CGGCCTGGCGGTAATTTAGTTC
AGAACTAAATTACCGCCAGGCCGACCGGTCGCCTCA
MHG_233 Fw fus up chsb-pyrG
AACAATGCTCTTCA
AGCCAATCTTATTGAGCACCAAGCTGTCTGAGAGGA
MHG_234 Rev fus pyrG pr. chsB
GGCACTGATGC
MHG_235 Fw prom. chsB CTTGGTGCTCAATAAGATTGGC
MHG_236 Rev 5'utr chsb GGTTAAACTGGTAGTATGTGCG
ATTCGCACATACTACCAGTTTAACCATGAGCAAGGG
MHG_237 Fw fus 5'utr chs-GFPm
CGAGGAGCTCTTC
ACCGGCTCCAGCGCCTGCACCAGCTCCCTTGTAGAG
MHG_238 Rev fus GFPm-GA
CTCGTCCATGCCG
GAGCTGGTGCAGGCGCTGGAGCCGGTGCCGCCTACC
MHG_239 Fw fus ga-chsb sin atg
ACGGCTCTGGTCC
MHG_241 fw chsB sin atg GCCTACCACGGCTCTGGTCC
CAGGCGCTGGAGCCGGTGCCGCCTACCACGGCTCTG
MHG_242 FwBIS fus ga-chsb sin atg
GTCC
MHG_244 Fw up gelE TGTAAATATCTAGACGAGTCAGAC
MHG_245 Rev up gelE TGGATCCCGACCGTGCTGTTC
GAACAGCACGGTCGGGATCCAACCGGTCGCCTCAA
MHG_246 Fw fus upgelE-pyrG
ACAATGCTC
GGGCATTGGGTGGTCGGTTCCCTGTCTGAGAGGAGG
MHG_247 Rev fus pyrG-prom gelE
CACTGATGCG
MHG_248 Fw prom gelE GGAACCGACCACCCAATGCCC
MHG_249 rev sp gelE GTCGGCCGCCAGGGCGCTG
CAGCGCCCTGGCGGCCGACAGCAAGGGCGAGGAGC
MHG_250 fw fus sp gelE-gfp
TCTTC

Página 74
 Materiales y Métodos
Código Nombre Secuencia
CAGGCGCTGGAGCCGGTGCCCTGCCCGTGATTGCCT
MHG_251 Fw fus GA-gelE
CCAAG
MHG_252 rev down gelE AAAGTGCACGTACTGACAGGAG
MHG_253 rev 5'coil gelE TGTATTAACGTTGCCGGTACCG
CGGTACCGGCAACGTTAATACAGGAGCTGGTGCAG
MHG_254 fw fus coil gelE-GFP
GCGCTGGAGCC
CGCCAACACCGCCGTCGGGCTTGTAGAGCTCGTCCA
MHG_255 rev fus 3'coil gelE-gfp
TGCCG
MHG_256 Fw 3'coil gelE CCCGACGGCGGTGTTGGCG
MHG_257 rev 3'utr gelE TACACAGGTAGTAGATAGACATTAG
CTAATGTCTATCTACTACCTGTGTAACCGGTCGCCTC
MHG_258 fw fus 3'utr gelE-pyrG
AAACAATGCTC
TTCGCTGCATAGTAGCCATCATACTGTCTGAGAGGA
MHG_259 rev fus pyrG down gelE
GGCACTGATGCG
MHG_260 fw down gelE TATGATGGCTACTATGCAGCG
MHG_261 rev GAs GGCACCGGCTCCAGCGCC
TCTATTCGCACATACTACCAGTTTAACCATGGTGAG
MHG_262 fw fus 5'utr chsb-mcherry
CAAGGGCGAGGAG
MHG_267 rev up sucA TTTGGTGATGTCGCTGACCGC
TACGCGCGGTCAGCGACATCACCAAAATGTTCACCA
MHG_268 fus up sucA-EglC
AGACCCAGATTC
ACGGTACCGGCAACGTTAATACAGGCCGCATCTTTT
MHG_269 fw fus coilgelE-HA
ACCCATAC
TCACCGCCAACACCGCCGTCGGGCTGAGCAGCGTAA
MHG_270 rev fus HA-gelE
TCTGGAAC
MHG_271 Fw Chs5 TTGCGCGAAGAGCGCGAGCAGC
MHG_272 Rev Chs5 ATGCGCGAAGCTCTTTACAATG
MHG_273 Fw Chs5 AGAACGCGGATTTGATGCAGAG
MHG_274 rev up chs5 TGACGGAAGCACGAATCGACAG
CTGTCGATTCGTGCTTCCGTCAACCGGTCGCCTCAA
MHG_275 fw fus chs5-pyrG
ACAATGCTC
CTCGAACGTAGCGCTCAACAGTGTCTGAGAGGAGGC
MHG_276 rev fus chs5-pyrG
ACTGATGC
MHG_277 Fw dwn chs5 ACTGTTGAGCGCTACGTTCGAG
MHG_278 rev dwn chs5 ACACTCTACGCAGAACGGAATG
MHG_280 fw chsb genotip. TTATCCAATTTTGAGCAATGCTCG
MHG_281 Fw sucA externo GAGTGGAGAAGCCAGCAAGAG
GAACTAAATTACCGCCAGGCCGAAGAGGCCGTTCA
MHG_282 Fw fus up chsB-riboBAf
GGAGTCTGG
GCCAATCTTATTGAGCACCAAGCAGAACGTTTGCGC
MHG_283 Rev fus riboBAf-prom chsB
TGCAGAAC
JFA117 Δrab7 genot fw GAGCTGCGTGCCTACGCTCG
JFA118 Δrab7 genot rev GACAGTGTCTAAAGCGCGGCAG
TTTACTCTAATCCCGTACTGTAAAGAGGCCGTTCAG
MHG_292 fw fus final chsb-riboBaf
GAGTCTGG
GCATTGTTTGAGGCGACCGGTCAGAACGTTTGCGCT
MHG_293 rev fus riboBAf-pyrGAf
GCAGAAC
MHG_294 rev medio pyrG (a 600pb) AGCCGAGCAATGAGGTATATTATC
MHG_295 rev ppio ChsB AACTGTATCCAGACGTCGGAC
MHG_296 Fw medio ppio ChsB CTTGGCAGCTGGAATCGAAAC
MHG_297 Fw chsB para secuenciar TTACGCTCGTAGTGAAACTTCG
MHG_298 Fw slaB genotip slaB1 AGAAGGCCTAATGATAACCGTAC
MHG_299 Rev slaB genotip slaB1 CTACAAGCATACAATCAGTAAGG

Página 75
Materiales y Métodos

3.4. Manejo de Escherichia coli

Para culivar E. coli se utilizó en todos los casos medio LB: bacto-triptona 10 g/l,
extracto de levadura 5 g/l y NaCl 5 g/l. El pH se ajustó a 7.5 con NaOH. Para el medio sólido se
utilizó agar 1.5% (p/v). Se utilizaron las cepas DH1 (F- recA1 endA1 gyrA96 thi1 hsdR17
supE44); DH5α [F’ endA1 hsdR17 supE44 thi1 recA1 gyrA relA1Δ(lacIZYA-argF´)]; XL10-
Gold Ultracompetent Cells; y B538 (BL21 con el plásmido pRIL). Para transformar E. coli se
utilizó el método de Hanahan [191]. Para la selección de transformantes resistentes se añadió
ampicilina (100 μg/ml) o cloranfenicol (34 μg/ml), en cada caso. Para distinguir colonias sin
actividad β-galactosidasa se añadió al medio 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido
(X-gal) 131 µM e isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) 100 mM.

3.5. Manejo de Aspergillus nidulans

3.5.1. Cultivo y mantenimiento de cepas
Se utilizó el medio MCA para el mantenimiento de cepas y la obtención de
conidiosporas. Como inóculo para cultivos líquidos se recogieron esporas por raspado de la
superficie de las colonias con una espátula estéril y se resuspendieron en una solución de Tween
80 al 0.01% (v/v). Para los experimentos en los que se analizaba la secreción y la glicosilación
de InuA o de EglC las esporas se contaron en una cámara Neubauer, con el fin de realizar un
inóculo inicial de ~1.5 × 107 esporas/ml.

3.5.2. Transformación
Se detalla el protocolo descrito previamente [192]. Se transformó con 600 ng de DNA si
no se indica lo contrario. Se inocularon ~ 2 × 106 conidiosporas de la cepa receptora apropiada
en 400 ml de MMA líquido con los suplementos necesarios. El cultivo se incubó durante 16 h a
30ºC, tras lo cual el micelio se recogió por filtración a través de Miracloth (muselina con un
poro de 22-25 μm, Calbiochem) y se lavó con tampón de protoplastos frío (TP: MgSO4 1.2 M,
NaH2PO4 pH 5.8 10 mM).

3.5.2.1. Generación de protoplastos

Se resuspendió 1 g de micelio en 25 ml de TP. Se digirió la pared celular con 350 mg de

la mezcla enzimática Vinoflow FCE (Novozymes) a 30ºC con agitación durante 1-2 h. Se
comprobó la formación de protoplastos por observación al microscopio. Los 25 ml de la
digestión se dividieron en dos partes iguales de 12.5 ml en dos tubos Falcon. Se añadieron 12.5
ml de “Colchón de flotación” (D-Sorbitol 0.6 M; Tris-HCl 0.1 M; pH 7.5) frío a cada Falcon de

Página 76
 Materiales y Métodos
tal forma que no se mezclase con la solución de digestión. Los tubos se centrifugaron a 6000 ×
g, 10 min, a 4ºC. Tras la centrifugación, los protoplastos formaron una banda en la interfase. Se
recogieron y se diluyeron con 2 volúmenes (V) de Solución ST (D-Sorbitol 1 M; Tris-HCl 10
mM, pH 7.5). La suspensión se centrifugó a 4ºC, 10 min, a 4000 × g, se eliminó el sobrenadante
y se lavó el “pellet” de protoplastos con 1 ml de Solución ST, mediante resuspensión y
centrifugación a 13000 rpm, 1 min en minifuga en un tubo Eppendorf de 1.5 ml. El lavado se
repitió dos veces utilizando la solución STC (D-Sorbitol 1M; Tris-HCl 10 mM pH 7.5; CaCl2 10
mM). Tras los lavados, se estimó el número de protoplastos con una cámara de Neubauer. Se
concentraron por centrifugación y se resuspendieron en el volumen adecuado de STC para
obtener ~5 x 107 protoplastos/100 μl.

3.5.2.2. Transformación

A 200 μl de la suspensión de protoplastos anterior se añadieron 600 ng del DNA

transformante y 50 μl de una solución de polietilenglicol [SPEG: PEG 6000 (Fluka) 60% (p/v);
Tris-HCl 10 mM pH 7.5; CaCl2 10 mM]. Se incubó 20 min en hielo, tras lo cual, se añadió 1 ml
de SPEG a la mezcla y se dejó 5 min a temperatura ambiente. A continuación se añadieron 3 ml
de Solución STC, se agregaron 15 ml de Top agar [MMA o MCA con sacarosa 1 M y agar
0.4% (p/v) y con los suplementos apropiados, menos el correspondiente a la auxotrofía que se
pretendía complementar], fundido y atemperado. Finalmente, se sembró la mezcla en 4 placas
de medio de regeneración [MMA o MCA con sacarosa 1 M y agar 1% (p/v) con los
suplementos apropiados, menos el correspondiente a la auxotrofía que se pretendía
complementar]. Si la complementación era con pyrGfum se utilizó MCA, y MMA si era con otro
marcador de selección. Como control de que los protoplastos eran viables se plaqueó la mezcla
anterior, pero sin DNA añadido, en medio de regeneración con los suplementos que requiere la
cepa sin transformar. Como control de que no había existido contaminación se plaqueó la
misma mezcla en medio de regeneración con los suplementos apropiados, menos el que se
pretendía complementar.

3.5.3. Extracción de DNA genómico

3.5.3.1. Método rápido, para PCR

Se depositaron conidiosporas en un tubo con 100 μl de Breaking Buffer (Triton X-100

2%; SDS 1%; NaCl 100 mM; Tris-HCl pH 8 10 mM; EDTA pH 8 1 mM) y 150 mg de esferas
de vidrio (Ø 0,45-0,65 nm). Se incubó 30 min a 70ºC, y con agitación constante. Se añadieron
200 μl de Fenol Sevag, se mezcló y se centrifugó 5 min a 16110 × g. Se recogió la fase superior,
que contenía el DNA.

Página 77
Materiales y Métodos
3.5.3.2. Método elaborado, para Southern Blot

Se recogió el micelio con Miracloth, se congeló en nieve carbónica y se liofilizó. El

liofilizado se trituró con una bola de cerámica en un tubo de 2 ml utilizando un molino FP120
Fast Prep Cell Disruptor, con un pulso de 10 seg, fuerza 4. El polvo se resuspendió en 1 ml de
Tris-HCl pH 8 25 mM, sacarosa 250 mM, EDTA 20 mM. Se añadió SDS hasta una
concentración de 0.1% (v/v) y se incubó 15 min a 65ºC. A la suspensión se le añadió 1 V de
fenol Sevag y se mezcló y centrifugó. La fase acuosa se recogió y los ácidos nucleicos se
precipitaron con 0.1 V de acetato sódico 3 M y 0.6 V de isopropanol. El precipitado se lavó con
etanol 80% (v/v), se secó, se resuspendió en agua y se trató con RNasa A. El DNA se volvió a
precipitar y lavar y se resuspendió finalmente en agua.

3.5.4. Extracción de proteína total

Se siguió el protocolo descrito por Hervás et al. [171]. Se recogió el micelio por
filtración con Miracloth, se congeló en nieve carbónica y se liofilizó. El liofilizado se pulverizó
en un tubo de 2 ml con una bola de cerámica y un molino FP120 Fast Prep Cell Disruptor, 10
seg, fuerza 4. Se resuspendieron 6 mg del polvo de micelio en 1 ml de NaOH 0.2 M y β-
mercaptoetanol 0.2% (v/v). Se precipitaron las proteínas con ácido tricloroacético 7.5% (v/v)
durante 10 min a 4ºC. El precipitado se recogió por centrifugación en microfuga durante 5 min a
14000 rpm. Se eliminó el sobrenadante y el precipitado se resuspendió en 100 µl de Tris 1 M. A
esta solución se le añadieron 200 µl de tampón Laemmli [Tris-HCl pH 6.8 62.5 mM, SDS 2%
(p/v), β-mercaptoetanol 5% (v/v), urea 6 M y azul de bromofenol 0.05% (p/v)]. Antes de cargar
una alícuota en un gel de poliacrilamida, la mezcla se agitó vigorosamente con vórtex y se
incubó a 90ºC 2 min, se volvió a mezclar y se centrifugó 1 min a 14000 rpm en una microfuga
para eliminar el material insoluble.

3.5.5. Cruces entre estirpes de A. nidulans por reproducción sexual

Se siguió el protocolo descrito por Todd [152]. Se realizaron inóculos puntuales de
ambas estirpes en una placa de MCA de modo que al crecer contactasen. Los parentales tenían
distintos requerimientos nutricionales. Una vez favorecida la anastomosis (2-3 días de
crecimiento), se cortaron porciones de medio sólido de las zonas donde habían entrado en
contacto las colonias, que se trasplantaron a placas de MMA selectivo, que permitía sólo el
crecimiento de los heterocariontes. Las placas se incubaron hasta que se formaron sectores
heterocarióticos (2 días). Para favorecer la entrada en ciclo sexual, las placas, que contenían
nitrato de sodio 10 mM como fuente de nitrógeno, se sellaron para generar anaerobiosis. Los
cleistotecios, que se formaron a los 10-15 días de incubación, se recogieron de la placa con un

Página 78
 Materiales y Métodos
palillo estéril y se rodaron sobre una placa de agar 3% hasta que se desprendieron los restos de
células nodriza adheridos. Se liberaron las ascosporas rompiendo cada cleistotecio en la pared
de un tubo Eppendorf con 1 ml de agua estéril; se sembraron 5 μl en placas de MMA selectivo,
que se incubaron para comprobar si el cleistotecio era híbrido. Tras identificar un cleistotecio
híbrido, se plaquearon diluciones seriadas y se utilizó una placa con colonias separadas con el
fin de analizar la progenie.

3.5.6. Precipitación de proteínas de medio de cultivo

Se recogió 1 ml de medio de cultivo y se le añadieron 20 µl de lisozima 1 mg/ml y ácido
tricloroacético al 10% (v/v). Se mezcló y se incubó durante 10 min en hielo. El precipitado se
recogió por centrifugación a 4ºC y 14000 rpm durante 10 min en una centrífuga de mesa. Se
eliminó el sobrenadante y el pellet se lavó con 1 ml de etanol:éter 1:1, tras lo cual se centrifugó
5 min a 14000 rpm y 4ºC. Se volvió a lavar con etanol:éter 1:3 y se centrifugó de nuevo. Se
eliminó el sobrenadante por aspiración y el pellet se dejó secar. Finalmente el precipitado se
resuspendió en 25 µl de tampón Laemli, se calentó a 100ºC durante 2 min y se analizó en un gel
de poliacrilamida.

3.5.7. Genotipado de cepas transformantes

Todas las cepas obtenidas por transformación se genotiparon por Southern blot, excepto
tres cepas: la cepa en la que se delecionó hypB; la que contiene en el locus chsB la casete
riboBfum-prom-gfp-chsB; y la cepa chs5Δ. Estas tres cepas fueron genotipadas por PCR del locus
correspondiente con oligonucleótidos externos a las regiones de recombinación homóloga de los
casetes. En todos los Southern blots se diseñaron sondas que pudiesen detectar tanto el locus
silvestre como el locus con el transgén integrado. En todos los casos, la estrategia diseñada
permitía detectar en el Southern blot posibles integraciones múltiples del transgén.

3.5.8. Inducción de la expresión a partir de genes integrados en el locus inuA

3.5.8.1. Cultivo en matraz

Este protocolo se siguió tanto en los ensayos de expresión de InuA-HA, como en los
realizados con las cepas con la construcción inuA::[eglC-gfp-GPI]. Se inoculó un matraz de 100
ml que contenía 25 ml de MMA con ~1.5x107 esporas/ml (cámara de Neubauer). El matraz se
incubó a 30ºC en agitación durante 16 h. Se recogió el micelio por filtración con Miracloth y se
lavó con 1 V de MMA con sacarosa 1% (en vez de glucosa). El micelio se recogió
delicadamente y se introdujo en un matraz con 25 ml de MMA con sacarosa 1% como única

Página 79
Materiales y Métodos
fuente de carbono. En los controles de no inducción el medio de lavado y el de los matraces tras
la transferencia fue MMA con glucosa 1%. En las pruebas de inducción con otras fuentes de
carbono el medio contenía, en vez de sacarosa, la fuente indicada en cada caso. Una vez
transferido el micelio al nuevo matraz, éste se incubó en agitación a la temperatura indicada en
cada caso. Para las temperaturas de 37ºC, 39ºC y 42ºC se utilizaron baños de agua con
agitación, de modo que la temperatura final se alcanzaba rápidamente. Después de 1.5 h de
incubación, el cultivo se filtró con Micracloth para separar el micelio del medio de cultivo. El
micelio se prensó delicadamente, se congeló en nieve carbónica y se liofilizó para extraer las
proteínas (ver 3.5.4). Una alícuota del medio de cultivo se trató para precipitar las proteínas (ver
3.5.6).

3.5.8.2. Cultivo para microscopía

Este protocolo se llevó a cabo con las cepas que portaban la construcción inuA::[eglC-
gfp-GPI]. Después de incubar esporas durante 16 h en WMM (con glucosa 0.1%) a 26ºC en
cámaras de incubación para el microscopio invertido (ibidi µ-Slide 8 Well Uncoated Grid-500,
GmbH), el cultivo se atemperó a 28ºC colocando la cámara de incubación en el incubador
acoplado al microscopio. Posteriormente, se realizó el cambio de medio a WMM con sacarosa
0.1%, en vez de glucosa. Para ello, se retiró el medio original del pocillo y se añadieron 350 µl
del nuevo medio, recogiéndolo y soltándolo 3 veces con la pipeta para lavar las células; el
medio nuevo se retiró y se añadió finalmente otro volumen de medio al pocillo. En este
momento, en los experimentos de incremento de temperatura, se subió la temperatura de la sala,
del incubador y del objetivo del microscopio de tal manera que el medio de cultivo alcanzase
una temperatura de 37ºC en 15 min. También en estos casos, el medio secundario estaba
inicialmente atemperado a ~30ºC.

3.6. Técnicas de biología molecular, biología celular y

bioquímica
3.6.1. Obtención de casetes de transformación mediante PCR de fusión
Los casetes de deleción utilizados en este trabajo se obtuvieron del Fungal Genetics
Stock Center [193] cuando estaban disponibles. En caso contrario se construyeron mediante
PCR de fusión. Los casetes necesarios para sustituir un gen endógeno por un transgén también
se obtuvieron por PCR de fusión, siguiendo el protocolo descrito previamente [194].
Brevemente, se amplificaron los fragmentos de fusión por separado de tal manera que tuviesen
las regiones solapantes necesarias para realizar la fusión. A continuación, se utilizaron todos los

Página 80
 Materiales y Métodos
fragmentos para realizar una reacción de PCR de fusión con los oligonucleótidos más externos
del producto de fusión deseado. De este modo, se obtuvo un producto de PCR que consistía en
la unión de los fragmentos utilizados.

En el caso de los casetes de deleción, éstos comprendían 800 pb aguas arriba del ORF y
otros 800 pb aguas abajo, con el gen pyrG de Aspergillus fumigatus (y su región promotora)
entre ambas secuencias, como marcador de selección. De este modo, al transformar A. nidulans,
el ORF de cada gen y, en algún caso, algunos nucleótidos adyacentes, se sustituyeron por el
marcador de selección pyrGfum (ver esquema en la Figura M.1A).

Figura M.1. Representación esquemática de un reemplazamiento génico y de la integración de

un transgén en un locus. Se representa la transformación por recombinación homóloga que se
produce con los casetes generados por PCR de fusión. A. Deleción de un gen por el marcador de
selección pyrG de A. fumigatus. B. Generación de una cepa que expresa una proteína fusionada en C-
terminal a GFP, mCherry o HA.

Con el fin de obtener una casete de transformación para expresar ChsB etiquetada en N-
terminal se realizó una PCR de fusión de 5 fragmentos como sigue: (1) región 5’
complementaria de ~800 pb; (2) marcador de selección pyrGfum o riboBfum; (3) región promotora
estimada (de 711 pb) y 5’UTR; (4) GFP o mCherry; y (5) inicio del marco abierto de lectura
(~800 pb). Para el marcaje en C-terminal de CopA, ChsB o InuA se hizo una PCR de fusión de

Página 81
Materiales y Métodos
5 fragmentos: (1) final del marco abierto de lectura (~800 pb); (2) HA, GFP o mCherry; (3)
3’UTR (excepto en el caso de CopA, en el que este fragmento no se incluyó); (4) pyrGfum; y (5)
región 3’ complementaria de ~800 pb. En la Figura M.1B se representa el proceso de
recombinación que ocurre al transformar A. nidulans con un fragmento de DNA diseñado para
realizar un marcaje en C-terminal. En el caso de la integración de transgenes en el locus wA o en
el locus inuA, para dirigir la recombinación a dichos loci se utilizaron casetes con secuencias en
5’ y en 3’ complementarias a las secuencias inmediatamente aguas arriba y aguas abajo del
marco abierto de lectura de wA o inuA, respectivamente. Los casetes de transformación para
reemplazar eglC y gelE con los transgenes de dichos genes que contienen GFP en el “interior”
del ORF, se construyeron mediante PCRs de fusión similares. La posición precisa donde se
colocó la secuencia de GFP se indica en la sección correspondiente de Resultados.

3.6.2. Southern-blot
Los DNA aislados y digeridos con enzimas de restricción se corrieron en un gel de
agarosa. El DNA se fragmentó en el propio gel con luz UV durante 5 min. Se incubó el gel con
solución desnaturalizante (NaCl 1.5 M, NaOH 0.5 M) 45 min y, después, con solución
neutralizante (Tris-HCl pH 7.5 0.5 M, NaCl 3 M) (dos veces, 20 min). Se lavó con solución 2 ×
SSC (NaCl 3 M y citrato trisódico pH 7.4 300 mM) y se transfirió a una membrana de nylon. El
DNA se fijó a la membrana mediante iluminación con luz UV durante 5 min. Tras ello, la
membrana se incubó en “solución de Church” [BSA 1% (p/v), EDTA 1 mM, tampón fosfato pH
7.4 0.5 M, SDS 7% (p/v)] 2 h y se hibridó con una sonda marcada con 20 µCi de α-[P32]-dCTP,
con una actividad específica de 3000 Ci/mmol (kit Rediprime II Random Prime Labelling
System) durante 16 h, a 55ºC. Se lavó dos veces con 50 ml de 2 × SSC, SDS 0.1% y dos veces
con 50 ml de 0.2 × SSC, SDS 0.1%. A continuación, se utilizó una película Curix RP2 (AGFA
Healthcare) para detectar las señales radiactivas.

3.6.3. Electroforesis e inmunodetección de proteínas por western-blot

Los extractos proteicos se resolvieron en geles de poliacrilamida con 0.1% SDS,
utilizando una cubeta Mini-Protean Tetra Cell o Protean II xi Cell, ambas de BioRad.
Utilizamos una mezcla de acrilamida:bisacrilamida 29:1. Para resolver InuA-HA o EglC-GFP
utilizamos acrilamida al 8% (p/v). Para el resto de proteínas usamos entre 10% y 12% (p/v). Se
emplearon las condiciones de electroforesis recomendadas por el fabricante. El patrón de pesos
moleculares que se utilizó fue Precision Plus Protein Dual Color (Biorad). Cuando se analizó
InuA-HA el gel se corrió hasta que la banda de 50 kDa de dicho marcador se salió del gel.
Cuando se requirió, los geles se tiñeron con Biosafe Coomassie Staining (Biorad) o, para

Página 82
 Materiales y Métodos
western-blot se transfirieron utilizando el sistema de transferencia semiseca Trans-Blot Turbo
Transfer System (BioRad) a una membrana de nitrocelulosa, utilizando el programa para
proteínas de alto peso molecular. La membrana se incubó con PBS y leche desnatada 5% (p/v)
durante 1 h para bloquear los sitios de unión inespecífica. Posteriormente se realizaron 3
lavados de 10 min con PBS-T [PBS Tween 20 0.05% (v/v)] antes de incubar la membrana con
el anticuerpo primario correspondiente (Tabla M.3) en PBS-T, leche 1% (p/v) hasta el día
siguiente a 4ºC o durante 2 h a temperatura ambiente. Después, la membrana se lavó 3 veces
con PBS-T durante 10 min y se incubó con el anticuerpo secundario correspondiente conjugado
a peroxidasa (Tabla M.3) diluido en PBS-T, leche 1% (p/v) durante 1.5 h. Finalmente, se lavó
sucesivamente con PBS-T y PBS 10 min y se reveló utilizando el sistema ECL (GE
Pharmaceuticals) o el sistema Clarity Western ECL (Biorad) siguiendo las instrucciones del
fabricante. La quimioluminiscencia se detectó por exposición a películas Curix RP2 Plus
(AGFA HealthCare) o utilizando el sistema ChemiDoc MP Imaging System de Biorad.

Tabla M.3. Anticuerpos utilizados para western-blot

Anticuerpos Dilución Origen Referencia
Primarios
α-HA 1:1000 rata Roche, 3F10
α-Actina 1:8000 ratón MP Biomedicals, 69100
α-SarA 1:20000 conejo Producción propia con Davids Biotechnologie (GmbH)
α-GFP 1:5000 ratón Roche, 11814460001
Secundarios
α-IgG de ratón 1:8000 cabra Jackson Inmunoresearch Laboratories, 115-035-003
α-IgG de conejo 1:10000 asno GE Healthcare, NA934
α-IgG de rata 1:4000 cabra 3010-05, Southern Biotech

3.6.4. Generación de mutantes de sarA

3.6.4.1. Obtención y clonaje del casete de reemplazamiento génico de sarA

El casete de reemplazamiento de sarA utilizado para la mutagénesis se construyó por

PCR de la siguiente manera: amplificamos la secuencia codificante de sarA flanqueada por 997
pb de la región 5’ (que incluye los 89 pb correspondiente a la 5’UTR) y 627 pb de la región 3’
(incluyendo los 572 pb de la 3’UTR), utilizando los oligonucleótidos MHG_16 y MHG_39. En
paralelo se amplificaron el gen pyrGfum y 785 de la región 3’ flanqueante del sarA. Se
fusionaron los tres fragmentos y el DNA resultante se clonó en pGEM-T easy (Promega),
obteniendo el plásmido p2138. El inserto fue secuenciado completamente para verificar la
ausencia de mutaciones. La polimerasa utilizada fue PrimeSTAR HS (Takara).

3.6.4.2. Generación de una mutateca de sarA

Se utilizó el kit GeneMorph II EZClone Domain Mutagenesis Kit (Stratagene, número

de catálogo #200552), según el protocolo propuesto por el fabricante. Utilizando como molde

Página 83
Materiales y Métodos
p2138 y los oligonucleótidos MHG_18 y MHG_19, que flanquean el marco abierto de lectura
de sarA, se realizó una PCR con la enzima mutagénica del kit. La reacción de PCR se ajustó
para obtener 2 mutaciones de media, lo que se consigue diseñando una PCR en la que se
obtenga 10 veces más cantidad de producto que de molde añadido, utilizando 1,2 μg de p2138 y
23 ciclos de amplificación. Se comprobó en un gel la proporción entre la cantidad de producto y
del plásmido inicial. Se utilizaron 500 ng de este DNA mutagenizado como cebador para
amplificar p2138. Tras la PCR se degradó el plásmido molde por digestión con DpnI,
obteniendo una población plasmídica con mutaciones en sarA. Con dicha población de
plásmidos se transformaron las células “ultracompetentes” de E. coli XL10-Gold del kit
previamente citado, por el método de Hanahan. A partir de las placas de transformación se
recogieron las colonias transformantes mediante resuspensión en LB líquido y se cultivaron en
un matraz con 2 l de LB ampicilina (100 µg/mlhasta que la densidad inicial( DO600 = 0.5) se
duplicó. Se realizó una extracción plasmídica de estas células para obtener la mutateca de
partida.

3.6.4.3. Transformación de A. nidulans

Una parte de la mutateca se digirió (SpeI/NcoI) para obtener el inserto y se utilizaron

600 ng para transformar la cepa 1739 de A. nidulans.

3.6.5. Expresión de SarA en Escherichia coli, purificación y obtención de

anticuerpos
Se utilizó una librería de cDNA de A. nidulans, para la amplificación del cDNA de sarA
por PCR (PrimeStarHS, Takara) con los oligonucleótidos MHG_48 y MHG_49, que introducen
dianas NcoI en los extremos y añaden un triplete de Gly tras la Met iniciadora de SarA. El
producto de PCR se digirió con NcoI y se purificó (QIAquick PCR Purification Kit, Qiagen).
Este fragmento de DNA se ligó (ligasa T4, Takara) a un derivado del plásmido pET
previamente digerido (NcoI) y desfosforilado (fosfatasa alcalina, Roche), con el objetivo de
obtener un plásmido con un gen quimérico que codificase SarA con 10xHis en C-terminal. Con
el producto de la ligación se transformaron células DH1 de E. coli y se identificaron por PCR
colonias transformadas con el plásmido recombinante. Se comprobó la ausencia de mutaciones
por secuenciación de los plásmidos. Posteriormente, con dicho plásmido purificado se
transformaron las células BL21 aptas para expresión proteica dependiende de la polimerasa T7.
Éstas también contenían el plásmido pRIL (Stratagene), que codifica tRNAs para los codones
raros de Arg, Ile y Leu (AGG, AGA, AUA y CUA) y confiere resistencia a cloranfenicol. Para
expresar SarA-10xHis en dichas células realizamos un precultivo en LB con ampicilina 100

Página 84
 Materiales y Métodos
µg/ml y cloranfenicol 34 µg/ml a 37ºC, en agitación, 16 h. A partir de 2 ml de este precultivo se
inoculó un matraz con 500 ml de LB, ampicilina y cloranfenicol y se cultivó a 37ºC hasta
alcanzar un valor de 0.55 de densidad óptica. Posteriormente, se indujo la expresión de SarA-
10xHis añadiendo IPTG (100 mM) e incubando a 37ºC durante 3.5 h, tras lo cual se recogieron
las células por centrifugación. Una décima parte de las células se resuspendió en 30 ml de
“buffer de lisis” (tampón fosfato pH 7.4 20 mM, NaCl 0.5 M, Triton X100 1% (v/v), imidazol
70 mM, 0.2 mg/ml de lisozima y 1 µg/ml de DNasa) y las células se lisaron en una French
Press. Tras centrifugar el lisado en un rotor SS34 durante 30 min, a 16000 rpm y 4ºC, se recogió
el sobrenadante y se mezcló con 0.5 ml de Ni-Sepharose 6 FastFlow beads (GE Healthcare). El
sobrenadante con las beads se incubó 30 min a 4ºC en agitación para permitir la unión de SarA-
10xHis. Se recogieron las beads por centrifugación a 300 × g y se lavaron con PBS con
imidazol 70 mM y después con PBS con imidazol 10 mM (ambos lavados con agitación durante
10 min a 4ºC). Se eluyó SarA-10xHis con PBS que contenía EDTA 0.1 M y se intercambió el
buffer a PBS con SDS 0.5 % (p/v) en una columna de Sephadex G-25 (GE Healthcare). Se
comprobó por PAGE-SDS la pureza y concentración de SarA-10xHis y se liofilizó la muestra.
Se envió este liofilizado a Davids Biotechnologie para la obtención de anticuerpos en conejo
que reconociesen esta proteína de fusión SarA-10xHis en western blot.

3.6.6. Desglicosilación con PNGasa F

Para la digestión de InuA-HA con PNGasa F se utilizó el kit PNGase F kit (New
England Biolabs). Para la digestión de la proteína intracelular se pesaron 3 mg de micelio
pulverizado y liofilizado y se mezclaron con 500 µl de una solución de lisis [NaOH 0.2 M con
β-mercaptoetanol al 0.2% (v/v)]. Posteriormente esta mezcla se incubó 5 min en hielo, se
pipeteó en un filtro Microcon (Regenerated Cellulose YM-30), que retiene moléculas mayores a
30 kDa, y se centrifugó 30 min a 14000 × g para forzar la elución de la solución de lisis y la
concentración del material celular en el filtro, que incluía InuA-HA. El filtro se invirtió y se
colocó en un tubo nuevo para recoger el material celular, mediante centrifugación durante 5 min
a 3000 × g. Para neutralizar el pH, el material celular se resuspendió en 200 µl de HEPES pH
7.2 50 mM, KCl 100 mM, EDTA 2 mM, DTT 1 mM e inhibidores de proteasas (Complete
ULTRA EDTAfree, Roche, a la concentración recomendada). 36 µl de esta solución se
mezclaron con 4 µl de Glycoprotein Denaturing Buffer 10x (PNGase F kit, New England) para,
posteriormente, desnaturalizar las proteínas por incubación durante 10 min a 100ºC. Se dividió
esta solución de 40 µl en dos tubos con 20 µl cada uno. Cada uno de los tubos con 20 µl hasta
40 µl con: 4 µl de Reaction Buffer 10x, 4 µl de detergente NP40 10%, 8 µl de H2O y, en uno de
los tubos 4 µl de la solución de PNGasa F del kit (2000 unidades), en el otro (control negativo)
4 µl adicionales de H2O. Para la reacción de desglicosilación se incubaron los tubos a 37ºC

Página 85
Materiales y Métodos
durante 1.5 h. Finalmente, se añadió, a cada tubo, 50 µl de tampón Laemli y con una alícuota se
analizó InuA-HA por PAGE-SDS y western-blot.

Para la digestión de la inulinasa presente en el medio extracelular, se recogieron 3.2 ml

del medio de cultivo de una cepa inuA-HA en sacarosa durante 1.5 h (ver 3.5.8.1) y se filtraron
con un filtro Microcon (Regenerated Cellulose YM-30). Se invirtió el filtro y se recogió lo
retenido por centrifugación como en el caso anterior. Finalmente el material recogido se
resuspendió en 180 µl del mismo medio de cultivo. Se recogieron 36 µl de esta solución y se
mezclaron con 4 µl de Glycoprotein Denaturing Buffer 10x (PNGase F kit, New England) para,
posteriormente, incubar 10 min a 100ºC. A partir de aquí se siguió el mismo protocolo que para
la digestión de la inulinasa intracelular, explicada en el párrafo anterior.

3.7. Microscopía de fluorescencia in vivo

3.7.1. Especificaciones técnicas
Para todas las observaciones in vivo, utilizamos un microscopio invertido Leica
DMI6000B con una fuente de luz externa Leica EL6000. Las imágenes se tomaron utilizando
un objetivo HCX × 63, con una apertura numérica de 1.4 y una cámara Hamamatsu ORCA ER-
II cooled-charge. Se utilizaron filtros Semrock Brightline GFP-3035B (para GFP), TXRED-
4040B (para mCherry, mRFP y FM4-64) y el filtro adecuado para blankophor BA y CMAC
(filtro de excitación: 355–425 nm; espejo dicroico 455 nm; filtro de barrera: LP 470 nm).
Cuando se requirió, usamos un image splitter DualView DV2 para obtener imágenes
simultáneas en los canales verde y rojo. Las imágenes se analizaron, si no se indica lo contrario,
con los programas Metamorph (Molecular Devices) e ImageJ. Cuando se indica, las imágenes
fueron sometidas a un tratamiento de deconvolución ciega de los programas informáticos
Huygens Professional o Autoquant.

3.7.2. Condiciones de cultivo y experimentos de cambio de temperatura con

mutantes termosensibles
Se utilizaron cámaras de incubación ibidi µ-Slide 8 Well Uncoated Grid-500 (GmbH),
con 0.35 ml de medio de cultivo por pocillo. Cada pocillo se inoculó con esporas y las cámaras
se incubaron a 26ºC durante 16-17 horas antes de su observación al microscopio. La
temperatura se controló con un incubador acoplado a la pletina del microscopio y una camisa
térmica que envolvía el objetivo HCX × 63, ambos controlados por un equipo 37-2 digital
temperature controller (Peacon). Además, la temperatura de la habitación se mantuvo a 28-
30ºC. En el microscopio, se utilizó siempre una temperatura inicial de 28ºC. Cuando se

Página 86
 Materiales y Métodos
utilizaron mutantes termosensibles la temperatura se incrementó de tal forma que el medio de
cultivo alcanzase 37ºC en 15 min.

3.7.3. Utilización de colorantes fluorescentes

Para cargar las células con CMAC (Molecular Probes C2110, Invitrogen; 7-amino-4-
clorometil coumarin) se recogió de cada pocillo el medio de cultivo original y se sustituyó
medio fresco con CMAC 10 μM. Después de 5 min de incubación, se recogió el medio con
CMAC y el pocillo se lavó dos veces con medio sin el fluoróforo. Finalmente se añadió un
tercer volumen de medio sin CMAC (350 µl). Para el marcaje con Blankophor BA [Bayer AG;
ácido 4,4′-bis [(4-anilino-subst.1,3,5-triazin-2-yl)amino] stilben-2,2′-disulfónico] se utilizó una
concentración final de 1 μg/ml y se dejó incubar durante un minuto. Se retiró el medio con el
colorante y se añadió medio fresco. Para la carga con FM4-64 [Molecular Probes; dibromuro de
N-(3-trietilamoniopropil)-4-(p-dietil-aminofenilhexatrienil) piridinio] se añadió a una
concentración final de 1 µM, se incubó 5 min y se lavó una vez con medio sin fluoróforo.

3.7.4. Utilización de las drogas Latrunculina B y Brefeldina A

La droga Latrunculina B (Calbiochem) se utilizó a una concentración final de 0.1 mM y
la droga Brefeldina A (Fluka) se utilizó a 200 µg/ml, cambiando el medio original en el pocillo
de la cámara de incubación por medio con la droga.

3.7.5. Inducción del promotor niiA

Para la regulación de la expresión de SlaB, bajo el control del promotor niiA (alelo
slaB1 [190]), se inocularon esporas en WMM con nitrato 10 mM (para inducir la expresión) o
con amonio 40 mM (para reprimirla) como fuente de nitrógeno, y se cultivaron durante 16-18 h.

3.7.6. Análisis de colocalización: Li y Pearson

Para el cálculo del cociente de Li y el coeficiente de Pearson [195] se utilizaron
proyecciones de máximas intensidades de imágenes correspondientes a varios planos en el eje z.
Estas imágenes, previamente a la obtención de la proyección de máxima, habían sido sometidas
a deconvolución con el programa Huygens Professional. El cociente de Li y el coeficiente de
Pearson se calcularon con el plugin JaCoP (Just another Colocalization Plugin) de ImageJ,
mediante la utilización de regiones rectangulares intracelulares que no contuviesen núcleos.

Página 87
Materiales y Métodos
3.7.7. Cuantificaciones con imágenes de microscopía de fluorescencia
En los casos en que se compararon valores absolutos de fluorescencia, las imágenes
siempre se adquirieron con la misma cámara, con la misma distancia entre las diferentes
secciones axiales y con las mismas condiciones de exposición y excitación.

3.7.7.1. Intensidad de fluorescencia de CopA-GFP en sarA6

Para determinar los valores de intensidad de fluorescencia medios de CopA-GFP, se

obtuvieron proyecciones de máxima intensidad de cinco planos centrales de 4 células wt y 4
células sarA6 después de 80 min a 37ºC. Posteriormente se calcularon, con ImageJ, los valores
medios de intensidad de los píxeles intracelulares en las primeras 10 µm de cada célula,
excluyéndose los núcleos. Los valores obtenidos de las imágenes de células wt se agruparon y
se hizo lo mismo para los datos provenientes de imágenes de la cepa sarA6. A continuación, se
clasificaron los valores de los píxeles en 50 clases dependiendo del valor de intensidad que
tenían. Finalmente, se representó el porcentaje de píxeles que se agrupaban en cada una de las
clases (intervalos de intensidad) en cada condición (wt o sarA6).

3.7.7.2. Cuantificación del área ocupada por cisternas y de la fluorescencia citosólica de

células sarA6 mRFP-PHOSBP

Para la cuantificación de la fluorescencia asociada a cisternas o citosólica se utilizaron

proyecciones de suma de intensidades de los tres planos medios de una serie de planos en el eje
z. Para estimar la superficie ocupada por cisternas del Golgi, se dibujó en cada célula un
rectángulo (1.5 × 20 µm) cercano a la región apical, evitando el espacio ocupado por los
núcleos. Después de sustraer la señal de fondo (i.e. la intensidad de fluorescencia de una región
del cultivo sin células), se segmentaron las imágenes con Metamorph (thresholding functions)
de tal modo que se eligió un valor de intensidad de mRFP- PHOSBP que incluyese a todas las
cisternas. De este modo se determinó el porcentaje del área total que estaba ocupado por
cisternas. Se analizaron 13 hifas para cada condición (28ºC y ~ 40 min a 37ºC). Para cuantificar
la fluorescencia citosólica de mRFP-PHOSBP antes y después del incremento de temperatura del
cultivo a 37ºC, se dibujó un polígono de 10 µm2 cubriendo un espacio libre de cisternas de la
región apical de las hifas utilizadas para la anterior cuantificación. A continuación se determinó
la intensidad media de cada una de estas regiones. Los dos grupos mostraron diferencias
significativas (P<0.0001) en un análisis no paramétrico de Mann-Whitney.

3.7.7.3. Gradiente de ChsB en el TGN

Se midió la intensidad de fluorescencia de GFP-ChsB y mRFP-PHOSBP en un total de 60
cisternas del TGN. Estas cisternas son las correspondientes a las primeras 10 µm desde el ápice

Página 88
 Materiales y Métodos
de proyecciones de máxima intensidad de 6 células diferentes. Para determinar si existía
relación entre la variable distancia y las intensidades de GFP-ChsB y mRFP-PHOSPB se llevó a
cabo un análisis de correlación de Pearson, seguido del análisis estadístico correspondiente,
denominado Pearson Product Moment Correlation.

3.7.7.4. Localización relativa de ChsB y AbpA

Para determinar la posición relativa de ambas proteínas en la membrana, a partir de
pilas de imágenes de células que expresaban GFP-ChsB y AbpA-mRFP se obtuvo la proyección
de máximas intensidades de los 5 planos centrales y se midió la variación en fluorescencia
media de ChsB a lo largo de ~8 µm de cada hifa de uno de los “laterales” de la membrana (dado
que es una proyección, la imagen resultante es bidimensional), mediante una región de 4 píxeles
de ancho en la superficie celular. Además, se midió la fluorescencia media de AbpA en todo el
ancho de la hifa (ya que AbpA se localiza únicamente asociado a la membrana), a lo largo de ~8
µm de cada hifa. Se representaron ambos gráficos en un mismo eje de coordenadas para
comparar la distribución espacial de ambas proteínas en la membrana plasmática.

3.7.7.5. Vida media de las cisternas del TGN con ChsB

Se adquirió una imagen cada 1 o 2 segundos de células en crecimiento que expresaban

GFP-ChsB. A partir de estas “películas”, se representaron quimógrafos y se midió la vida media
de aquellas cisternas que se conseguían seguir durante todo su ciclo de aparición/desaparición.

3.7.7.6. Relocalización de ChsB en los mutantes nudA2 y nudA5

Para cuantificar el cambio en localización de ChsB en estos mutantes, se utilizaron

imágenes tomadas de cepas wt, nudA2 y nudA5 tras un cambio de temperatura de 30-40 min a
37ºC. Se realizaron proyecciones máximas de los 4 planos centrales de estas imágenes y se
midió la fluorescencia máxima de ChsB a lo largo del eje longitudinal la hifa. Para ello, se
trazaron regiones de ~ 7 µm de longitud, que tuviesen el ancho de la hifa y se representaron los
valores de fluorescencia máxima.

3.8. Herramientas informáticas

Para la búsqueda de secuencias se utilizaron las bases de datos del Broad Institute, del
NCBI y la Aspergillus Genome Database. El diseño y el análisis de los transgenes y plásmidos
se realizaron con el programa Vector NTI. Los alineamientos de secuencia se realizaron con
ClustalW, si no se indica lo contrario, y se visualizaron mediante ESpript 3.0 [196] o GeneDoc.

Página 89
Materiales y Métodos
Para la representación gráfica y el análisis descriptivo o estadístico de datos se utilizaron Excel
2010, SigmaPlot 11.0 y Prism 7. Para el análisis de estructuras proteicas se utilizó Pymol 2.0.4.

3.9 Reactivos, enzimas y kits comerciales de biología

molecular utilizados

3.9.1. Kits
Los siguientes kits, que no han sido nombrados previamente, se utilizaron siguiendo las
instrucciones de los respectivos fabricantes:

QIAquick® PCR Purification Kit (Qiagen): se utilizó para la purificación de productos

de PCR.
QIAquick® Gel Extraction Kit (Qiagen): para la purificación de fragmentos de DNA
procedentes de electroforesis en geles de agarosa.
QIAprep® Spin Miniprep Kit (Qiagen): para extraer plásmidos de E. coli con alto
grado de pureza y concentración.
Ilustra™ GFX™ PCR DNA and Gel Band Purification Kit (GE Healthcare): para la
purificación de fragmentos de DNA procedentes de PCR o de electroforesis en geles de agarosa.
pGEM T-Easy Vector System (Promega): Se utilizó para la clonación de productos de
PCR.
RediprimeTM II Random Prime Labelling System (GE Healthcare): para el marcaje de
fragmentos de DNA con [α-32P]-dCTP.
ProbeQuantTM G-50 Micro Columns (GE Healthcare): se utilizó para eliminar el
nucleótido no marcado de las sondas de DNA marcadas radiactivamente.

3.9.2. Reactivos y enzimas de biología molecular

Se detalla la procedencia de los reactivos y enzimas utilizados de manera general en el
laboratorio. Los reactivos químicos utilizados y los suplementos de los medios de cultivo se
obtuvieron generalmente de Sigma, Fluka y Merck. Los componentes de origen microbiológico
de los medios de cultivo utilizados fueron suministrados por Difco Laboratories y Pronadisa. La
calidad de los productos empleados fue siempre calidad analítica. Las enzimas de restricción
utilizadas procedían de New England Biolabs, Roche y Takara. Los reactivos empleados en las
reacciones de PCR (Prime Star HS) y la DNA ligasa del fago T4 fueron adquiridos a Takara.

Página 90
RESULTADOS
Capítulo I
 Resultados. Capítulo I

4.1. Capítulo I. Bloqueo condicional del tráfico de COPII

La salida de membrana y proteínas desde el retículo endoplasmático (RE) en vesículas
COPII es uno de los procesos mejor conocidos del tráfico intracelular de eucariotas [50, 197].
La biogénesis de las vesículas COPII está regulada por la proteína Sar1, conservada en todos los
eucariotas (Figura R.1). Una forma posible de bloquear la salida de vesículas del RE en
Aspergillus nidulans era mediante la manipulación genética del ortólogo de Sar1. Sin embargo,
el posible papel esencial de esta proteína obligaba a la utilización de mutantes condicionales, no
existentes al comenzar este trabajo. En esta parte de la tesis, nos propusimos obtener mutantes
termosensibles de sarA, el ortólogo de Sar1, y determinar el efecto que tiene el bloqueo de la
salida del RE en la organización del aparato de Golgi.

4.1.1. Localización del homólogo de sar1 en el genoma de A. nidulans

A. nidulans tiene un único homólogo de sar1, que se denomina sarA (AN0411) [198].
Mediante alineamientos de las secuencias de aminoácidos calculamos una identidad del 73%
con SAR1 de S. cerevisiae y del 65% con SAR1a de Homo sapiens. En todos los eucariotas
(metazoos, plantas, hongos) existe un alto grado de conservación de Sar1 (Figura R.1).

4.1.2. sarA es un gen esencial

Dado que en S. cerevisiae SAR1 es un gen esencial [199] y que Sar1 es fundamental en
la ruta secretora esperábamos que sarA tuviese también una función esencial. Para verificar esta
predicción, mediante la técnica de rescate de heterocariontes [200], reemplazamos por
transformación la secuencia codificante de sarA por el gen pyrG, de A. fumigatus (pyrGfum)
[194], que complementa la auxotrofía para pirimidinas que la cepa transformada tenía, por
poseer la mutación pyrG89. En esta cepa el gen nkuA estaba delecionado (nkuAΔ::bar) para
prevenir la recombinación no homóloga. Únicamente obtuvimos transformantes diploides o
heterocariontes, según el genotipado de las cepas mediante Southern-blot y PCR (véase el
capítulo II, donde se reúnen las deleciones de todas las GTPasas de la familia Arf / Sar). Las
colonias heterocariontes darían lugar a dos tipos de conidiosporas: transformantes (sarAΔ::
pyrGfum) y no transformantes (pyrG89; sarA). Comprobamos que las esporas procedentes de las
colonias heterocariontes eran incapaces de crecer en medio sin pirimidinas (capítulo II), lo que
indica que sarA es un gen esencial.

Página 95
Resultados. Capítulo I

Figura R.1. Alineamiento de la familia Sar1. Alineamiento múltiple de secuencia mediante

ClustalW. El color rojo indica residuo invariable y el amarillo similitud de secuencia con un umbral
de 0.15 usando la matriz BLOSUM62. Nombre de especie y números de identificación de GenBank:
Aspergillus nidulans: 74598992, Cricetulus griseus: 55976614, Homo sapiens: 8926205,
Saccharomyces cerevisiae: 1370452, Drosophila melanogaster: 24648946, Caenorhabditis elegans:
373220385; Arabidopsis thaliana: 15223516.

Para comprobar en qué fase de la transición morfogenética de conidio a hifa se detiene

el crecimiento en ausencia de sarA, incubamos esporas de las colonias heterocariontes en medio
sin pirimidinas. De las 300 esporas observadas ninguna fue capaz de emitir tubo germinativo
(datos no mostrados). Esto indica que sarA se requiere para el establecimiento de polaridad.

4.1.3. Diseño del método de generación de mutantes termosensibles

Nuestro objetivo era buscar mutaciones en sarA que (a) causasen termosensibilidad y
(b) permitiesen realizar estudios estructura-función. Las mutaciones se obtuvieron por PCR
mutagénica. El método elegido requiere la clonación del gen en un plásmido que replique en E.
coli (Figura R.2). Tras ello, se amplifica por PCR el gen clonado con una polimerasa con alta
tasa de error. Ambas hebras del producto obtenido se usan como cebadores para amplificar el
plásmido completo en una reacción posterior, generando así plásmidos recombinantes
mutagenizados al azar en el gen diana. Con la población de plásmidos se transforma E. coli y se

Página 96
 Resultados. Capítulo I
hace una extracción de la población de plásmidos, que constituye la mutateca. En primer lugar,
el gen sarA es pequeño. Su región codificante, intrones inclusive, es de 1086 pb; por lo cual su
clonación en un vector es trivial. Por tanto, el factor limitante del método arriba explicado es la
obtención de un número suficiente de clones transformantes de E. coli con los plásmidos
mutagenizados que constituya una mutateca representativa; sin embargo, el número de clones
necesarios para obtener tal mutateca en el caso de un gen tan pequeño como sarA es
relativamente bajo. Como consecuencia, este método de mutagénesis era idóneo para generar
una mutateca de la secuencia completa de sarA. Para la obtención de los mutantes deseados, la
frecuencia de mutación idónea que permitiría realizar estudios de estructura-función, sería
aquélla que causase una única mutación de cambio de sentido por gen. El número de mutaciones
para conseguir este objetivo se ve influido por la degeneración del código genético (1-2
mutaciones necesarias para obtener una mutación de cambio de sentido), y por la presencia de
intrones. SarA posee 5 intrones, que cubren un 49.6% de su región codificante. Por tanto,
decidimos introducir ~2 mutaciones por gen.

4.1.4. Construcción de la mutateca de sarA en Escherichia coli

Utilizamos una casete que contiene el gen sarA silvestre, con su región 3’UTR completa
y, aguas abajo, el marcador de selección pyrGfum (Figura R.2A-B). Para comprobar que la
disposición del marcador de selección en una posición adyacente a sarA no afectaba a la función
del gen, se transformó con dicha casete una cepa nkuAΔ pyrG89. Los transformantes se
genotiparon mediante Southern-blot para comprobar la correcta integración y la ausencia de
eventos de recombinación ectópicos. Se comprobó que estos transformantes eran
indistinguibles, en cuanto a su crecimiento, de una cepa silvestre a 30ºC, 37ºC y 42ºC, tanto en
medio completo como en medio mínimo (Figura R.2B). Esto demostró que las manipulaciones
genéticas necesarias para el reemplazamiento de sarA no provocan una pérdida detectable de
función del gen. Denominamos a este alelo “pseudosilvestre”, que contiene el marcador de
selección pyrGfum adyacente a sarA, sarA0. Clonamos en un plásmido la casete arriba detallada
y generamos plásmidos mutagenizados en sarA, mediante PCR mutagénica (ver Materiales y
Métodos y la Figura R.2C). Transformamos E. coli, obteniendo alrededor de 20.000 colonias.
Para determinar el número medio de mutaciones introducidas y su distribución estadística
secuenciamos el gen sarA del plásmido de 20 transformantes (Figura R.2C). El número de
mutaciones por clon se ajustó a una distribución normal (test D’Agostino-Pearson), y su media
se ajustó a 2 (Figura R.2C). Por tanto, el número medio de mutaciones por gen es el que se
había decidido en el diseño experimental, por lo que consideramos que el ajuste de las
condiciones de PCR mutagénica fue el correcto.

Página 97
Resultados. Capítulo I

Figura R.2. Mutagénesis de sarA. A. Estructura de sarA que muestra, a escala, los exones (azul) y
los intrones (gris). Las flechas indican la región mutagenizada, que abarca casi el total del gen. B.
Arriba, esquema del reemplazamiento génico. Específicamente, la casete consiste en 997 pb aguas
arriba del codón de iniciación, seguido por la región codificante, el 3'UTR completo (572 pb) y 55 pb
adicionales para facilitar la terminación de la transcripción. Este fragmento genómico está fusionado
al marcador de selección pyrG de Aspergillus fumigatus y seguido de 785 pb del DNA flanqueante a
AN0411 (sarA) para promover la recombinación homóloga. Abajo se muestra en un test de
crecimiento que la cepa silvestre que porta el alelo natural de sarA y la cepa con el reemplazamiento
génico de la casete mostrada arriba (alelo denominado sarA0) no presentan diferencias detectables de
crecimiento, ni en medio mínimo ni en completo. C. Esquema del proceso de mutagénesis,
transformación de A. nidulans y selección de mutantes termosensibles.

Página 98
 Resultados. Capítulo I
4.1.5. Selección y caracterización de 8 alelos termosensibles de sarA
Mediante transformación de A. nidulans con la mutateca obtuvimos una colección de
transformantes portadores de alelos sarA mutados. Replicamos un total de ~1300 transformantes
primarios en medio mínimo a 30ºC y 42ºC (Figura R.2C) e identificamos ocho transformantes
que crecían a 30ºC pero que eran incapaces de crecer a 42ºC. Purificamos estos transformantes
mediante aislamiento de colonias, tras plaquear una suspensión de conidiosporas en medio
completo sin pirimidinas. Además comprobamos por triplicado en cada caso la
termosensibilidad de estas colonias aisladas (Figura R.2C). La secuenciación de sarA en las
ocho cepas seleccionadas mostró que todas contenían mutaciones de cambio de sentido en sarA.
Denominamos a estos nuevos alelos sarA1-sarA8. De los 8 alelos diferentes, 5 tenían más de
una mutación de cambio de sentido, mientras que los tres restantes contenían una única
mutación de este tipo (Figura R.3A). Además, la mayoría de ellos contenía al menos una
mutación silenciosa (Figura R.3A).

Mediante un test de crecimiento a 30ºC, 37ºC y 42ºC (Figura R.3B), tanto en medio
mínimo como completo, comprobamos que existían diferentes grados de termosensibilidad: i)
crecimiento silvestre a 30ºC y 37ºC y ausencia de crecimiento a 42ºC (sarA1, sarA3 y sarA8);
ii) crecimiento silvestre a 30ºC, crecimiento deficiente a 37ºC y ausencia de crecimiento a 42ºC
(sarA2, sarA6 y sarA7); iii) crecimiento deficiente a 30ºC y ausencia de crecimiento a 37ºC y
42ºC (sarA4 y sarA5).

4.1.6. La termosensibilidad de los transformantes estaba ligada genéticamente a

sarA
El locus ureB se encuentra a 64 kb de sarA en dirección hacia el centrómero del
cromosoma VIII y codifica la única ureasa de A. nidulans [201]. La distancia genética entre
ureB y el locus ureA situado a 30 kb centrómero distal es de 0,5 cM [201]. Esto indica, aun
teniendo en cuenta que la distancia física no correlaciona totalmente con la distancia genética,
que el gen sarA debiera estar fuertemente ligado a ureB. La mutación ureB3 impide el
crecimiento con urea como fuente de nitrógeno. Para averiguar si la termosensibilidad de los
transformantes seleccionados es debida a las mutaciones detectadas en sarA, cruzamos cada
mutante termosensible con una cepa ureB3. Los mutantes sarA4 y sarA5 no cruzaron.
Confirmamos que la termosensibilidad de los restantes mutantes es debida a una mutación en un
único gen, ya que alrededor del 50% de la descendencia de cada cruce fue termosensible.
Mediante crecimiento a 42ºC o con urea como fuente de nitrógeno confirmamos que ureB3 y la
termosensibilidad se encontraban en repulsión y determinamos una frecuencia de recombinación
(dobles mutantes ts ureB3 o no-ts ureB+) similar para todos los cruces (alrededor de 10 cM), lo

Página 99
Resultados. Capítulo I
que concuerda con la disposición cromosómica de sarA y ureB y las distancias genéticas
conocidas de la zona. Por tanto la termosensibilidad de los mutantes está genéticamente ligada a
sarA, lo que descartó la posibilidad de que se debiera a mutaciones no relacionadas con los
alelos sarA, que se hubiesen generado espontáneamente durante la transformación.

Figura R.3. Mutantes termosensibles de sarA. A. Caracterización molecular de los alelos sarA. La
posición en el DNA es relativa al primer nucleótido del codón de iniciación. B. Test de crecimiento de
las cepas mutantes en sarA. C. A la izquierda, estructura 3D de Sar1 de hámster con la nomenclatura
de la estructura secundaria (pdb 1F6B). La región punteada está aumentada para facilitar la
visualización de la inserción de la hélice N-terminal. A la derecha, los aminoácidos sustituidos
mapeados en la estructura de Sar1 de hámster. Las sustituciones para cada alelo, y los residuos
involucrados están en el mismo color que en A. Los números corresponden a los residuos en A.
nidulans. Nótese que tanto sarA4 y como sarA5, que comparten la sustitución W184C, están de color
morado.

Página 100
 Resultados. Capítulo I
4.1.7. Los niveles de SarA no están alterados en la estirpe control sarA0
Con el objetivo de analizar SarA por western-blot, obtuvimos un anticuerpo policlonal.
Para ello, expresamos SarA marcada con 10 histidinas (SarA-10xHis) en E. coli y la
purificamos incubando un extracto soluble con una resina de sefarosa-níquel (ver Materiales y
Métodos). Una vez purificada, utilizamos SarA-10xHis como antígeno y obtuvimos antisuero de
conejo, inmunorreactivo en western-blot contra SarA.

Para determinar los niveles de SarA en una cepa wt y otra sarA0, las cultivamos a 30ºC
y 37ºC. Extrajimos la proteína total mediante lisis alcalina directa del micelio, para reducir la
posibilidad de proteólisis. Este método requiere congelar y liofilizar el micelio para,
posteriormente, lisar las células con un tampón alcalino. Posteriormente, se realiza una
precipitación con ácido tricloroacético y se resuspende el pellet con tampón Laemli (ver
Materiales y Métodos).

Mediante western-blot, comprobamos que los niveles de SarA en nuestro control

“pseudosilvestre” sarA0 eran los mismos a los de una cepa silvestre, independientemente de la
temperatura de cultivo (Figura R.4A). Esto confirma que el reemplazamiento génico de sarA
con la casete sarA-pyrGfum no afecta a la expresión de SarA, lo que demuestra la validez del
método de reemplazamiento génico.

4.1.8. Los niveles de SarA de los mutantes sarA-ts disminuyen con el aumento de la
temperatura
Una vez comprobado que el reemplazamiento génico empleado no afectaba a los niveles
SarA, estudiamos el efecto de las distintas mutaciones. Del mismo modo que en el apartado
anterior, cultivamos los mutantes termosensibles a 30ºC y 37ºC (no utilizamos sarA4 y sarA5
dado su fuerte defecto de crecimiento). Como se aprecia en la Figura R.4A, los niveles de SarA
a 30ºC en sarA1, sarA2 y sarA6 (Figura R.4B) eran menores a los de la cepa silvestre. Esto
indica en estos mutantes que el plegamiento de SarA está afectado incluso a temperatura
permisiva. Por otro lado, sarA3, sarA7 y sarA8 no causaron una reducción de los niveles de
SarA a 30ºC. Sin embargo, a 37ºC, los niveles de SarA fueron notablemente menores en todos
los mutantes termosensibles estudiados (Figura R.4A). Estos resultados sugieren que las cepas
termosensibles obtenidas expresan variantes mutantes de SarA que, a temperatura restrictiva,
pierden su conformación nativa y son degradadas por los sistemas de control de calidad.
Concluimos que, al menos varios de los mutantes obtenidos, eran una herramienta genética
excelente para bloquear de manera reversible, rápida y específica el transporte de proteínas y
lípidos desde el RE al Golgi y así estudiar la biogénesis y el funcionamiento de este último.

Página 101
Resultados. Capítulo I

Figura R.4. Niveles de SarA a 30ºC y 37ºC y análisis in silico de sarA3, sarA4 y sarA6. A.
Extractos de proteína total, obtenidos mediante lisis alcalina, de las cepas con los alelos indicados,
obtenidos de cultivos crecidos en medio mínimo a 30ºC o 37ºC, analizados mediante western-blot. Se
utilizaron anticuerpos específicos contra SarA. El cambio de movilidad de la banda correspondiente a
SarA7 (SarA se alarga en 3 aminoácidos) confirma la especificidad de la inmunodetección. B.
Western-blot de wt y sarA6 similar a A, realizando un cambio de temperatura de 30ºC a 37ºC durante
el tiempo indicado en cada caso. C. sarA3 provoca tres sustituciones, involucrando los residuos
recuadrados. El diagrama muestra la red hidrofóbica que incluye la fenilalanina 93 y la isoleucina
165, afectadas por sarA3, con su equivalencia en hámster entre paréntesis. El código de colores
corresponde al mostrado en la Figura R.3C. D. Se muestran las posiciones de las sustituciones
causadas por sarA4 y sarA6, localizadas en la α-hélice C-terminal. El alineamiento corresponde a
hámster, A. nidulans y S. cerevisiae, respectivamente.

4.1.9. Análisis de las sustituciones resultantes de las mutaciones de sarA1-sarA8 en

el contexto de la estructura de la proteína
La proteína Sar1 de hámster, ortóloga de SarA, está cristalizada [202] y su secuencia es
muy similar a la de SarA (Figura R.1). Por lo tanto, estudiamos las sustituciones aminoacídicas
sobre su estructura tridimensional. Recuérdese que las GTPasas de la familia Arf/Sar se activan
mediante la unión de GTP y la consecuente inserción de su α-hélice N-terminal anfipática en la

Página 102
 Resultados. Capítulo I
membrana donde actúan. Cuando están unidas a GDP, la α-hélice N-terminal se encuentra en un
bolsillo cerrado por el bucle que conecta las β-láminas 2 y 3 (para detalle de esta región, ver
Figura R.3C). La unión de GTP por intercambio con GDP provoca que estas β-láminas se
desplacen. Este desplazamiento cambia la posición del bucle y permite que la hélice N-terminal
se extienda hacia fuera de la estructura.

Tanto sarA1 como sarA2 probablemente provoquen un defecto general en el

plegamiento de SarA, ya que causan una notable reducción de los niveles de dicha proteína
incluso a 30ºC (Figura R.4A). sarA2 es un mutante hipomorfo que crece menos que una cepa
silvestre a 30ºC y 37ºC y no crece a 42ºC (Figura R.3B). sarA2 causa las sustituciones Asn18Ile
e Ile61Val en SarA. Ile61 se encuentra en el bucle entre las láminas β-2 y β-3, que participan en
el broche que sujeta la α-hélice N-terminal. Por otro lado, la sustitución Asn18Ile alteraría la
posición del bucle que conecta dicha α-hélice N-terminal con la primera β-lámina.
Posiblemente, la combinación de ambas sustituciones altere la correcta disposición de la α-
hélice N-terminal. Una de las sustituciones causadas por sarA1, Gly62Arg, también afecta al
bucle β-2 β-3, posiblemente alterando el adecuado funcionamiento del mecanismo de
plegamiento / extensión de la hélice α-1.

Las sustituciones resultantes de sarA3 impiden el crecimiento a 42ºC, aunque permiten

un crecimiento esencialmente silvestre a 30ºC y 37ºC. Sin embargo, los niveles de SarA están
muy reducidos ya a 37ºC (Figura R.4A). Las tres sustituciones Phe93Leu, Asp117Glu e
Ile165Val son conservativas. Asp117Glu afecta a un residuo orientado hacia el disolvente. Por
su parte, Phe93Leu e Ile165Val podrían debilitar los contactos hidrofóbicos entre la α-hélice 4 y
la β-lámina central (Figura R.4C).

Las mutaciones sarA4 y sarA5 afectan al crecimiento incluso a 30ºC y no forman

colonias a 37ºC ni a 42ºC. Son fenotípicamente indistinguibles entre sí. sarA4 provoca una
doble sustitución Ala112Ser, Trp184Cys, mientras que sarA5 codifica una proteína SarA
mutante con una única sustitución, Trp184Cys. Por lo tanto, el defecto de crecimiento
provocado por sarA4 y sarA5 es debido a la sustitución Trp184Cys. El residuo Trp184 está
conservado en todos los ortólogos de Sar1 que han sido caracterizados, incluido el de hámster
(Figura R.1) y se localiza en la α-hélice C-terminal, que cubre la β-lámina central, que es
hidrofóbica (Figura R.4D).

sarA6 provoca la sustitución Ser186Pro, que también afecta a la α-hélice C-terminal

(Figura R.4D). Esta sustitución Ser186Pro interrumpiría la α-hélice, lo que presumiblemente
afectaría al plegamiento. De hecho, los niveles de SarA en sarA6 disminuyen con el aumento de
la temperatura (Figura R.4A). Podemos, por tanto, asumir razonablemente que sarA6 es un
mutante termosensible válido para estudiar el efecto de la inactivación de todas las funciones de
SarA.

Página 103
Resultados. Capítulo I
La mutación sarA7 (Phe93Ile, STOP191Trp + Thr192 Ser193) causa, al igual que
sarA3, una sustitución de Phe93 por un aminoácido con cadena lateral alifática. Además, es
posible que la adición de tres residuos más en la hélice C-terminal afecte al plegamiento de la
proteína, al alterar el bucle que conecta α1 con β1.

sarA8 sólo causa la sustitución Gly27Ser. Gly27 forma parte del denominado bucle P
(P-loop) o motivo de Walker A [203]. El P-loop tiene la secuencia consenso GxxxxGKS/T, en
donde el residuo N-terminal de Gly corresponde al sustituido en SarA8. Esta glicina está
conservada en la gran mayoría de ATPasas y GTPasas [204]. El mutante sarA8 crece a 30ºC y
37ºC como una cepa silvestre y no crece a 42ºC (Figura R.3B).

4.1.10. Selección de los alelos termosensible idóneos para estudios por microscopía
Para determinar el efecto de la inactivación de SarA nuestro propósito era visualizar,
mediante microscopía de fluorescencia in vivo, el comportamiento de los diferentes
compartimentos exocíticos utilizando proteínas fluorescentes. Dado que nuestro microscopio
admite una temperatura máxima en la pletina de 37-39ºC, debíamos seleccionar un mutante
termosensible adecuado a esta limitación. sarA6 y sarA7 tienen un gran defecto en el
crecimiento a 37ºC; sin embargo, sarA1, sarA2, sarA3 y sarA8 crecen bien a esta temperatura.
Por lo tanto, sarA6 y sarA7 eran potencialmente útiles para microscopía in vivo, dado que
permiten hacer el cambio a la temperatura restrictiva en la propia pletina del microscopio.
Elegimos inicialmente sarA6 porque, a diferencia de sarA7, contiene una única mutación de
cambio de sentido y, por lo tanto, conocemos la sustitución concreta que provoca la
termosensibilidad. Nos propusimos determinar cómo variaban los niveles de SarA a lo largo del
tiempo cuando se incrementa la temperatura de incubación de las células sarA6 desde 30ºC a
37ºC. Cultivamos la cepa mutante sarA6 y una estirpe silvestre durante 16 horas a 30ºC, para
después cambiar los cultivos a 37ºC. Recogimos células antes del cambio de temperatura y
después de 30, 60 y 120 minutos a 37ºC. Mediante western-blot comprobamos que, mientras
que en la cepa silvestre no hubo variaciones en los niveles de SarA, en el mutante sarA6 se
produjo una disminución drástica de SarA después de 30 minutos del cambio de temperatura
(Figura R.4B). Por lo tanto, seleccionamos sarA6 para realizar estudios por microscopía.

4.1.11. La inactivación condicional de SarA detiene la secreción al nivel del retículo

endoplasmático
4.1.11.1. Deslocalización de Sec23 de los sitios de salida del retículo endoplasmático

Primero, estudiamos el reclutamiento de COPII a los sitios de salida del retículo

endoplasmático (ERES) en el mutante sarA6, mediante la visualización de la subunidad de

Página 104
 Resultados. Capítulo I
COPII Sec23 [205]. Utilizamos una cepa sarA6 cuya única copia de Sec23 está etiquetada con
GFP endógenamente y se expresa en su locus y con su promotor nativo. En una cepa silvestre,
Sec23-GFP se localiza en numerosos puntos intracelulares, que corresponden a los ERES [24]
(Figura R.5A). El patrón de localización subcelular de Sec23-GFP en el mutante sarA6 fue
indistinguible del silvestre a 28ºC (Figura R.5A). Sin embargo, después de 20 minutos tras el
cambio de temperatura a 37ºC en el microscopio, la mutación sarA6 provocó la deslocalización
parcial de Sec23 de estos focos hacia un patrón difuso de fluorescencia en el citosol. Después de
30 minutos, los ERES estaban claramente reducidos a unos pocos agregados de mayor tamaño.
Este fenotipo era aún más conspicuo tras 55 minutos del cambio de temperatura (Figura R.5A).
Por lo tanto, a 37ºC sarA6 provoca una desorganización de los ERES. Nos preguntamos si este
efecto era específico del alelo sarA6. Realizamos el mismo experimento utilizando el mutante
sarA8 y comprobamos que el efecto de sarA8 sobre los ERES era indistinguible del producido
por sarA6 (Figura R.5B). Esto indica que la desorganización de los ERES no era un efecto
específico de alelo, sino que se debía a la inactivación de SarA. Por tanto, estos resultados
sugieren que la inactivación de SarA impide la formación de vesículas COPII para el transporte
desde el RE al aparato de Golgi.

4.1.11.2. Deslocalización de la GTPasa exocítica RabE y de la v-SNARE SynA

Esperábamos que la inactivación de la salida del RE bloquease la exocitosis. Para

averiguarlo, utilizamos dos proteínas que intervienen en los últimos pasos de la exocitosis:
RabE, que se encuentra en las vesículas de secreción que viajan desde el trans-Golgi (TGN)
hacia la membrana plasmática y se acumulan en el Spitzenkörper (SPK) [36]; y la v-SNARE
SynA que presumiblemente participa en la fusión de estas vesículas de secreción con la
membrana plasmática [12]. A 28ºC SynA se localiza en la membrana apical y en el SPK, tanto
en sarA6 como en una cepa silvestre (Figura R.5C). Por su parte, RabE marca el SPK de forma
indistinguible en sarA6 y en una cepa silvestre (Figura R.5D). A los 20-30 minutos de cambiar
la temperatura a 37ºC, tanto SynA como RabE cambiaron su localización en sarA6. SynA se
deslocalizó parcialmente de la membrana plasmática, acumulándose en estructuras
intracelulares (Figura R.5C) mientras que RabE se volvió citosólico, probablemente porque ya
no se reclutaba a las membranas del TGN (Figura R.5D). Estos resultados son consistentes con
un bloqueo de la exocitosis y sugieren que sarA6, al desorganizar los ERES, impide la
exocitosis a 37ºC.

Página 105
Resultados. Capítulo I

Figura R.5. sarA6 impide la secreción y sarA6 y sarA8 impiden la biogénesis de vesículas COPII.
A. Sec23-GFP en células wt y sarA6. Las células fueron precultivadas a 28ºC y cambiadas a 37ºC
durante el tiempo indicado. Sec23 se deslocaliza en el mutante sarA6. B. Sec23-GFP en células wt y
sarA8, mostrando el mismo resultado que con sarA6. C. GFP-SynA, como en A. D. GFP-RabE.
(Todas las imágenes a la misma magnificación).

4.1.11.3. RerA, que continuamente cicla entre el retículo endoplasmático y el Golgi, se

encuentra desplazada hacia el retículo en el mutante sarA6

Con el fin de comprobar si verdaderamente estaba ocurriendo un bloqueo del tráfico al

nivel del RE, nos propusimos estudiar una proteína transmembrana que ciclase continuamente
entre el RE y el aparato de Golgi. La predicción era que al inactivar SarA se impediría la salida
de vesículas COPII y dicha proteína se acumularía en el RE. Para ello elegimos RerA, ya que su
localización está bien caracterizada [18]. RerA es una proteína transmembrana que, aunque cicla
continuamente entre el RE y el Golgi, en el estado estacionario se localiza en el Golgi temprano
[18]. Su función es facilitar la vuelta al RE de proteínas residentes de este orgánulo que han
viajado al Golgi [206]. Después de construir una cepa sarA6 gfp-rerA, realizamos experimentos
de microscopía in vivo. Descubrimos que sarA6 altera la localización normal de RerA-GFP
incluso a 28ºC. Mientras que en una cepa silvestre GFP-RerA marca las cisternas del Golgi

Página 106
 Resultados. Capítulo I
temprano, en sarA6 se localiza, además, en las envolturas nucleares (Figura R.6A). (Recuérdese
que las envolturas nucleares corresponden a membranas del RE). Por lo tanto a temperatura
permisiva sarA6 se comporta como un mutante hipomorfo (como sugería el western-blot de la
Figura R.4A), que impide parcialmente el transporte desde el RE al aparato de Golgi. Cuando
incrementamos la temperatura del cultivo, en tan sólo 10-15 minutos toda la señal de
fluorescencia GFP-RerA se desplazó al RE, marcándose tanto las envolturas nucleares como la
red de membranas correspondiente al RE periférico (Figura R.6A-B) [159]. Concluimos que la
inactivación de SarA mediante el mutante sarA6 bloquea el tráfico desde el RE al aparato de
Golgi.

Figura R.6. Rápida inactivación del tráfico anterógrado en la interfaz retículo-Golgi por sarA6. A.
GFP-RerA en hifas wt y sarA6, precultivadas a 28ºC y cambiadas a 37ºC. Nótese la rápida relocalización
del marcador al retículo, resepresentada esquemáticamente en la derecha. Las flechas señalan los núcleos.
B. Secciones de un z-stack, sometido a deconvolución mostrando la localización de RerA en el retículo
endoplasmático, después de más de 30 minutos del cambio de temperatura a 37ºC.

Página 107
Resultados. Capítulo I
4.1.12. Desorganización del Golgi por inactivación de SarA
Una vez establecido que sarA6 impide la adecuada salida del RE, determinamos su
efecto en el aparato de Golgi utilizando proteínas marcadoras tanto del Golgi temprano como
del TGN (Tabla R.1). Utilizamos tanto proteínas periféricas como integrales de membrana. De
este modo podíamos estudiar tanto el mantenimiento de la identidad de las cisternas del Golgi
como el destino final de las membranas.

Tabla R.1. Proteínas marcadoras utilizadas en el estudio de la desorganización del Golgi.

Golgi temprano TGN

Periférica de membrana CopA PHOSBP

Integral de membrana SedV TlgB

4.1.12.1. El Golgi temprano pierde su identidad y sus membranas se relocalizan al retículo

endoplasmático

La proteína periférica CopA se relocaliza al citosol

El complejo oligomérico COPI está implicado en el tráfico dentro del aparato de Golgi
y en el transporte retrógrado entre el Golgi y el RE. Al tráfico retrógrado intra-Golgi mediado
por COPI se le atribuye un papel clave en la maduración de cisternas [55, 135, 207]. CopA es
una subunidad esencial de COPI [165], la denominada subunidad α. Como se demuestra en el
capítulo IV, CopA-GFP se localiza en el Golgi temprano. En el mutante sarA6 cultivado a 28ºC,
CopA-GFP se localizó igual que en una cepa wt (Figura R.7A). Sin embargo, a los 20-30
minutos de incrementar la temperatura a 37ºC, CopA-GFP se deslocalizó desde las cisternas del
Golgi al citosol (Figura R.7A). La Figura R.7B muestra una cuantificación del aumento de
fluorescencia citosólica (intensidades bajas), que correlaciona con una disminución de
fluorescencia en cisternas (intensidades altas de fluorescencia). Dicho efecto no ocurre en la
cepa silvestre. Este resultado es compatible con que se produzca una reabsorción de las cisternas
del Golgi temprano al bloquearse el tráfico desde el RE.

Las membranas del Golgi temprano marcadas con SedV se reabsorben por el RE

Posteriormente, investigamos el destino de una proteína transmembrana. Elegimos la t-

SNARE específica del Golgi temprano, SedV [18]. SedV se encuentra normalmente en las
cisternas del Golgi temprano; sin embargo, en el mutante sarA6 a 28ºC, se localizó parcialmente
en las envolturas nucleares (Figura R.7C), de un modo similar a RerA (Figura R.6A). A los 10-
15 minutos de incrementar la temperatura a 37ºC, SedV se localizó totalmente en las

Página 108
 Resultados. Capítulo I
membranas del RE (Figura R.7C), como demuestra su colocalización con el marcador del RE
Sec63-GFP [159] (Figura R.7D). Este resultado subraya la desorganización del aparato de Golgi
causada por sarA6. Por tanto, la función sarA es necesaria para la existencia del Golgi
temprano. En ausencia de SarA, CopA se hace citosólica mientras que las membranas del Golgi
que contienen SedV se relocalizan al RE.

Figura R.7. Desorganización del aparato de Golgi temprano tras la inactivación de SarA con
sarA6. A. Desorganización del Golgi temprano marcado con CopA-GFP. B. La desorganización se
muestra con este gráfico, que reúne las intensidades de fluorescencia de 4 células wt o sarA6 después
de 80 minutos a 37ºC, mostrando que en sarA6 hay una reducción en las intensidades altas,
correspondientes a las cisternas del Golgi y un aumento en las intensidades bajas, correspondientes a
señal citosólica. C. Relocalización de mCherry-SedV desde el Golgi temprano al RE debido al
incremento a 37ºC de células sarA6. D. Plano medio de una célula apical sarA6 que expresa Sec63-
GFP y mCherry-SedV, sometidas a deconvolución, donde se aprecia la colocalización de ambos
marcadores. Las flechas señalan los núcleos.

4.1.12.2. Las cisternas del trans-Golgi (TGN) se desorganizan y disipan

4.1.12.2.1. La proteína periférica PHOSBP se desplaza desde el TGN al citosol

A continuación, estudiamos los efectos de sarA6 sobre el TGN, en primer lugar con una
proteína periférica, PHOSBP, que se recluta a la monocapa citosólica del TGN por detección por

Página 109
Resultados. Capítulo I
coincidencia de Arf1 y PtdIns4P [24, 167]. Esta proteína marca específicamente las cisternas del
TGN y es similar a CopA en que se recluta de manera Arf1-dependiente. En el capítulo IV
demostramos que mRFP-PHOSBP (TGN) no colocaliza con CopA-GFP (Golgi temprano).

mRFP-PHOSBP se localizó en las cisternas del TGN en el mutante sarA6 como en la cepa
silvestre (Figura R.8A). Sin embargo, al incrementar la temperatura a 37ºC, mRFP-PHOSBP se
deslocalizó al citosol en sarA6, pero no en la cepa silvestre (Figura R.8A). El aumento en
fluorescencia citosólica correlacionó con la disminución de fluorescencia en las cisternas del
TGN (Figura R.8B).

4.1.12.2.2.Las cisternas del TGN marcadas con TlgB se disipan

Finalmente, estudiamos el efecto de sarA6 en TlgB, la t-SNARE del TGN, y por tanto
una proteína integral de membrana [38]. A 28ºC, GFP-TlgB marcó las cisternas del TGN tanto
en sarA6 como en una cepa silvestre. Tras 30-45 minutos de subir la temperatura del cultivo,
GFP-TlgB se deslocalizó de las cisternas hacia un patrón citosólico difuso en la región apico-
proximal de las células, sobre cuyo fondo se distinguía un entramado poco fluorescente (Figura
R.8A). Este comportamiento de TlgB en respuesta a sarA6 contrasta con el de SedV, dado que
el efecto en TlgB fue mucho más tardío y TlgB no se desplazó al RE. Las estructuras
remanentes de TlgB que se concentran en los ápices hinchados podrían corresponder a un
estadio desorganizado del TGN resultante del bloqueo de la salida del RE. Estos resultados
ponen de manifiesto la asimetría existente entre las cisternas del Golgi temprano y las del TGN
(Figura R.8C).

Para corroborar que esta desorganización del aparato de Golgi no es específica del alelo
sarA6, sino que por el contrario es debida a la inactivación de SarA, utilizamos el mutante
sarA8. Determinamos el efecto de sarA8 en las dos t-SNAREs del Golgi, SedV y TlgB. A 28ºC,
TlgB se localizó en el TGN, mientras que SedV mostró una localización parcialmente
desplazada hacia el RE (Figura R.8D), como en el mutante sarA6. A la temperatura restrictiva,
SedV se desplazó totalmente a las membranas del RE, mientras que TlgB se relocalizó en un
patrón reticular difuso en la región próxima al ápice (Figura R.8D). En resumen, la
deslocalización de SedV y TlgB causada por sarA6 y sarA8 fue indistinguible, lo que confirma
que no era específica del alelo utilizado.

En resumen, estos resultados demuestran que se requiere la salida del RE para la

biogénesis tanto de las cisternas del Golgi temprano como del TGN, lo que concuerda con el
modelo de maduración de cisternas, según el cual el Golgi no es una entidad estable, sino que se
mantiene mediante aporte continuo de tráfico del RE. Además, concluimos que la inactivación
de SarA desorganiza el aparato de Golgi de manera asimétrica: el Golgi temprano se reabsorbe

Página 110
 Resultados. Capítulo I
por el RE junto con SedV y libera CopA al citosol, mientras que el TGN se disipa (esquema en
la Figura R.8C).

Figura R.8. Desorganización del TGN por inactivación de SarA. A. A la izquierda,

desorganización de las cisternas del TGN, marcadas con mRFP-PHOSBP tras un cambio a 37ºC. A la
derecha, relocalización de GFP-TlgB a una señal citosólica difusa y a estructuras remanentes poco
fluorescentes (las imágenes detalle de la derecha corresponden a secciones sometidas a
deconvolución). B. A la izquierda, gráfico de barras que muestra el área en proyeciones suma
ocupadas por estructuras mRFP-PHOSBP en n=13 células sarA6 antes y después del cambio de
temperatura a 37ºC. El gráfico de la derecha representa el incremento en fluorescencia citosólica de
mRFP-PHOSBP en las mismas células. C. Diagrama que enfatiza los diferentes destinos de las
sintaxinas del Golgi temprano y el TGN después del bloqueo del tráfico de COPII mediante sarA6. D.
Efecto causado por sarA8 sobre mCherry-SedV y GFP-TlgB, el cual es indistinguible del causado por
sarA6.

Página 111
Resultados. Capítulo I
4.1.13. La inactivación de SarA tiene consecuencias morfogenéticas: formación de
globos apicales

Previamente, se habían descrito alteraciones morfológicas apicales causadas por el

bloqueo de la ruta secretora al nivel del aparato de Golgi [18]. Por ello, determinamos el efecto
en la morfología celular de incrementar la temperatura de cultivos de los mutantes
termosensibles obtenidos. En el caso de los mutantes sarA1, sarA2, sarA3 y sarA8, que son
capaces de crecer relativamente bien a 37ºC (Figura R.3B), estudiamos el efecto morfológico
realizando un cambio de 28ºC a 42ºC, utilizando un incubador no acoplado al microscopio. A
28ºC las hifas estos mutantes presentaron una morfología normal (Figura R.9). Tras incubar
estas células durante 60 o 90 minutos a 42ºC los cuatro mutantes presentaron el mismo cambio
morfológico: las regiones apicales se hincharon a los 60 minutos, mientras que después de 90
minutos la mayoría de estos ápices estaban lisados (Figura R.9). Por lo tanto, una inactivación
aguda de SarA provoca que los ápices se hinchen y, si se mantiene la inactivación, las células
finalmente se lisan, probablemente por debilitamiento de la pared celular como resultado de la
ausencia de exocitosis.

Figura R.9. Ápices inflados y lisis de los mutantes cuya temperatura restrictiva es 42ºC. La
morfología apical de las cepas con el alelo sarA indicado, a 28ºC y después de un cambio a 42ºC
durante 60 o 90 minutos. Nótense, tras 90 minutos, las nubes correspondientes al material intracelular
liberado tras la lisis.

El efecto morfológico del incremento de temperatura en los otros dos mutantes, sarA6 y
sarA7, cuyo crecimiento está muy afectado a 37ºC (Figura R.3B), lo estudiamos directamente
en la pletina del microscopio. A 28ºC, su morfología fue normal. Sin embargo, tras 45-60
minutos del cambio a 37ºC, sarA6 sufrió un engrosamiento apical (Figura R.10A), similar al del

Página 112
 Resultados. Capítulo I
resto de mutantes. También, una cierta proporción de la población celular se lisó (Figura
R.10B). Sorprendentemente, tras más de 90 minutos de incubación de las células a 37ºC, una
mayoría de los ápices que no habían lisado continuó creciendo isotrópicamente, formando
grandes globos apicales o subapicales de alrededor de 10 µm de diámetro (Figura R.10C).

Figura R.10. Consecuencias morfológicas de sarA6. A. Ápice inflándose a medida que aumenta el
tiempo a 37ºC. B. Ejemplo de un ápice que se lisa después de ∼1 hora a 37ºC. C. Globo formado
después de 90 minutos de incubación a 37ºC. D. Cuantificación de ápices sarA6 normales, hinchados,
en globo y lisados a 28ºC (n=37), 1 hora a 37ºC (n=68) y 2 horas a 37 ºC (n=66). En el eje y se
representa la proporción porcentual. E. Campo general de un cultivo de células sarA6 preincubadas a
28ºC y cambiadas a 37ºC. F. Imagen similar para un cultivo de una cepa sarA7.

Página 113
Resultados. Capítulo I
En la Figura R.10D se cuantifica la morfología de la población, clasificando los ápices
en cuatro grupos excluyentes: normal, hinchado, en globo y lisado. El fenotipo celular de globo
representa alrededor de un 60% de la población después de 2 horas a 37ºC. Este fenómeno, que
fue completamente reproducible, no era específico del alelo sarA6 (Figura R.10E), ya que
también se dio en las células sarA7 transferidas a 37ºC (Figura R.10F). Hay que recordar que al
menos en el caso de sarA6, en estas condiciones de temperatura existen aún niveles detectables
de proteína SarA (ver el western-blot de la Figura R.4B) y es posible que exista un nivel basal
de salida del RE, que alimentaría la formación de estos globos. De hecho, cuando la temperatura
se incrementó a 39ºC las células sarA6 se lisaron (no mostrado).

4.1.13.1. Los globos formados por sarA6 tienen una pared celular engrosada, una gran
vacuola, gran cantidad de retículo endoplasmático y múltiples núcleos

Para detectar posibles alteraciones de la pared celular, teñimos las células con
Blankophor BA (BPBA). BPBA es un agente blanqueador fluorescente, análogo al Calcoflúor
White, que se une a la quitina y a los glucanos de la pared celular de hongos [208]. A 28ºC,
BPBA marcó la pared celular más o menos homogéneamente tanto en la cepa sarA6 (Figura
R.11A) como en la silvestre (no mostrado). Sin embargo, tras la formación de los globos a 37ºC
el marcaje con BPBA mostró que éstos están delimitados por una pared celular mucho más
reactiva al compuesto, lo que indica que la pared está engrosada (Figura R.11A y reconstrucción
tridimensional en el vídeo suplementario R.1). También aparecieron puntos hiper-reactivos a lo
largo de la hifa (Figura R.11A). La microscopía de contraste diferencial (DIC) confirmó que
tanto los globos como los puntos mencionados tienen la pared celular engrosada (Figura
R.11A). Además, los globos formados en la región subapical presentan ápices que, aunque se
marcan con BPBA, lo hacen en mucho menos grado que el globo adyacente (Figura R.11B).
Estos resultados sugieren que la lisis celular de los globos se impide por un reforzamiento de su
pared.

Otro rasgo característico de estos globos era que muchos contenían una gran estructura
intracelular esférica (ver Figura R.11C, imagen izquierda), semejante a una gran vacuola.
Utilizamos 7-amino-4-clorometil coumarin (CMAC), que marca fluorescentemente el lumen
vacuolar, y demostramos que efectivamente están ocupados por grandes vacuolas (ver Figura
R.11C, imagen derecha). Además, demostramos que los globos contienen una gran acumulación
de membranas del RE (marcadas con Sec63-GFP) y entre 4 y 8 núcleos, marcados con la
histona H1, HhoA, etiquetada con mCherry (Figura R.11D-F).

Página 114
 Resultados. Capítulo I

Figura R.11. Caracterización subcelular de los globos. A. Ejemplo de una célula con globo teñida
con blankophor. Las imágenes fluorescentes bajo la imagen Nomarski corresponden a una proyección
de intensidades máximas y a un plano medio de un z-stack sometido a deconvolución. B. Globo
formado subapicalmente, teñido con blankophor. C. Globos teñidos con CMAC para marcar las
vacuolas, que también son visibles en la imagen Normarski. D. Ápice en globo teñido con CMAC y
expresando Sec63-GFP para marcar las membranas del RE. La imagen es un plano de un z-stack
tratado con un programa de deconvolución. E. Un globo con los núcleos marcados con HhoA-
mCherry (histona H1). Se trata de una proyección de las intensidades máximas. F. Varios planos de
un stack de Sec63-GFP en un globo. La imagen de la izquierda muestra, adicionalmente, una tinción
de las vacuolas con CMAC.

Página 115
Resultados. Capítulo I

Figura R.12. El reestablecimiento de la polaridad correlaciona con la reactivación de la

exocitosis. A. Arriba, diferentes planos de un z-stack con deconvolución de GFP-SynA en células
cambiadas a 37ºC durante 2 horas, localizándose únicamente en el RE, en sarA6. B. RerA-GFP
marcando el retículo en globos. C. Recuperación de la localización de GFP-SynA en la membrana
apical de un ápice recién formado en una célula recuperándose al cambiarla de 37ºC a 28ºC. D.
Recuperación de la localización normal de GFP-RerA al recuperarse el crecimiento apical.

Página 116
 Resultados. Capítulo I
4.1.13.2. Reorganización del Golgi y restablecimiento del crecimiento morfológicamente
normal

En el estadio de globos observamos la localización de RerA y de la v-SNARE SynA y

determinamos que se encuentran completamente en el RE (Figura R.12A-B y vídeo
suplementario R.2 para ver RerA). Posiblemente, la acumulación de GFP-SynA en el RE
corresponde a proteína de nueva síntesis, cuya salida del RE está bloqueada o limitada. Estos
resultados sugieren que el aparato de Golgi está desorganizado en el estadio morfológico de
globos.

Este estadio es sin embargo reversible. Cuando redujimos la temperatura a 28ºC, los
globos reestablecieron un eje (o varios ejes) de polaridad y emitieron tubos germinativos
normales, con crecimiento polarizado (Figura R.12C-D y vídeo suplementario R.3). En estas
condiciones, RerA volvía a localizarse en cisternas (Figura R.12D), probablemente
correspondientes a un aparato de Golgi funcional. De hecho, SynA recuperó su característica
localización apical en el nuevo eje (o los nuevos ejes) de crecimiento (Figura R.12C y vídeo
suplementario R.4). Estos resultados indican que, una vez restaurado el tráfico desde el RE, el
aparato de Golgi se reorganiza, se restaura la secreción apical y la morfología normal reaparece.
Por lo tanto, estos resultados demuestran fehacientemente que el aparato de Golgi es un
orgánulo dinámico que puede desorganizarse y, posteriormente, reorganizarse y subrayan la
capacidad morfogenética que tiene la regulación de la exocitosis a nivel de salida del RE, e
indirectamente a través de la biogénesis del Golgi.

4.1.14. Búsqueda de mutantes revertientes de la termosensibilidad de sarA6 y

sarA8
Para encontrar interactores genéticos de sarA, decidimos buscar mutaciones supresoras
de la ausencia de crecimiento resultante de la falta de función de sarA. Con este objetivo nos
propusimos utilizar los mutantes termosensibles que habíamos obtenido.

Es importante señalar que, en este momento de la investigación, aún no habíamos sido

capaces de encontrar el ortólogo de Sec12 en A. nidulans, dada la gran divergencia a nivel de
secuencia de esta proteína en eucariotas (ver capítulo II). Considerábamos posible realizar la
búsqueda de la proteína activadora (GEF) de SarA mediante esta estrategia de búsqueda de
supresores, dado que SEC12, en S. cerevisiae, es supresor en multicopia de un alelo
termosensible de SAR1 [209].

Decidimos utilizar los alelos termosensibles que mejor habíamos caracterizado: sarA6 y
sarA8. Por lo tanto, para encontrar mutaciones que suprimieran la letalidad de sarA6 o de sarA8

Página 117
Resultados. Capítulo I
a 42ºC, buscamos revertientes extragénicos. Este proyecto lo llevamos a cabo en colaboración
con el Profesor Herb N. Arst. Mutagenizamos con luz ultravioleta esporas sarA6 o sarA8 y las
plaqueamos en medio completo, incubando las placas a 42ºC. Después, preseleccionamos
colonias con crecimiento a dicha temperatura. Lamentablemente, sólo caracterizamos
supresores intragénicos, que, por otro lado, nos podían ayudar a estudiar las relaciones
estructura/función en SarA.

4.1.14.1. Mutaciones intragénicas supresoras de la termosensibilidad de sarA6

sarA6 tiene 3 mutaciones silenciosas (G373T, G849A, G997T) y una mutación de

cambio de sentido (T1072C). Esta última mutación provoca la sustitución Ser186Pro (ver
capítulo X). En este caso, preseleccionamos y purificamos 30 colonias revertientes. Finalmente,
seleccionamos y analizamos un total de 10. Todas ellas contenían las mutaciones silenciosas en
sarA6. Además, los 10 revertientes analizados tenían nuevas mutaciones de cambio de sentido
en sarA, casi con seguridad causantes de la reversión fenotípica. En la tabla R.2 se resumen los
resultados obtenidos.

Tabla R.2. Revertientes intragénicos de sarA6.*

Mutación Sustitución Fenotipo Interpretación
sarA Mal crecimiento a 37ºC, no crece a Alteración de la α-
(T1072C)1 (S186P)
6 42ºC hélice C-terminal
s2 Revertiente muy débil Estabiliza la α-
hélice C-terminal,
s25 Revertiente muy débil afectada por S186P
A1070T I182L
(T1072C) (S186P) ¿Tiene una
Buen crecimiento a 37ºC, fenotipo mutación supresora
s30
único a 42ºC adicional?

G1058C G181A
s24 Buen crecimiento a 37ºC
(T1072C) (S186P)
s8 C1073T Permiten la
S186L Buen crecimiento a 37ºC
s16 (T1072C) correcta formación
T1082C de la α-hélice C-
s10 S186A Buen crecimiento a 37ºC
(T1072C) terminal
s28 T1072 Criosensible. 42ºC es su
S186F
s29 + C1073T temperatura óptima de crecimiento
T1072
S186 <<revertiente
s21 (reversión <<Crecimiento silvestre>>
(SarA wt) directo>>
directa)
* sarA6 y todos los revertientes contienen, además, las mutaciones silenciosas G373T, G849A, G997T.
1
La mutación es relativa al primer codón de iniciación.

Página 118
 Resultados. Capítulo I
Todos los revertientes fueron intragénicos. Se pueden dividir en tres tipos:

1-Reversión verdadera: el revertiente s21 codifica una proteína SarA silvestre.

2-Reversión equivalente: los revertientes s8, s16, s10, s28 y s29 han sufrido una
mutación missense en el codón mutado en sarA6, provocando un cambio a un tercer
aminoácido, aceptable para la función de SarA. Se cambia la prolina presente en SarA6
(Ser186Pro) por leucina, alanina o fenilalanina, las cuales, al contrario que la prolina, son
aceptables en una α-hélice. Por tanto, la α-hélice C-terminal se formaría adecuadamente,
permitiendo el crecimiento a 42ºC. Es interesante el caso de la sustitución Ser186Phe, porque
causa criosensibilidad, con una temperatura óptima de crecimiento de 42ºC.

3-Mutación missense en un segundo sitio: s2, s25, s30 y s24 tienen dos mutaciones
missense: mantienen la mutación de sarA6, y tienen otra mutación en un codón diferente.

En s2, s25 y s30 la mutación supresora provoca el cambio Ile182Leu; en s24 la

mutación supresora provoca la sustitución Gly181Ala. Las dos “sustituciones supresoras” están
en la α-hélice C-terminal, y deben de compensar de algún modo la alteración de ésta provocada
por S186P.

Por otro lado, las cepas s2, s25 y s30 tienen la mutación A1070T (Ile182Leu). Las dos
primeras son revertientes muy débiles; sin embargo, la cepa s30 crece bien a 37ºC y tiene un
fenotipo único a 42ºC. Esta diferencia se puede explicar de dos modos: que s2 y s25 tuviesen
mutaciones deletéreas adicionales, o que la cepa s30 tuviese una mutación supresora adicional.

4.1.14.2. Mutaciones intragénicas supresoras de la termosensibilidad de sarA8

sarA8 contiene una mutación silenciosa (g.G119A) y una mutación missense

(g.G246AGly27Ser). Preseleccionamos y aislamos 10 revertientes de sarA8. Secuenciamos el
gen sarA de 5 de ellos. La tabla R.3 muestra la caracterización de estas 5 cepas revertientes.

v4 es un revertiente verdadero y v3, v7 y v10 son revertientes intragénicos por

mutaciones missense en un segundo sitio.

Tanto v3 como v10 tienen una sustitución en la posición 182 de SarA (I182L y I182F,
respectivamente), además de la sustitución causada por sarA8 (G27S). I182 está en la α-hélice
C-terminal y la sustitución I182L es el mismo cambio en la secuencia proteica que tienen los
revertientes s2, s25 y s30 de sarA6. Además, la α-hélice C-terminal está a más de 10 Å de
distancia de G27S. Es posible que la sustitución I182L estabilice la estructura o mejore la
función de la proteína de manera independiente de las sustituciones originales de SarA6 y
SarA8, lo que destacaría la importancia de la α-hélice C-terminal en la función/estabilidad de
SarA.

Página 119
Resultados. Capítulo I
Tabla R.3. Revertientes de sarA8*.
Mutación Sustitución fenotipo Interpretación
Crece bien a 37ºC, Afecta la unión del nucleótido
sarA8 (G246A) (G27S)
no crece a 42ºC por estar sustituido el P-loop
(G246A)
+ Colonias compactas
v2 (G27S)
(supresión y pequeñas a 42ºC
extragénica)
Estabilización de la estructura /
A1070C I182L función de SarA de modo
v3
(G246A) (G27S) independiente a la mutación
termosensible
G27 <Revertiente directo>
v4 G246
(SarA wt)
A701G E87G
v7
(G246A) (G27S)
Estabilización de la estructura /
A1070T I182F
v102 función de SarA de modo
A1072T
independiente a la mutación
(G246A) (G27S)
termosensible
*sarA8 y todos los revertientes contienen, además, la mutación silenciosa G119A.
1
La posición es relativa al primer nucleótido del codón de iniciación.
2
Una parte de un intrón y 35 pb de un exón sin secuenciar.

El mutante v7 tiene la sustitución de SarA8 (Gly27Ser) y la sustitución Glu87Gly en

una α-hélice alejada de Gly27Ser, en la región del switch II de esta GTPasa. En esta posición
87, en SAR1 de humano, hámster chino, Drosophila melanogaster y Caenorhabditis elegans,
hay una alanina en vez de un glutamato. El cambio Glu87Gly aumenta la similitud de SarA con
dichos ortólogos, y podría mejorar la estabilidad o la función de la proteína.

v2 es un revertiente extragénico, ya que la secuencia de sarA corresponde con el alelo

sarA8. Por lo tanto, cruzamos v2 con una cepa silvestre para determinar la segregación de la
supresión y la termosensibilidad. En la descendencia del cruce, el fenotipo revertiente no
segregó mendelianamente: sólo una pequeña proporción tenía el fenotipo de v2 (~1/50). Como
consecuencia, abandonamos la investigación de este revertiente: una posibilidad que explicase
esta segregación anormal sería que la reversión se deba a una mutación no mendeliana, como
por ejemplo una aneuploidía. Otra posibilidad sería que una gran proporción de ascosporas con
el genotipo revertiente no germinase. Dado que previamente habíamos visto una interacción
genética entre sarA8 y sec23-gfp (la cepa doble mutante crece peor que los mutantes simples),
comprobamos por secuenciación si sec23 estaba mutado en la cepa v2. El revertiente v2 no
contiene mutaciones en el gen sec23.

Página 120
Capítulo II
 Resultados. Capítulo II

4.2. Análisis sistemático de la famila Arf/Sar y de sus

proteínas reguladoras GEFs y GAPs
La regulación espacio-temporal de un gran número de procesos celulares está
determinada por proteínas G pequeñas. Las proteínas G de la familia Arf/Sar participan en el
tráfico intracelular y en la organización del citoesqueleto (ver Introducción) [7]. Para la
hidrólisis del GTP es necesaria la estimulación de la actividad GTPasa por su proteína GAP
(GTPase activating protein) correspondiente. Para la liberación de GDP es necesaria la acción
de su GEF (GTP exchange factor).

En este capítulo se muestran los resultados de la búsqueda bioinformática de las

proteínas de la familia Arf/Sar en Aspergillus nidulans, y de sus correspondientes GEFs y
GAPs, así como la deleción de cada uno de los genes que las codifican. En las tablas R.4 y R.5
se muestra un resumen de los resultados.

4.2.1. Identificación bioinformática de las proteínas de la familia Arf/Sar, de sus

GEFs y de sus GAPs

4.2.1.1. Identificación de las GTPasas de la familia Arf/Sar

Dentro de esta familia se encuentran Sar1, que actúa en el retículo endoplasmático (RE),
las Arf del aparato de Golgi, las Arl (Arf like protein) y las Arf que actúan en la membrana
plasmática.

Arl1/Arl2
Las proteínas codificadas por AN5912 y AN12112 son homólogas a Arl1p/ARL1 y
Cin4p/ARL2 (S. cerevisiae / H. sapiens), respectivamente (Figura R.13). Estas Arl se
caracterizan por presentar un residuo de tirosina alrededor de la posición 77, que se encuentra en
el “bolsillo de selectividad” de interacción con el dominio GRIP, un efector específico de
Ar1p/ARL1. En el resto de proteínas Arf/Sar, en la posición correspondiente se encuentra un
aminoácido distinto, generalmente una leucina. Esta leucina ocupa una gran parte del bolsillo de
selectividad [123] para la interacción de Arl1p con el dominio GRIP. Aunque ARL2 y la
proteína codificada por AN12112, también presentan dicha Tyr, la posición correspondiente a la
esquina opuesta del bolsillo de selectividad está parcialmente ocluida por un residuo, lo que
impide la interacción con el dominio GRIP [123]. De esta manera, pudimos diferenciar las
proteínas del grupo correspondiente a Arl1p/ARL1 y del grupo de CIN4/ARL2 y sus
respectivos homólogos en A. nidulans (Figura R.13). Denominamos Arl1 al producto de
AN5912 y Arl2 al producto de AN12112.

Página 123
Resultados. Capítulo II

Figura R.13. Arl1/Arl2. Alineamiento múltiple de secuencia. EL color rojo indica residuo invariable
y el amarillo similitud de secuencia con un umbral de 0.15 usando la matriz BLOSUM62. Están
recuadradas en azul la tirosina conservada en Arl1, Arl2 y sus homólogos en A. nidulans y la leucina
o isoleucina presente en la esquina opuesta del bolsillo de selectividad para el dominio GRIP. Arl1p y
Cin4p son proteínas de S. cerevisiae y ARL1, ARL3 y ARL2 de humano.

Arl3p/ARFRP1
Arl3p/ARFRP1 (S. cerevisiae/ H. sapiens) es, junto a Sar1p/SAR1 y Cin4p/ARL2, la
única Arf/Sar conservada en eucariotas que no presenta diana de miristoilación. La proteína
codificada por el gen AN0634 no presenta una diana de miristoilación y tiene gran homología
con Arl3p y ARFRP1 (Figura R.14). Denominamos Arl3 a la proteína codificada por AN0634.

Página 124
 Resultados. Capítulo II

Figura R.14. Arl3p/ARFRP1. El hueco presente en el alineamiento es, posiblemente, debido a

errores en la predicción automática de los intrones del gen AN0634. Arl3p es de S.cerevisiae y
ARFRPhs de Homo sapiens. Ver leyenda de la Figura R.13 para detalles del alineamiento.

Arf1
La proteína ortóloga a Arf1p ha sido descrita previamente [174], se denominó ArfA y se
localiza en el aparato de Golgi [174]. Como muestra la Figura R.15, ArfA presenta una gran
homología con Arf1p y Arf2p de S. cerevisiae y las Arf del Golgi de humanos. Por otro lado,
existe otro gen en A. nidulans (AN3934) que codifica una proteína con gran homología con
Arf1p y ArfA, pero que carece de motivo de miristoilación en el extremo N-terminal (Figura
R.15), aunque sí contiene una glicina en la tercera posición. A esta GTPasa la hemos nombrado
ArfX.

Página 125
Resultados. Capítulo II

Figura R.15. Arf1. Nótese la menor homología de AN3934 (ArfX) con el resto de proteínas. Ver
leyenda de la Figura R.13 para detalles del alineamiento.

Arf3/ARF6
La proteína ortóloga a Arf3p, que ha sido descrita previamente y nombrada ArfB, se
localiza principalmente en la membrana plasmática [210, 211]. Como se muestra en la Figura
R.16, existe una grandísima homología entre ArfB, Arf3p de S. cerevisiae y la ortóloga en
humanos, ARF6.

Página 126
 Resultados. Capítulo II

Figura R.16. Arf3p/ARF6. AN5020 es ArfB. Ver leyenda de la Figura R.13 para detalles del
alineamiento.

Sar1
La caracterización del ortólogo de SAR1 / Sar1p en A. nidulans se encuentra en el
capítulo I. Está codificada por el gen AN0411 y se ha denominado SarA.

4.2.1.2. Identificación de las GEFs de las GTPasas de la familia Arf/Sar

4.2.1.2.1. GEF de SarA: Sec12

Schlacht y Dacks [205], en un estudio filogenético de los componentes del complejo
COPII, habían propuesto que, en Aspergillus fumigatus, AFUA_5G05910 codifica el ortólogo
de Sec12. AN11127 de A. nidulans codifica una proteína muy parecida a la codificada por
AFUA_5G05910. Mediante un alineamiento intentamos encontrar características comunes con
Sec12 de S. cerevisiae y Sec12 humano. La Figura R.17 muestra el alineamiento
correspondiente. La secuencia no está muy conservada, excepto por una pequeña región
(posiciones 29-40 de S. cerevisiae), que se encuentra conservada en todos los ortólogos de
Sec12 y es esencial para la activación de Sar1 [212]. En la estructura de la proteína, esta región
está expuesta al citosol y forma un bucle (denominado K-loop), esencial para la interacción con

Página 127
Resultados. Capítulo II
Sar1 [212]. Esta secuencia está conservada en AN11127 de A. nidulans, lo que sugiere que la
proteína que codifica es ciertamente el ortólogo Sec12.

Figura R.17. Sec12. Alineamiento múltiple de secuencia (CLUSTALW) de la proteína codificada por
AN11127 y de Sec12p (Saccharomyces cerevisiae) y Sec12 de Homo sapiens.

Por otro lado, la topología de la proteínas coincide: Sec12p es una proteína tipo II con
un paso de membrana, con el extremo N-terminal hacia el citosol, al igual que la codificada por

Página 128
 Resultados. Capítulo II
AN11127, según el software de predicción HMMTOP [213]. Denominamos sec12 al gen
AN11127.

Además, amplificamos y secuenciamos el cDNA de sec12, confirmando la predicción

de intrones y que el gen se expresa. El trabajo de caracterización de sec12 ha sido continuado
por Ignacio Bravo Plaza, estudiante de doctorado.

4.2.1.2.2. GEFs de las GTPasas Arf

En el caso de las GEFs de las GTPasas Arf, el dominio catalítico consiste en un módulo
de ~200 aminoácidos, denominado dominio Sec7, conservado en todas las GEFs de GTPasas de
la familia Arf (ver Introducción). En hongos se han establecido dos subfamilias: la subfamilia
GBG (de GBF/BIG GEFs), presente en todos los eucariotas, y la subfamilia SYT1/SYT2 [130].

Subfamilia GBG
La conservación de dominios no catalíticos de la subfamilia GBG permitió encontrar los
representantes de esta subfamilia en Aspergillus nidulans. En la Figura R.18 se muestra la
arquitectura de dominios de las proteínas GBG. Mediante alineamiento de las GBGs de S.
cerevisiae y de Homo sapiens con los homólogos putativos de A. nidulans, se pudo determinar
que dichos dominios están conservados (Figuras R.19, R.20, R.21 y R.22), inclusive un motivo
altamente conservado localizado en el dominio HUS (Homology Upstream of Sec7) [N (Y/F)
DC (D/N/E)]. La proteína codificada por AN6709 se denomina HypB [25] y es homóloga de
Sec7p y BIG1/2. Una segunda proteína, codificada por AN0112 es la única ortóloga de Gea1/2p
y GBF. Denominamos a AN0112 geaA y a la proteína que codifica GeaA (para la
caracterización de GeaA véase el capítulo III).

Con el objetivo de determinar si existen más proteínas de la subfamilia GBG se analizaron todas
las proteínas, conocidas o predichas, codificadas en el genoma de A. nidulans con la secuencia
consenso N (Y/F) DC (D/N/E). Existen 4 proteínas más con esta secuencia, y ninguna de ellas
presenta homología significativa con la familia GBG, ni contiene un dominio Sec7.

Figura R.18. Arquitectura de dominios de la subfamilia GBG. DCB: Dimerization and

Cyclophilin Binding. HUS: Homology Upstream of Sec7. HDS1-3: Homology Downstream of Sec7 1-
3.

Página 129
Resultados. Capítulo II
Subfamilia SYT1 / SYT2
Mouratou et al. han establecido la existencia de esta subfamilia, que es exclusiva de
hongos y está formada en S. cerevisiae por Syt1p y Yel1p [130]. Sin embargo, Gillingham y
Munro incluyen las proteínas de esta subfamilia en la familia PSD (PH and Sec7 domain), ya
que contienen, además del dominio Sec7, un dominio de homología a pleckstrina (Pleckstrin
homology, PH), de interacción con fosfoinosítidos [7]. En A. nidulans existen 2 genes (AN6120
y AN3438) que codifican proteínas con un dominio Sec7 y un dominio PH, predicho por
InterPro y SMART. Por tanto, las proteínas codificadas por AN3438 (Syt1a) y AN6120 (Syt1b)
pertenecen a esta subfamilia.

Figura R.19. Dominio DCB en la familia GBG. Alineamiento múltiple de secuencia del dominio
DCB conservado en la familia GBG. Rojo indica residuo invariable y amarillo similitud de secuencia
con un umbral de 0.15 usando la matriz BLOSUM62.

Página 130
 Resultados. Capítulo II

Figura R.20. Dominio HUS en la familia GBG. Está recuadrada en azul la secuencia consenso del
motivo N (Y/F) DC (D/N/E), del dominio HUS. Ver leyenda de la Figura R.13 para detalles del
alineamiento.

Página 131
Resultados. Capítulo II

Figura R.21. Dominio HDS1 en la familia GBG. Ver leyenda de la Figura R.13 para detalles del
alineamiento.

Página 132
 Resultados. Capítulo II

Figura R.22. Dominio HDS2 en la familia GBG. Ver leyenda de la Figura R.13 para detalles del
alineamiento.

4.2.1.3. Identificación de las GAPs de las GTPasas de la familia Arf/Sar

Las GAP de Arf promueven la hidrólisis del GTP mediante su característico dominio
ArfGAP. La GAP de Sar1 (Sec23p) está identificada en A. nidulans [24] y no presenta
características comunes con las GAP de Arf.
Dentro de las proteínas ArfGAP existen varias familias [7]. En S. cerevisiae existen dos
representantes de la familia ArfGAP1 [7]: Gcs1p y Gts1p. Gcs1p contiene, además del dominio
ArfGAP, el motivo ALPS (ArfGAP1 Lipid Packing Sensor) [98]. La proteína codificada por
AN2222 posee una alta homología con Gcs1p (Figura R.23) y contiene, en la región que alinea
con el motivo ALPS de Gcs1p, una secuencia de aminoácidos con las características específicas
del motivo ALPS: una región rica en serinas y treoninas y con la secuencia GppG ó GpppG,
donde G es un aminoácido grande y p un residuo pequeño. Por tanto, denominamos a AN2222
gcs1.

Página 133
Resultados. Capítulo II
Gts1p, además de tener un dominio ArfGAP, contiene un motivo UBA (Ubiquitin-
associated), y una secuencia C-terminal poli (A-Q) y poli Q. Estas características se cumplen en
la proteína codificada por AN1629, que denominamos Gts1.

La familia ArfGAP3 está formada únicamente por Glo3p en S. cerevisiae. Esta GAP
contiene, además del dominio ArfGAP, un motivo ISxxxFG duplicado, donde x es cualquier
aminoácido, motivo también presente en las GAP de esta familia en mamíferos. Denominamos
glo3 a AN6033, ya que codifica una proteína con el dominio ArfGAP que además posee dicho
motivo ISxxxFG duplicado.

Finalmente Age1p y Age2p son los representantes en S. cerevisiae de la familia

SMAP1. En mamíferos, esta familia presenta un dominio de unión a clatrina [7]. La proteínas
con dominio ArfGAP codificada por AN1931 y AN4274 presenta cierta homología con estas
GAP, que denominamos Age1a y Age1b, respectivamente. Sin embargo, la mitad N-terminal de
Age1b contiene un dominio de homología con Pleckstrina (PH). Aunque en S. cerevisiae no
existe ninguna proteína con dominio ArfGAP que contenga un dominio PH, en mamíferos
existen varias [7].

Página 134
 Resultados. Capítulo II

Figura R.23. Gcs1. El motivo ALPS de Gcs1p está recuadrado en azul. Ver leyenda de la Figura
R.13 para detalles del alineamiento.

Página 135
 Resultados. Capítulo II
Tabla R.4. La familia Arf/Sar en Aspergillus nidulans y sus proteínas reguladoras.
Aspergillus Saccharomyces Homo sapiens Características para
nidulans cerevisiae identificación
Arf/Sar
Sin secuencia de miristoilación
AN0634|Arl3 Arl3p ARFRP1
/gran similitud de secuencia
Residuos específicos para
AN5912|Arl1 Arl1p ARL1 interacción con dominio GRIP /
gran similitud de secuencia
Sin secuencia de miristoilación
AN12112|Arl2 Cin4p ARL2/ARL3
/gran similitud de secuencia
Homología con Arf del aparato de
AN3934|ArfX
Golgi
ARF1/ARF3/ Descrita previamente [174]/gran
AN1126|ArfA Arf1p /Arf2p
ARF4/ARF5 similitud de secuencia
SAR1A / Estudio mutacional/gran similitud
AN0411|SarA Sar1p
SAR1B de secuencia
Descrita previamente [211] / Gran
AN5020|ArfB Arf3p ARF6
similitud de secuencia
GEF de Sar1
AN11127|Sec12 Sec12p SEC12 K-loop/topología
GEFs de Arf Dominio Sec7
Descrita previamente
[25]/Dominios funcionales
AN6709|HypB Sec7p BIG1/BIG2 conservados / secuencia consenso
N (Y/F) DC (D/N/E)/ similitud de
secuencia
Dominios funcionales conservados
/ secuencia consenso N (Y/F) DC
AN0112|GeaA Gea1p/Gea2p GBF1 (D/N/E) / similitud de secuencia /
mutante supresor de la
esencialidad de hypB
AN3438|Syt1a Syt1p/Yel1p Dominio PH
AN6120|Syt1b Syt1p/Yel1p Dominio PH
GAPs de Arf Dominio ArfGAP
AN2222|Gcs1 Gcs1p Motivo ALPS / similitud de secuencia
AN1931|Age1a Age1p/Age2p similitud de secuencia
AN4274|Age1b Age1p/Age2p similitud de secuencia / dominio PH
AN6033|Glo3 Glo3p Motivo ISxxxFG duplicado / homología
Dominio UBA / extremo C-terminal poli (A-Q) y
AN1629|Gts1 Gts1p
poliQ

Página 136
 Resultados. Capítulo II
4.2.2. Deleción sistemática de los genes de la familia ARF, de sus GEFs y de sus
GAPs

Para tener una visión general de la importancia la función fisiológica de las diferentes
GTPasas de esta familia, procedimos a delecionar los genes que las codifican, así como los
correspondientes a sus GEFs y sus GAPs. Para ello, utilizamos el marcador de selección pyrGfum
(gen pyrG de Aspergillus fumigatus) fusionado a regiones 5’ y 3’ flanqueantes del marco abierto
de lectura de cada gen. Con estas casetes transformamos una cepa pyrG89 de A. nidulans,
auxótrofa para pirimidinas, para sustituir la región codificante completa de cada gen por
pyrGfum. Estas casetes las obtuvimos normalmente del Fungal Genetics Stock Centre [193] y, en
los casos en que no estaban disponibles, las construimos por PCR de fusión. En todas las
transformaciones comprobamos, mediante el método de rescate de heterocariontes [200], si las
respectivas deleciones eran letales (ver esquema en Figura R.25). En los casos en que la
deleción de un gen provocase letalidad, comprobamos la presencia de núcleos silvestres y
núcleos con el gen delecionado mediante Southern Blot, excepto en el caso de hypB, que lo
genotipamos por PCR. Por otro lado, cuando la deleción no fue letal, comprobamos mediante
Southern-blot la correcta deleción del gen objetivo y determinamos el fenotipo de la cepa
mediante test de crecimiento en placa con diferentes medios y temperaturas de incubación
(Figuras R.24, R.25 y R.26).

Las deleciones de los genes que codifican las GTPasas ArfA y ArfB y la GEF HypB¸ se
habían estudiado previamente [25, 174, 210]. Sin embargo, decidimos recomprobar las
deleciones de arfA y de hypB por su importancia en la ruta secretora y en el trabajo que íbamos
a acometer a continuación.

4.2.2.1. Las GTPasas SarA, ArfA y Arl2 son esenciales

Del total de siete genes que codifican GTPasas de la familia Arf/Sar, tres de ellos
resultaron ser esenciales para el crecimiento (Figura R.24). Entre ellos está sarA, que se requiere
para el tráfico del RE al aparato de Golgi y está implicada en la biogénesis de dicho orgánulo
(ver capítulo I para detalles de la deleción de sarA). El segundo gen esencial es arfA. ArfA es
crítico (previsiblemente) para la función del Golgi. De hecho la deleción simultánea de los dos
ortólogos de S. cerevisiae (ARF1 y ARF2) es letal [214]. La tercera GTPasa esencial es Arl2
(codificada por AN12112). Sin embargo, su ortólogo en S. cerevisiae, Cin4p no es esencial para
el crecimiento.

Además de estos tres “casos esenciales”, la deleción de arfB provocó la formación de

microcolonias que, pese a su crecimiento tan enfermo, fueron capaces de reproducirse tanto
asexual como sexualmente. ArfB se requiere para la endocitosis [172]. La deleción de las otras
tres GTPasas restantes (arl1, arl3 y arfX) no provocó ningún defecto de crecimiento ni en

Página 137
Resultados. Capítulo II
medio mínimo ni en medio completo a 25ºC, 30ºC, 37ºC y 42ºC (Figura R.24). La deleción de
ARL1 y ARL3 en S. cerevisiae tampoco altera el crecimiento silvestre [215].

4.2.2.2. Sec12, HypB y GeaA son GEFs de Arf/Sar esenciales

HypB y GeaA son las GEF putativas de ArfA en el aparato de Golgi. Ambas son
esenciales para el crecimiento (Figura R.25). En concordancia con estos resultados la deleción
simultánea de GEA1 y GEA2 en S. cerevisiae es letal [77], al igual que la deleción de SEC7
[216]. Por otro lado la deleción de sec12 (AN1127), la posible GEF de sarA, fue letal (Figura
R.25). Por tanto, las GEF de proteínas G esenciales son también esenciales para el crecimiento.

Finalmente, mientras que la deleción de syt1a (AN3438) no alteró el crecimiento, la cepa

syt1bΔ (AN6120Δ) tiene un defecto claro en la esporulación. Este defecto en esporulación es
termosensible (Figura R.25).

4.2.2.3. Age1a es la única GAP de Arf esencial en Aspergillus nidulans

De las 5 GAPs identificadas, solamente Age1a (codificada por AN1931) es

prácticamente indispensable para el crecimiento. La deleción de age1a provoca letalidad a 30ºC
y 37ºC; sin embargo, permite la formación de microcolonias a 42ºC (Figura R.26). Esto
demuestra un menor requerimiento de esta proteína a 42ºC. El resto de deleciones no afectan al
crecimiento en los medios ensayados, con la excepción de glo3Δ (AN6033Δ), que crece menos
que una cepa silvestre a 42ºC (Figura R.26).

4.2.2.4. Estudio preliminar de gcs1Δ

Dado que en este trabajo estábamos interesados en estudiar el tráfico de salida de cargo
desde el aparato de Golgi decidimos investigar la función de Gcs1. Esta proteína contiene un
motivo ALPS, sensor de curvatura [98]. Este motivo hipotéticamente permitiría el reclutamiento
de Gcs1 a membranas donde se estuviese formando una vesícula de secreción. Este
reclutamiento inactivaría la GTPasa Arf que estuviese mediando el proceso, completándose la
formación de la vesícula y liberándose dicha GTPasa —se ha relacionado Gcs1 de manera
específica con Arl1 [215]—. Por otro lado, age1b (AN4274) codifica una GAP con un dominio
PH, de interacción con lípidos. Pese a las investigaciones ya hechas, se sabe poco sobre
requerimiento de proteínas sensoras de lípidos o de curvatura en el proceso de salida de carriers
del aparato de Golgi. Gcs1p y Age1b son las dos únicas GAP de Arf con un dominio sensor de
lípidos. Con la hipótesis de que, al menos se necesitaría una GAP de Arf con sensor de
curvatura para la salida de cargo del Golgi, construimos el doble mutante gcs1Δ age1bΔ. Sin
embargo, el crecimiento de esta cepa doble mutante fue indistinguible al de una cepa wt (Figura

Página 138
 Resultados. Capítulo II
R.27). Por lo tanto, rechazamos nuestra hipótesis de que la doble deleción de gcs1 y age1b
(AN4274) sería muy nociva. Por otro lado determinamos la localización de SynA, como
marcador de exocitosis, en una cepa gcs1Δ. En esta cepa, GFP-SynA se localiza como en una
cepa wt (Figura R.27).

Finalmente, para abordar mediante interacciones sintéticas la posibilidad de que Gcs1

en tuviese un papel en la exocitosis, construimos los dobles mutantes gcs1Δ rabDΔ, gcs1Δ
synAΔ y gcs1Δ rabCΔ. La cepa doble mutante gcs1Δ rabDΔ crece peor que los mutantes
simples gcs1Δ y rabDΔ. Por lo tanto, ambas deleciones presentan una interacción sintética
negativa. RabD (Sec4p en S. cerevisiae) está implicado en la fusión de las vesículas de
exocitosis con la membrana plasmática. Por lo tanto, este resultado sugiere que Gcs1 está
implicada en una ruta alternativa de transporte de cargo a la membrana plasmática, quizá al
nivel de la salida del Golgi. El resto de mutaciones no mostraron un efecto sintético.

Tabla R.5. Deleción de los genes de la familia Arf/Sar y sus proteínas reguladoras.
Aspergillus Saccharomyces
Fenotipo de la cepa knockout
nidulans cerevisiae
Arf/Sar
AN0634|Arl3 ARL3 Silvestre
AN5912|Arl1 ARL1 Silvestre
AN12112|Arl2 CIN4 Letal
AN3934|ArfX Silvestre
AN1126|ArfA ARF1/ARF2 Letal
AN0411|SarA SAR1 Letal
AN5020|ArfB ARF3 Microcolonias
GEF de Sar1
AN11127|Sec12 Sec12p Letal
GEFs de Arf
AN6709|HypB Sec7p Letal
AN0112|GeaA Gea1p/Gea2p Letal
AN3438|Syt1a Syt1p/Yel1p Silvestre
Esporulación reducida a 37ºC, casi inexistente a
AN6120|Syt1b Syt1p/Yel1p
42ºC
GAPs de Arf
AN2222|Gcs1 Gcs1p Silvestre
AN4274|Age1b Age1p/Age2p Silvestre
AN1931|Age1a Age1p/Age2p Letal a 30ºC y 37ºC; microcolonias a 42ºC
Silvestre a 30ºC y 37ºC, ligeramente afectado a
AN6033|Glo3 Glo3p
42ºC.
AN1629|Gts1 Gts1p Silvestre

Página 139
Resultados. Capítulo II

Figura R.24. Deleción de las GTPasas de la familia Arf/Sar. En cada panel se muestra el genotipoado por Southern blot (izquierda), excepto en el caso de sarA que
también se genotipó por PCR con oligonucleótidos del locus de sarA externos a la construcción. En todos los Southern-blots la sonda hibrida en el locus mutado, tanto si el
alelo es wt como si es nulo y las digestiones se diseñaron para visualizar bandas de distinto tamaño para cada uno de los dos alelos. A la derecha se muestra un test de
crecimiento. En el caso de que la deleción fuese letal se muestra el crecimiento de una solución de esporas procedente de las colonias heterocariontes Δ/wt crecidas en
medio con y sin pirimidinas (pir.), excepto en el caso de sarA, donde sólo se comprobó el crecimiento a 37ºC por estriación. sarA, arfA y arl2 son genes esenciales.

Página 140
 Resultados. Capítulo II

Figura R.25. Deleción de las GEF de GTPasas de la familia Arf/Sar. Similar a la Figura R.24. hypB, sec12 y geaA son genes esenciales. Se muestra una
representación esquemática del análisis de los tranformantes heterocariontes hypBΔ::pyrGfum; hypB+, aplicable al resto de deleciones letales. Los transformantes
heterocariontes, que contienen núcleos transformados y no transformados producen esporas uninucleadas. Las esporas hypB+ no crecen en medio sin
pirimidinas, lo que permite comprobar el crecimiento de las esporas hypBΔ::pyrGfum, que forman microcolonias aconidiales a 30ºC y 37ºC. Excepcionalmente,
fuimos capaces de extraer DNA de las microcolonias que forma hypBΔ, y genotiparlas mediante PCR.

Página 141
Resultados. Capítulo II

Figura R.26. Deleción de las GAP de GTPasas de la familia Arf/Sar. Similar a la Figura R.24. age1a es un gen esencial, con la excepción de que, a 42ºC, es
capaz de formar microcolonias.

Página 142
 Resultados. Capítulo II

Figura R.27. Caracterización de gcs1Δ. A. Las diferentes estirpes fueron sembradas en una misma
placa para cada temperatura. El medio de cultivo era MCA y fueron crecidas durante 3 días. Este test
muestra que gcs1Δ presenta interacción sintética negativa con rabDΔ, pero no con el resto de
deleciones. Nótese que las cepas gcs1Δ, rabDΔ, rabDΔ gcs1Δ, age1bΔ y gcs1Δ age1bΔ tienen,
además, la mutación wA4 que provoca la formación de conidiosporas blancas. age1b es AN4274. B.
La localización de GFP-SynA no se altera por la deleción de gcs1.

Página 143
Capítulo III
 Resultados. Capítulo III

4.3. Capítulo III. Supresión de la letalidad de hypBΔ (SEC7Δ)

hypB codifica una GEF de Arf, denominada HypB o Sec7, que pertenece a la subfamilia
BIG/Sec7 [25, 130] y que se localiza específicamente en las cisternas del TGN [24]. La deleción
de hypB es prácticamente letal (ver capítulo II); de hecho, determinamos que el fenotipo
“terminal” de hypBΔ es de microcolonias aconidiales (Figura R.28). hypB5 es un alelo
termosensible de hypB que permite un crecimiento normal a 30ºC y lo impide a 42ºC [217, 218]
(Figura R.28). Este mutante codifica una proteína HypB con la sustitución Ala180Pro en el
dominio catalítico de la GEF, denominado dominio Sec7, que inactivaría su función GEF a la
temperatura restrictiva. De hecho, cuando se incrementa la temperatura de cultivo de las células
hypB5 de 28ºC a 37ºC se detiene la extensión apical y deslocaliza la SNARE exocítica SynA del
domo apical a estructuras intracelulares [18, 36]. Nos propusimos utilizar el mutante
termosensible hypB5 para buscar mutaciones supresoras del papel esencial de hypB.

4.3.1. Caracterización de geaA1, un supresor extragénico de hypBΔ (sec7)

Mediante mutagénesis con ultravioleta de una cepa hypB5 seleccionamos un total de 40

colonias capaces de crecer a 42ºC. De estos 40 clones, 39 contenían mutaciones supresoras
intragénicas en hypB5, mientras que uno tenía el alelo hypB5 original, sin cambios en su
secuencia (Tabla R.6). La mutación supresora que esta última estirpe debía contener fue
denominada suA1hypB5.

Tabla R.6. Revertientes del fenotipo termosensible de hypB5.

Página 147
Resultados. Capítulo III
Mediante mapeo genético, con ayuda del Profesor Herbert N. Arst, determinamos que el
fenotipo de supresión segregaba mendelianamente y se encontraba ligado al cromosoma VIII,
entre los genes AN0118 (nudA) y AN0098 (nirA). El gen AN0112, que se encuentra en esta
región cromosómica, codifica la putativa GEF de Arf1 en el Golgi temprano, denominada
Gea1/2p en S. cerevisiae y GeaA en A. nidulans. Esta GEF es esencial para el crecimiento del
hongo (ver capítulo II). Mediante secuenciación del gen AN0012 del mutante revertiente
descubrimos la mutación de cambio de sentido A3065G, que provoca la sustitución
Tyr1022Cys. A este alelo mutante de geaA lo denominamos geaA1. Para determinar si la
mutación encontrada en geaA1 era la causante de la supresión, transformamos un mutante
hypB5 con un fragmento de DNA del alelo geaA1 que contenía la mutación. Los transformantes
se seleccionaron a 42ºC, temperatura a la que hypB5 no crece. Aparecieron colonias en las
placas de transformación, mientras que no crecieron colonias en el control sin transformar.
Mediante purificación y secuenciación de estas colonias comprobamos que contenían la
mutación de geaA1 (g.A3065G) y eran idénticas fenotípicamente a la cepa revertiente hypB5
suA1hypB5 original (Figura R.28). Así, confirmamos que geaA1 suprime la termosensibilidad
de hypB5 y, por tanto, que geaA1 es suA1hypB5.

Con el fin de averiguar si geaA1 suprime también la letalidad resultante de hypBΔ,

delecionamos hypB en una cepa geaA1, mediante transformación con una casete de deleción con
el marcador de selección pyrG de Aspergillus fumigatus. Pudimos recuperar mutantes hypBΔ
geaA1 en homocariosis (ver test de crecimiento en la Figura R.28), lo que demuestra que geaA1
no sólo suprime la termosensibilidad de hypB5, sino también rescata la letalidad de hypBΔ. Por
tanto, en un fondo genético geaA1, el gen hypB no es estrictamente necesario para el
crecimiento de A. nidulans.

Figura R.28. Supresión de hypB5 y hypBΔ por geaA1. Test de crecimiento en MCA de los
diferentes mutantes utilizados. geaA1 suprime el requerimiento de hypB y la termosensibilidad de
hypB5. A 42ºC, hypB5 forma microcolonias aconidiales, mientras que en presencia de geaA1 forma
colonias mayores, con conidiosporas. geaA1 también rescata el crecimiento hypBΔ a 30ºC, 37ºC y
42ºC.

Página 148
 Resultados. Capítulo III

Figura R.29. Regiones conservadas en BIG/Sec7 y GBF/Gea. A. Esquema de los dominios

conservados en BIG/Sec7 y GBF/Gea. La mutación de hypB5 afecta a un residuo conservado en el
dominio catalítico Sec7d. La sustitución de GeaA1 (Y1022C) se encuentra entre los dominios HDS1 y
HDS2. B. Alineamiento múltiple de homólogos de GBF/Gea en la región entre los dominios HDS1 y
HDS2. Primero, buscamos una gran homología de HDS1 y HDS2. Después inspeccionamos y
ajustamos manualmente la región entre HDS1 y HDS2, que se encuentra menos conservada.
Específicamente, las secuencias utilizadas son: A. nidulans XP_657716, Saccharomyces cerevisiae
CAA89558, Pichia pastoris XP_002490563, Ustilago maydis XP_757309, Rhizopus delemar
EIE78027, Mus musculus BAD32197, Homo sapiens NP_004184, Danio rerio XP_694714,
Strongylocentrotus purpuratus XP_003728128, Caenorhabditis elegans NP_001255140, Drosophila
melanogaster NP_610761, Arabidopsis thaliana NP_198766.

La Tyr 1022 de GeaA, sustituida por una cisteína en la cepa geaA1, se encuentra entre
los dominios HDS1 y HDS2 (ver capítulo II). Mediante alineamiento múltiple, descubrimos que
esta tirosina pertenece a un motivo conservado en la subfamilia Gea/GBF (Figura R.29).
Estudiamos los homólogos de Gea/GBF de 11 Aspergillus diferentes y comprobamos que
contienen serina, tirosina (Tyr1022 en GeaA), leucina (SYL) en la región entre HDS1 y HDS2.
En otras 27 secuencias fúngicas, que incluyen basidiomicetos, zigomicetos y ascomicetos, el
motivo conservado es SY(L/I/V), con pocas excepciones (Pichia pastoris: SFM, Candida
albicans: SFL). Revisamos más de 30 secuencias de vertebrados (incluyendo mamíferos, pez
ceba y xenopus) y comprobamos que contienen la secuencia SFVSWL, correspondiente a una
duplicación del motivo. Los equinodermos tienen SYF. En los ecdisozoos, Drosophila
melanogaster tiene SFI, Ceratitis capitata y Bombyx mori SYL/I y C. elegans SWF.
Concluimos que el motivo serina-residuo aromático-residuo hidrofóbico está conservado en las
proteínas GBF/Gea en opistocontos. En resumen, existe un motivo conservado S-Ω-ϕ, donde Ω
es un residuo aromático y ϕ un aminoácido hidrofóbico (Figura R.29). El motivo consenso en
hongos es SYL. Es importante remarcar que HypB y sus ortólogos (las proteínas BIG/Sec7) no

Página 149
Resultados. Capítulo III
contienen este motivo conservado. La sustitución Tyr1022Cys en este motivo conservado de
GeaA soslaya el requerimiento esencial de HypB / Sec7.

4.3.2. La sustitución Tyr1022Cys altera la localización subcelular de GeaA

Una posible explicación para el mecanismo de supresión es que la sustitución en GeaA1

provoque que la proteína se desplace hacia las cisternas del TGN, donde sustituiría a HypB en la
activación de ArfA.

Dado que no conocíamos la localización subcelular de GeaA en A. nidulans

reemplazamos el alelo silvestre geaA por un alelo geaA-gfp (Figura R.30A). La cepa geaA-gfp
presentó un crecimiento silvestre (Figura R.30B). GeaA-GFP marca estructuras similares a las
cisternas del aparato de Golgi (Figura R.30C). Algunas de estas cisternas se encuentran cerca
del ápice, como es característico del Golgi temprano (las cisternas del TGN están excluidas de
la región apico-proximal) [24]. GeaA-GFP también es parcialmente citosólica, como se deduce
de que los núcleos tienen menos fluorescencia que el resto del interior celular.

Una vez determinada la localización de GeaA, estudiamos la localización de GeaA1.

Marcamos el alelo mutante geaA1 con gfp, de tal manera que fuese la única copia de geaA en el
genoma. La cepa geaA1-gfp mostró un fenotipo de crecimiento indistinguible a geaA1. De
hecho, geaA1-gfp suprime la termosensibilidad de hypB5 de manera similar a geaA1 (Figura
R.30B). Por lo tanto, el marcaje con GFP aparentemente no afectó a la función alterada de
GeaA1. La localización de GeaA1-GFP se muestra en la Figura R.30C-F. Como GeaA-GFP,
ésta se localiza en estructuras intracelulares similares a cisternas del Golgi. Sorprendentemente,
GeaA1-GFP también se localiza asociado a la membrana plasmática en la región apico-
proximal, donde su distribución recuerda las de la v-SNARE SynA [12] y la enzima ChsB (ver
capítulo V). Ésta es la una región en la que predomina la exocitosis en los hongos filamentosos.
GeaA1-GFP también se localiza en el Spitzenkörper, donde las vesículas exocíticas se acumulan
antes de fusionarse con la membrana plasmática (Figura R.30C).

Para comprobar la asociación de GeaA1-GFP con la membrana apical, utilizamos el

fluoróforo lipofílico FM4-64 [155]. Como se muestra en la Figura R.30F, GeaA1-GFP
colocaliza con FM4-64 en la membrana plasmática. Por lo tanto, GeaA1-GFP se encuentra en la
membrana plasmática o íntimamente asociado a ella. Tratamos A. nidulans con Brefeldina A
para determinar el grado de asociación de GeaA y GeaA1 con el Golgi. Brefeldina A es una
droga que, en A. nidulans, provoca la agregación de las cisternas del Golgi, formándose
agregados específicos y distintos (brefeldin bodies) para el Golgi temprano y para el TGN [24].
Comprobamos que tanto GeaA-GFP como GeaA1-GFP se encuentran en agregados
intracelulares tras el tratamiento (Figura R.30E).

Página 150
 Resultados. Capítulo III

Figura R.30. Distribución intracelular de GeaA-GFP y GeaA1-GFP. A. Marcaje C-terminal de

GeaA o GeaA1 con GFP por integración in locus mediante transformación con el casete lineal del
esquema, obteniéndose transformantes con una copia única de geaA o geaA1 marcados con gfp. B.
Test de crecimiento, donde se muestra que las proteínas GeaA y GeaA1 marcadas con GFP son
funcionales. Nótese que GeaA1-GFP suprime la termosensibilidad de hypB5 del mismo modo que
geaA1. C. Proyecciones de intensidades máximas de series z sometidas a deconvolución. GeaA-GFP
se localiza en las cisternas del Golgi. GeaA1-GFP, además del Golgi, marca la superficie apical. La
localización apical se mantiene al cambiar un cultivo hypB5 durante 40 minutos (n: núcleo). D.
Perfiles de intensidad de fluorescencia a lo largo de la hifas de C. Nótese el desplazamiento hacia el
ápice de GeaA1-GFP. E. Hifas tratadas con brefeldina A, lo que no altera la localización apical de
GeaA1-GFP. F. Tinción de la membrana plasmática con FM4-64 en una cepa geaA1-gfp, lo que
demuestra que GeaA1-GFP se encuentra en la membrana plasmática o muy íntimamente asociada a
ella.

Página 151
Resultados. Capítulo III
Mediante co-visualización de GeaA-GFP y mCherry-SedV, comprobamos que ambos
marcadores colocalizan (Figura R.31A). Por el contrario, GeaA-GFP y mRFP-PHOSBP no
colocalizan (Figura R.31A). Mediante el cálculo de los coeficientes de Li y de Pearson,
confirmamos cuantitativamente la colocalización de GeaA-GFP con mCherry-SedV en las
cisternas del Golgi temprano y la ausencia de colocalización de GeaA-GFP con mRFP-PHOSBP
(Figura R.31B). Estos resultados concuerdan con otros trabajos que describen la localización en
el Golgi temprano de los ortólogos de GeaA (ver, por ejemplo, [219]). Posteriormente, para
averiguar en qué parte del Golgi se encuentra GeaA1, co-visualizamos GeaA1-GFP con los
marcadores del Golgi (mCherry-SedV y mRFP-PHOSBP). Determinamos que GeaA1-GFP se
encuentra en las cisternas del Golgi temprano (Figura R.31A), colocalizando con mCherry-
SedV y, aunque no se encuentra principalmente en el TGN, presentó un mayor coeficiente de
correlación de Pearson (es decir un mayor grado de colocalización) con PHOSBP que GeaA
silvestre. Posteriormente, al analizar la localización de los agregados de GeaA y GeaA1
formados tras el tratamiento con Brefeldina A, encontramos que, pese a localizarse en su
mayoría en los agregados del Golgi temprano, se detectaba una mayor proporción de agregados
del TGN que contenían una señal detectable de GeaA1-GFP (87%) que en el caso de GeaA-
GFP (44%). Esto sugiere que GeaA1 se encuentra asociado al TGN en mayor medida que
GeaA.

La sustitución Tyr1022Cys suprime la termosensibilidad de hypB5 y la esencialidad de

hypB. Además, dicha sustitución cambia la localización de GeaA. Por lo tanto, era posible que
la localización de GeaA1, en un fondo genético hypB5, estuviese alterada respecto a la que
presenta en un fondo genético silvestre. Para determinar el efecto de hypB5 en la localización de
GeaA1, obtuvimos una cepa GeaA1-GFP hypB5. GeaA1-GFP presenta la misma localización en
la cepa hypB5 a 28ºC que en una cepa silvestre. Realizamos un cambio de temperatura a 37ºC,
usando como control una cepa hypB5 geaAwt. El incremento de temperatura detuvo el
crecimiento de las hifas hypB5, mientras que las células geaA1-gfp hypB5 continuaron
creciendo. La localización de GeaA1-GFP se mantuvo como a 28ºC, con su característica
localización en cisternas intracelulares y en la membrana apical (Figura R.30C). Este resultado
sugiere que estos cambios en la localización están implicados en, o son un reflejo de la
supresión.

Página 152
 Resultados. Capítulo III

Figura R.31. Localización intra-Golgi de GeaA-GFP y GeaA1-GFP. A. Arriba, proyecciones de

intensidades máximas de una serie z de GeaA-GFP y mCherry-SedV (izquierda) o mRFP-PHOSBP
(derecha), que muestran la colocalización de GeaA con el marcador del Golgi temprano (SedV) y su
baja colocalización con mRFP-PHOSBP. La barra corresponde a 2 μm. Abajo, igual pero con una cepa
geaA1-gfp. C. Abajo, análisis de correlación de intensidades de Li en el canal verde. Abajo, gráfico
que muestra la dispersión y los valores medios del coeficiente de correlación de Pearson. Las barras
azules indican el error estándar. Tanto GeaA-GFP como GeaA1-GFP predominan en el Golgi
temprano. La caída en la colocalización entre GeaA1 y SedV comparado con GeaA/SedV
correlaciona con el desplazamiento de GeaA1 hacia la membrana plasmática apical. También existe
mayor corelación en GeaA1/PHOSBP que en GeaA/PHOSBP, aunque ésta es, aun así, baja.

4.3.3. La mutación geaA1 no altera el reclutamiento de CopA

En S. cerevisiae Gea1p, a diferencia de Sec7p, interacciona con Sec21p, una subunidad
de COPI. Esta interacción concuerda con las observaciones que describen que los miembros de
la subfamilia Gea/GBF se localizan en el Golgi temprano, donde también se localiza COPI (ver
capítulo IV) [220, 221].

Nos preguntamos si la localización de GeaA1 en la membrana plasmática provocaría el

reclutamiento a ésta de sus interactores, como por ejemplo COPI. Para contestar esta pregunta,

Página 153
Resultados. Capítulo III
determinamos la localización de CopA-GFP (ver capítulo IV) en la cepa mutante geaA1. Como
se muestra en la Figura R.32, CopA en el fondo genético geaA1 presenta una localización en
cisternas intracelulares que es indistinguible de una cepa silvestre. Tras cuantificar la intensidad
de fluorescencia media de 4 células (región de 10 x 1.5 µm por célula), así como la intensidad
máxima y la mínima, no encontramos diferencias significativas en ninguno de estos valores, ni
tampoco en la polarización de las cisternas. En otras palabras, la relocalización de GeaA1 no
provoca una relocalización de COPI ni altera su reclutamiento a las cisternas del Golgi.

Figura R.32. Reclutamiento de CopA-GFP a

estructuras intracelulares en una cepa geaA1.
CopA-GFP se recluta eficientemente a estructuras
intracelulares tanto en una cepa wt como en el
mutante geaA1.

4.3.4. Implicación de arl1 y arl3 en la supresión de hypB5 por geaA1

Los resultados arriba expuestos indicaron que geaA1 parecía soslayar la necesidad de
hypB mediante una actuación en el TGN. Existe evidencia de la interacción de Gea2p de S.
cerevisiae con Arl1p y la flipasa Drs2p [124]. Además, dicha interacción se requiere para el
reclutamiento de proteínas específicas al TGN [124], donde se localizan Arl1p y Drs2p.

Como hemos descrito, GeaA1 no se localiza mayoritariamente en el TGN; sin embargo

su mayor presencia en el TGN podría ser la causa de la supresión. Hipotetizamos que, si ese
fuese el caso, el mecanismo de supresión de geaA1 podría requerir un reclutamiento inicial de
GeaA1 a las membranas del TGN. La eficiencia de dicho reclutamiento podría aumentar por
interacción con Arl1. Esto significaría que Arl1 estaría implicado en el mecanismo de supresión.
Por otro lado, Arl3p se requiere para el reclutamiento de Arl1p al TGN [222]. Esto significaría
que Arl3 también se necesitaría para la supresión mediada por geaA1. Para probar dichas
hipótesis, aprovechamos la colección de mutantes de deleción que obtuvimos en el capítulo II.
Mediante cruces obtuvimos una cepa geaA1 arl1Δ y un mutante triple hypB5 geaA1 arl1Δ.
También, obtuvimos las cepas correspondientes con el mutante arl3Δ: geaA1 arl3Δ y hypB5
geaA1 arl3Δ. El crecimiento de las cepas analizadas se muestra en la Figura R.33. La deleción
de arl1 o de arl3 altera ligeramente el crecimiento de la cepa geaA1 a 37ºC. También,
comprobamos que los triples mutantes hypB5 geaA1 arl1Δ y hypB5 geaA1 arl3Δ crecen de un

Página 154
 Resultados. Capítulo III
modo similar al doble mutante hypB5 geaA1 a 30ºC y 37ºC. Por el contrario, a 42ºC los triples
mutantes crecen considerablemente peor que el mutante doble hypB5 geaA1, de manera que
arl1Δ, y en menor grado arl3Δ, impiden en cierta medida la supresión llevada a cabo por
geaA1. De estos resultados se deduce que, tanto arl1 como arl3 juegan un cierto papel para que
el mecanismo de supresión funcione completamente. Una posible explicación sería, como se
indica más arriba, que Arl1 aumentase la estabilidad de GeaA1 en el TGN.

Figura R.33. Interacciones genéticas entre arl1Δ, arl3Δ, geaA1 y hypB5. Se muestra un test de
crecimiento de las cepas indicadas en MCA a 30ºC, 37ºC y 42ºC. Como se puede apreciar los triples
mutantes arl1Δ hypB5 geaA1 y arl3Δ hypB5 geaA1 crecen peor que el mutante doble hypB5 geaA1.

Página 155
Capítulo IV
 Resultados. Capítulo IV

4.4. Capítulo IV. Localización subcelular y caracterización de

CopA, una subunidad esencial de COPI

COPI es posiblemente el principal complejo multiproteico formador de cubiertas en el

aparato de Golgi. Sin embargo, su localización específica no se había determinado en
Aspergillus nidulans. Otros investigadores habían visualizado CopA (subunidad de COPI),
utilizando una cepa que sobre-expresa CopA-GFP y mantiene la copia endógena del gen [26],
sin establecer si se localizaba en el Golgi temprano, en el TGN o en ambos. Para entender la
organización del aparato de Golgi, consideramos que era importante conocer la localización
precisa de COPI.

4.4.1. La construcción copA-gfp es funcional

En A. nidulans, la deleción de copA (AN3026) —también llamado sod(VI)C— es letal
[185]. sod(VI)C1 es una mutación termosensible de CopA, que impide el crecimiento a 42ºC
[223], lo que confirma el papel esencial de la proteína. Para expresar una fusión CopA-GFP a
niveles fisiológicos reemplazamos el gen copA residente por una variante que codifica la
proteína de fusión CopA-GFP, que representa la única fuente de CopA en la cepa manipulada.
El reemplazamiento génico de copA por la fusión copA-gfp no causó defecto en el crecimiento
en las condiciones utilizadas para microscopía, indicando que CopA-GFP es funcional.
Genotipamos los transformantes con oligonucleótidos externos a la construcción y
comprobamos que el reemplazamiento génico había ocurrido fielmente.

4.4.2. CopA-GFP se localiza en estructuras citosólicas dinámicas polarizadas hacia

el ápice
Estudiamos CopA-GFP mediante microscopía in vivo. CopA-GFP se localiza en
estructuras polarizadas (Figura R.34A) hacia el ápice de la hifa, que mostraban formas anulares,
esféricas, elipsoidales, elongadas o tubulares (Figura R.34A). Mediante la adquisición de series
de imágenes con una resolución temporal de 10 fotogramas por segundo observamos
movimientos a grandes distancias de una pequeña proporción de estas estructuras. Sin embargo,
la mayoría de ellas no presentaban estos movimientos (Figura R.34B). Las estructuras CopA-
GFP cambian su forma constantemente, observándose esferas que se elipsoidizan, para
finalmente dar lugar a formas anulares o elongadas. En ocasiones, estas estructuras coalescían y
se volvían a separar, dando la impresión de intercambio de material. Estas formas y esta
dinámica son características de las cisternas del aparato de Golgi [24].

Página 159
Resultados. Capítulo IV

Figura R.34. Localización de CopA-GFP en A. nidulans. A. La imagen es una proyección de

máxima intensidad de una serie de planos en el eje Z, mejorada mediante un algoritmo de
deconvolución. La polarización se muestra en el gráfico inferior, que representa la intensidad de la
señal a lo largo de la hifa de la imagen. B. Dinámica de CopA-GFP. La imagen corresponde a una
serie de imágenes en el tiempo (time-lapse). El quimógrafo inferior corresponde a la línea azul de la
imagen y muestra el cambio en intensidad a lo largo de los 22 segundos del time-lapse mostrando que,
en general, CopA-GFP no realiza movimientos a grandes distancias.

4.4.3. CopA-GFP se localiza mayoritariamente en el Golgi temprano, donde

colocaliza con SedV
SedV es un marcador del Golgi temprano bien caracterizado [38]. Generamos una
estirpe con ambos marcadores para determinar la localización relativa de CopA-GFP y
mCherry-SedV. Utilizando un microscopio acoplado a un beam splitter, que permite adquirir
imágenes simultáneamente en los canales GFP y mCherry/RFP, determinamos la localización
relativa de ambas proteínas. Para estudiar la colocalización: (1) inspeccionamos las imágenes
adquiridas visualmente; (2) realizamos un análisis de correlación de intensidad de Li [195]; y
(3) calculamos el coeficiente de correlación de Pearson [195]. Del análisis de Li se obtiene un
cociente de correlación de intensidad (ICQ) o cociente de Li, que es una medida de la
proporción de píxeles que presentan una intensidad alta o baja tanto en el canal rojo como en el
verde (es decir, cierta correlación en las intensidades de los dos canales). Un valor de -0.5 indica
exclusión y +0.5 indica colocalización total; se considera que existe una colocalización
significativa cuando el valor del ICQ es mayor que 0.2. Del análisis de Pearson se obtiene un
coeficiente que indica la correlación existente entre ambos canales de fluorescencia. Un valor de
1 indica correlación perfecta positiva y valores cercanos a 1 indican correlación positiva.

Mediante inspección visual, observamos que, en su gran mayoría, las cisternas que
contienen mCherry-SedV también contienen CopA-GFP y viceversa (Figura R.35A). Filmamos
estas cisternas y comprobamos que esta coincidencia de ambos marcadores se mantenía a lo
largo del tiempo, dado que se movían conjuntamente en xy. Para los cálculos de colocalización
de Li y de Pearson adquirimos un conjunto de planos en el eje Z, cubriendo el ancho total de la
hifa. Los tres planos centrales fueron procesados mediante deconvolución y, posteriormente,

Página 160
 Resultados. Capítulo IV
obtuvimos una imagen que es la proyección de intensidades máximas de los tres planos.
Seleccionamos regiones que incluyesen únicamente espacio intracelular, evitando las regiones
nucleares. Medimos regiones de un total de 11 células. Los valores de Pearson y de Li (Tabla
R.7 y Figura R.35B-C) indicaron que existe colocalización entre SedV y CopA, con un
coeficiente de Pearson medio de 0.72 y un cociente de Li de 0.30.

Figura R.35. Colocalización de CopA-GFP y mCherry-SedV. A. Imagen de canal dual de CopA-

GFP y mCherry-SedV. Los rectángulos muestran la región utilizada para el análisis de colocalización.
B. Región utilizada para el análisis. C. Cociente de correlación de intensidad de Li y coeficiente de
Pearson de las regiones de B.

4.4.4. CopA-GFP no colocaliza con mRFP-PHOSBP (TGN)

El marcador del TGN mRFP-PHOSBP [24] se recluta a la cara citosólica de las
membranas del TGN por detección por coincidencia de PtdIns4P y la GTPasa del Golgi Arf1
[167]. Basándonos en el resultado previo de que CopA-GFP colocaliza casi totalmente con
SedV, predijimos que CopA no se encontraría en el TGN. Mediante vídeos y proyecciones en el
eje Z comprobamos que las estructuras CopA-GFP no colocalizan con mRFP-PHOSBP (Figura
R.36A). El análisis de colocalización, mediante el cálculo del cociente de Li y el coeficiente de
Pearson, se hizo de manera idéntica al apartado anterior. Ni los valores de Pearson ni de Li
mostraron alta correlación (Pearson=0.30; Li=0.16), con lo que concluimos que CopA no
colocaliza con PHOSBP y, por tanto, no se encuentra en el TGN (Tabla R.7 y Figura R.36B-C).

Página 161
Resultados. Capítulo IV
La Figura R.37 muestra que existen diferencias significativas entre los coeficientes de Pearson
correspondientes a CopA/SedV y CopA/ mRFP-PHOSBP.

TablaR.7. Cocientes de Li y coeficientes de Pearson de cada región (célula) analizada.

SedV/CopA PHOSBP/CopA
Pearson Li Pearson Li
0.61 0.30 0.44 0.25
0.81 0.33 0.56 0.28
0.75 0.26 0.21 0.12
0.72 0,33 0.17 0.11
0.64 0.36 0.18 0.11
0.82 0.36 0.50 0.23
0.76 0.27 0.39 0.20
0.69 0.28 0.09 0.08
0.72 0.26 0.35 0.10
0.71 0.29 0.30 0.12
0.71 0.32 0.32 0.16
0.18 0.09
0.15 0.19
0.40 0.17
0.27 0.21
(P)=0.72 (Li)=0.30 (P)=0.30 (Li)=0.16

Figura R.36. Colocalización de CopA-GFP y mRFP-PHOSBP. A. Imagen de canal dual de CopA-

GFP y mRFP-PHOSBP. Los rectángulos muestran la región utilizada para el análisis de colocalización.
B. Región utilizada para el análisis. C. Cociente de correlación de intensidad de Li y coeficiente de
Pearson de las regiones de B.

Página 162
 Resultados. Capítulo IV

Figura R.37. Colocalización de CopA-GFP

con mCherry-SedV y mRFP-PHOSBP. El
gráfico muestra la media y el error estándar del
coeficiente de correlación de Pearson calculado
de un total de n=11 células en el caso
CopA/SedV y n=15 células en el caso de
CopA/PHOSBP.

4.4.5. CopA-GFP se acumula en los agregados de Golgi temprano tras el

tratamiento con Brefeldina A
En A. nidulans [24], al igual que en mamíferos [46] y otros hongos [224], la droga
Brefeldina A (BFA) provoca una alteración del aparato de Golgi, dando lugar en este caso,
como ya se ha mencionado, a la formación de agregados específicos de Golgi temprano y TGN.
En mamíferos, tras el tratamiento con BFA, COPI se vuelve rápidamente citosólico [225]. Tras
añadir BFA, las estructuras CopA-GFP se reorganizaron rápidamente (1-2 min), perdiendo parte
de su distribución polarizada y formándose un pequeño número de estructuras grandes y muy
fluorescentes. En la cepa CopA-GFP/ mCherry- SedV ambos marcadores colocalizaron
totalmente en los agregados, mostrando que CopA-GFP queda capturado en los agregados de
Golgi temprano (Figura R.38A). mCherry-SedV se encontró, además de en los agregados,
rodeando los núcleos (la envoltura nuclear es un dominio del retículo endoplasmático),
localización que no presentó CopA-GFP. Por el contrario, tras el tratamiento con BFA de la
cepa copA-gfp mRFP-PHOSBP los agregados que secuestran mRFP-PHOSBP eran diferentes a los
formados por CopA-GFP (Figura R.38B), mostrando que CopA no se acumula en los agregados
de TGN. Estos resultados subrayan que en el estado estacionario CopA predomina en el Golgi
temprano.

Página 163
Resultados. Capítulo IV

Figura R.38. Efecto de la droga Brefeldina A en CopA-GFP. A. Las imágenes corresponden a un

plano, en canal dual, de células copA-gfp mCherry-sedV, tratadas con Brefeldina A (BFA) 4 minutos
antes de tomar la imagen. B.Igual que en A, pero con células copA-gfp mRFP-PHOSBP, tras 9 minutos
de tratamiento con BFA.

4.4.6. CopA se deslocaliza al alterar la organización del Golgi temprano, pero no al

alterar el TGN

Dado que CopA se localiza en el Golgi temprano, quisimos averiguar si el

funcionamiento normal del TGN y del Golgi temprano era necesario para el reclutamiento de
CopA. Para alterar el TGN utilizamos los mutantes termosensibles hypB5 y hypA1. HypB
(Sec7) se encuentra específicamente en las cisternas del TGN, donde debe activar a ArfA. HypA
(Trs120), por su parte, es la GEF de RabE y su función es necesaria para la salida de tráfico del
TGN, con destino exocítico [36, 37]. Ninguna de las dos mutaciones afectó a la localización de
CopA a 30ºC o a 37ºC después de > 50 min (Figura R.39). En ambos mutantes, CopA marcó,
como como en una cepa silvestre, cisternas intracelulares. Por el contrario, la desorganización
general del aparato de Golgi mediada por sarA6 alteró drásticamente la localización de CopA
(ver capítulo I), de acuerdo con la conclusión de que el Golgi se mantiene dinámicamente sólo
si existe un flujo continuo de membranas desde el RE.

Página 164
 Resultados. Capítulo IV

Figura R.39. Localización de CopA-GFP después de la inactivación de HypB y Trs120. A. La

mutación termosensible hypB5 no afecta a la localización de CopA-GFP. B. La inactivación de
Trs120 mediante hypA1 tampoco altera la localización de CopA. Las imágenes son proyecciones
máximas de varios planos en el eje z.

Página 165
Capítulo V
 Resultados. Capítulo V

4.5. Capítulo V. Implicación del reciclaje endocítico en el

mantenimiento de la polaridad de ChsB
ChsB es una quitina sintasa específica de hongos filamentosos que es crucial para el
crecimiento [28, 226]. Se localiza en el ápice de las hifas, al igual que la sinaptobrevina SynA
[28, 227], donde probablemente contribuye, mediante la síntesis de quitina, al proceso de
construcción de nueva pared celular. Contiene un dominio citosólico de 543 residuos y una
región con siete hélices transmembrana (Figura R.40A). En este capítulo elegimos la proteína
ChsB como modelo para estudiar el mecanismo por el cual ciertas proteínas transmembrana
presentan una localización polarizada en el casquete apical de las hifas.

4.5.1. La enzima ChsB es esencial

En primer lugar, revisamos el fenotipo de un mutante nulo chsBΔ [226]. Delecionamos
el gen chsB, reemplazándolo por el marcador de selección pyrGfum y comprobamos que la
ausencia de chsB no permite el crecimiento más allá de la formación de microcolonias incapaces
de esporular (Figura R.40B). Por lo tanto, la deleción de chsB es virtualmente letal. Este
resultado concuerda con lo descrito previamente [226]. Fuimos incapaces de rescatar colonias
chsBΔ viables utilizando sorbitol como estabilizador osmótico o probando diferentes
temperaturas de cultivo. Concluimos que ChsB es una enzima clave para la supervivencia de
Aspergillus nidulans, por lo que alteraciones en su localización fisiológica se traducirían en
defectos de crecimiento y/o morfogénesis.

4.5.2. Localización subcelular de ChsB: membrana apical, vesículas de secreción,

estructuras citosólicas y septos
Un estudio previo de la localización de ChsB [227] utilizó un transgén integrado
ectópicamente que expresaba ChsB marcada con EGFP y conservaba el gen chsB silvestre. Para
comprobar la funcionalidad de la proteína de fusión GFP-ChsB, diseñaron un sistema para
reprimir la expresión del gen chsB silvestre con un promotor regulable. Para evitar posibles
artefactos producidos por esta estrategia y para determinar con certeza la funcionalidad normal
de ChsB con marcajes fluorescentes, decidimos reemplazar, en cada caso, el gen chsB silvestre
con los distintos transgenes.

Específicamente, construimos las siguientes cepas:

1. Marcaje en C-terminal: reemplazamos el gen endógeno chsB por genes quiméricos

chsB-gfp o chsB-mCherry, es decir, con la proteína fluorescente en C-terminal. Comprobamos
que estos derivados de ChsB no eran completamente funcionales, ya que las estirpes

Página 169
Resultados. Capítulo V
correspondientes, pese a ser viables, presentaron un crecimiento muy reducido y una
esporulación muy deficiente (Figura R.40C). En segundo lugar, para tener la copia wt además
de la fusión fluorescente, construimos cepas con chsB-gfp o chsB-mCherry como segunda
copia, integradas en tándem después del gen wt chsB. Estas nuevas cepas no presentaban
defectos de crecimiento, lo que demuestra que el efecto fenotípico nocivo de la fusión en C-
terminal con GFP o mCherry es recesivo. Finalmente, construimos otra cepa con el transgén

Figura R.40. Caracterización básica y marcaje fluoresente de ChsB. A. Representación

esquemática de ChsB. B. Test de crecimiento en medio completo (MCA) que muestra las
microcolonias del mutante chsBΔ después de 7 días de crecimiento a 37ºC. C. Test de crecimiento
que muestra la gran afectación de las cepas construidas para expresar ChsB marcado con GFP o
mCherry en el extremo C-terminal. D. Localización de las proteínas de fusión ChsB-GFP y GFP-
ChsB. E. Test de crecimiento donde se aprecia que el crecimiento de una cepa gfp-chsB es similar al
de una cepa silvestre.

Página 170
 Resultados. Capítulo V
chsB-gfp que se expresa bajo el control del promotor natural de chsB, sustituyendo al gen wA.
La integración de transgenes en el locus wA se usa frecuentemente en A. nidulans ya que las
cepas resultantes únicamente tienen un defecto en la pigmentación de las esporas, que en los
mutantes wAΔ son blancas en vez de verdes (wt) [152]. De este modo, se facilita el seguimiento
de la segregación del transgén en la progenie de cruces meióticos, ya que los descendientes que
contienen el transgén introducido en wA son blancos.

2. Marcaje en N-terminal: al contrario que con chsB-gfp, la expresión de gfp-chsB o

mcherry-chsB como única fuente de ChsB permitió un crecimiento indistinguible al de una cepa
wt a varias temperaturas (Figura R.40D). Por tanto, la proteína de fusión es suficientemente
funcional como para permitir un crecimiento similar al wt. También construimos una cepa con
mCherry-chsB y otra con gfp-chsB integrados en el locus wA, que presentaron crecimiento
silvestre. La localización subcelular de ChsB marcada con GFP en N o en C-terminal (funcional
y afuncional, respectivamente) era ligeramente diferente. ChsB-GFP se localiza en una región
más amplia de la membrana apical que GFP-ChsB y el citosol de la región subapical con la
primera es ligeramente más fluorescente que con la segunda (Figura R.40E). Dados estos
resultados, decidimos utilizar para todas las observaciones microscópicas y el resto de los
experimentos los transgenes gfp-chsB y mCherry-chsB integrados como copia única en el locus
chsB y, por tanto, las proteínas quiméricas expresadas bajo el control de su propio promotor
representaban la única fuente de ChsB.

Ambas proteínas (mCherry-ChsB y GFP-ChsB) presentaron una localización subcelular

idéntica (Figura R.41A).

ChsB reside en cuatro regiones subcelulares diferentes (Figura R.41B):

1) Estructuras citosólicas, polarizadas hacia el ápice de la hifa (para su caracterización ver más
adelante).

2) Algunos septos. (En otros estudios se ha propuesto que se localiza únicamente en los septos
en formación [28]).

3) Acumulación apical de vesículas secretoras. Dicha estructura característica de hongos

filamentosos se denomina Spitzenkörper. El Spitzenkörper consiste en una acumulación de
vesículas con identidad exocítica, a la espera de fusionarse con la membrana plasmática del
ápice [12].

4) Membrana apico-proximal, formando un casquete semiesférico en la punta de cada hifa que

se extiende unos 3-4 µm desde el ápice propiamente dicho. Esta localización es similar a la de la
sinaptobrevina SynA [12]. Co-visualizamos ChsB y SynA en una cepa doble fluorescente y
confirmamos que ambas proteínas colocalizan tanto en la membrana plasmática como en el
Spitzenkörper (Figura R.41C). El hecho de que ambas proteínas presenten la misma

Página 171
Resultados. Capítulo V
localización sugiere que utilizan rutas de transporte similares. La localización de ChsB en el
casquete apical sugiere que, una vez la enzima llega a la membrana en vesículas secretoras,
difunde alejándose del ápice; también sugiere que esta difusión está de algún modo restringida.
La restricción se produciría por endocitosis de ChsB en las regiones subapicales de la membrana
plasmática (Figura R.41C). Previamente, nuestro laboratorio había propuesto que la localización
polarizada de SynA se mantiene por reciclaje endocítico (Figura R.41C) [12, 157].

Figura R.41. Localización subcelular de ChsB A. Cultivo mixto de dos cepas que expresan GFP-
ChsB y mCherry-ChsB, respectivamente. La imagen se trata de una proyección máxima de imágenes
en el eje-z, sometidas a deconvolución. B. Localización de GFP-ChsB expresada en su locus bajo su
propio promotor, como única fuente de ChsB. Presenta una localización altamente polarizada hacia
los ápices de las hifas. Se localiza en la membrana apical, en el Spitzenkörper y en estructuras
intracelulares. C. GFP-SynA y mCherry-ChsB presentan una localización muy parecida, posiblemente
porque siguen rutas similares. Estas rutas podrían implicar reciclaje endocítico mediado por un anillo
de endocitosis subapical. Se trata de proyecciones máximas de varios planos en el eje z, sometidas
previamente a un proceso de deconvolución.

Página 172
 Resultados. Capítulo V
4.5.3. La localización polarizada de ChsB en la membrana plasmática se mantiene
por endocitosis
En este apartado demostraremos, utilizando múltiples abordajes, que la polaridad de
ChsB en la membrana plasmática requiere de su endocitosis en un anillo subapical
especializado.

En A. nidulans, la endocitosis juega un papel importante en el mantenimiento de la

polaridad de proteínas como SynA [12, 38, 157]. La maquinaria de endocitosis, formada por
parches de actina y sus proteínas accesorias, se concentra en un anillo subapical en las hifas
[190], anillo donde se concentran los parches de actina y se produciría la endocitosis de las
proteínas polarizadas, impidiendo su difusión más allá de esta barrera [12]. Un componente de
esta maquinaria de endocitosis es la proteína AbpA [190], que se une a F-actina. Para
determinar la localización relativa del casquete polar de ChsB y del collar endocítico co-
visualizamos GFP-ChsB y AbpA-mRFP. Como se aprecia en la Figura R.42A, la localización
de ChsB en la membrana plasmática coincide con la porción de membrana situada en posición
apico-proximal al anillo de endocitosis marcado con AbpA. De hecho, en películas en las que
visualizamos el crecimiento de las hifas, quedó patente que la extensión apical estaba
coordinada con la localización de AbpA-mRFP a una distancia constante del ápice, y con la
restricción en la localización de ChsB a la región anterior al anillo de endocitosis (vídeo
suplementario R.5). Para confirmar estas observaciones cuantificamos la fluorescencia relativa
de GFP-ChsB y mRFP-AbpA a lo largo de la membrana plasmática del casquete apical de 8
células (Figura R.42A). Esta cuantificación mostró que la reducción de la intensidad GFP-ChsB
en la membrana coincide espacialmente con la aparición de la señal de mRFP-AbpA. Estos
resultados sugerían que ChsB mantiene la polaridad en la membrana por un mecanismo en el
que se requiere la endocitosis mediada por parches de actina.

La droga latrunculina B (latB) provoca la despolimerización del citoesqueleto de actina

[228], desensamblando tanto los cables de actina como los parches endocíticos [190]. Esta
droga se ha utilizado para estudiar el bloqueo de la endocitosis en A. nidulans [172]. Tratamos
con latB (100 µM) hifas en cultivo y determinamos el efecto en la localización de GFP-ChsB.
El tratamiento con latB provocó una despolarización de la fracción de ChsB residente en la
membrana plasmática, lo que se manifieste en un significativo incremento del perímetro del
casquete apical ocupado por ChsB (Figura R.42B). Este resultado involucra claramente a la
endocitosis en la restricción de la localización de ChsB al casquete polar. Como control de
actividad normal de la droga, visualizamos, en un cultivo en paralelo, GFP-RabE, comprobando
el característico cambio en localización que esta proteína sufre como resultado de la eliminación
de los cables de actina [36].

Página 173
Resultados. Capítulo V

Figura R.42. Endocitosis y la polarización de ChsB en la membrana apical. A. Localización

relativa de GFP-ChsB y AbpA-mRFP y cuantificación de n=5 células, que demuestra que ChsB se
localiza, en la membrana plasmática (MP), en la región anterior al anillo endocítico. B. El tratamiento
con Latrunculina B, que inhibe la endocitosis mediante la despolimerización de actina, provoca una
pérdida de polarización de ChsB en la MP; cuantificación de n=15 células tratadas con la droga y
n=15 células sin tratar. C. El mutante fimAΔ presenta una pérdida total de polarización de ChsB. D.
La inhibición de la expresión de SlaB provoca un efecto similar al causado por fimAΔ. (Para detalles
sobre las cuantificaciones ver Materiales y Métodos).

Página 174
 Resultados. Capítulo V
Para confirmar la conclusión de que la endocitosis mantiene la polaridad de ChsB en la
membrana plasmática, utilizamos dos mutantes: fimAΔ y slaB1. fimA codifica la proteína
fimbrina (Sac6p en S. cerevisiae), cuya función es agrupar entre sí los filamentos de actina [229,
230]. Su deleción retrasa el establecimiento de la polaridad durante la germinación y afecta
severamente a la endocitosis [172, 231]. En las células fimAΔ, que presentan una morfología
alterada, ChsB, lejos de encontrarse polarizado, se distribuye homogéneamente en la membrana
plasmática (Figura R.42C). Por otro lado, slaB1 es un alelo de expresión condicional de SlaB,
una proteína esencial para el crecimiento de A. nidulans necesaria para la endocitosis [171]. Su
ortólogo en S. cerevisiae, Sla2p, regula la función de Arp2/3 durante el proceso de endocitosis
[232]. El alelo slaB1 dirige la expresión de SlaB bajo el control del promotor regulable niiAP
[171], que se induce con nitrato y se reprime con amonio. Por lo tanto, en presencia de amonio
como fuente de nitrógeno la endocitosis se bloquea y el crecimiento se detiene [171].
Cultivamos conidiosporas slaB1 en medio con amonio o nitrato. Las esporas provenían de
colonias cultivadas en medio con nitrato y, por lo tanto, contenían una carga inicial de SlaB que
permite su crecimiento, aunque limitado hasta que se “agota” la proteína, en amonio. En estas
condiciones (con amonio), donde la expresión de SlaB está reprimida, ChsB se encontraba
distribuida por toda la membrana plasmática (Figura R.42D). Por el contrario, en nitrato la
morfología celular fue normal y ChsB presentó localización polarizada (Figura R.42D). Estos
resultados, junto con la localización relativa de ChsB y AbpA y el efecto de la droga
Latrunculina B, nos permiten concluir que la endocitosis de ChsB en el anillo subapical de
parches de actina es necesaria para su polarización.

4.5.4. La ChsB intracelular se localiza en las cisternas más apicales del TGN
mRFP-PHOSBP se localiza en las cisternas del TGN, también llamado Golgi tardío [24].
Mediante la visualización simultánea de GFP-ChsB y mRFP-PHOSBP (Figura R.43A),
determinamos que los puntos citosólicos de ChsB colocalizan con las cisternas marcadas con
mRFP- PHOSBP. Por tanto, ChsB se encuentra aparentemente en las cisternas del TGN y no en el
Golgi temprano. Para confirmarlo, co-visualizamos mCherry-SedV y GFP-ChsB. SedV es una
proteína SNARE y un marcador prototípico del Golgi temprano [18]. Construimos una cepa que
expresaba GFP-ChsB y mCherry-SedV. Como muestra la Figura R.43A, las cisternas con ChsB
no se corresponden con las cisternas del Golgi temprano, marcadas con mCherry-SedV.

Para confirmar estas observaciones, cuantificamos la localización de ChsB tanto en el

TGN como en el Golgi temprano. Por una parte, determinamos que la proporción de cisternas
con PHOSBP marcadas también con ChsB era del 95% (179 cisternas de n = 10 células); además
determinamos el porcentaje de cisternas ChsB-positivas que también contenían PHOSBP, que fue
también del 95%. Por otra parte, hicimos lo mismo para SedV: la proporción de cisternas SedV-

Página 175
Resultados. Capítulo V
positivas con señal de ChsB fue del 8% (231 cisternas, n = 10 células) y la de cisternas ChsB
que tuviesen SedV fue del 13%. Parte de los resultados se muestran en la Figura R.43B. De este
análisis se concluye que ChsB se encuentra muy mayoritariamente en el TGN. Téngase en
cuenta que una pequeña proporción de cisternas con SedV contiene marcadores del TGN y que,
de igual manera, una pequeña parte de las cisternas PHOSBP contiene proteína de Golgi
temprano, debido a que se encuentran en un estadio intermedio del proceso de maduración [18].

Figura R.43. Localización subcelular de ChsB en las cisternas del Golgi. A. Izquierda,
covisualización de GFP-ChsB y mRFP-PHOSBP, marcador del TGN, donde se aprecia que ambas
proteínas colocalizan. Existe una mayor abundancia relativa de GFP-ChsB en las cisternas más
apicales del TGN. Derecha, localización relativa de GFP-ChsB y mCherry-SedV; ambas proteínas no
colocalizan. B. Cuantificación de la proporción de estructuras con ChsB y los marcadores del Golgi
(para detalle ver texto). ChsB se localiza mayoritariamenteen las cisternas del TGN. C. Eje y:
intensidad de fluorescencia de GFP-ChsB (verde) y mRFP-PHOSBP en las mismas cisternas del TGN.
Eje x: distancia de dichas cisternas al ápice celular. Existe una correlación negativa altamente
significativa entre la intensidad de ChsB y la distancia al ápice, correlación que no existe en el caso de
PHOSBP.

Página 176
 Resultados. Capítulo V
Tras determinar que ChsB se localiza en el TGN, observamos que su distribución no era
homogénea y que existía mayor señal fluorescente en las cisternas más apicales (Figura R.43A).
Realizamos una cuantificación de la fluorescencia de GFP-ChsB y mRFP-PHOSBP en 60
cisternas del TGN, localizadas en las 10 µm más apicales de un total de 6 células (Figura
R.43C). Mediante el análisis estadístico de correlación de Pearson [233], confirmamos que la
intensidad de GFP-ChsB en las cisternas del TGN correlaciona negativamente con la distancia
apical (P < 0.0001, r = -0.75, n = 60), correlación que no existe en el caso de mRFP-PHOSBP (P
= 0.536, n = 60). Por tanto, cuanto más apical es una cisterna del TGN más ChsB contiene; en
otras palabras, las cisternas apicales del TGN están enriquecidas con ChsB. Estos resultados
sugieren que aquellas cisternas más cercanas al anillo endocítico acumulan más ChsB,
probablemente porque recibirían más enzima proveniente de endocitosis, dado que los
compartimentos endosomales por los que ChsB circularía se formarían cerca del anillo de
endocitosis, en la región subapical, y por tanto se fusionarían preferentemente con las cisternas
más cercanas y “accesibles”. Estos datos indicaban que ChsB se recicla a la membrana
plasmática a través del TGN, en lugar de directamente desde un endosoma de reciclaje.

4.5.5. El transporte basípeto de ChsB requiere la función de la dineína

A la vista de la distribución desigual de ChsB en el TGN hipotetizamos que era posible
que existiese un paso de transporte en dirección basípeta que enviase ChsB desde un
compartimento endosomal —que recibiría tráfico del anillo de endocitosis— al TGN. En A.
nidulans los microtúbulos se disponen con su extremo (+) hacia el ápice de la hifa. Por lo tanto,
en el caso de depender de microtúbulos, el supuesto transporte basípeto de ChsB debería estar
mediado por la dineína citoplasmática, dado que es el único motor que viaja hacia el extremo (-)
de los microtúbulos.

Para investigar si se requiere dineína para el tráfico de ChsB desde un compartimento

endosomal a las cisternas del TGN utilizamos nudA2 y nudA5, dos mutantes termosensibles de
nudA, que codifica la cadena pesada de la dineína [15]. Como muestra la Figura R.44A, la
distribución de ChsB fue normal a 28ºC en nudA2 y nudA5. Sin embargo, cuando la temperatura
del cultivo se incrementó (lo que no afectó a la localización de ChsB en la cepa wt) ChsB se
deslocalizó progresivamente del casquete apical y marcó una estructura en la región
citoplasmática apical, aparentemente a expensas de la ChsB de la membrana plasmática. Este
compartimento es similar al compartimento donde se acumula SynA en situación de déficit de
dineína [157]. Con nudA2, demostramos que este compartimento en el que ChsB se acumula es
rápidamente accesible al marcador endocítico FM4-64. FM4-64 es un fluoróforo lipofílico que
se ha utilizado para seguir la internalización de membranas por endocitosis y su transporte a las
vacuolas, ya que tiñe, en pasos sucesivos, los diferentes compartimentos de la ruta endocítica

Página 177
Resultados. Capítulo V
[155]. En tan sólo 5 minutos desde la “carga” de FM4-64, éste accedió al “compartimento
nudA2” que contenía ChsB (Figura R.44B). Este resultado confirmó que el compartimento
anormal donde se acumula ChsB posee origen endocítico. Para descartar que dicho
compartimento tuviese identidad de endosoma tardío utilizamos el marcador CMAC (7-amino-
4-clorometil coumarin), que tiñe endosomas y vacuolas que ya han recibido el tráfico
biosintético de enzimas hidrolíticas del TGN [157]. Al contrario que el FM4-64, el CMAC no
marcó el compartimento donde se acumula ChsB, lo que demuestra que no tiene identidad de
endosoma tardío / vacuola.

Figura R.44. La dineína media el transporte basípeto de ChsB. A. A la izquierda, hipotético

modelo del transporte basípeto mediado por dineína y el efecto de su inactivación. La inactivación de
NudA por incremento de la temperatura de cultivo de los mutantes termosensibles nudA2 y nudA5
provoca una relocalización de GFP-ChsB desde la membrana apical a un compartimento subapical. A
la derecha se muestra la medida de intensidad de fluorescencia a lo largo de la hifa (linescan) de las
células mostradas. B. El compartimento donde se acumula ChsB al inactivarse NudA tiene naturaleza
endocítica, dado que se marca con FM4-64 en muy poco tiempo (la imagen corresponde a 14 minutos
después de la adición del colorante fluorescente).

Página 178
 Resultados. Capítulo V
En su conjunto, los resultados arriba explicados indican que ChsB es endocitada en el
anillo subapical de endocitosis y que viaja desde compartimentos endosomales al TGN, en un
proceso de reciclaje endocítico en el que participa la dineína.

4.5.6. ChsB reside en el TGN de manera transitoria

Una vez establecido que ChsB se localiza en las cisternas apicales del TGN, nos
propusimos averiguar su comportamiento a lo largo del tiempo. Realizando microscopía time-
lapse, con una resolución temporal de 1-2 imágenes por segundo, determinamos que GFP-ChsB
se localiza en las cisternas del TGN de manera transitoria. Mediante quimógrafos, derivados de
regiones de interés trazadas a través del eje longitudinal, en los que el eje y representa tiempo y
el eje x distancia, estudiamos la dinámica de ChsB. Las líneas verticales (Figura R.45A) reflejan
las cisternas del TGN a lo largo del tiempo de manera que la longitud de dichas líneas refleja el
tiempo de residencia de ChsB en dichas cisternas. El tiempo medio de residencia, basado en 36
eventos observados en un total de 20 células, fue de 58 ± 4 segundos (desviación estándar)
(Figura R.45B). Este tiempo medio representa más o menos la mitad de los 2 minutos de vida
media que previamente se había determinado para las cisternas del TGN [36]. Por tanto, este
resultado sugiere que el tiempo de residencia de ChsB en el TGN vendría delimitado por su
llegada a una cisterna preexistente y su salida en vesículas secretoras hacia la membrana
plasmática. Intentamos visualizar el tráfico de GFP-ChsB desde las cisternas del TGN a la
membrana plasmática. Sin embargo, la baja relación señal/ruido debida al gran predominio de
ChsB en la región del ápice nos impidió visualizar de manera directa este transporte.

Figura R.45. Presencia transitoria de ChsB en el TGN. A. Quimógrafo de una célula que expresa
GFP-ChsB. Se aprecian múltiples trazas con origen y final que corresponden a cisternas del TGN
marcadas con GFP-ChsB. B. Algunas trazas ampliadas que evidencian la presencia transitoria de
ChsB en el TGN. Se muestra la medición del tiempo de estancia de ChsB en un total de 36 cisternas.

Página 179
Resultados. Capítulo V
En A. nidulans, las cisternas del TGN, maduran a carriers exocíticos al adquirir la
GTPasa RabE, tras lo cual estos carriers viajan inmediatamente al ápice para su exocitosis [36].
En este proceso, las cisternas sufren cambios en su composición por los que pierden
gradualmente la identidad del Golgi, a medida que adquieren RabE [36]. Hipotetizamos que
ChsB utilizaría esta ruta y por tanto que la salida de ChsB del TGN coincidiría con el
reclutamiento de RabE. Para intentar averiguarlo, co-visualizamos mCherry-ChsB y GFP-RabE.
ChsB y RabE presentan poca colocalización, al igual que RabE y PHOSBP (Figura R.46A) [36].
Cofilmamos ChsB y RabE tomando una imagen por segundo, durante series temporales de 2
minutos. De este modo, visualizamos procesos aislados en que RabE se recluta al final de un
ciclo de mCherry-ChsB (Figura R.46B), sin embargo estos experimentos no fueron
completamente concluyentes debido a que la fotoinactivación de mCherry-ChsB hizo inviable el
acumular un número suficiente de estos eventos para realizar el necesario análisis cuantitativo.

En conclusión, ChsB se localiza en las cisternas del TGN de manera transitoria, con un
tiempo medio de estancia menor que el tiempo de vida de la cisterna, lo que indica que la
estancia de ChsB en el TGN es sólo temporal, en su viaje a la membrana plasmática.

4.5.7. La función de TRAPPII es necesaria para el tráfico de ChsB

Dada la dificultad técnica de co-visualizar RabERAB11 y ChsB durante la salida de las
vesículas secretoras del TGN nos centramos en un abordaje genético. La activación de RabE en
el TGN la realiza TRAPPII, que actúa como su GEF (guanine nucleotide exchange factor) [37].
hypA es un gen esencial que codifica Trs120, una de las subunidades específicas de TRAPPII
necesaria para la activación de RabE [37]. A temperatura restrictiva la mutación termosensible
hypA1 impide la activación de RabE, imposibilitando su reclutamiento a membranas [37]. Para
determinar el efecto de la inactivación de TRAPPII en el tráfico de ChsB, estudiamos por
microscopía la dinámica de GFP-ChsB en el mutante termosensible hypA1.

A 28ºC, la cepa hypA1 crece como una cepa silvestre y RabE presenta también una
localización wt [37]. hypA1 no afectó a la localización de ChsB a 28ºC (Figura R.46C). Por el
contrario, tras 25 minutos de subir la temperatura del cultivo a 37ºC ChsB desapareció de la
membrana plasmática y, más tarde, del Spitzenkörper en el mutante hypA1 —pero permaneció
“normal” en una cepa wt —, acumulándose en estructuras intracelulares (Figura R.46C). Este
resultado indica que RabE ciertamente se requiere para el tráfico de ChsB a la membrana
plasmática.

Página 180
 Resultados. Capítulo V

Figura R.46. Estudio de la relación de RabE y ChsB. A. Localización relativa de GFP-RabE y

mCherrry-ChsB que muestra la que ambas proteínas colocalizan en el Spitzenkörper. B. Procesos
aislados en que cisternas marcadas con mCherry-ChsB adquieren GFP-RabE, nunca hemos
visualizado el proceso contrario. C. Se muestra la deslocalización de GFP-ChsB de la membrana
plasmática por efecto de la inactivación de la subunidad Trs120 del complejo TRAPPII.

4.5.8. ChsB se acumula en el TGN por inactivación de Sec7

Snc1, El ortólogo de SynA en S. cerevisiae, viaja desde los endosomas al Golgi, para
después volver a la membrana plasmática [234]. Sin embargo, se ha demostrado recientemente
que existe otra ruta de reciclaje endocítico que no pasa por el aparato de Golgi, en la que la
exocitosis ocurre directamente desde los endosomas tempranos [41]. El cargo que viaja por esta
ruta directa no se acumula en el TGN en célula mutantes sec7-1 (Sec7 es la GEF de Arf1 en el

Página 181
Resultados. Capítulo V
TGN). Dado que nuestros resultados sugerían que ChsB está sujeto a un reciclaje endocítico a
través del TGN (Figura R.47A) utilizamos hypB5, una mutación termosensible en el gen que
codifica Sec7 (HypB) de A. nidulans [24]. hypB5 provoca, a temperatura restrictiva, la parada
de la secreción apical [18].

Figura R.47. Bloqueo de ChsB en el TGN por inactivación de Sec7/HypB. A. Modelo de trabajo
de la ruta de reciclaje endocítico seguida por ChsB y otras enzimas modificadoras de la pared celular.
B. Localización de mCherry-ChsB y el marcador del TGN GFP-TlgB en una cepa wt y en hypB5 a
28ºC. No existen diferencias apreciables entre ambas cepas a esta temperatura. Al incrementar la
temperatura a 37ºC en la cepa wt la localización de ambas proteínas permanece inalterada. C. En el
mutante hypB5, después de un cambio de temperatura a 37ºC, en poco tiempo mCherry-ChsB se
acumula en estructuras intracelulares que corresponden a las cisternas del TGN marcadas con GFP-
TlgB. En la ampliación se aprecia el alto grado de colocalización entre mCherry-ChsB y GFP-TlgB.
(Todas las imágenes corresponden a proyecciones máximas de planos en el eje z después de haber
sido procesadas mediante deconvolución).

Página 182
 Resultados. Capítulo V
ChsB presentó una localización normal en el mutante hypB5 a 28ºC (Figura R.47B). Sin
embargo, al incrementar la temperatura a 37ºC, ChsB se deslocalizó en un tiempo de tan sólo 15
minutos del casquete apical y del Spk y pasó a estructuras intracelulares (Figura R.47C).
Mediante co-visualización de ChsB y TlgB confirmamos que las estructuras intracelulares
donde se acumula ChsB corresponden a membranas del TGN, ya que también contienen TlgB
(Figura R.47C). Como control se confirmó que en una cepa wt el cambio de temperatura de
28ºC a 37ºC no altera la localización ni de ChsB ni de TlgB (Figura R.47B).

En resumen, ChsB se acumula en las cisternas del TGN después de la inactivación de

Sec7. Globalmente, los resultados indican firmemente que la localización de ChsB en la
membrana apical se mantiene por reciclaje endocítico a través de las cisternas apicales del TGN,
cuya función depende de Sec7 (HypB).

4.5.9. La mutación geaA1 restaura la localización silvestre de ChsB en el mutante

hypB5
Como se demuestra en el capítulo III, geaA1 codifica una versión mutante de la GEF
GeaA (Gea1 en S. cerevisiae), que remedia tanto la termosensibilidad de hypB5 como la
letalidad de hypBΔ. Para determinar si geaA1 suprime el requerimiento de HypB para la
localización de ChsB en la membrana plasmática construimos una cepa mutante hypB5 geaA1-
gfp mCherry-chsB. A 28ºC, ChsB se localizó como en la cepa silvestre (Figura R.48A). Las
cisternas intracelulares donde se encontraba ChsB no se correspondían con las marcadas con
GFP-GeaA1 (que predomina en el Golgi temprano), lo que indica que ChsB se localiza en las
cisternas del TGN también en el fondo genético geaA1, como ocurre normalmente. Al
incrementar la temperatura del cultivo, no se alteró la localización de ChsB, que permaneció en
el casquete apical en el doble mutante geaA1 hypB5 (Figura R.48B), al contrario de lo que
ocurre con el mutante simple hypB5, en el que ChsB se acumula en cisternas intracelulares
(Figura R.48B), como se discutió en el apartado anterior.

Por otro lado observamos que a 37ºC ChsB tampoco colocalizó en el Golgi temprano
con GeaA1 en la cepa hypB5 geaA1-gfp mCherry-chsB (Figura R.48B). Esto sugiere que el
mecanismo de supresión no está mediado por el reciclaje de ChsB desde cisternas del Golgi
temprano, hipotéticamente promovido por geaA1.

En cualquier caso, estos resultados demuestran que el alelo geaA1 suprime el

requerimiento de HypB para el reciclaje de ChsB [12]. Por lo tanto, refuerzan la implicación
directa de la GEF Sec7/HypB en la localización de ChsB en la membrana apical.

Página 183
Resultados. Capítulo V

Figura R.48. Supresión por geaA1 de la deslocalización de ChsB causada por hypB5. A. ChsB
presenta una localización nativa a 28ºC tanto en un mutante hypB5 como en el mutante doble hypB5
geaA1-gfp. B. Al incrementar la temperatura a 37ºC, mCherry-ChsB se relocaliza a las cisternas del
TGN en la cepa hypB5, mientras que permanece en la membrana plasmática en el doble mutante. En
ningún caso ChsB y GeaA1 colocalizan en las cisternas del Golgi, lo que sugiere que ChsB se
encuentra en el TGN en estas condiciones. Las imágenes son proyecciones máximas en el eje z
sometidas a un proceso de deconvolución.

4.5.10. RabO (RAB1) se requiere para el tráfico de ChsB

La función de RAB1/Ypt1 (RabO en A. nidulans) se ha circunscrito a la regulación del
tráfico de llegada al aparato de Golgi desde el retículo endoplasmático (RE). Sin embargo,
recientemente se ha determinado su localización en A. nidulans y Neurospora crassa, y se ha
observado que, además de encontrarse en el Golgi temprano, se localiza también en el
Spitzenkörper, la prototípica estructura exocítica de los hongos filamentosos [18, 235]. De
hecho, se ha propuesto que RabO podría regular la fusión de vesículas con la membrana
plasmática, lo que sería una función novedosa para esta GTPasa [184]. Nosotros confirmamos
que ChsB y RabO colocalizan en el Spitzenkörper (Figura R.49A).

Página 184
 Resultados. Capítulo V

Figura R.49. La función de la GTPasa RabO (RAB1) es necesaria para el tráfico de ChsB. A.
GFP-ChsB y mCherry-RabO colocalizan en el Spitzenkörper. B. Test de crecimiento que muestra la
interracción sintética negativa entre los alelos y rabOts gfp-chsB a 25ºC y 30ºC (a 37ºC y 42ºC el
mutante rabOts es inviable). C. Control wt que muestra la localización de ChsB a 28ºC y 37ºC. D.
Rápida relocalización de GFP-ChsB desde la membrana apical a estructuras intracelulares por efecto
de la inactivación de RabO. Debajo de cada imagen a 37ºC se muestra el tiempo transcurrido en
horas:minutos desde el incremento de temperatura. Todas las imágenes son proyecciones de las
intensidades máximas de varios planos en el eje z y han sido procesadas por deconvolución.

Para determinar la posible implicación de RabO en el tráfico de ChsB utilizamos el

mutante termosensible rabOts [18, 166]. Al obtener la cepa gfp-chsB rabOts mediante
cruzamiento meiótico, comprobamos que el marcaje con GFP de ChsB y la mutación
termosensible de rabO presentan un efecto sintético negativo, apreciándose un crecimiento
notablemente inferior de la cepa “doble mutante” en relación a los “mutantes simples” a las
temperaturas de 25ºC y 30ºC, permisivas para rabOts (Figura R.49B). La localización de GFP-

Página 185
Resultados. Capítulo V
ChsB estaba afectada en rabOts incluso a 28ºC, ya que detectamos a dicha temperatura un
incremento de fluorescencia intracelular, aparentemente a expensas de la fluorescencia del
casquete apical (Figura R.49C-D). Después de 20 minutos tras cambiar la temperatura a 37ºC no
se detectó ChsB en la membrana apical, sino en puntos intracelulares, efecto que no se produjo
en una cepa wt (Figura R.49C-D). Estos resultados demuestran que se requiere RabO para la
localización de ChsB en la membrana apical, pero no ahondan en si este requerimiento procede
del papel de RabO en el Golgi o de una hipotética función en el Spitzenkörper. Sin embargo, la
interacción sintética detectada y la rápida deslocalización de ChsB del casquete polar sugieren
que RabO podría realizar una función “post-Golgi” en el tráfico de ChsB.

4.5.11. La ausencia de la subunidad Chs5 del exómero no altera el tráfico de ChsB

En S. cerevisiae, la proteína Chs5p forma parte de un complejo oligomérico
denominado exómero, que se requiere para el tráfico del TGN a la membrana plasmática de la
quitina sintasa Chs3p y de otras proteínas [56]. Delecionamos el ortólogo de CHS5 en A.
nidulans (AN8710≡chs5) y comprobamos que las cepas chs5Δ no presentan defectos ni en el
crecimiento ni en la localización de ChsB (ver Figura R.50A). Estos datos indican que el
exómero no está implicado en el tráfico de ChsB.

Figura R.50. Localización de ChsB en los mutantes dnfAΔ, dnfBΔ, chs5Δ y synAΔ. A. dnfAΔ y
chs5Δ no afectan a la localización de ChsB, mientras que la deleción de dnfA provoca una ligera
deslocalización de ChsB. A la izquierda, test de crecimiento en medio completo (MCA) del mutante
chs5Δ y una cepa wt. B. synAΔ no altera la distribución de GFP-ChsB. Todas las imágenes son
proyecciones máximas en el eje z y las de A han sido sometidas a deconvolución.

Página 186
 Resultados. Capítulo V
4.5.12. Implicación de la actividad flipasa en el tráfico de ChsB
Las rutas que conectan el TGN con la membrana plasmática presentan la particularidad
de que no parecen necesitar de proteínas de cubierta para deformar la membrana del TGN y
formar las vesículas de secreción. Existe cierta evidencia de que la composición lipídica,
específicamente los dominios enriquecidos en esfingolípidos y esteroles, y la distribución
asimétrica de determinados fosfolípidos en la membrana del TGN contribuyen a la biogénesis
de las vesículas o carriers de secreción [98, 184, 236]. Por ello determinamos el efecto en ChsB
de la deleción de las flipasas DnfA y DnfB [173]. DnfA presenta una localización similar a
ChsB y, de hecho, se endocita en el anillo subapical de parches de actina [173]. La deleción de
dnfA afectó débilmente a la localización de ChsB, cuya distribución en la membrana apical
estaba alterada y abarcaba una menor superficie en el casquete polar (Figura R.50A). Esto
sugiere que la flipasa DnfA pudiera jugar un papel en el tráfico de ChsB. Por el contrario, la
deleción de dnfB (DRS2 en S. cerevisiae) no alteró la localización de ChsB (Figura R.50A).

4.5.13. La sinaptobrevina SynA no se requiere para el tráfico de ChsB

Pese a que se ha propuesto que SynA (homóloga de Snc1p en levadura) es la v-SNARE
implicada en la fusión de las vesículas exocíticas con la membrana plasmática [12], hemos
demostrado recientemente que la deleción de synA no afecta al crecimiento (Manuel S. López-
Berges, sin publicar). Visualizamos GFP-ChsB en una cepa synAΔ y comprobamos que su
distribución no estaba alterada (Figura R.50B). Por lo tanto, la función de SynA no se requiere
para la exocitosis ni para el reciclaje endocítico de ChsB, pese a circular, aparentemente, por la
misma ruta.

4.5.14. ChsB recicla al TGN desde un compartimento endosomal localizado aguas

arriba del dominio RabB (RAB5)
RabB (RAB5) es la Rab principal de los endosomas tempranos y una GTPasa clave en
el proceso de maduración endosomal, dado que recluta la enzima fosfatidil inositol-3-fostafo
(PtdIns3P) kinasa Vps34, que se requiere, a través de la síntesis de PtdIns3P, para la iniciación
de la ruta de los cuerpos multivesiculares [158]. También recluta a los endosomas al complejo
CORVET, que media eventos de fusión en los endosomas, y a los motores para el transporte de
estos endosomas tempranos en microtúbulos [157, 158, 166, 237-239] (Figura R.51A). Por lo
tanto, si ChsB reciclase al TGN desde endosomas tempranos RabB/RAB5+, la deleción de rabB
afectaría considerablemente su localización. Para averiguarlo construimos la cepa gfp-chsB
rabBΔ y determinamos que ChsB se localiza normalmente en ausencia de RabB (Figura
R.51B). Este resultado indica que el compartimento endosomal desde el que ChsB recicla al

Página 187
Resultados. Capítulo V
TGN se encuentra aguas arriba de los endosomas que contienen PtdIns3P y ESCRT.
Hipotéticamente, este compartimento podría corresponder al denominado endosoma post-Golgi,
propuesto por Pelham y colaboradores [240].

Para confirmar el resultado obtenido con rabBΔ, utilizamos un mutante termosensible

(hbrA2 ≡ vps33ts) del gen que codifica la proteína SM (Sec1/Munc18-like) denominada Vps33,
que es una de las subunidades del complejo CORVET [166]. Este mutante es inviable a 42ºC.
Tanto a temperatura permisiva (28ºC), como después de un cambio a restrictiva (>1.5 horas a
42ºC), ChsB no varió su localización (Figura R.51B). Este resultado confirma que el reciclaje
de ChsB es independiente de los “endosomas RabB/RAB5+” en el reciclaje de ChsB. Nótese
que tanto rabBΔ como vps33ts impiden la secreción de inulinasa por una ruta independiente a la
de ChsB (ver capítulo VI).

Figura R.51. Las funciones endosomales relacionadas con RabB (RAB5) no se requieren para el
tráfico de ChsB. A. Esquema que representa los efectores reclutados por RabB. A la izquierda, las
distintas subunidades del complejo CORVET. Los mutantes utilizados afectan a Vps33 y RabB, que
presentan un círculo rojo en el esquema. B. Microscopía de fluorescencia que muestra la “localización
wt” que presentan el mutante rabBΔ y el mutante termosensible vps33ts a 28ºC y después de 1.5 horas
a 42ºC. Todas las imágenes corresponden a una proyección de las intensidades máximas de planos en
el eje z. En el experimento con vps33ts, las imágenes han sido sometidas a deconvolución.

Página 188
 Resultados. Capítulo V
4.5.15. El reciclaje de ChsB depende críticamente de RabC y GARP
Para investigar la ruta que transporta ChsB desde los endosomas al TGN, nos centramos
en Rab6 (RabC en A. nidulans), un regulador clave del tráfico retrógrado que conecta los
endosomas con el aparato de Golgi [241]. A 28ºC, la deleción de rabC [38] afectó gravemente
la localización de ChsB (Figura R.52A), disminuyendo la cantidad de ChsB que se localiza en la
membrana apical. Además, también provocó la presencia de fluorescencia citosólica difusa, que
posiblemente corresponde a vesículas incapaces de fusionarse con su compartimento de destino.
Estas observaciones implicaron a RabC en el reciclaje de ChsB. El principal candidato a mediar
este rol de RabC es el complejo GARP (Golgi-associated retrograde protein). El complejo
oligomérico de tethering o anclaje GARP está formado por cuatro subunidades diferentes,
denominadas Vps51, Vps52, Vps53 y Vps54. GARP se asocia con la cara citosólica del TGN y
reconoce el tráfico proveniente de los endosomas, para su incorporación al aparato de Golgi
[242, 243]. Este complejo, en S. cerevisiae, se localiza en el Golgi por interacción con Ypt6
(Rab6 en mamíferos, RabC en A. nidulans) a través de Vps52 [244]. Para averiguar si GARP
está implicado en el tráfico de ChsB, estudiamos el mutante vps52Δ. vps52Δ forma colonias
pequeñas y a nivel celular tiene un claro defecto morfogenético patente por sus hifas
engrosadas, además de presentar vacuolas pequeñas y numerosas (Ignacio Bravo Plaza, sin
publicar) (en estos aspectos fenotípicos se asemeja al mutante rabCΔ [38]). Como en rabCΔ
(i.e. rab6Δ), la localización de ChsB en vps52Δ está alterada: ChsB marca de manera difusa el
interior celular y presentaba menor fluorescencia en la membrana apical que la cepa wt (Figura
R.52B).

Hipotetizamos que en el mutante vps52Δ, debido a una eficiencia de transporte entre los
endosomas y el TGN reducida, el tráfico de ChsB se desviaría hacia la ruta de degradación
endocítica, aumentando así el transporte de ChsB a las vacuolas. Para examinar dicha
posibilidad, explotamos el hecho de que A. nidulans crece más rápidamente a 37ºC que a 28ºC,
lo que debe de requerir una mucho mayor eficiencia del reciclaje endocítico para mantener
polarizada ChsB en los sitios de crecimiento. Por tanto, incrementamos la temperatura de un
cultivo de células vps52Δ de 28ºC a 37ºC, en paralelo a un cultivo silvestre y otro rabCΔ. Tanto
en el mutante rabCΔ como en vps52Δ, ChsB perdió su localización en el casquete apical y el
Spitzenkörper, y se relocalizó a vacuolas (Figura R.52C), tal como confirmamos, en el caso de
vps52Δ, mediante tinción con CMAC (Figura R.52C). Estos resultados sugieren que el tethering
de GARP dependiente de RabC es necesario para el reciclaje eficiente de ChsB.

Página 189
Resultados. Capítulo V

Figura R.52. Alteración del tráfico de ChsB causado por la ausencia de GARP o de RabC
(RAB6). A. En el mutante rabCΔ GFP-ChsB presenta una localización deficiente a 28ºC y una
relocalización a vacuolas cuando la temperatura del cultivo se eleva a 37ºC. B. La localización de
ChsB en la membrana apical está afectada en vps52Δ. C. Al incrementar la temperatura, se reduce la
cantidad de ChsB en la membrana plasmática y se relocaliza en numerosas vacuolas, teñidas con el
colorante fluorescente CMAC. Las imágenes son proyecciones de intensidades máximas de varios
planos en el eje z y han sido procesadas mediante deconvolución.

Página 190
 Resultados. Capítulo V
4.5.16. En hifas silvestres, la síntesis de novo de ChsB no parece contribuir en gran
medida a mantener sus niveles estacionarios
Hipotetizamos que la gran mayoría de ChsB que está presente en el TGN provendría del
reciclaje desde la membrana plasmática y no de la ruta biosintética. Para averiguar la posible
contribución de la síntesis de novo al pool de ChsB nos propusimos bloquear la salida de dicha
proteína del RE con la mutación termosensible sarA6. sarA6 impide la salida del RE tanto de la
endoglucanasa EglC (capítulo VII) como de la enzima inulinasa (capítulo VI). Como se muestra
en la Figura R.53A-B, a 28ºC sarA6 no afectó a la localización de ChsB. Al incrementar la
temperatura del cultivo para bloquear la salida de proteínas del RE, ChsB siguió detectándose
en el casquete apical durante los primeros 30 minutos y no se detectó en el RE. Después de 40-
50 minutos del incremento de temperatura en sarA6, el aparato Golgi está totalmente
desorganizado (Figuras R.7 y R.8). En este tiempo, siguió sin detectarse ChsB en el RE aunque
se apreció un efecto leve en la localización de ChsB, que ya no se localizaba nítidamente en el
Spk y que, aunque permanecía polarizado en la membrana plasmática, el casquete apical se
redujo claramente (Figura R.53A). El marcador del TGN TlgB no marca cisternas en estos
tiempos (Figura R.8A) y, sin embargo, ChsB también se localiza en estructuras intracelulares.
No hemos determinado la identidad de estas estructuras. A partir de 1 hora a 37-38ºC, las hifas
comenzaron a lisarse. Incluso en estos tiempos no llegamos a detectar ChsB en el RE (Figura
R.53A). Estas observaciones apoyan la idea de que la ChsB detectada en condiciones normales
en el TGN no procede de nueva síntesis, sino de reciclaje endocítico.

Si las células sarA6 se incuban a 37ºC durante suficiente tiempo, la región apical de la
membrana plasmática crece isotrópicamente hasta formar un globo característico (Figura R.10).
En estas condiciones, se puede estudiar el efecto de un bloqueo crónico, aunque probablemente
parcial, de la salida de tráfico del RE. De hecho, en estas condiciones SynA, que en condiciones
normales colocaliza con ChsB en la membrana plasmática (Figura R.40D), se encuentra
exclusivamente en el RE (Figura R.12A). Para estudiar si ChsB se comportaba igual, formamos
estos globos apicales en una cepa sarA6 gfp-chsB. Sin embargo, en este estadio ChsB no se
localizó en el RE; por el contrario, estaba mayoritariamente en la membrana de los globos,
incluso después de 5 horas de cambiar la temperatura (Figura R.53C), así como en “parches” en
la membrana de las hifas. Esta localización en globos y parches coincide con los
engrosamientos de la pared celular descritos en el capítulo I (Figura R.11A). Para confirmar que
hay acumulación de proteínas en el RE en las condiciones en que ChsB no se detectó en dicho
orgánulo, co-visualizamos SynA y ChsB en un mutante sarA6. En el estadio de globos SynA se
localizaba claramente en el RE y ChsB en la membrana de los globos (Figura R.53C).

Finalmente consideramos otras dos posibilidades. La primera que el aporte biosintético

de ChsB fuese normalmente alto, pero que en el mutante sarA6 la ChsB de nueva síntesis se

Página 191
Resultados. Capítulo V
degrada al inactivar la salida del RE, por ejemplo como resultado de la activación de la ruta de
estrés de pared. La segura posibilidad es que se interrumpiera la síntesis de ChsB por motivos
similares, de manera que ChsB no se acumulase en el RE. Por ello determinamos por western-
blot los niveles de ChsB en sarA6 a las temperaturas permisiva y restrictiva. Como muestra la
Figura R.53D, sarA6 no afectó a los niveles de ChsB ni a 30ºC ni a 39ºC, lo que no concuerda
con ninguno de estos dos escenarios. Por ello concluimos que la ausencia de acumulación de
ChsB en el RE en el mutante sarA6 indica que la aportación de la ruta biosintética es baja, y que
la proteína que se localiza en el casquete procede de la enzima cautiva en el ciclo de reciclaje
endocítico.

Figura R.53. Efecto de sarA6 en ChsB. A. Seguimiento temporal del efecto de sarA6 sobre GFP-
ChsB después de una subida de temperatura. B. GFP-ChsB en una cepa wt. C. mCherry-ChsB y GFP-
ChsB en un balloon formado por el efecto después de 2.5 horas de sarA6 a 37ºC. SynA se localiza en
las membranas del retículo endoplasmático, mientras que ChsB se encuentra en la superficie celular.
D. Western-blot para detectar los niveles de ChsB a 30ºC y 39ºC en una cepa wt y en el mutante
sarA6.Cultivamos durante 16 horas las cepas gfp-chsB y sarA6 gfp-chsB a 30ºC. Después, cambiamos
a 39ºC durante 1.5 horas un cultivo de cada tipo, a la vez que recogíamos el micelio de cultivos
idénticos, como control de 30ºC. Todas las imágenes de microscopía de esta figura son proyecciones
máximas de planos en el eje z previamente sometidos a deconvolución.

Página 192
Capítulo VI
 Resultados. Capítulo VI

4.6. Capítulo VI. Estudio de la ruta de secreción de una

enzima soluble: InuA
Con la idea de que diferentes proteínas pudiesen seguir rutas de secreción distintas,
decidimos estudiar el camino seguido por una proteína soluble. Para ello, elegimos la enzima
extracelular codificada por AN11778 [245], la cual se ha descrito previamente como una
invertasa, es decir, catalizadora de la conversión de sacarosa en glucosa y fructosa [246]. Esta
proteína presenta tres ventajas experimentales: (i) tiene gran homología con la exo-inulinasa
InuE de Aspergillus awamori, cuya estructura tridimensional está disponible (código protein
data bank: Q96TU3) [247]; (ii) contiene un péptido señal canónico y se ha determinado
experimentalmente el sitio de corte de la proteasa, entre Ala18 y Leu19 [245]; y (iii) está
extensamente glicosilada [245]. La idea subyacente de que los diferentes estados de
glicosilación podrían servir para determinar en qué nivel de la ruta secretora se encontraría
bloqueada esta enzima, en mutantes con bloqueos del tráfico exocítico, dado que en su paso por
el retículo endoplasmático (RE) y el aparato de Golgi las proteínas adquieren patrones de
glicosilación diferenciados [4, 248]. Denominamos inuA al gen AN11778 y, a su vez, InuA a la
proteína que codifica, por su gran homología con InuE de A. awamori.

4.6.1. InuA es una inulinasa esencial para el crecimiento en inulina

InuA tiene una identidad de secuencia del 54.9% y una similitud del 80.7% con la exo-
inulinasa InuE, de Aspergillus awamori (Figura R.54) [247]. La conservación es casi total en las
región correspondiente al dominio catalítico y ligeramente inferior en el dominio C-terminal [las
diferencias principales se encuentran en el péptido señal y en la unión entre los dos dominios
(Figura R.54)]. Por otro lado, InuA tiene sólo una identidad del 30.5% y una similitud de 60.3%
con Suc2p de S. cerevisiae (Figura R.54). Esto sugirió que el sustrato fisiológico de la enzima
codificada por AN11778 es el polisacárido inulina. Sin embargo, InuA es activa también sobre
sacarosa y, por ello, fue previamente clasificada como una invertasa [245]. Esta paradoja puede
ser explicada por el hecho de que las inulinasas también presentan actividad catalítica sobre
sacarosa [249]. Para verificar nuestra predicción, delecionamos el gen y probamos el
crecimiento de la cepa inuAΔ en diferentes fuentes de carbono. La deleción de inuA no afectó al
crecimiento en glucosa o sacarosa, pero impidió el crecimiento en inulina (Figura R.55),
indicando que InuA es una inulinasa que también tiene actividad β-fructofuranosidasa sobre
sacarosa.

Página 195
Resultados. Capítulo VI

F20

Q372

R382

N537

Figura R.54. Alineamiento de InuA de A. nidulans, InuE de A. awamori y Suc2 de S. cerevisiae.

En rojo, conservación total, en gris los residuos conservados. El rectángulo marca el péptido señal
predicho por SignalP 4.1 y la línea punteada el sitio de corte predicho y determinado
experimentalmente [245]. La línea verde señala los residuos que forman parte del dominio catalítico
de InuE (F20-Q372) y la línea azul indica la región correspondiente al dominio C-terminal de dicha
proteína (R382-N537).

4.6.2. Detección de las formas intracelulares y extracelulares de InuA mediante su

etiquetado con HA3
Para monitorizar la ruta exocítica seguida por InuA mediante western-blot, diseñamos
inicialmente dos quimeras génicas que codifican distintas versiones de InuA etiquetadas con
tres copias del epítopo hemaglutinina (HA3). Ambas se expresan bajo el control del promotor
constitutivo y moderadamente fuerte gpdAmini y se integraron en copia única en el locus pyroA
[24], mediante corrección de la mutación pyroA4. Una de ellas expresa InuA marcada con HA3
en C-terminal y, la otra, en N-terminal (corriente abajo del péptido señal). Específicamente en la
quimera “N-terminal”, introdujimos HA3 después de los 25 primeros aminoácidos, basándonos
en las predicciones de péptido señal hechas por SignalP 4.1 y en la determinación de la
secuencia N-terminal de la proteína madura [245]. Mediante western-blot con un anticuerpo
anti-HA, comprobamos que ambas proteínas de fusión presentan un patrón electroforético
similar (Figura R.56). Esto se cumplió tanto en el caso de un extracto proteico de micelio como
en el caso del medio de cultivo (Figura R.56). Una vez comprobado que ambas quimeras se

Página 196
 Resultados. Capítulo VI
comportaban de manera similar, elegimos la etiquetada en C-terminal para los experimentos
posteriores.

Figura R.55. Crecimiento en diferentes fuentes de carbono. Test de crecimiento en medio mínimo
al que se le ha sustituido el amonio tartrato por amonio sulfato y se ha mantenido la glucosa 1% o se
ha sustituido por sacarosa 1%, inulina 1%. En el último caso no se ha añadido fuente de carbono.
Como se puede apreciar, después de 7 días a 30ºC, el crecimiento de la cepa inuAΔ en inulina es
idéntico al que ocurre sin fuente de carbono incapaz, mientras que las estirpes wt y inuA-HA crecen y
esporulan.

Figura R.56. Patrón eletroforético de InuA-HA y HA-InuA. No existen diferencias apreciables en

el patrón electroforético correspondiente al micelio ni en el del medio extracelular.

Página 197
Resultados. Capítulo VI
Primeramente, monitorizamos por western-blot la secreción de InuA-HA al medio de
cultivo. Para ello, precultivamos las células durante 16 horas, recogimos el micelio y lo
utilizamos para inocular matraces con medio fresco. Incubamos estos matraces durante 1-3
horas adicionales tanto a 30ºC como a 37ºC. Después de separar el micelio y el medio por
filtración, precipitamos las proteínas del medio extracelular con ácido tricloracético y las
analizamos mediante PAGE-SDS y western-blot (Figura R.57). Detectamos InuA-HA secretada
de novo después de 30 minutos y, con mucha mayor intensidad, después de 1 hora (Figura
R.57A). La inulinasa secretada migra como una mancha poco definida (smear) en un rango que
va de 80 kDa a más de 250 kDa. Destacando en el smear se podían apreciar tres bandas muy
heterogéneas, con movilidades correspondientes a ~80-85 kDa, ~150 kDa y, una tercera, con
una movilidad muy inferior a 150 kDa (asteriscos en la Figura R.57A). En otras palabras, la
mayoría de InuA-HA secretada presenta una movilidad muy baja, lo que indica que la inulinasa
extracelular está altamente glicosilada (el peso molecular de la enzima sin glicosilar es de ~65
kDa). También detectamos un cambio en la movilidad de InuA-HA extracelular a lo largo del
tiempo, posiblemente por cambios en su contenido en glicanos, dependientes de la “edad” del
cultivo (Figura R.57A). Dicha variación temporal había sido detectada previamente [245].

En segundo lugar, analizamos la inulinasa asociada a las células, es decir, dentro de los
límites de la pared celular, mediante extractos proteicos de micelio. Para obtener los extractos
proteicos, realizamos una lisis alcalina del micelio liofilizado, seguida de una precipitación con
ácido tricloracético. Después neutralizamos el precipitado y lo resuspendimos en tampón
Laemli. De este modo, pudimos analizar InuA del micelio a partir de extractos de proteína total
donde se minimizaba la posible degradación de proteínas resultantes de la manipulación de los
extractos in vitro. Por western-blot detectamos una banda prominente con una movilidad de ~80
kDa (Figura R.57B). Mediante el uso de geles más largos pudimos resolverlo en cuatro bandas
diferentes (Figura R.57C), a las que denominamos GB1-GB4 (de glicosilación basal). Además
de las formas GB, en el western-blot detectamos un smear de bandas, que denominamos GA (de
glicosilación abundante). Estas formas GA parecen coincidir en movilidad con la inulinasa
secretada. Gracias a exposiciones largas de los western-blots, también detectamos bandas con
mayor movilidad que las bandas GB (Figura R.57C). La bandas de este tipo predominantes
corresponden a un doblete, con una movilidad consistente con InuA-HA carente péptido señal y
sin otras modificaciones postraduccionales (~65 kDa), atribuible al producto primario de
traducción una vez importado al RE previamente a su glicosilación. En el doblete una de las
bandas es minoritaria y podría corresponder a InuA en la que la proteasa señal hubiera cortado
el péptido señal en un enlace distinto del preferente.

Página 198
 Resultados. Capítulo VI

Figura R.57. Caracterización del patrón electroforético de InuA-HA. A. InuA-HA secretada al

medio extracelular en un tiempo de 30 min hasta 3 horas. Los asteriscos indican bandas mayoritarias.
B. InuA-HA expresada bajo el promotor gpdAmini, se trata de un extracto proteico de micelio mediante
lisis alcalina (ver Materiales y Métodos). Corresponde al mismo experimento que en A. C. Patrón
electroforético de InuA-HA procedente de micelio. Se trata de dos exposiciones diferentes de una
misma película. Se aprecian las cuatro bandas correspondientes a GB; InuA-HA con todo el rango de
movilidades que corresponde a GA; así como InuA con mayor movilidad que GB, donde predomina
una banda que corresponde a la movilidad de InuA-HA sin glicosilar. Los asteriscos indican las
bandas intermedias entre GB y el doblete de mayor movilidad.

4.6.3. Regulación de la expresión de InuA mediante el uso de sacarosa

Previamente se había determinado que la expresión de InuA se puede inducir con
sacarosa [250]; por tanto, nos propusimos aprovechar esta regulación natural de su expresión.
Esto sería ventajoso en nuestros experimentos, dado que podríamos inducir la expresión de la
inulinasa después de interrumpir condicionalmente un paso específico de la ruta secretora
(Figura R.58A). De este modo, toda la inulinasa presente en la célula habría sufrido dicho
bloqueo, sin existir proteína InuA sintetizada, glicosilada y transportada previamente que
pudiese enmascarar el análisis. Por lo tanto, realizamos un reemplazamiento el gen inuA original
por una versión que expresa la proteína marcada con HA3 en C-terminal, manteniendo la región

Página 199
Resultados. Capítulo VI
promotora natural del gen. Probamos que esta versión InuA-HA era funcional, tras confirmar
que la cepa obtenida es capaz de utilizar inulina como fuente de carbono (Figura R.55).
Además, confirmamos que, efectivamente, la expresión de InuA-HA se puede controlar con la
fuente de carbono: si las células transformantes se cultivan en medio con sacarosa la expresión
es notablemente mayor que si se cultivan con glucosa. De hecho, la expresión se induce
drásticamente en menos de 1.5 horas, tras cambiar el medio de cultivo con glucosa por uno con
sacarosa (Figura R.58B).

Figura R.58. Pruebas de inducción de InuA con diferentes fuentes de carbono. A. Esquema
general de los experimentos de inducción, combinados con mutaciones o drogas, llevados a cabo, en
este trabajo, con InuA-HA expresado bajo su propio promotor. “Tratamiento” significa adición de una
droga o incremento de temperatura en el caso de estudiar un mutante termosensible. B. western-blot
que muestra los niveles de InuA de un cultivo de 16 horas con glucosa 1% como fuente de carbono.
En el segundo y tercer carril se muestran los niveles de InuA tras un cambio del cultivo anterior a un
medio con glucosa 1% o sacarosa 1% durante 1.5 horas. La sacarosa induce notablemente la
expresión de InuA. C. Niveles de InuA en cultivos con diferentes tiempos de inducción con sacarosa
1% (carriles 1-3), con glucosa 1% (glu), con glucosa 1% y sacarosa 1% (gluc+sac), con inulina 1% o
sin fuente de carbono.

Página 200
 Resultados. Capítulo VI
A continuación, comprobamos la expresión de InuA en cultivos con diferentes fuentes
de carbono. Como se muestra en la Figura R.58C, la glucosa es parcialmente represora en
presencia de sacarosa; la inulina, a pesar de ser parcialmente insoluble, es casi tan buen inductor
como la sacarosa (en mismas concentraciones p/v); y la ausencia de fuente de carbono no
promueve la expresión de InuA (Figura R.58C). De este modo, dispusimos de un sistema donde
poder expresar de manera regulada la proteína de fusión InuA-HA3.

4.6.4. Las especies moleculares GB y GA son intracelulares

Nos preguntamos si la inulinasa de los extractos de micelio provenía de InuA secretada
y retenida en el periplasma o si, por el contrario, correspondía a la enzima intracelular
“capturada” en los compartimentos secretores, en tránsito a su destino final. Para responder a
esta pregunta, indujimos la síntesis de InuA-HA en protoplastos purificados, estabilizados
osmóticamente con 1 M sorbitol. Los protoplastos no tienen pared celular [251] y, por tanto,
carecen proteínas solubles periplásmicas. Al igual que en el caso del micelio, en los protoplastos
detectamos una fuerte inducción de la síntesis de InuA después de 1.5 horas (Figura R.59A).
Esta inulinasa intracelular presenta tanto formas GB como formas de menor movilidad, que
coinciden en movilidad con parte de las especies GA (Figura R.59A). Este resultado indica que
las formas detectadas en el micelio son, al menos en parte, intracelulares. De hecho, una
proporción significativa (47%) de InuA se libera de los protoplastos al tratarlos con SDS
(Figura R.59A). En conclusión, estos resultados sugieren que los extractos de proteína total de
micelio representan fielmente la proteína intracelular.

4.6.5. La diversidad de especies moleculares de InuA se produce por N-

glicosilación
Utilizamos la enzima PNGasa F para eliminar totalmente los N-glicanos de InuA [252].
La PNGasa F es una amidasa que rompe el enlace que une la asparagina con la primera N-acetil
glucosamina (GlcNAc) del glicano [252]. Observamos un cambio de movilidad tanto en la
enzima secretada como en las especies intracelulares GB y GA. Todas ellas se convirtieron en
dos bandas con una movilidad similar (~65 kDa, Figura R.59B-C), las cuales coinciden con el
“doblete” de alta movilidad detectado en el micelio que, como se ha discutido antes,
correspondería al producto de importación al RE (esto es, el producto primario de traducción al
que se le ha eliminado el péptido señal). Estos resultados demuestran que la heterogeneidad de
especies moleculares de InuA y su característico patrón electroforético son debidos a N-
glicosilaciones.

Página 201
Resultados. Capítulo VI

Figura R.59. Análisis de InuA en protoplastos y desglicosilación enzimática. A. La inducción de

la expresión de InuA-HA en protoplastos produce especies moleculares, tanto intracelulares como
extracelulares, que son indistiguibles a las que producen las hifas intactas. Cuando se tratan los
protoplastos con SDS 0.2 %, gran parte de la inulinasa se libera, probablemente por desaparición de
las membranas intracelulares. Los protoplastos se separaron del medio con un filtro de 0.45 µm,
retenido indica retenido en el filtro y luego liberado con tampón Laemli y el eluido es el volumen que
ha atravesado el filtro. La cuantificación de los carriles indicados la realizamos con el programa
Image Lab. B. El tratamiento de InuA, tanto miceliar como extracelular, con PNGasa F produce la
conversión de todas las formas moleculares a dos bandas con movilidad compatible con InuA-HA sin
modificaciones postraduccionales. C. Gel largo que confirma que las dos bandas obtenidas tras la
desglicosilación enzimática coinciden en movilidad con las dos bandas más “rápidas” de InuA del
micelio. Los tamaños moleculares indicados son estimaciones basadas en una recta patrón construida
a partir de dicho western-blot, a partir de los tamaños correspondientes a las bandas del marcador de
masa molecular. El recuadro corresponde a una ampliación 2 x de una imagen más expuesta de la
región señalada.

Página 202
 Resultados. Capítulo VI
4.6.6. Análisis de la glicosilación basal en el retículo endoplasmático
InuA contiene 8 motivos Asn-X-Ser/Thr y, por tanto, posee 8 asparaginas que son
aceptoras potenciales de N-glicosilación. En el RE de S. cerevisiae, la enzima oligosacárido
transferasa (OST) cataliza la transferencia en bloque de una cadena oligosacarídica a las
asparaginas correspondientes de los polipéptidos nacientes [1]. Esta cadena está compuesta por
[N-acetil glucosamina(GlcNAc)]2-(manosa)9-(glucosa)3 [1]. Antes de llegar al Golgi, dicha
cadena pierde las tres glucosas y una manosa. De este modo, cada cadena añade ~1.7 kDa al
peso molecular de la proteína. De hecho, la diferencia en movilidad entre cada banda de las
formas GB coincide, grosso modo, con ~1.7 kDa, lo que es compatible con que dichas especies
se diferencien en el número de asparaginas N-glicosiladas (ver estimación de las masas
moleculares en la Figura R.59C). Además, la inulinasa del micelio presenta especies
moleculares adicionales, muy débiles, entre la enzima sin glicosilar y las formas GB. Estas
bandas están espaciadas entre ellas con aproximadamente el mismo intervalo de movilidad que
las bandas GB (Figura R.57C) y podrían corresponder a InuA con menos bloques de
oligosacáridos. En resumen, nos planteamos la hipótesis de que la escalera de bandas existente
entre la enzima sin glicosilar y la banda con menor movilidad de GB correspondiese a los
distintos niveles de glicosilación parcial de las asparaginas Asn-X-Ser/Thr de InuA. Para probar
esta hipótesis inhibimos la N-glicosilación en el RE con tunicamicina. Esta droga impide el
primer paso en la biosíntesis de dolicol-P-P-(GlcNAc)2-(manosa)9-(glucosa)3, que sirve como
sustrato de la OST. Específicamente, la tunicamicina es un nucleósido que inhibe la
transferencia de GlcNAc-1-fosfato desde UDP-GlcNAc al dolicol-fosfato.

Añadimos tunicamicina (20 µM y 100 µM) al medio en el momento de la inducción con

sacarosa e incubamos a 30ºC durante el tiempo indicado (Figura R.60A). La droga provocó un
desplazamiento de la escalera GB hacia movilidades mayores, efecto que aumentó con la
concentración de tunicamicina (Figura R.60A). Esto permitió la detección de dos bandas
adicionales (bandas 2 y 1; Figura R.60A), que no eran detectables sin el uso de la droga. La
utilización de 20 µM de tunicamicina produjo un menor efecto a los 60 min que a los 90 min,
mientras que el patrón no cambió con el tiempo cuando usamos una concentración de 100 µM.
La utilización de estas altas concentraciones de tunicamicina no impidió la secreción de InuA;
sin embargo, el patrón electroforético de las formas secretadas de InuA se extendió, abarcando
también movilidades mayores, es decir especies de InuA hipoglicosiladas (Figura R.60A). Estos
resultados indican que la tunicamicina reduce la capacidad de N-glicosilación y, por tanto,
disminuye las especies de InuA con 5 a 8 antenas de N-glicanos e incrementa la presencia
relativa de bandas con 1-5 antenas (20 µM) o 1-3 antenas (100 µM) (Figura R.60A).

Con el fin de inhibir en mayor medida la N-glicosilación, utilizamos concentraciones incluso

mayores de tunicamicina. Esto provocó un desplazamiento más acusado de las formas GB, hasta

Página 203
Resultados. Capítulo VI
tal punto de que predominaban las especies moleculares con una movilidad similar a la
inulinasa digerida con PNGasa F (Figura R.60B), lo que sugiere que estas bandas representan la
inulinasa sin glicosilar. Con 500 µM tunicamicina, la cantidad total de InuA era visiblemente
menor, posiblemente debido a la degradación de la proteína sin glicosilar (Figura R.60B).
Nótese que ni siquiera la mayor concentración de tunicamicina utilizada impidió la exocitosis de
InuA.

Figura R.60. Inhibición de la N-glicosilación con Tunicamicina. A. Efecto sobre InuA-HA,

después de 60 y 90 minutos, del tratamiento con 20 µM y 100 µM tunicamicina. Nótese el aumento
proporcional de bandas con mayor movilidad. La secreción no está afectada por la inhibición de la
glicosilación. Los asteriscos en la inmunodetección inferior señalan las dos bandas sin glicosilación.
B. Efecto con mayores concentraciones de tunicamicina: 100 µM, 200 µM y 500 µM.

Estas observaciones sugieren que las especies GB corresponden a la N-glicosilación “en

bloques” que sucede en el RE. Sin embargo, cuando se reduce la eficiencia de este proceso la
secreción de InuA no se detiene y, de hecho, se detectan nuevas especies de la enzima en el

Página 204
 Resultados. Capítulo VI
espacio extracelular, que deben de corresponder a InuA hipoglicosilada en el RE y modificada
en el aparato de Golgi. Por tanto, la N-glicosilación en el RE no parece ser una condición sine
qua non para el avance de InuA en la ruta secretora.

4.6.7. El bloqueo de la salida del retículo con sarA8 impide la secreción de InuA y
la formación de las especies GA
Las observaciones y conclusiones del apartado anterior se podrían explorar mediante
bloqueos en el transporte de InuA desde el RE al aparato de Golgi. Con este propósito
utilizamos un mutante termosensible de la GTPasa encargada de dicho proceso, SarA (Sar1)
(capítulo I). Elegimos el alelo mutante sarA8, dado que crece bien a 30ºC y 37ºC pero no es
viable a 42ºC. De este modo, al combinar la inducción con sacarosa y el incremento de la
temperatura de cultivo conseguiríamos un bloqueo condicional y agudo del transporte de InuA.
Por tanto, tras obtener la cepa sarA8 inuA-HA correspondiente, la precultivamos durante 16
horas a 30ºC en matraces con medio mínimo con glucosa, en paralelo con un control sarA+.
Posteriormente, transferimos el micelio a medio mínimo con sacarosa e incubamos los cultivos
a 30ºC, 39ºC o 42ºC durante 1.5 horas. La secreción de InuA al medio externo a 30ºC fue
similar a la cepa silvestre (Figura R.61A). Por el contrario, la secreción de InuA a 39ºC estaba
casi totalmente anulada, mientras que a 42ºC fue indetectable (Figura R.61A). A dichas
temperaturas, la cepa wt secretó InuA en cantidades similares a las secretadas a 30ºC (Figura
R.61A). Esto demuestra que la secreción de InuA se bloquea mediante la inactivación
condicional de SarA.

En relación a la inulinasa del micelio, el mutante sarA8 acumuló a 30º C las formas GB
(~6 veces más que en el wt), mientras que a 37ºC los niveles de GB fueron similares al wt. Estas
especies GB mostraron una fuerte reducción a 42ºC (Figura R.61A). La gran reducción en los
niveles de GB a 42ºC es atribuible a un incremento en la degradación de proteínas asociada a
estrés del retículo (ERAD, endoplasmic-reticulum-associated protein degradation) o a una
reducción de la síntesis de InuA. El incremento, detectado a 30ºC, de las formas GB indica que
incluso a la temperatura permisiva sarA8 afecta a la interfaz RE-Golgi, hecho que ya habíamos
demostrado en el capítulo I, al determinar que causa la deslocalización parcial de SedV.
Además, el mutante sarA8 presenta niveles ligeramente reducidos de las especies GA a 30ºC,
los cuales llegan a ser indetectables a 39ºC y 42ºC (Figura R.61A). Dicha ausencia de especies
GA correlaciona con el bloqueo en la secreción de inulinasa. Estos resultados muestran que la
producción de GA requiere un transporte eficiente del RE al aparato de Golgi y que GB no se
produce o se degrada cuando la salida del RE está muy comprometida. Sin embargo, si la
eficiencia de dicha salida se reduce sólo parcialmente, las especies GB se acumulan mientras
que GA se reduce. Téngase en cuenta que la afectación parcial de la función de SarA

Página 205
Resultados. Capítulo VI
desorganiza drásticamente el aparato de Golgi (capítulo I), pudiendo impedir la glicosilación en
dicho orgánulo. En conjunto, estos resultados demuestran que SarA se requiere para la secreción
de InuA y para la formación de las especies GA.

Figura R.61. Efecto de sarA8 en InuA. A. En este experimento el cambio de temperatura se ha

realizado simultáneamente con la inducción por cambio a medio con sacarosa. Los niveles de InuA
GB están aumentados a 30ºC y 39ºC en sarA8; sin embargo, no existe InuA GA a 39ºC ni a 42ºC, lo
que correlaciona con el bloqueo en la secreción de InuA. La cuantificación de las especies
moleculares GB la realizamos con el programa Image Lab. B. Test de crecimiento que muestra la
termosensibilidad sarA8. A la derecha, representación esquemática de los experimentos de A (i) y C
(ii). C. En este segundo experimento, la inducción de InuA se ha realizado en un cultivo precalentado
durante 1 hora. Esto ha provocado que, a 39ºC, se permita la secreción de InuA, correspondiente a la
glicosilación basal (GB). A la derecha se muestra una mayor exposición que demuestra que la
inulinasa del medio de cultivo no proviene de lisis celular, ya que no están presentes las especies con
mayor movilidad que GB. Las bandas del patrón de peso molecular se indican con una línea,
corresponden a los mismos pesos moleculares que en A.

Por último, si se sigue el protocolo estándar en el que la temperatura se cambia en el

momento de la inducción, sarA8 no secreta InuA a 39ºC (Figura R.61A); sin embargo, si
inducimos la expresión de InuA una hora después del cambio de temperatura (ver esquema en
Figura R.61B), sarA8 secreta cantidades muy reducidas de inulinasa que, además, corresponde a
las especies GB (Figura R.61C). En estas condiciones, sarA8 podría permitir una salida lenta del

Página 206
 Resultados. Capítulo VI
RE de InuA y, debido a la desorganización parcial del aparato de Golgi, la inulinasa no podría
adquirir las glicosilaciones que la transformarían en GA, aunque sí secretarse. La ausencia en el
medio extracelular de las especies sin glicosilar y de transición entre éstas y GB, las cuales sí
están presentes en el micelio, indica que la inulinasa GB que detectamos en el medio de cultivo
no puede proceder de lisis celular (ver Figura R.61C).

En conclusión, este y otros resultados apuntan a una relación precursor-productor entre

las formas GB y GA, que se formarían en el RE y en el aparato de Golgi, respectivamente.

4.6.8. La alteración de la interfaz retículo-Golgi por inactivación de RabO o SedV

bloquea la secreción de InuA y la síntesis de las especies GA
La GTPasa RabO y la t-SNARE SedV se localizan en el Golgi temprano y se requieren
para la organización del aparato de Golgi [18]. La inactivación de estas proteínas con los
mutantes termosensibles rabOts y sedVts desorganiza el Golgi [18]. La deslocalización del
marcador del Golgi temprano RerA [18] que ocurre en estas condiciones sugiere que dichas
mutaciones previenen la biogénesis de las cisternas del Golgi a partir del tráfico proveniente del
RE.

Estudiamos el efecto de rabOts y sedVts en la secreción de InuA. Como se muestra en la

Figura R.62A, a 39ºC y 42ºC ambas mutaciones bloquean prácticamente la secreción, de
acuerdo con su efecto en el Golgi. En cuanto a la enzima intracelular, sedVts eliminó las especies
GA a 42ºC, mientras que rabOts las redujo a 30ºC y eliminó a 39ºC y 42ºC (Figura R.62A).
Además, rabOts secretó cantidades mínimas de las especies GB a 39ºC. Estas cantidades
menores se convirtieron en claramente detectables al utilizar una temperatura de 37ºC (Figura
R.62B). Incluso a 30ºC, el mutante rabOts presenta defectos en la glicosilación de la inulinasa
secretada, puesto que presenta bandas definidas que no están presentes en la cepa wt (Figura
R.62A).

Estos resultados refuerzan las observaciones realizadas con sarA8 e indican que la
formación de las cisternas del Golgi temprano por tráfico del RE es necesaria para la conversión
de InuA GB en GA, así como para su secreción. Sin embargo, dejan abierta la incógnita de si se
requieren estadios posteriores del aparato de Golgi para la glicosilación o secreción de InuA.

Página 207
Resultados. Capítulo VI

Figura R.62. Efecto de sedVts y rabOts en InuA-HA. A. Análsis de InuA en sedVts y rabOts a 30ºC;
39ºC y 42ºC, en el que se aprecia una reducción de las formas GA en el micelio, lo que correlaciona
con una reducción drástica en la secreción de InuA. En las imágenes de la derecha el patrón de pesos
moleculares está únicamente señalado con líneas horizontales; los pesos moleculares son los mismos
que en la imagen de la izquierda. B. InuA en rabOts a 30ºC y 37ºC. A 37ºC el mutante secreta InuA
con la glicosilación basal, lo que sugiere un defecto en la glicosilación en el aparato de Golgi.

4.6.9. Implicación del aparato de Golgi temprano en la glicosilación de InuA

Para afectar al aparato de Golgi sin perturbar la interfaz RE-Golgi utilizamos dos
bloqueos genéticos diferentes. Uno de ellos implica el uso de una mutación en el complejo COG
(conserved oligomeric Golgi). COG es un complejo de anclaje o tethering esencial para la
estructura y la función del Golgi. Su función es crucial para mantener la glicosilación normal en
el Golgi, dado que media el tráfico retrógrado entre sus cisternas y mantiene, de este modo, el
orden secuencial necesario de las enzimas de glicosilación [163, 164, 253]. Utilizamos un
mutante podB1 termosensible del gen de A. nidulans que codifica la subunidad COG2 [165]. A
30ºC, podB1 se comportó como una cepa wt respecto a la glicosilación de InuA y a su secreción

Página 208
 Resultados. Capítulo VI
al medio externo (Figura R.63A). Sin embargo, a 42ºC podB1 fue incapaz de producir especies
GA detectables, aunque produjo niveles normales de GB. A esta temperatura tampoco secretó
inulinasa, mientras que el control wt sí lo hizo (Figura R.63A). Por lo tanto, podB es necesario
para la transformación de GB en GA mediante glicosilación y para la secreción de InuA. Estos
resultados refuerzan la conclusión de que GB es precursor de las especies GA, que se producen
en el aparato de Golgi. Además, también implican a la compartimentación del aparato de Golgi
per se en la glicosilación y la secreción de InuA, dado que la conexión RE-Golgi en podB1 no
debe de estar afectada.

Una segunda manera de alterar la homeostasis del Golgi es mediante mutaciones

termosensibles que condicionen la función del complejo de cubierta COPI. copA codifica, en A.
nidulans, la subunidad α del complejo COPI (ver capítulo IV). sod(VI)C1 (a partir de ahora
copAts) es una mutación termosensible de copA, que impide el crecimiento a 42ºC [223]. Como
muestra la Figura R.63B, copAts reduce la secreción de InuA a 30ºC, mientras que a 42ºC la
secreción es aún menor, lo que correlaciona con su crecimiento termosensible (Figura R.63C).
Sin embargo, no impide totalmente la formación de las especies moleculares GA. Esto podría
ser debido a que el mutante copAts fuese un hipomorfo que mantuviese una estructura
suficientemente organizada del aparato de Golgi como para glicosilar y secretar InuA durante el
tiempo de 1.5 horas a 42ºC.

Figura R.63. Alteración del Golgi con podB1 y copAts. A. Efecto del incremento de la temperatura
del cultivo a 42ºC en el mutante podB1. A 42ºC, podB1 no produce InuA del tipo GA, ni es capaz de
secretar inulinasa al medio extracelular. B. copAts, incluso a la temperatura permisiva de 30ºC secreta
menos InuA que la cepa wt, efecto que se ve exacerbado al realizar la inducción a 42ºC. C. Test de
crecimiento de una cepa copAts.

Página 209
Resultados. Capítulo VI
4.6.10. Papel esencial del TGN en la secreción de InuA: HypB/Sec7 y HypA/Trs120

HypB (Sec7) y HypA (Trs120) son dos residentes prototípicos del trans-Golgi (TGN),
cruciales para su función [18, 24, 37]. HypB (Sec7) actúa como GEF de Arf en el TGN [24].
HypA (Trs120) activa RabE durante la salida de vesículas secretoras [36, 37]. Utilizamos las
mutaciones termosensibles hypB5 [25] y hypA1 [37] para provocar un bloqueo en el TGN y
estudiar el efecto sobre InuA. Existen numerosos datos que implican al TGN de hongos en la
salida de cargo del Golgi, pero no en su glicosilación [135].

hypA1 no provocó ningún efecto sobre la inulinasa intracelular a ninguna de las

temperaturas probadas —30ºC, 37ºC y 42ºC (Figura R.64A). Sin embargo, hypA1 impidió la
secreción de InuA casi completamente a 37ºC y 42ºC (Figura R.64B). Estos resultados indican
que hypA1 no es necesario para la glicosilación de InuA, aunque es crucial para su exocitosis,
presumiblemente a través de la activación de RabE.

Figura R.64. Efecto de hypA1 y hypB5 en InuA. Ambos mutantes impiden la secreción de InuA a
42ºC. A. Análisis por western-blot de la inulinasa del micelio. B. Western-blots del medio
extracelular. Las imágenes de abajo corresponden a mayores exposiciones de la misma membrana.

Página 210
 Resultados. Capítulo VI
hypB5 provocó un efecto diferente al de hypA1. Mientras que el patrón de glicosilación
de la inulinasa intracelular es esencialmente igual al de una cepa wt (Figura R.64), el mutante
hypB5 a 39ºC secretó especies de InuA hipoglicosiladas, cuyas formas más abundantes
migraron como las formas más “rápidas” de GA (Figura R.64B). Esto indica que hypB5
presenta un defecto en la glicosilación de InuA en el aparato de Golgi. Como corresponde a su
papel clave en el TGN, hypB5 redujo notablemente la secreción de InuA a 42ºC (Figura R.64B).

Estos resultados sugieren que la integridad del TGN es necesaria para la secreción de
inulinasa y que HypB (Sec7) participa tanto en la salida de cargo desde el TGN como en la
organización del Golgi, necesaria esta última para la correcta glicosilación. Junto con los
resultados del apartado anterior, sugieren que lo que llamamos el Golgi temprano (i.e. el Golgi
donde se encuentra SedV) es más importante para la glicosilación de InuA que el TGN.

4.6.11. La integridad de los endosomas tempranos es un requisito para la exocitosis

de InuA
Existía evidencia previa de que ciertas proteínas solubles, como la invertasa de S.
cerevisiae, requieren el funcionamiento normal del sistema endosomal para su tráfico normal al
exterior celular [30], de manera que estas proteínas viajarían a los endosomas antes de ser
secretadas. Por ello, alteramos el tráfico entre Golgi y endosomas y analizamos su efecto en
InuA. Para afectar la integridad de los endosomas tempranos utilizamos el mutante
termosensible vps33ts y el mutante de deleción rabBΔ. RabB (ortóloga de RAB5 de mamíferos y
Vps21p en S. cerevisiae) es el principal determinante del establecimiento de identidad
endosomal en A. nidulans [158]. RabB recluta la kinasa Vps34, requerida para iniciar la ruta de
cuerpos multivesiculares [158]. También recluta el complejo CORVET, que media eventos de
fusión y HookA que media el transporte endosomal a larga distancia [18, 157, 158]. Vps33 es
una subunidad común de los complejos CORVET y HOPS [237], complejos oligoméricos que
se localizan en los endosomas tempranos y tardíos, respectivamente. Específicamente, Vps33 es
una proteína SM (Sec1/Munc18) que interviene en procesos de fusión endosomal.

Como se muestra en la Figura R.65A, la mutación rabBΔ impidió la secreción de InuA.

Sin embargo, no alteró los niveles ni el patrón electroforético de la inulinasa del micelio.
Concentramos las proteínas del medio utilizando un filtro Microcon y digerimos este
concentrado de proteínas con PNGasa F para convertir todas las especies de InuA en el doblete
de bandas sin glicosilar y, así, eliminar la posibilidad de que, en rabBΔ, InuA se hiperglicosilase
de manera que no entrase en el gel o que no la detectásemos mediante western-blot. De este
modo, pudimos detectar una pequeña cantidad de InuA secretada por el mutante rabBΔ, que en
cualquier caso era muy inferior a la del wt (Figura R.65B). Concluimos que RabB es necesario
para la secreción eficiente de InuA al medio externo, pero no para su glicosilación.

Página 211
Resultados. Capítulo VI

Figura R.65. Efecto de rabBΔ y vps33ts en InuA. A. Efecto de rabBΔ. rabBΔ no es capaz de secretar
InuA eficientemente, mientras que InuA en el micelio es igual que una cepa wt. El recuadro verde es
una exposición más baja de las formas GB, que muestra la ausencia de diferencias entre wt y rabBΔ.
B. Mediante desglicosilación de la inulinasa del micelio confirmamos que InuA intracelular no está
alterada en la cepa mutante. La desglicosilación de las proteínas del medio de cultivo nos permitió
detectar InuA y confirmar el déficit en secreción que causa la mutación rabBΔ. C. vps33ts no es capaz
de secretar InuA eficientemente a 42ºC.

Al realizar los experimentos equivalentes con el mutante vps33ts, basados en cambio de

temperatura, comprobamos que a 30ºC vps33ts es capaz de secretar InuA al medio externo,
mientras que a 42ºC la InuA secretada es prácticamente indetectable (Figura R.65C). Por tanto,

Página 212
 Resultados. Capítulo VI
al igual que RabB, Vps33 no es necesario para la glicosilación de InuA (Figura R.65C), pero sí
lo es para su secreción al medio externo. Es importante recalcar que ni RabB ni Vps33 son
necesarios para el transporte de ChsB a la membrana plasmática (capítulo V). Además, RabB no
se requiere para la secreción de EglC (capítulo VII). Por tanto, concluimos que el efecto de
rabBΔ es específico sobre el cargo inulinasa.

Quisimos comprobar si la maduración endosomal era necesaria para la secreción de

InuA o si, por el contario, solo se requiere la integridad de los endosomas tempranos (RabB y
Vps33). Para ello utilizamos el mutante rabSΔ. RabS (ortólogo de Rab7 de mamíferos e Ypt7p
de S. cerevisiae) media la fusión homotípica que ocurre entre los endosomas tardíos y la
heterotípica entre ellos y las vacuolas; como consecuencia, el mutante rabSΔ presenta vacuolas
con un tamaño reducido [186]. Al contrario que rabBΔ y vps33ts, la mutación rabSΔ no afectó
ni a la glicosilación ni a la secreción de InuA (Figura R.66A).

Finalmente, analizamos el mutante vpsTΔ —el ortólogo de VPS10 de S. cerevisiae—

[38]. En S. cerevisiae Vps10p media el transporte de hidrolasas vacuolares a los endosomas,
función que parece estar conservada en Aspergillus [254]. La mutación vpsTΔ no afectó a la
secreción de InuA ni a su glicosilación (Figura R.66B), lo que indica que esta proteína no está
implicada en el tráfico de inulinasa.

Figura R.66. vpsTΔ y rabSΔ no afectan al tráfico de InuA. A. InuA de micelio y extracelular en
una cepa wt y otra cepa rabSΔ. La precipitación del medio extracelular está hecha por duplicado y,
por ello, aparecen “duplicados” los carriles. B. Lo equivalente con vpsTΔ. No existen diferencias
apreciables entre la cepa silvestre y las cepas mutantes.

Página 213
Resultados. Capítulo VI
Globalmente los resultados anteriores muestran que los endosomas juegan un papel
clave en la exocitosis de InuA. Sin embargo, ni la integridad de los endosomas tardíos y las
vacuolas, ni tampoco el transporte de hidrolasas vacuolares son necesarios. Por lo tanto, estas
evidencias implican de manera específica a los endosomas tempranos en la secreción de InuA.

En este capítulo hemos cartografiado la ruta de secreción y de glicosilación de InuA. En

conjunto los resultados indican que las especies GB se producen por la N-glicosilación las
asparaginas de InuA en el RE. Posteriormente las especies GA se producirían por modificación,
en el aparato de Golgi, de los N-glicanos de las especies GB. Tanto la conexión RE-Golgi,
como el Golgi temprano y HypB (Sec7) son necesarios para la síntesis de estas especies
moleculares GA y para la secreción de inulinasa. Trs120 también es indispensable para la
exocitosis de InuA pero no para la glicosilación. Consideramos que el resultado más importante
de este capítulo es el que implica, de manera específica, la función de los endosomas tempranos
en la secreción de inulinasa.

Página 214
Capítulo VII
 Resultados. Capítulo VII

4.7. Capítulo VII: Análisis de la ruta de secreción de una

proteína anclada a GPI: EglC
Las proteínas ancladas a GPI (PA-GPI) son proteínas cargo de la ruta secretora que
viajan unidas a la membrana mediante un anclaje de glicosil fosfatidil inositol (GPI)
covalentemente unido, unión que se produce en el retículo endoplasmático (RE) [2]. En S.
cerevisiae y en mamíferos las PA-GPI se concentran en vesículas diferentes del resto de cargo.
En S. cerevisiae la separación ocurre en la salida del RE, desde donde las PA-GPI viajan al
Golgi en vesículas COPII exclusivas [31]. Por el contrario, en mamíferos la segregación de las
PA-GPI ocurre en el TGN (ver Introducción).

4.7.1. Análisis bioinformático de las proteínas ancladas a GPI en Aspergillus

nidulans
Con el propósito de utilizar como cargo modelo una proteína anclada a GPI que se
expresase eficientemente y viajase a la superficie celular nos basamos en un estudio que
identificó y caracterizó hasta 12 PA-GPI diferentes en la pared celular o el periplasma de A.
nidulans [255]. De entre ellas, nos fijamos en las pertenecientes a las familias Bgl2 y Gas/Gel,
ya que eran las más estudiadas en levaduras. Ambas familias presentan actividad β-(1,3)-
endoglucanasa; sin embargo, los miembros de la familia Gas/Gel también tienen actividad
transglicosilasa, la cual actúa inmediatamente después de la actividad endoglucanasa [256, 257].
De este modo, estas enzimas rompen un enlace β(1,3) de un glucano y transfieren el extremo
reductor así formado a un extremo no reductor de otro glucano. Esta doble actividad enzimática
permite la extensión en longitud de las cadenas de glucanos [257].

Respecto a la familia Bgl2, el estudio proteómico citado identificó la proteína EglC

[255]. EglC presenta gran homología con Bgt1p y Bgt2p de Neurospora crassa [258] y con
Bgl2 de S. cerevisiae (Figura R.67). SignalP 4.1 predice que los 21 primeros residuos de EglC
corresponden al péptido señal que determina su entrada al RE (corte entre los residuos 19 y 20 a
partir de la metionina N-terminal). Por otro lado, los últimos 24 aminoácidos conformarían la
señal de anclaje a GPI, ocupando la posición ω la Gly442 (Figura R.67), que representaría el
aminoácido C-terminal cuando dicha señal se procesa.

Página 217
Resultados. Capítulo VII

Figura R.67. Alineamiento de la familia Bgl2. Alineamiento múltiple de secuencia mediante

ClustalW. El color rojo indica residuo invariable y el amarillo similitud de secuencia con un umbral
de 0.15 usando la matriz BLOSUM62. Nombre de especie y números de identificación de GenBank:
Aspergillus nidulans (EglC): 74593233, Saccharomyces cerevisiae (Bgl2p): 1323515, Neurospora
crassa (Bgt1p): 28923819: Neurospora crassa (Bgt2p): 28920483. El rectángulo rojo al principio de
la secuencia de EglC muestra el péptido señal predicho por SignalP 4.1, y la línea punteada indican el
punto de corte por la peptidasa correspondiente. El rectángulo rojo del final muestra la señal de
anclaje al GPI y la línea punteada indica el punto de corte. La hélice superpuesta indica una región
polar compatible con ser una α-hélice transmembrana.

Página 218
 Resultados. Capítulo VII

Figura R.68. Alineamiento de la familia Gel/Gas. Alineamiento múltiple como en la figura 1.

Nombre de especie y números de identificación de GenBank: Aspergillus nidulans: GelE: 67901048,
GelC: 67526545, GelD: 67526545; Saccharomyces cerevisiae: Gas1: 1023941878, Gas2:
1023942311. El rectángulo rojo al principio de la secuencia de EglC muestra el péptido señal
predicho por SignalP 4.1, y la línea punteada indican el punto de corte por la peptidasa. La hélice al
final de la secuencia indica una región polar compatible con ser una α-hélice transmembrana y la línea
punteada indica la región donde posiblemente está el punto de corte, tras el reconocimiento de la señal
de anclaje del GPI.

Página 219
Resultados. Capítulo VII
En relación a la familia Gas/Gel, estudiamos la homología de secuencia entre Gas1p y
Gas2p de S. cerevisiae y todas las proteínas Gel de A. nidulans (GelA-GelE). Todas estas
proteínas de A. nidulans, excepto GelC, fueron identificadas por espectrometría de masas en el
estudio previamente descrito [255]. En un primer alineamiento, comprobamos que GelA y GelB
son muy diferentes del resto de proteínas. Por lo tanto, las excluimos de un segundo
alineamiento, con el que comprobamos que el nivel de similitud de estructura primaria entre
Gas1p y Gas2p y GelC/D/E es relativamente alto (Figura R.68). En A. fumigatus, de los siete
miembros de la familia Gel, solamente tres de ellos (Gel1p, Gel2p y Gel4p) se expresan
constitutivamente [259]. Con este dato en mente, comprobamos los datos de expresión en A.
nidulans de gelC, gelD y gelE (RNAseq, comunicación personal de Mark X. Caddick a
Aspergillus Genome Database). Éstos indicaban que GelE se expresa a niveles mucho mayores
que GelC y GelD. Por tanto, preseleccionamos GelE para nuestro estudio. Finalmente,
verificamos que GelE presenta péptido señal (corte entre los residuos 18 y 19) y, en su extremo
C-terminal, contiene predeciblemente una hélice transmembrana (Figura R.68), que constituye
una parte indispensable de la señal de anclaje a GPI (Figura R.68).

En conclusión, seleccionamos EglC y GelE para su estudio como modelos de PA-GPI.

4.7.2. Etiquetado fluorescente de EglC y GelE

Dado que las PA-GPI tienen su extremo N-terminal ocupado por el péptido señal y su
región C-terminal constituye la señal de anclaje de GPI (Figura R.69A), la fusión de cualquier
proteína o péptido en uno de sus extremos alteraría su función. Por tanto, integramos la
secuencia de gfp en un punto “interior” de la ORF de eglC y gelE. En primer lugar, marcamos
tanto EglC como GelE con GFP entre el péptido señal y el resto de la proteína. Específicamente,
construimos un gen quimérico que codificaba los 21 aminoácidos N-terminales de EglC
seguidos de GFP y el resto de EglC (Figura R.69B). Además, introdujimos un conector de 5x
Gly-Ala en ambos extremos de la secuencia de GFP para evitar en la medida de lo posible
efectos indeseados de la GFP sobre el plegamiento de los dominios de EglC. Realizamos la
construcción equivalente con GelE, considerando los 20 primeros aminoácidos como el péptido
señal (Figura R.69B). Ambos casetes de transformación incluyeron el marcador de selección
pyrGfum y secuencias flanqueantes para mediar la recombinación homóloga y su correcta
integración en los loci correspondientes, sustituyendo los genes eglC o gelE endógenos. Tras
transformar A. nidulans y estudiar los transformantes comprobamos que las células no tenían
fluorescencia. En vista de esto, para utilizar un promotor fuerte y constitutivo, construimos
cepas que expresaban los mismos genes quiméricos con el promotor gpdA mini. Estas cepas
tampoco fueron fluorescentes. Consideramos la posibilidad de que estuviésemos afectando al
plegamiento de EglC y GelE o a su entrada al RE y, por lo tanto, decidimos cambiar la posición

Página 220
 Resultados. Capítulo VII
de la GFP. Para ello, estudiamos la estructura tridimensional de los ortólogos cristalizados de
EglC y GelE: la endo-β-1,3-glucanasa de Musa acuminata [260] y Gas2p de S. cerevisiae [256],
respectivamente. Estas proteínas tienen, como dominio catalítico, un barril TIM (β-α)8,
frecuente en enzimas modificadoras de carbohidratos [256, 260]. Gas2p, además, tiene un
dominio rico en cisteínas (familia CBM45), que también participaría en la catálisis. En ambas
proteínas existe una secuencia no conservada entre la región catalítica y la secuencia de anclaje
de GPI (Figuras R.67 y R.68), probablemente carente estructura secundaria, que no está resuelta
en los cristales correspondientes [256, 260]. Decidimos situar la GFP en esta supuesta región
espaciadora de EglC y GelE, asumiendo que, de esta manera, no afectaríamos al plegamiento de
la proteína. Específicamente, marcamos GelE con GFP entre los residuos 482 y 483 y EglC
entre 359 y 360. Denominamos a estos genes quiméricos eglC-gfp-GPI y gelE-gfp-GPI. Una
vez integradas en sus respectivos loci por recombinación homóloga, estas quimeras produjeron
resultados satisfactorios dado que las cepas presentaron fluorescencia en la superficie celular
(Figura R.70).

Figura R.69. Estructura de GelE y EglC y marcaje con GFP. A. El dibujo representa las proteínas
GelE y EglC con el péptido señal en N-terminal y la señal de anclaje de GPI en C-terminal,
enfatizando la dificultad del marcaje con GFP. B. Las dos estrategias utilizadas en el marcaje de estas
proteínas. Para preservar las secuencias N y C-terminales la GFP se integró en el interior de la
secuencia proteica. El marcaje después del péptido señal no produjo resultados satisfactorios; sin
embargo, GFP colocado en el largo bucle predicho que existiría en ambas proteínas, permitió
visualizarlas por microscopía de fluorescencia.

Página 221
Resultados. Capítulo VII
4.7.3. Las quimeras fluorescentes de EglC y GelE se localizan en la periferia
celular
Mediante microscopía in vivo, determinamos que la localización de ambas proteínas era
indistinguible entre sí y que su fluorescencia era relativamente baja. Se localizan principalmente
en la superficie celular y, en menor medida, en los septos y en el Spitzenkörper (Figura R.70).
Sus distribuciones a lo largo de la superficie de la hifa son “antipolarizadas”: hay más
fluorescencia en las zonas basales y menos en las apicales (Figura R.70). Además, existe una
acumulación en los sitios de ramificación, donde están naciendo nuevos ápices (Figura R.70A).
La localización de estas proteínas en la superficie celular y los septos es consistente con su
función de enzimas modificadoras de la pared celular.

Figura R.70. Localización e inmunodetección de EglC-GFP-GPI y GelE-GFP-GPI A. A la

izquierda, localización de GelE en la superficie celular, en la vacuola de la espora, en los septos y en
el Spitzenkörper. A la derecha, débil inmunodetección de GelE-GFP-GPI. B. A la izquierda,
localización de EglC de manera indistinguible a GelE. Derecha, inmunodetección de EglC, mostrando
diversidad de especies moleculares. Todas las imágenes con la misma ampliación.

Página 222
 Resultados. Capítulo VII
Las proteínas ancladas a GPI suelen N-glicosilarse [2, 149], proceso que ocurre tanto en
el RE como en el Golgi. Si fuese el caso, la determinación del patrón electroforético de estas
proteínas podía ser útil para averiguar la ruta que toman en su viaje a la superficie celular, de
manera similar al abordaje realizado con InuA (ver capítulo VI). De hecho, mediante western-
blot, demostramos que EglC y GelE presentan numerosas bandas (Figura R.70), que serán
analizadas más adelante. Obtuvimos mayor señal de EglC que de GelE en el western-blot y
decidimos continuar los estudios sólo con EglC (Figura R.70B).

4.7.4. La expresión de EglC-GFP-GPI bajo el promotor gpdAmini mejora su señal

fluorescente
Dado que la expresión de EglC-GFP-GPI y GelE-GFP-GPI con su promotor natural
produjo niveles de fluorescencia relativamente bajos, decidimos expresar EglC-GFP-GPI con el
promotor moderadamente fuerte gpdAmini. Mediante el uso de este promotor obtuvimos mayor
señal fluorescente con una localización esencialmente igual (Figura R.71). La única diferencia
fue que la localización en el SPK no era tan evidente, probablemente por el aumento
considerable de la fluorescencia en la superficie celular. El western-blot de la Figura R.71
muestra que la sobreexpresión de EglC-GFP-GPI no afectó a su patrón de especies moleculares.

Figura R.71. Expresión de EglC-GFP-GPI bajo el promotor gpdAmini. La expresión de EglC con el
promotor gpdAmini no altera la localización ni el patrón electroforético de la proteína, pero mejora su
señal.

Página 223
Resultados. Capítulo VII
4.7.5. Expresión regulable de EglC-GFP-GPI mediante integración del gen
quimérico en el locus inuA
Recuérdese que nuestro objetivo era determinar la ruta seguida por una PA-GPI. Para
ello sería útil realizar interrupciones de pasos específicos del tráfico intracelular y determinar el
efecto en la localización de EglC. Estos bloqueos se pueden hacer con mutantes termosensibles,
incrementando la temperatura del cultivo en células ya crecidas. Sin embargo, al realizar este
tipo de experimentos con un promotor constitutivo, la proteína que se localizase en la superficie
celular previamente a la interrupción del tráfico enmascararía el efecto real de dicha
interrupción. Este inconveniente se puede subsanar utilizando un promotor regulable e
induciendo la expresión de EglC después del bloqueo del tráfico. Sin embargo, los promotores
regulables que se utilizan en A. nidulans requieren o la inducción con una fuente de carbono
pobre (promotor alcAP [18]) o el uso de una fuente alternativa de nitrógeno (promotor niiAP
[171]). Dado que la regulación de la expresión de InuA con glucosa/sacarosa había dado buenos
resultados anteriormente (capítulo VI), decidimos usar dicha regulación para la expresión EglC.
Para ello, sustituimos en el genoma la ORF de inuA por el gen quimérico eglC-gfp-GPI. Así,
obtuvimos una cepa en la que eglC-gfp-GPI estaba controlado por el circuito de regulación
transcripcional que normalmente controla la expresión de inuA. (Parte de los experimentos
relativos a esta cepa fueron realizados junto a Esteban Moscoso Romero, estudiante del “Máster
en Microbiología y Parasitología: Investigación y Desarrollo” de la Universidad Complutense
de Madrid, que se incorporó a este proyecto). Comprobamos que esta cepa transgénica no era
fluorescente si se cultivaba en medio con glucosa. Sin embargo, al cultivarla con sacarosa como
fuente de carbono, EglC-GFP-GPI se expresó y marcó con fluorescencia su localización normal.
Es más, cuando cultivamos estas células en medio con glucosa y las cambiamos, una vez
crecidas, a medio con sacarosa, en 5-10 minutos se empezó a apreciar fluorescencia citosólica.
Después de 2 horas, la fluorescencia fue relativamente alta y EglC-GFP-GPI se localizó igual
que cuando se expresaba con su promotor natural (Figura R.72A). La potencia de la inducción
con sacarosa quedó patente al analizar los niveles de EglC mediante western-blot. Como
muestra la Figura R.72B, la expresión de EglC-GFP-GPI en un cultivo con glucosa no era
detectable con un tiempo de exposición que saturaba la señal correspondiente a la inducción con
sacarosa durante 1.5 horas, tanto a 30ºC como a 37ºC (Figura R.72C). Los western-blots
también revelaron que las modificaciones postraduccionales se producían fielmente (Figura
R.72B-C).

Página 224
 Resultados. Capítulo VII

Figura R.72. Inducción de la expresión de EglC-GFP-GPI con sacarosa mediante su integración

en el locus inuA. A. Célula expresando EglC-GFP-GPI tras 2 horas del cambio a un medio con
sacarosa. B. Patrón electroforético de EglC-GFP-GPI en donde se indica la clasificación de las
diferentes regiones. C. Electroforesis que muestra la especificidad de la inmunodetección (MAD2 es
una cepa que no contiene eglC-gfp-GPI). También pone de manifiesto la regulación de la expresión
por la fuente de carbono: el carril glucosa muestra la inmunodetección de extracto proteico de una
cepa eglC-gfp-GPI cultivada, posteriormente a un cultivo de 16 horas en medio con glucosa, en medio
nuevo con glucosa durante 1.5 horas; el carril sacarosa muestra la inmunodetección de la misma cepa
crecida en medio con sacarosa 1.5 horas adicionales a las 16 horas en glucosa. Nótese que en esta
electroforesis las muestras se han dejado correr más que en B.

4.7.6. Análisis del patrón electroforético de EglC-GFP-GPI

El tamaño predicho para EglC-GFP-GPI, una vez descontados el péptido señal y el
péptido de anclaje de GPI, es de ~ 69,3 kDa. Si a ello le sumamos la masa molecular de un
anclaje GPI estándar (3 x manosas + 3 x etanolaminas fosfato + etanolamina + glucosamina +
inositol + ceramida o diacilglicerol; ~1.9 kDa), la masa molecular final sería de ~ 72.2 kDa. El
patrón electroforético de EglC-GFP-GPI presenta cuatro regiones bien diferenciadas (Figura
R.72B). En primer lugar, una región corresponde al conjunto de bandas con una movilidad
mayor a la banda de 50 kDa del marcador que, creemos, correspondería a EglC-GFP-GPI

Página 225
Resultados. Capítulo VII
degradada. La segunda región contiene una banda con una movilidad superior a 75 kDa.
Hipotetizamos que esta banda corresponde a EglC-GFP-GPI procesada pero sin glicosilar, con
un tamaño teórico de ~ 72.2 kDa. Denominamos a esta banda E0. En tercer lugar, existe una
serie de bandas discretas con una movilidad de 75-100 kDa, que presentan distancia similar
entre ellas. Por la experiencia con la inulinasa (capítulo VI), hipotetizamos que esta región
podría corresponder a EglC-GFP-GPI con N-glicosilaciones producidas en el RE, en donde la
N-glicosilación ocurre por transferencia en bloque de cadenas de glicanos [114]. Denominamos
a este conjunto de bandas E1. Además, hay al menos dos bandas ‘de transición’ entre E0 y E1, de
muy baja intensidad en el western-blot (Figura R.72C). Finalmente, una tercera región, que
denominamos E2, contiene numerosas especies de EglC-GFP-GPI en una señal difusa entre la
posición de 100 kDa y el principio del gel. Hipotéticamente corresponderían a las
glicosilaciones del aparato de Golgi, que extenderían las cadenas añadidas en el RE. Es
destacable la similitud entre el patrón de EglC-GFP-GPI y el de la inulinasa (capítulo VI),
siendo ambas proteínas cargo de la ruta secretora.

4.7.7. Estudio de la ruta de exocitosis de EglC

Para el estudio de la ruta secretora de utilizamos la cepa que contiene el transgén eglc-
gfp-GPI integrado en el locus inuA, para regular su expresión con la fuente de carbono. No
obstante, cuando lo consideramos necesario utilizamos, como control, otras de las
construcciones quiméricas explicadas más arriba.

4.7.7.1. Visualización de EglC-GFP-GPI acumulado en el retículo endoplasmático por

efecto de sarA6

En primer lugar, nos dispusimos a averiguar si la acumulación de EglC-GFP-GPI en el

lumen de un orgánulo celular era detectable por microscopía de fluorescencia. Para ello
utilizamos el mutante termosensible sarA6 (ver capítulo I). Por cruzamiento, obtuvimos una
cepa inuA::[eglC-gfp-GPI] sarA6. En esta cepa, cultivada a 30ºC y con sacarosa como fuente de
carbono, EglC-GFP-GPI se localizó normalmente en la superficie celular (Figura R.73A). Para
determinar el efecto de la inactivación de SarA, incrementamos la temperatura de otro cultivo a
37ºC a la vez que inducíamos la expresión de EglC-GFP-GPI. Para ello cambiamos el medio de
cultivo por medio con sacarosa y, simultáneamente, incrementamos la temperatura del
incubador acoplado al microscopio. En estas condiciones observamos que en el mutante sarA6,
EglC-GFP-GPI no viajó a la superficie celular, a diferencia de la cepa wt (Figura R.73A). En
cambio, se localizó exclusivamente en la red de membranas del RE, que incluye las envolturas
nucleares (Figura R.73A). Este resultado demuestra que: (1) SarA es necesario para que EglC-

Página 226
 Resultados. Capítulo VII
GFP-GPI salga del RE; (2) EglC-GFP-GPI es una proteína reportera válida para determinar, por
microscopía de fluorescencia, la acumulación de EglC en el lumen de los orgánulos (nótese que
la GFP es intralumenal en este caso, a diferencia del GFP de GFP-ChsB). Cabe destacar que la
acumulación de EglC-GFP-GPI en el RE es homogénea en toda su membrana. En S. cerevisiae
la acumulación de las PA-GPI en los sitios de salida del retículo (ERES) parece ser
independiente a COPII [149]. Específicamente, las mutaciones termosensibles sec12-4 (Sec12p
es la GEF de Sar1) y sec16-2 (Sec16 se requiere para la organización adecuada de los ERES) no
impiden la acumulación de la PA-GPI Cwp2p en puntos intracelulares, presumiblemente ERES.
Sin embargo, en la cepa sarA6 no detectamos acumulación de EglC-GFP-GPI en puntos
intracelulares (para ver ERES, marcados con Sec23, ver la Figura R.5A-B). Esta falta de
acumulación podría ser debida a altos niveles de expresión de EglC-GFP-GPI bajo el control del
promotor inuA recién inducido, que saturarían los ERES. Por ello, realizamos el mismo
experimento expresando EglC-GFP-GPI con su promotor natural. En este caso, ya que se trata
de un promotor constitutivo, era de esperar que parte de EglC-GFP-GPI se encontrase en la
superficie celular. Efectivamente, mientras que a temperatura permisiva EglC-GFP-GPI se
localizó en sarA6 como en el wt, a 37ºC, EglC-GFP-GPI se encontró, además de en la periferia,
marcando las membranas del RE (Figura R.73B). Este marcaje era homogéneo en todo el RE y,
por tanto, no existía acumulación en puntos similares a ERES. También probamos el uso del
promotor constitutivo gpdAmini y obtuvimos el mismo resultado que con el promotor natural
(Figura R.73C). Estos resultados demuestran que, en ausencia de SarA, EglC-GFP-GPI no es
capaz concentrarse en sitios específicos del RE, independientemente de sus niveles de
expresión.

A continuación, estudiamos el patrón electroforético de EglC-GFP-GPI acumulado en el

RE en el mutante sarA6 (Figura R.74). Estos experimentos los hicimos del mismo modo que los
anteriormente descritos con InuA-HA (capítulo VI). Brevemente, cultivamos las cepas durante
16 horas en medio con glucosa. Después, cambiamos el cultivo a un medio con sacarosa e
incubamos durante 1.5 horas adicionales en las condiciones indicadas en cada caso. En el caso
de sarA6 y su control wt la inducción con sacarosa la hicimos tanto a 30ºC como a 39ºC. A
30ºC, sarA6 no alteró el patrón de bandas de EglC-GFP-GPI (Figura R.74A). Mientras que en la
cepa wt no se detectaron diferencias entre 30ºC y 39ºC, en el mutante sarA6 la diferencia fue
sustancial, dado que no se detectó el conjunto de especies moleculares E2 a 39ºC. Esto indica
que las formas E2 corresponden a glicosilaciones en el aparato de Golgi (Figura R.74A). En otro
experimento, realizado a 37ºC, la mutación sarA6 también alteró el patrón de bandas de E1
(Figura R.74B). Se detectó un incremento notable de una o más bandas E1, minoritarias en la
cepa silvestre (Figura R.74B). Dicha(s) banda(s) tiene(n) una movilidad menor que la principal
en la cepa wt. ¿Corresponde esta banda a una versión de EglC-GFP-GPI con el GPI no

Página 227
Resultados. Capítulo VII
remodelado? Hipotéticamente sarA6 podría impedir una remodelación eficiente del GPI y
provocar un cambio en la movilidad de EglC-GFP-GPI.

Figura R.73. Acumulación de EglC-GFP-GPI en el retículo endoplasmático por acción de sarA6.

A. EglC-GFP-GPI se encuentra en la superficie celular tanto la cepa wt a 30ºC y 37ºC como el
mutante sarA6 a 30 ºC; sin embargo, en la cepa sarA6 a la temperatura restrictiva de 37ºC, EglC se
acumula en el RE de manera homogénea. Esta acumulación ocurre tanto después de la inducción de
su expresión con sacarosa, como con el uso de su promotor natural (B) o del promotor gpdAmini (C).

Página 228
 Resultados. Capítulo VII

Figura R.74. Efecto en el patrón electroforético de EglC-GFP-GPI por sarA6. A. Experimento de

inducción e incubación a 30ºC o 39ºC. En la derecha se muestra la misma inmunodeteccción pero con
mayor tiempo de exposición. B. Como en A pero a 30ºC y 37ºC y, además, con un control de no
inducción a 30ºC para las cepas wt y sarA6. Mientras que no se aprecia efecto en E3, hay una
alteración clara de E1. Arriba a la derecha, se muestra una exposición menor de la misma
inmunodetección. Abajo a la derecha, electroforesis diferente con las mismas muestras, utilizando un
gel más largo para confirmar el cambio en E1.

4.7.7.2. Bloqueo de EglC en estructuras intracelulares por inactivación de SedV (Sed5)

SedV (Sed5p en S. cerevisiae) es la t-SNARE del Golgi temprano que se encarga de la

recepción de tráfico proveniente del RE [18, 38]. Para averiguar si esta SNARE está involucrada
en el tráfico de EglC, determinamos, por microscopía in vivo y western-blot, la localización y el
estado de EglC-GFP-GPI en el mutante termosensible sedVts. El western-blot de la Figura
R.75A ilustra la similitud en el patrón de EglC-GFP-GPI entre la cepa silvestre y el mutante
sedVts a 30ºC, 37ºC y 39ºC. No obstante, detectamos una ligera diferencia en las regiones E1 y
E2 a 37ºC y 39ºC, ya que sedVts provoca un aumento relativo de las bandas con mayor
movilidad de las especies E2 y de las bandas con menor movilidad de las especies E1. Este
resultado indica que existe una reducción en la eficiencia con la que EglC se glicosila en el
aparato de Golgi, causada por el déficit de SedV a temperatura restrictiva. Mediante

Página 229
Resultados. Capítulo VII
microscopía observamos que a 37ºC, en el mutante sedVts, EglC-GFP-GPI no se encuentra en la
superficie celular, sino que se acumula en estructuras intracelulares (Figura R.75B). Estos
resultados demuestran que SedV se requiere para el tráfico de EglC-GFP-GPI y sugieren que
esta proteína se acumula en estructuras con identidad parcial de Golgi, incapaces tanto de
avanzar en la ruta como de glicosilar de manera eficiente.

Figura R.75. EglC-GFP-GPI en sedVts. A. Inmunodetección de extractos proteicos de células wt o

sedVts inducidas con sacarosa durante 1.5 horas a las temperaturas indicadas. El mutante sedVts
presenta un incremento de las dos bandas superiores de E1 que sólo ocurre a 37ºC y 39ºC. A su vez, a
estas temperaturas existe un aumento de las bandas inferiores de E 2. B. A 37ºC, en el tiempo de
inducción indicado, sedVts no secreta EglC, si no que lo acumula intracelularmente.

4.7.7.3. TRAPPII es necesario para el tráfico de EglC, mientras que RabD (Sec4) regula su
distribución en la superficie celular

RabE (Ypt31p / Ypt32p en S. cerevisiae, RAB11 en mamíferos) es la GTPasa que

regula la salida de vesículas secretoras que desde el TGN se dirigen al Spitzenkörper [36]. Dado
que EglC-GFP-GPI se localiza en el Spitzenkörper y parece pasar por el Golgi para viajar a la
superficie celular (ver más arriba), nos preguntamos si RabE media la salida de EglC del aparato
de Golgi. Para responder a esta pregunta, utilizamos el mutante termosensible de Trs120,

Página 230
 Resultados. Capítulo VII
denominado hypA1 (Figura R.76A). Trs120 es un componente del complejo TRAPPII, el cual
activa a RabE en el TGN [37]. Mediante microscopía de fluorescencia in vivo y western-blot
demostramos que hypA1 impide que EglC-GFP-GPI viaje a la superficie celular (Figura R.76B).
De hecho EglC-GFP-GPI se acumuló en estructuras intracelulares, hipotetizamos que
correspondiesen a cisternas con identidad de TGN (Figura R.76B). En conclusión, Trs120 es
necesario para el transporte de EglC-GFP-GPI a la superficie celular, probablemente porque, al
activar a RabE, permite el transporte de EglC-GFP-GPI en vesículas secretoras desde el TGN.
Por otro lado, la maduración postraduccional de EglC-GFP-GPI en el mutante hypA1 fue
normal (Figura R.76C).

Figura R.76. Efecto de hypA1. A. Test de crecimiento de una cepa hypA1 en MMA, en comparación
con una estirpe wt. B. EglC-GFP-GPI expresado en el locus inuA en células wt o hypA1 a 37ºC,
durante el tiempo indicado de inducción. El mutante hypA1 no exocita EglC a la superficie celular; sin
embargo acumula EglC en estructuras intracelulares. C. Western-blot anti-GFP para detectar EglC-
GFP-GPI en células wt o hypA1 después de 1.5 h de inducción a las temperaturas indicadas.

rabD codifica la GTPasa homóloga de Sec4p en S. cerevisiae. Aunque rabD no es un

gen esencial, es importante para el crecimiento, dado que su deleción provoca una reducción del
diámetro de las colonias [36]. Sec4p media la fusión de las vesículas de exocitosis con la
membrana plasmática, aguas abajo de Ypt32p (RabE) [261]. RabD podría realizar una función

Página 231
Resultados. Capítulo VII
similar a Sec4p, ya que se localiza en los carriers exocíticos que se reúnen en el Spitzenkörper,
pero no se detecta en el TGN [36], al contrario que RabE. rabDΔ no impidió la secreción de
EglC-GFP-GPI; sin embargo afectó a su localización en la superficie celular. Mientras que la
localización normal es “antipolarizada” a lo largo de las hifas, rabDΔ provocó la polarización
de EglC-GFP-GPI, de manera que en el mutante predominaba en el casquete polar (Figura
R.77A). Es posible que RabD esté implicado en una ruta específica de tráfico exocítico
“basolateral” (por analogía con células de mamífero) y que, en ausencia de RabD, EglC viaje
por una ruta “directa” a la membrana apical. Alternativamente, EglC podría sufrir, en
condiciones wt, una secreción polarizada y que en el mutante rabDΔ la pared celular estuviese
alterada y se impidiese la difusión de EglC en el periplasma desde la región apical hacia
regiones basolaterales. Por otro lado, el mutante rabDΔ presentó niveles reducidos de todas las
especies moleculares de EglC-GFP-GPI (Figura R.77B). (Ver Discusión para la integración de
estos resultados en un modelo de secreción “basolateral”).

Figura R.77. Efecto de rabDΔ en la distribución y en los niveles de EglC-GFP-GPI. A. Imágenes

de microscopía que ponen de manifiesto el cambio en polaridad de EglC en rabDΔ. B.
Inmunodetección que muestra una reducción específica en los niveles de todas las formas de EglC.

4.7.7.4. EglC no necesita endosomas tempranos funcionales para su exocitosis

Para investigar la posibilidad de que, como en el caso de InuA (capítulo VI), los
endosomas estuviesen implicados en el tráfico de EglC utilizamos las dos mismas mutaciones
que afectan a la función de los endosomas y a su maduración, rabBΔ [158] y vps33ts [166], y
que impiden la secreción de inulinasa (Figura R.65). El mutante rabBΔ no impidió el tráfico de

Página 232
 Resultados. Capítulo VII
EglC-GFP-GPI ni alteró su maduración postraduccional (Figura R.78A-B). Por otro lado
vps33ts, no afectó el patrón electroforético de EglC-GFP-GPI, ni a 30ºC ni a 42ºC (Figura
R.78C). Estos resultados indican que la función endosomal no se necesita para la secreción de
EglC, lo que constituye una diferencia de gran importancia con la secreción de InuA, que
necesita la función de RabB y Vps33, y sugiere que InuA y EglC siguen rutas de exocitosis
diferentes.

Figura R.78. vps33ts y rabBΔ no afectan a EglC-GFP-GPI. A. Células rabBΔ y wt, tras 2.5 horas de
inducción de la expresión de EglC-GFP-GPI con sacarosa. La localización de EglC es indistinguible
en ambas cepas. B. Inmunodetección de EglC-GFP-GPI en una cepa wt y otra rabBΔ. La imagen de la
derecha es una mayor exposición de la misma inmunodetección. C. Como en B para vps33ts. No hay
diferencias entre la cepa silvestre y la mutante.

Página 233
DISCUSIÓN
 Discusión

5.1. Bloqueo condicional del tráfico de vesículas COPII y

localización de COPI
En el primer periodo de esta tesis seleccionamos alelos termosensibles de SarASar1, la
GTPasa que controla la formación de vesículas COPII. Para la obtención de los mutantes,
generamos, por mutagénesis al azar, una mutateca de alelos de sarA con la que transformamos
Aspergillus nidulans para seleccionar un total de 8 mutantes termosensibles, con el objetivo de
inactivar condicionalmente SarA. Únicamente existían mutantes termosensibles de esta GTPasa
en S. cerevisiae [262], las cuales muestran una actividad de intercambio de GTP reducida a
todas las temperaturas [263]. En nuestro caso, hemos determinado que los niveles de proteína
SarA en los mutantes utilizados disminuyen con el incremento de temperatura, lo que sugiere
que las mutaciones inducen defectos en el plegamiento de SarA, provocando su degradación.

La inactivación de SarA causa la parada de la extensión apical, tal como se ha

observado en numerosos mutantes condicionales que bloquean la ruta secretora [18, 37, 166].
También provoca la desorganización de los sitios de salida del retículo (ERES) y el bloqueo de
los cargos InuA y EglC en el retículo endoplasmático (RE), lo que confirma el bloqueo del
tráfico COPII. Por lo tanto, hemos desarrollado una herramienta genética para bloquear de
manera condicional el proceso de formación de las vesículas COPII y, por ende, el tráfico del
RE al aparato de Golgi.

La desorganización de los ERES en los mutantes sarA6 y sarA8 conlleva la formación

de grandes agregados que contienen la subunidad de COPII Sec23. Otros autores han
visualizado agregados similares al bloquear la formación de las vesículas COPII. En concreto,
estos autores utilizaron mutantes termosensibles de SEC12 y SEC16 en S. cerevisiae [19]
(Sec12p es la encargada de activar a Sar1 [64] y Sec16p es necesaria para la organización de los
ERES [59]), así como la droga cerulenina, que inhibe de la síntesis de ácidos grasos [19]. Estos
agregados también se forman en mamíferos: en células de Drosophila en cultivo, la inactivación
de Sar1 provoca la agregación de Sec16 en ERES inusualmente grandes [20]. Sin embargo,
existen mutantes que bloquean la salida del RE y no forman estos agregados [143, 264]. Por
tanto, la formación de estos agregados es un efecto causado por algunos bloqueos específicos de
la salida del RE. Los ERES contienen múltiples complejos COPII, que interaccionan entre sí a
través de la proteína Sec16 [59]. La relación estequiométrica entre las subunidades de COPII y
Sec16 en los ERES determina la organización de éstos [59]. Una posibilidad para explicar la
formación de los grandes agregados es que ciertos bloqueos de la salida del RE provoquen un
desequilibrio de los componentes de los ERES, causando el colapso del sistema y la agregación
de sus elementos.

Página 237
Discusión

5.2. Potencial morfogenético de la regulación de la salida del

RE
Nuestros datos muestran que tras el bloqueo de la salida del RE la extensión apical se
detiene y que el déficit en la eficiencia de la salida del RE, si se mantiene en el tiempo, causa
defectos morfogenéticos acusados, dando lugar a la formación de grandes globos apicales de
~10 µm de diámetro (unas 7 veces el ancho normal de una hifa). Estas estructuras presentan una
pared celular engrosada, una gran vacuola, numerosos núcleos y abundante RE. Los globos
recuerdan a diversas estructuras de hongos filamentosos formadas por la hifas, en condiciones
naturales: las esporas holoblásticas [265], los apresorios que desarrollan ciertos patógenos de
plantas [266] y las clamidosporas que se forman en la región apical de las hifas de Candida
albicans [267]. Al igual que los globos formados por sarA6 y sarA7, las clamidosporas de C.
albicans tienen una pared engrosada, abundante RE y una gran vacuola [268].

En A. nidulans el mutante mnrA455, y dos alelos mutantes de choC (choC3 y choCΔ)

también forman globos apicales [269-271]. mnrA455 es una mutación termosensible de una
fosfomanomutasa ortóloga de Sec53 [269]. La inactivación de Sec53 bloquea la salida de cargo
del RE [272] y, por tanto, mnrA455 podría provocar el mismo efecto. En relación al gen choC,
éste codifica una metil-transferasa de fosfolípidos, implicada en la síntesis de fosfatidil-colina
[270, 271]. Como se ha comentado antes, la inhibición de la síntesis de ácidos grasos con
cerulenina desorganiza los ERES e impide la salida de cargo del RE [19]. Las mutaciones en
choC podrían inhibir síntesis de fosfatidil colina y, por tanto, causar el mismo efecto que la
cerulenina, esto es bloquear la salida del RE. Por tanto el mutante mnrA455 y los dos alelos
mutantes de choC forman globos apicales quizá mediante el bloqueo de la salida del RE, del
mismo modo que sarA6 y sarA7.

En conjunto, toda esta información pone de relieve el potencial morfogenético de la

regulación del tráfico de salida del RE y sugiere que los cambios morfológicos que ocurren en el
desarrollo de los hongos filamentosos se regulan, en cierta medida, por modulación de la
exocitosis, mediante el control de la eficiencia del transporte dependiente de COPII.

5.3. Modelo de maduración de cisternas

Tan sólo 10-30 minutos después de la inactivación de SarA el aparato de Golgi se
desorganiza. Esta desorganización la hemos visualizado por microscopía de fluorescencia in
vivo, al observar proteínas tanto periféricas (CopA, subunidad esencial de COPI, y PH OSBP, que
reconoce Arf1 y PtdIns4P) como integrales de membrana (las t-SNAREs del Golgi SedV y
TlgB). Hemos demostrado que el aporte continuo de membranas desde el RE al Golgi es una

Página 238
 Discusión
condición indispensable para la organización y el mantenimiento de este último. Estos
resultados son difíciles de reconciliar con el modelo de cisternas estables, que propone que las
cisternas del Golgi son compartimentos permanentes que reciben y envían el cargo sin alterarse
en gran medida. Por el contrario, sugieren que el aparato de Golgi es un orgánulo transitorio y
dinámico, cuyo mantenimiento depende de la entrada de membrana y proteínas desde el RE.
Esta conclusión es consistente con el modelo de maduración de cisternas, según el cual las
nuevas cisternas del aparato de Golgi se forman por coalescencia de múltiples vesículas COPII,
mientras que las cisternas más ‘tardías’ se descomponen en vesículas secretoras [21, 88, 273].
En concordancia con los datos de esta tesis, en células de mamífero se ha detectado la
desorganización del aparato de Golgi tras la expresión de una forma inactiva de Sar1 [45].

Al inactivar sarA6, el Golgi temprano y el TGN se desorganizan de manera distinta: las

membranas del Golgi temprano se reabsorben por el RE y las cisternas del TGN se disipan. Este
resultado es consistente con el hecho de que el Golgi temprano y el Golgi tardío o TGN
presentan diferencias composicionales y funcionales [22, 23]. En el estudio anteriormente
mencionado, en el que visualizan la desorganización del Golgi en células de mamífero al
expresar una forma inactiva de Sar1 [45], los autores observan que el Golgi se reabsorbe
completamente por el RE. Sin embargo sólo utilizan marcadores de cis-Golgi (p58, GRASP65 y
GM130) y, por tanto, no determinan el destino de las membranas del TGN. La reabsorción del
Golgi temprano por el RE descrita en esta tesis es consistente con que, en condiciones normales,
exista un equilibro dinámico entre el tráfico del RE al Golgi mediado por COPII y el transporte
retrógrado del Golgi al RE realizado por COPI. Según esta interpretación, una vez inactivado
SarA el tráfico COPII se detiene y el trasporte retrógrado de COPI envía las membranas y las
proteínas del Golgi temprano al RE, donde se acumulan. Por otro lado, el hecho de que el TGN
no se reabsorba por el RE al inactivar SarA muestra que COPI no es capaz de enviar las
membranas del TGN al RE. Esto concuerda con la observación de que la subunidad α de COPI,
denominada CopA, se localiza en el Golgi temprano. La localización preferente de COPI en S.
cerevisiae también es el Golgi temprano [27, 274, 275]. Además, HypB no es necesaria para
reclutar a CopA al Golgi, lo que refuerza el hecho de que CopA no reside, en el estado
estacionario, en el TGN (HypB activa a Arf1 específicamente en el TGN y Arf1 es la GTPasa
que recluta a COPI). Estas observaciones sugieren que existe cierta independencia funcional
entre COPI y el TGN. En un reciente trabajo, Glick y colaboradores estudian la función de
COPI y proponen que no realiza un transporte retrógrado desde el TGN [27]. Según estos
autores, COPI únicamente realiza transporte retrógrado en del Golgi temprano, al menos en S.
cerevisiae. Estos autores proponen que las vesículas de clatrina/AP-1 son las encargadas del
transporte retrógrado en el Golgi tardío (TGN). De hecho AP-1 está involucrado en la
localización en el TGN de un gran número de proteínas, como Tlg1p, Drs2p, Chs3p, Pin2p y
Kex2p [276-280]. Aunque se ha interpretado que el adaptador AP-1 media rutas de reciclaje

Página 239
Discusión
desde los endosomas tempranos, también podría realizar tráfico intra-Golgi, ya que se localiza
en el Golgi tardío [168]. En conclusión, la desorganización asimétrica del aparato de Golgi por
inactivación de SarA y la localización mayoritaria de COPI en el Golgi temprano, junto con
otras investigaciones [27], son consistentes con la idea de que COPI no es esencial para el
tráfico retrógrado desde el TGN.

5.4. Caracterización general de la familia Arf/Sar y de sus

reguladores
Mediante el análisis sistemático de las GTPasas de la familia Arf/Sar y de sus proteínas
reguladoras GEFs y GAPs hemos identificado y clasificado, en A. nidulans, los integrantes de
dichas familias y estudiado su nivel de conservación. Además, hemos realizado las deleciones
simples de sus genes para determinar el posible papel esencial de cada proteína. En primer
lugar, identificamos 7 GTPasas y fuimos capaces de encontrar los homólogos correspondientes
en S. cerevisiae y en humanos, excepto en un caso. Es notable la gran conservación que
presentan estas proteínas. De las 7 GTPasas, tres de ellas resultaron ser esenciales para el
crecimiento de A. nidulans: SarA, que funciona en el RE; ArfA, la GTPasa principal del aparato
de Golgi; y Arl2. En concordancia con estas observaciones, los homólogos de SarA y ArfA en
S. cerevisiae y en humanos realizan funciones esenciales [60, 214, 281]. En humanos, existen
dos isoformas de Sar1 (Sar1A y Sar1B) y determinadas enfermedades en el metabolismo de
lipoproteínas, incluyendo la enfermedad conocida como chylomicron retention diseases o
enfermedad de Anderson, son causadas por mutaciones en Sar1B [281]. Sin embargo, el
homólogo de Arl2 en S. cerevisiae, Cin4p, no es esencial [125]. En humanos, sus ortólogos se
denominan ARL2 y ARL3 y participan en el transporte de proteínas en las células
fotorreceptoras [126] y mutaciones en ARL3 provocan retinitis pigmentosa [127]. En S.
cerevisiae, Cin4 realiza funciones relacionadas con microtúbulos [125, 282]. Los microtúbulos
en S. cerevisiae no participan en la ruta secretora; sin embargo, en A. nidulans los microtúbulos
son esenciales para mantener un crecimiento por extensión apical eficiente, al colaborar con los
cables de actina [36]. Hipotéticamente, la GTPasa Arl2 de A. nidulans podría reclutar efectores
a las membranas del Golgi que mediasen la interacción con microtúbulos.

Por otra parte también hemos identificado y delecionado los genes que codifican las
proteínas reguladoras de estas GTPasas, es decir sus GEFs y sus GAPs correspondientes. Pese a
existir un grado de conservación suficiente como para asignar los homólogos en otras especies,
existe una mayor divergencia en estas GEF que en las GTPasas Arf/Sar que activan. De las 5
GEF halladas, 2 de ellas son esenciales: Sec12, que activa a SarA en el RE (Ignacio Bravo

Página 240
 Discusión
Plaza, sin publicar); GeaA, la GEF del Golgi temprano y HypB, su equivalente en el TGN. En
S. cerevisiae, las proteínas homólogas de estas tres GEFs son también esenciales [216, 283].

Finalmente, de un total de 5 GAPs identificadas y delecionadas, solamente la codificada

por AN1931 (Age1a) es esencial. Syt1b y Glo3 se requieren para la esporulación a alta
temperatura y la deleción de gcs1 no presenta defecto alguno en el crecimiento. Las proteínas
GAPs de Arf/Sar están menos conservadas que las GEFs. De acuerdo con este hecho, existe una
divergencia en sus funciones, al menos en la función de Gcs1. En S. cerevisiae Gcs1p se
requiere para el tráfico de Snc1 a la membrana plasmática; sin embargo, el ortólogo en A.
nidulans no es necesario para la localización de SynA, ortólogo de Snc1 (Figura R.27).

La identificación de las GTPasas de la familia Arf/Sar y de sus GEFs y GAPs supone la

clasificación más detallada de estas proteínas en el género Aspergillus. Las características de
estas GTPasas compartidas con sus posibles ortólogos en S. cerevisiae y humanos ponen de
manifiesto el alto grado de conservación de estos interruptores moleculares. La deleción de los
genes que las codifican mostró una alta proporción de genes esenciales, la mayoría de los cuales
también realizan funciones esenciales en S. cerevisiae y en humanos, indicando la conservación
de sus funciones en eucariotas.

5.5. GeaA1 mantiene el crecimiento en ausencia de HypB

El Golgi temprano y el TGN comparten una misma GTPasa reguladora, Arf1. Sin
embargo, existe una GEF de Arf1 específica para el Golgi temprano (GeaA/Gea1/GBF en A.
nidulans/S. cerevisiae/mamíferos) y otra específica para el TGN (HypB/Sec7/BIG). Estas
GEFs presentan alto grado de conservación en eucariotas [130]. GeaA y HypB son proteínas
esenciales para el crecimiento. En este trabajo hemos aprovechado la existencia de un alelo
termosensible de hypB (hypB5) para buscar mutaciones extragénicas que permitiesen el
crecimiento de la cepa hypB5 a 42ºC, mediante mutagénesis con ultravioleta. De un total de 40
clones revertientes capaces de crecer a 42ºC, 39 de ellos tenían mutaciones adicionales en hypB,
mientras que uno presentaba el alelo hypB5 intacto, por lo que lo seleccionamos. Tras el mapeo
genético descubrimos que este clon tenía una mutación en geaA (alelo geaA1) que, como
demostramos, es la causante de la supresión. Esta mutación provoca la sustitución Tyr1022Cys
en GeaA. Tyr1022 está localizada en un motivo conservado Ser-Ω-ϕ, presente en la subfamilia
Gea/GBF (donde Ω es un aminoácido aromático y ϕ un residuo hidrofóbico). El alelo geaA1
también revierte la letalidad resultante de hypBΔ. geaA1 es hipomorfo, ya que una cepa geaA1
crece peor que una cepa silvestre. Esto sugiere que la capacidad de GeaA1 de suplir HypB
ocurre a expensas de su función fisiológica. Hemos demostrado que Tyr1022Cys induce un
cambio en la distribución subcelular de GeaA1 (Figura R.30). Este cambio parece reflejar su

Página 241
Discusión
desplazamiento hacia fases posteriores de la ruta secretora ya que GeaA1 se redistribuye, en
parte, a la membrana apical, donde las vesículas exocíticas se fusionan preferentemente [12]. El
cambio en la localización podría reflejar una dinámica alterada del Golgi, que resultase en el
desvío de una parte de GeaA1 a la membrana plasmática. Alternativamente, la sustitución
Tyr1022Cys podría provocar, directamente, un reclutamiento anormal de GeaA1 a la membrana
plasmática, en cuyo caso el cambio en localización per se provocaría la supresión. En esta línea,
una posibilidad altamente especulativa sería que GeaA1 reorganizase la ruta exocítica de tal
modo que se evitase el paso del cargo por el TGN. De hecho, existe un precedente de
reorganización de la ruta secretora por manipulación de un ortólogo de GeaA, en casos de
infección vírica [284].

En el capítulo V, investigamos el efecto de GeaA1 sobre el tráfico de la quitina sintasa

ChsB, y descubrimos que GeaA1 es capaz de restaurar la localización normal de ChsB en la
membrana apical en un fondo genético hypB5. En este experimento, en el que GeaA1 estaba
marcado con GFP, comprobamos que mCherry-ChsB y GeaA1-GFP no colocalizan en las
cisternas intracelulares en el fondo hypB5. Dado que GeaA1 se localiza, además de en la
membrana apical, en el Golgi temprano y, en este experimento, no colocaliza con ChsB, ChsB
debe de localizarse en el TGN, como en una cepa silvestre. Este resultado parece poco
compatible con un mecanismo de supresión que evite el paso del cargo (como ChsB) por el
TGN, ya que ChsB se localiza en él cuando se inactiva HypB en presencia de GeaA1. También
argumenta en contra de que GeaA1 medie un reciclaje de ChsB desde la membrana plasmática a
través del Golgi temprano, a no ser que el tiempo de estancia de ChsB en éste fuese tan corto
que la hiciese indetectable.

Por otro lado, Tyr1022Cys provoca un ligero incremento en la localización de GeaA1

en el TGN (Figura R.31B), incremento que se hace más patente tras el tratamiento con
Brefeldina A. Además, las deleciones de arl1 y de arl3, cuyos productos son GTPasas del TGN,
reducen la capacidad de supresión de geaA1 (Figura R.33). En S. cerevisiae, Arl3p recluta a
Arl1p al TGN [121, 222] y, a su vez, Arl1p, Gea2p (ortóloga de GeaA) y Drs2p forman un
complejo en la membrana del Golgi [124]. Por tanto, en A. nidulans, es posible que Arl1 y Arl3
estén implicados en el reclutamiento de una parte de GeaA al TGN, lo que podría facilitar la
supresión. Estos resultados, en conjunto, sugieren que el mecanismo de supresión implica la
acción de GeaA1 en el TGN, donde hipotéticamente podría activar a Arf1 y facilitar, aunque
algo ineficientemente, el funcionamiento de la ruta secretora en ausencia de HypB. De acuerdo
con esta hipótesis, GeaA1 sería capaz de desarrollar las funciones esenciales de HypB en el
TGN y, por tanto, ambas GEF serían, hasta cierto punto, intercambiables.

Con los datos de que disponemos actualmente, sólo podemos especular sobre el
mecanismo por el cual Tyr1022Cys cambia la localización de GeaA1. La sustitución podría

Página 242
 Discusión
alterar la interacción del motivo Ser-Ω-ϕ con un adaptador de reciclaje retrógrado que
hipotéticamente se requiriese para relocalizar GeaA en el Golgi temprano durante el proceso de
maduración cisternal. Esto implicaría que si GeaA1 se reciclase de un modo ineficiente e
invadiese el TGN, debería viajar rápidamente con las vesículas de exocitosis, ya que sólo hemos
detectado un pequeño incremento en la localización de GeaA1 en el TGN. Una alternativa un
poco diferente sería que GeaA residiese en el Golgi temprano por detección simultánea de
varios tipos moleculares como, por ejemplo, un tipo de lípido y Arf1. La sustituciónTyr1022Cys
eliminaría la detección de una de estas moléculas, lo que causaría una localización de GeaA1
más amplia. A este respecto, un fragmento del ortólogo de GeaA de mamíferos, GBF1, que
contiene el motivo Ser-Ω-ϕ, interacciona in vitro con el fosfolípido PI(3,4,5)P3 y permite la
localización de GBF1 en la membrana plasmática [285]. Por tanto, el motivo Ser-Ω-ϕ podría ser
necesario para la interacción de GeaA con lípidos. El hecho de que una sustitución en GeaA
permita el crecimiento fúngico en ausencia de HypB es de gran importancia, ya que GeaA y
HypB son las dos únicas GEFs del aparato de Golgi esenciales para el crecimiento (capítulo II).
En cualquier caso, en el futuro será necesario investigar en profundidad el mecanismo molecular
por el que Tyr1022Cys relocaliza GeaA1.

5.6. Cartografiado del tráfico de tres cargos de la ruta

secretora: ChsB, InuA y EglC
En la última parte de esta tesis investigamos el tráfico de tres proteínas diferentes. En
primer lugar, estudiamos la proteína integral de membrana ChsB, una quitina sintasa encargada
de la síntesis de quitina en el proceso de construcción de nueva pared celular. Previamente se
había demostrado que esta enzima se localiza exclusivamente en la región apical de la
membrana plasmática de las hifas. El segundo cargo que investigamos es una enzima
exoglucanasa, EglC, que se encuentra unida a membrana por un anclaje de glicosil fosfatidil
inositol (GPI). Las proteínas ancladas a GPI (GPI-AP) circulan por una ruta de exocitosis que,
en levaduras y mamíferos, presenta diferencias con otros tipos de cargo [2, 31, 145]. En tercer
lugar, investigamos la secreción de una enzima soluble, cuya expresión se encuentra regulada.
Se trata de la inulinasa InuA. En S. cerevisiae se habían descrito diferencias en las rutas de
exocitosis para enzimas solubles, las PA-GPI y proteínas transmembrana [29-33]. Además,
existía evidencia adicional en mamíferos de que las rutas de exocitosis de distintos tipos
proteicos divergen [34, 35]. En resumen, tratamos de responder a la siguiente pregunta: ¿existen
diferentes rutas de exocitosis para proteínas con diferente estructura y función fisiológica? Al
final de este apartado, se trata de dar una respuesta razonada a la pregunta, a la luz de los
resultados de esta tesis.

Página 243
Discusión
5.6.1. La ruta de reciclaje endocítico de ChsB
ChsB participa en la síntesis de la pared celular en los sitios de crecimiento polarizado
[28]. Las quitinas sintasas actúan en la membrana plasmática y utilizan uridina-difosfo-N-
acetilglucosamina citosólica como sustrato para sintetizar quitina, la cual se deposita en la pared
celular a medida que se sintetiza, a través de un conducto que atraviesa la membrana plasmática
y que forma la propia quitina sintasa [286]. Como proteínas integrales de membrana, viajan
embebidas en la membrana de las vesículas secretoras y son transferidas a la membrana
plasmática allí donde dicha vesícula se fusiona por exocitosis. En los hongos filamentosos A.
nidulans, Neurospora crassa y Ustilago maydis las vesículas secretoras se fusionan con la
membrana apical [17, 36, 287]. Sin embargo, dicha exocitosis apical no sería capaz, per se, de
generar la polaridad que ChsB y otras proteínas de membrana presentan [28, 173], ya que
cualquier proteína integral de membrana, una vez en la membrana plasmática, difundiría
rápidamente en la bicapa lipídica en sentido basípeto. Esta difusión alteraría la localización de
ChsB y el resto de proteínas polarizadas.

Valdez-Taubas y Pelham demostraron que la polarización inicial que se da por

exocitosis localizada se puede mantener si las proteínas se endocitan antes de que la difusión
elimine la polarización [32]. Estas proteínas de membrana, una vez endocitadas, se envían de
nuevo a la membrana plasmática en un proceso conocido como reciclaje endocítico [32].
Investigaciones posteriores demostraron que en A. nidulans la maquinaría endocítica predomina
en un anillo subapical, cuya disposición delimita la localización de las proteínas de membrana
que están polarizadas en la región apical de las hifas [12, 190, 231]. La v-SNARE SynA y la
flipasa DnfA son dos ejemplos bien estudiados de proteínas que se mantienen polarizadas
gracias a la endocitosis. De hecho, se ha demostrado que mutaciones específicas en synA [38] y
en dnfA [173] provocan la pérdida total de polarización de SynA y DnfA, ya que previenen su
endocitosis. Con estos datos, hipotetizamos que la polarización de las enzimas modificadoras de
la pared celular en la región apical estaría mediada por reciclaje endocítico. En este trabajo
hemos demostrado que la localización de ChsB en la membrana plasmática se encuentra
restringida a la región anterior al anillo de endocitosis y que la inhibición de la endocitosis
provoca la pérdida de polarización de ChsB, lo que es consistente con su reciclaje endocítico.
De hecho, hemos demostrado que, en lugar de reciclar directamente desde endosomas [41],
ChsB viaja a las cisternas del TGN, donde permanece alrededor de 1 minuto a 28ºC para,
posteriormente, ser reenviada a la membrana plasmática. El hecho de que la inactivación de
HypB (Sec7p en S. cerevisiae) provoca que ChsB se acumule en estructuras internas con
identidad de TGN, sumado a que dicho efecto no ocurre en una cepa geaA1, constituye la
demostración definitiva de que ChsB viaja por esta ruta de reciclaje indirecto, a través del TGN
(ver modelo en Figura D.1).

Página 244
 Discusión
¿Qué ruta sigue ChsB para volver desde el TGN a la membrana plasmática? En A.
nidulans, se conoce la formación de vesículas secretoras a partir de las membranas del TGN.
Este proceso ocurre tras la activación y el reclutamiento de RabE al TGN por parte del complejo
TRAPPII [36, 37]. En esta tesis hemos determinado que la inactivación de Trs120, un
componente esencial de TRAPPII, provoca la relocalización de ChsB desde la membrana apical
a estructuras internas. Este hecho demuestra que TRAPPII es necesario para el tráfico de ChsB a
la membrana plasmática y sugiere que ChsB viaja a la membrana plasmática por la ruta
dependiente de RabE, lo que es consistente con el conocido papel de los ortólogos de RabE en
el reciclaje endocítico [288-291]. Sin embargo, en N. crassa las quitina sintasas se asocian con
una población de vesículas que se encuentran en la parte central del Spitzenkörper [235]. Esta
región central no contiene YPT-31 (RabE en A. nidulans), que por el contrario se asocia con la
región periférica del Spitzenkörper, sino que es rica en YPT-1 (RabO). A. nidulans podría
diferir de N. crassa en esta característica en particular, dado que RabE parece encontrarse en
todo el Spitzenkörper [36]. Al igual que en N. crassa, en A. nidulans RabO también se
encuentra en el Spitzenkörper [18], donde colocaliza con ChsB (Figura R.49A). De hecho, la
inactivación de RabO deslocaliza rápidamente ChsB de la membrana plasmática y la mutación
rabOts presenta una interacción sintética negativa con el alelo gfp-chsB. Hipotéticamente RabO
y RabE podrían colaborar en el tráfico de ChsB a la membrana plasmática. De hecho, los
ortólogos de RabO y RabE en S. cerevisiae, Ypt1p e Ypt31p respectivamente, cooperan para
regular Sec7p (HypB en A. nidulans) en el TGN [133].

5.6.1.1. El requerimiento de dineína

La inactivación de la dineína provoca la acumulación de ChsB en un compartimiento

membranoso que se marca con FM4-64 poco tiempo después de la adición de este trazador de
endocitosis (Figura R.44B). Esta observación nos lleva a concluir que existe un compartimento
endosomal por el cual transita ChsB en su viaje al TGN desde la membrana plasmática (Figura
D.1). Los endosomas tempranos, que contienen y requieren RabB (RAB5 en mamíferos) para
funcionar, se alejan del ápice utilizando dineína [186]; sin embargo, es improbable que la “ruta
RabB” medie el reciclaje de ChsB porque la localización de ChsB no está alterada en el mutante
rabBΔ (Figura R.51). Este resultado sugiere que ChsB transita por membranas endosomales que
están aguas arriba de los endosomas tempranos (= “endosomas RabB”).

Por otro lado, en ausencia de dineína funcional los endosomas tempranos se acumulan
en la misma región subapical donde se concentra ChsB [157, 239, 292-295]. Proponemos la
existencia de un endosoma de sorting que contenga al menos dos dominios diferentes, uno
destinado al reciclaje al TGN (con ChsB) y el otro encargado de la degradación endocítica (con
RabB) (Figura D.1). En ausencia de dineína, debido a la inexistencia de fuerzas mótiles que

Página 245
Discusión
resuelvan dichos dominios, ChsB y RabB podrían encontrarse en un mismo compartimento sin
dominios definidos. En este escenario, ChsB estaría acumulado en un compartimento anormal
con identidad mixta. SynA también se encuentra en estos endosomas anormales formados tras la
inactivación de la dineína [157], lo que subraya las coincidencias en el tráfico de ChsB y SynA.

Figura D.1. Modelo de reciclaje de ChsB. ChsB viaja a la membrana plasmática en vesículas
secretoras (en rojo), previa acumulación en el Spitzenkörper (SPK), y difunde en la membrana hasta
que es capturado y endocitado por el collar endocítico de la región subapical. Las vesículas
endocíticas, cargadas con ChsB, llegan a un endosoma de organización (sorting endosome). En este
compartimento, los dominios enriquecidos con RabB adquieren identidad de endosomas tempranos
(ET, en azul), se unen a dineína para transportarse en sentido basípeto y progresar en la ruta de
degradación endocítica. Por su parte, ChsB se segrega en dominios diferentes (en verde), que se
fusionan con el TGN en un proceso que implica a RabC, GARP y la dineína. Una vez en el TGN,
ChsB se concentra en vesículas con RabE (en rojo), quizás con la cooperación de RabO, que se envían
al Spitzenkörper (SPK). Además, deben existir rutas alternativas menores (flechas amarillas finas)
entre los endosomas y el TGN o el Golgi temprano, lo que permite un reciclaje parcial en ausencia de
GARP o RabC.

Página 246
 Discusión
5.6.1.2. El transporte de ChsB desde los endosomas al TGN mediado por RabC/GARP

Para el transporte eficiente desde los endosomas de sorting al TGN en mamíferos,

RAB6 (RabC en A. nidulans [38]) recluta al complejo de anclaje GARP a las membranas del
Golgi [39]. Ni la deleción de vps52 (Vps52 es una subunidad de GARP) ni rabCΔ provocan una
deslocalización completa de ChsB del domo apical a 28ºC (figura R.52A-B); sin embargo, a
37ºC dicha deslocalización de ChsB sí es completa (Figura R.52). Esta deslocalización
correlaciona con la redistribución de ChsB a vacuolas y, por lo tanto, es indicativa de que se
produce un fallo en el reciclaje desde los endosomas al TGN; es decir, al no clasificarse ChsB
para reciclaje desde los endosomas sigue la ruta de degradación endosomal, la cual termina en
las vacuolas. El diferente grado de afectación a 28ºC y 37ºC puede deberse al hecho de que la
extensión apical es mucho más rápida, lo que con toda probabilidad impone una mayor carga en
la ruta reciclaje.

Un posible sustituto para la función de GARP que explicaría el reciclaje parcial de

ChsB a 28ºC sería el complejo COG (conserved oligomeric Golgi) [296], el cual puede actuar
tanto en el Golgi temprano [164, 297, 298] como en el TGN [299]. Una posibilidad alternativa
sería que la ruta biosintética de ChsB aportase suficiente enzima a 28ºC como para detectarse en
la membrana plasmática en ausencia de reciclaje endocítico. Sin embargo, esta posibilidad es
improbable ya que los resultados obtenidos con el mutante sarA6 sugieren que el aporte de
ChsB al sistema por síntesis de novo en el estadio de hifas es bajo o inexistente (Figura R.53).
En último lugar, es posible que, en ausencia de GARP, una proporción de ChsB viaje a la
membrana plasmática directamente desde los endosomas de sorting por una ruta de reciclaje
endocítico directo [41].

En resumen, nuestros resultados sugieren que la polarización de ChsB se puede

mantener por varias vías, lo que pone de manifiesto la robustez del sistema de reciclaje
endocítico que, por otro lado, parece crucial para el proceso de extensión apical a la vista de los
defectos causados por la ausencia de GARP. De entre estas rutas, la mediada por RabC y GARP
parece ser una ruta principal. Por tanto, la ruta de reciclaje seguida por ChsB (y probablemente
SynA) es similar a la seguida por Snc1 en S. cerevisiae, la cual requiere Ypt6 (RabC en A.
nidulans) y GARP [40].

5.6.2. El tráfico y las modificaciones postraduccionales de InuA y EglC

Hemos desarrollado un sistema de expresión regulable para estudiar la ruta de
exocitosis de InuA y EglC, marcadas con HA3 y GFP, respectivamente. En concreto, hemos
aprovechado la regulación transcripcional de la expresión de InuA. En uno de los primeros
estudios de la ruta secretora con mutantes condicionales, Schekman y colaboradores utilizaron

Página 247
Discusión
un sistema similar [248]. En presencia de glucosa como fuente de carbono apenas hay expresión
de InuA, sin embargo si se utiliza sacarosa la expresión se incrementa considerablemente. Este
nuevo método de regulación de la expresión en A. nidulans, mediante la integración del gen
deseado en el locus de inuA puede ser útil para investigaciones futuras y presenta ventajas
significativas respecto a los promotores regulables que actualmente se utilizan: no requiere un
gran tiempo de inducción ni un cambio de la fuente de nitrógeno, como sí ocurre con el
promotor niiAP [171] ni se necesita la utilización de fuentes de carbono pobres, como sí sucede
con el uso del promotor alcAP [18].

5.6.2.1. La N-glicosilación de InuA

InuA es una inulinasa que contiene un total de 8 motivos de N-glicosilación Asn-X-

Ser/Thr. De hecho, investigaciones previas demostraron que InuA se glicosila [245].
Efectivamente hemos determinado que el complejo patrón electroforético que InuA presenta se
debe a la N-glicosilación que esta enzima, durante su viaje al exterior celular, adquiere. Esto lo
hemos demostrado mediante la utilización de la enzima PNGasa F, que sólo elimina N-glicanos
de las proteínas sustrato [252]. Tras dicho tratamiento, todas las especies de InuA tanto del
micelio como del espacio extracelular se transforman en una banda que coincide en movilidad
electroforética con la predicha para el producto de InuA procesado por la peptidasa señal
(Figura R.59B-C).

La clasificación de las diferentes especies glicosiladas de InuA en dos grupos,

glicosilación basal (GB) y glicosilación abundante (GA), nos permitió iniciar la investigación de
un modo lógico y ordenado. Inicialmente demostramos que las formas GB, que se visualizan en
western-blot como bandas discretas, corresponden a InuA con más o menos bloques de N-
glicanos, al observar que las especies GB se desplazan a bandas con menor movilidad tras
inhibir específicamente la N-glicosilación en el RE con tunicamicina. La adquisición de N-
glicanos por parte de otros cargos también produce un patrón de bandas discretas en geles de
acrilamida [248, 300]. Además, las especies GB se siguen produciendo cuando se bloquea la
salida del RE, lo que confirma que se forman en dicho compartimento.

Posteriormente, utilizamos un panel de mutaciones condicionales o de deleción de la

ruta secretora para determinar los requerimientos genéticos de la glicosilación de InuA.
Descubrimos que se requieren tres procesos para la conversión de InuA GB en InuA con
glicosilación abundante (GA): la salida del RE (que bloqueamos con sarA8), la llegada al
aparato de Golgi de las vesículas cargadas con InuA (sedVts y rabOts) y la función adecuada del
Golgi temprano (podB1). Por lo tanto, concluimos que la conversión de GB en GA se produce
por glicosilación en el aparato de Golgi, en el cual los N-glicanos añadidos en bloques en el RE
se modifican considerablemente [4, 301]. Estas modificaciones en el Golgi se muestran en geles

Página 248
 Discusión
de acrilamida como una señal difusa o smear tanto en el caso de InuA (Figura R.57C) como en
otros cargos [248, 300]. Las proteínas HypB (Sec7) y Trs120 no son necesarias para que InuA
adquiera un patrón de glicosilación intracelular normal. Sin embargo, el mutante hypB5 a
temperatura semipermisiva secreta InuA hipoglicosilada. Es posible que la ausencia de función
de HypB afecte a la organización del Golgi temprano, reduciendo la eficiencia de glicosilación.
Alternativamente, también podría ser necesaria cierta función del TGN para la glicosilación de
InuA. Otra posibilidad es que, a temperatura semipermisiva, la actividad GEF de HypB esté
totalmente inhibida (la sustitución que provoca la termosensibilidad se encuentra en el dominio
GEF) mientras que otras funciones no estén afectadas. En esta línea, la inactivación selectiva de
la función GEF podría alterar el Golgi temprano, por ejemplo al secuestrar gran cantidad de
Arf1 en el TGN, que al no adquirir GTP no realiza su función y no se libera.

Las mutaciones sarA8 y rabOts presentan un aparato de Golgi parcialmente

desorganizado a temperatura permisiva (capítulo I y [18]). A temperatura semipermisiva tanto
sarA8 como rabOts provocan la secreción de las especies GB de InuA. Una explicación
plausible es que la desorganización parcial del Golgi, causada por la incubación de estos
mutantes a temperatura semipermisiva, impida la glicosilación pero permita el tráfico de InuA
por el Golgi y su secreción. En cualquier caso, este resultado demuestra que las modificaciones
en los N-glicanos de InuA que se producen en el Golgi no son un requisito para su secreción. La
cinética de transporte de InuA en la ruta secretora podría no depender de su glicosilación. Esto
concuerda con el efecto de la tunicamicina que, pese a inhibir parcialmente la glicosilación en el
RE, no impide la secreción de InuA y sólo la reduce a concentraciones altas (Figura R.60).

5.6.2.2. Las modificaciones postraduccionales de EglC

Pese a que no hemos comprobado qué tipo de modificación postraduccional sufre EglC
y que causa el patrón de bandas que presenta en geles desnaturalizantes de poliacrilamida, es
probable que la modificación principal sea la N-glicosilación, por su semejanza con el patrón de
InuA. De hecho, hemos comprobado que la salida del RE es necesaria para la adquisición de las
modificaciones que dan lugar a las especies moleculares de menor movilidad denominadas E 2,
lo que es consistente con que las formas E2 se produzcan en el Golgi por modificación de las
especies E1, formadas en el RE. Por tanto, aparentemente, InuA y EglC sufren modificaciones
postraduccionales relativamente similares (GPI excluido). Por otro lado, EglC es una PA-GPI y
el anclaje y la maduración del GPI son procesos necesarios para su salida del RE [2]. Pese al
pequeño incremento en masa que supone la adición del GPI (~1.9 kDa) y la aún menor
variación que conlleva su remodelado, es posible que en alguno de los mutantes utilizados en
nuestros estudios éstos procesos no estén ocurriendo eficientemente. En el mutante sarA6, a
37ºC existe un desplazamiento de la banda principal de E1, que podría corresponder a una

Página 249
Discusión
deficiencia en el remodelado del GPI. Esta interpretación, aunque por el momento especulativa,
dejaría abierta la puerta a un posible requerimiento de SarA en el remodelado del GPI. Por otro
lado, formalmente es posible que dicha banda correspondiese a EglC totalmente N-glicosilado y
acumulado en el RE o en el Golgi a la espera de las glicosilaciones que la transformarían en E2,
que podrían ocurrir de manera ralentizada por la desorganización del Golgi que causa sarA6 a
dicha temperatura.

5.6.2.3. La parte común de las rutas de exocitosis de InuA y EglC

La secreción de InuA y EglC requiere la formación de las vesículas COPII por parte de
SarA y su correcta llegada y fusión con el aparato de Golgi, como demuestra la inhibición de la
exocitosis en los mutantes condicionales de la GTPasa SarA y de la SNARE SedV (así como de
RabO en el caso de InuA, no estudiado con EglC). De hecho, EglC se acumula en el RE en el
mutante sarA6 (Figura R.73). Estos resultados demuestran que InuA y EglC viajan al aparato de
Golgi en vesículas COPII, donde se fusionan en un proceso que requiere la intervención de
SedV y, al menos en el caso de InuA, también de RabO. Por tanto, InuA y EglC no se exocitan
por una ruta secretora no convencional que no implique al Golgi [302-304]. Los datos también
indican que ambos cargos atraviesan el TGN en su camino al exterior celular, ya que los
reguladores esenciales del TGN HypB y Trs120 (TRAPPII) son necesarios para la secreción de
InuA y, además, la inactivación de Trs120 impide la exocitosis de EglC y provoca su
acumulación en estructuras intracelulares (Figura R.76B).

En los mutantes en los que InuA o EglC no se exocitan no hemos detectado por lo
general un incremento considerable de los niveles intracelulares de proteína, con alguna
excepción. Por ejemplo, en el mutante sarA8 a 30ºC, existe un incremento de las formas GB de
InuA, sin embargo este incremento no se detecta a temperatura restrictiva, a la cual la secreción
de InuA está totalmente inhibida (Figura R.61A). Creemos que en estas condiciones no
aumentan los niveles de cargo retenido en el RE en el caso de sarA8 porque debe de activarse la
ruta de degradación de proteínas por estrés en el RE (ERAD) [305]. En el resto de casos, donde
InuA se bloquea en fases posteriores, es posible que exista una parada general de la ruta, lo que
provoque una inhibición de la síntesis/translocación de más proteína o una degradación continua
del exceso de cargo.

5.6.2.4. La rama específica de InuA en la ruta secretora

Hemos demostrado que el regulador maestro de los endosomas tempranos, RabB y uno
de sus efectores (Vps33) son específicamente esenciales para la secreción de InuA (Figura
R.65). Los otros dos cargos estudiados, ChsB y EglC, no necesitan RabB para su exocitosis

Página 250
 Discusión
(Figuras R.51 y R.78A-B). Estos resultados sugieren que InuA sigue una ruta de secreción
especial.

En S. cerevisiae, se han descrito dos rutas diferenciadas de secreción desde el TGN [29,
30]. Una de ellas es independiente de la función de los endosomas y por ella viajan la PA-GPI
Bgl2p y las proteínas integrales de membrana Snc1p y Pma1p [29, 30, 33]. La exocitosis de esta
primera ruta se realiza a partir de vesículas de baja densidad [29, 30]. Por la segunda ruta se
secretan, al menos, las enzimas solubles invertasa, fosfatasa ácida y exoglucanasa en vesículas
de alta densidad [29, 30]. Para que funcione esta última ruta se necesita que haya transporte de
vesículas de clatrina desde el TGN a los endosomas [29, 30, 33]. Si se bloquea este tráfico, por
mutaciones en CHC1, VPS1, PEP12 o VPS4 [30, 33, 306], las enzimas solubles mencionadas se
desvían hacia la otra ruta y se secretan en vesículas ligeras [30, 33]. Se ha propuesto que en esta
segunda ruta el cargo viaja a los endosomas antes de ser secretado [30, 33]. Teniendo en
consideración estas investigaciones, concluimos que la secreción de InuA en A. nidulans tiene
características comunes con la ruta dependiente de endosomas de S. cerevisiae.

Una diferencia entre la secreción de InuA en A. nidulans y la secreción de las enzimas

solubles antes mencionadas en S. cerevisiae es que, en el caso de A. nidulans, las mutaciones
que afectan a los endosomas impiden la secreción de InuA, en vez de divertir el tráfico por otra
ruta. Esta diferencia puede deberse a que en los mutantes que estamos utilizando en este trabajo
(rabBΔ y vps33ts) no se impida el viaje a los endosomas (como sucede en los mutantes probados
en S. cerevisiae), sino que, una vez en los endosomas, se imposibilite la salida de InuA de éstos.

RabB tiene una proteína paráloga, RabA, que puede, en parte, realizar sus funciones
[187]. De hecho, la doble deleción rabAΔ rabBΔ es letal [187]. RabA también se localiza en los
endosomas tempranos y, pese a no ser esencial para la función de los endosomas [157, 187], es
capaz de reclutar al complejo CORVET, aunque de un modo mucho más ineficiente que RabB
[187]. La función de RabA podría permitir, en ausencia de RabB, la recepción de InuA por los
endosomas anormales del mutante rabBΔ. Como consecuencia, InuA podría quedar atrapada en
endosomas incapaces de exportar cargo. En segundo lugar, vps33ts a 42ºC también impide la
secreción de InuA, quizá porque su inactivación no es total o porque no se necesita para la
recepción de tráfico biosintético por los endosomas (Vps45 podría sustituir a Vps33 en su
ausencia [161]). Sin embargo, otra alternativa es que el sistema de secreción de InuA funcione
de manera diferente al descrito en levadura para las enzimas invertasa, fosfatasa alcalina y
exoglucanasa. Mientras que en S. cerevisiae el tráfico de esta ruta puede desviarse en caso de
bloqueo, en A. nidulans el transporte a los endosomas podría ser una función esencial para la
secreción de InuA. Además, hay que tener en cuenta que la maduración de los endosomas es
esencial en A. nidulans [158], lo que sería consistente con una función secretora. En conclusión,

Página 251
Discusión
consideramos plausible que InuA se secrete por una ruta similar, pero no idéntica, a la de las
vesículas densas de levadura y diferente a la ruta que toman EglC y ChsB desde el TGN.

Por otra parte, VpsT (cuyo ortólogo en S. cerevisiae es Vps10p) es un receptor que
reconoce y envía hidrolasas desde el TGN al sistema endosomal y que podía ser un candidato
para mediar el tráfico de InuA a los endosomas [38]. Sin embargo, la deleción de vpsT no afecta
a la secreción de InuA. Por tanto, el tráfico de InuA es independiente de VpsT y se mantiene la
incógnita sobre el hipotético transporte que dirige InuA los endosomas. Además, la implicación
endosomal en la secreción de InuA parece restringirse a los endosomas tempranos, como
sugiere el hecho de que la secreción de InuA funciona a niveles normales en un mutante rabSΔ.
En S. cerevisiae, ni Vps10p (ortólogo de VpsT) ni la función de los endosomas tardíos son
necesarios para la ruta de exocitosis de las vesículas densas [30, 33].

Por tanto, proponemos un modelo por el que InuA viaja a los endosomas tempranos
antes de ser exocitado (Figura D.2). Existen dos posibilidades, una de ellas es que InuA vuelva
desde los endosomas tempranos al TGN para su exocitosis. La segunda es la secreción directa
desde los endosomas a la membrana plasmática. Se trata de una posibilidad muy atractiva, ya
que es un proceso que se ha descrito previamente en el reciclaje endocítico [41] y en la
secreción apical [13] y basolateral [34, 35, 42] que ocurre en mamíferos. Es más, en mamíferos,
RAB11 (homólogo de RabE) puede promover la exocitosis desde compartimentos endosomales
[13]. Este dato podría explicar el requerimiento de Trs120 para la secreción de InuA, mediante
la activación de RabE en endosomas. En el futuro será necesaria una investigación más
detallada para tratar de cartografiar de manera precisa la ruta de secreción de InuA en la
conexión TGN/endosomas. Sería informativo purificar los endosomas anormales de la cepa
rabBΔ y detectar si están enriquecidos en InuA y otras enzimas solubles que normalmente se
secreten, así como profundizar en la posible existencia de vesículas de secreción de distinta
densidad.

Una pregunta que queda por responder es ¿por qué existe exocitosis a través de los
endosomas? La respuesta puede estar en la naturaleza de los cargos. InuA es una enzima soluble
que únicamente se necesita si la inulina es la principal fuente de carbono en el medio. De hecho,
su síntesis está fuertemente regulada por la fuente de carbono. Por el contrario, tanto EglC como
ChsB son enzimas que se expresan de un modo constitutivo y que, además, están implicadas en
la síntesis de pared celular, proceso que ocurre en paralelo al crecimiento celular. Es posible que
la exocitosis de EglC y ChsB desde el TGN (pese a sus diferencias: ChsB proviene de reciclaje
endocítico y EglC de nueva síntesis en el RE), que es independiente de los endosomas,
constituya una ruta directa y siempre en funcionamiento: si hay crecimiento celular se necesita
la actividad de esta ruta para construir la pared. Por otro lado, la ruta por la que viaja InuA
puede ser una ruta regulada, en la que el paso por los endosomas constituiría un nivel de

Página 252
 Discusión

Figura D.2.Modelo especulativo del tráfico de ChsB, InuA y EglC. Según este modelo, ChsB
trafica (flecha azules) por reciclaje endocítico desde un endosoma de sorting al TGN, en un proceso
que implica a RabC, GARP y la dineína. En el TGN se concentra en vesículas RabE para viajar al
Spitzenkörper, desde donde se exocita en la región apical (la Figura D.1 muestra con mayor detalle el
modelo de reciclaje de ChsB). InuA y EglC se sintetizan en el RE, desde donde viajan al Golgi
temprano en vesículas COPII distintas. La cisterna del Golgi temprano madura hasta alcanzar el
estadio de TGN. En el TGN las rutas de InuA y EglC divergen. InuA (flechas verdes) viaja, en
vesículas de clatrina, a los endosomas tempranos mediante un proceso probablemente dependiente de
RabB y Vps33. Desde los endosomas tempranos InuA se secreta en vesículas RabE, pasando
previamente por el Spitzenkörper. Por otro lado, siguendo una ruta más directa de exocitosis, EglC
(flechas naranjas) se concentra en vesículas RabE que viajan al Spitzenkörper, antes de ser
enganchadas por microtúbulos y viajar en sentido basípeto. Finalmente EglC se exocita en regiones
apico-distales. (Es posible que la separación de EglC e InuA en vesículas COPII diferentes implique
que, en el Golgi, se encuentren también en cisternas diferentes).

Página 253
Discusión
regulación añadido al transcripcional, quizá de almacenamiento previo a su secreción. Otra
posibilidad, a nuestro juicio menos plausible, es que las enzimas solubles como InuA necesiten
modificaciones postraduccionales antes de ser secretadas, y que éstas se produzcan en los
endosomas. Una tercera posibilidad es que InuA no viaje a los endosomas antes de secretarse,
sino que se requiera un tráfico constante entre Golgi y endosomas para, de alguna manera,
facilitar la exocitosis de InuA.

5.6.2.5. La ruta directa de secreción de EglC: ¿secreción “basolateral”?

A diferencia de InuA, para la exocitosis de EglC no se requiere la integridad de los

endosomas tempranos, como demuestra su localización en la superficie celular en ausencia de
rabB (Figura R.78A). EglC probablemente se exocita por una ruta más directa desde el TGN.
Nuestros resultados indican que EglC se exocita desde el TGN en vesículas secretoras formadas
por RabE, ya que la inactivación de una subunidad de TRAPPII (Trs120, que activa a RabE [36,
37]) impide la exocitosis de EglC-GFP-GPI y provoca su acumulación en estructuras internas,
probablemente cisternas del TGN (Figura R.76B). Una característica particular de EglC (y de
GelE, la otra PA-GPI estudiada en este trabajo) es que su disposición en la superficie celular es
“antipolarizada”; es decir, con una mayor concentración en regiones apico-distales y una menor
presencia en la región apical (Figura R.72A). Esta distribución, que también se ha observado en
otros cargos en A. nidulans, como en la permeasa de aminoácidos AgtA [307], podría explicarse
por una alta difusibilidad de las proteínas exocitadas en la región más apical de la membrana y
el periplasma de las hifas y una menor capacidad de difusión en regiones apico-distales. De este
modo, las proteínas del periplasma, o integrales de membrana que no sufriesen reciclaje
endocítico, presentarían la localización “antipolarizada”. Sin embargo, esto no parece ser cierto
para todas ellas, puesto que la SNARE SsoA se dispone homogéneamente en toda la membrana
plasmática [12]. Otra posibilidad es que EglC se exocite por una ruta de secreción no apical. La
localización parcial de EglC en el Spitzenkörper (Figura R.70) parece, en principio,
incompatible con la secreción no apical; sin embargo, podría existir una ruta de secreción no
apical desde el Spitzenkörper que estuviese mediada por transporte basípeto de las vesículas
RabE en microtúbulos (Figura D.2) [15]. Esta hipotética ruta de secreción sería semejante a la
secreción basolateral que ocurre en células epiteliales de mamífero y explicaría el hecho de que
el ~24% de las vesículas RabE se desplazan en sentido basípeto [36], propulsadas por dineína
sobre los microtúbulos [15]. En resumen, EglC viajaría desde el TGN al Spitzenkörper en
vesículas RabE, donde estas vesículas se clasificarían para su envío en dineína/microtúbulos a
regiones apico-distales, donde EglC se exocitaría (ver modelo en Figura D.2). Además esta ruta
también daría cuenta de la localización de múltiples proteínas en el septo, entre ellas EglC y
GelE. Según este modelo, el Spitzenkörper sería un centro organizador de varias vías de

Página 254
 Discusión
secreción. De hecho, el Spitzenkörper de A. nidulans contiene diferentes tipos de vesículas
[173].

Un resultado que podría arrojar luz sobre esta cuestión es el efecto de rabDΔ sobre
EglC. En ausencia de la GTPasa RabD (cuyo homólogo en S. cerevisiae es Sec4p), EglC no se
dispone de manera “antipolarizada” en la superficie celular, sino que EglC presenta una
localización polarizada en el domo apical, semejante a la distribución de ChsB. Según nuestro
modelo, este efecto podría ser debido al desvío de EglC hacia una ruta de secreción polarizada.
RabD, como componente del complejo denominado exocisto, podría ser necesaria para una ruta
de secreción “basolateral”, mientras que la ruta de secreción apical sería menos dependiente de
RabD.

5.7. Discusión general y perspectivas de futuro

En los primeros capítulos de esta tesis hemos establecido el carácter transitorio y
dinámico del aparato de Golgi y su relación fundamental con el RE, lo que reafirma los
resultados de investigaciones realizadas con levaduras [43, 44] y células de mamífero [45, 46].
Los resultados obtenidos también ponen de manifiesto las diferencias existentes entre el Golgi
temprano y el TGN. Sin embargo, las proteínas GEFs esenciales del Golgi temprano (GeaA) y
del TGN (HypB) son, hasta cierto punto, intercambiables, puesto que una sustitución en GeaA
permite el crecimiento de A. nidulans en ausencia de HypB. El análisis bioinformático y la
deleción sistemática de las GTPasas de la familia Arf/Sar y de sus proteínas reguladoras (GEFs
y GAPs) demuestran el alto grado de conservación de estos interruptores moleculares de la ruta
secretora y nos permiten tener una visión general del papel de estas proteínas en el tráfico de
membranas en A. nidulans. Una vez establecidos estos hechos, nos dispusimos a investigar a los
protagonistas del tráfico: los cargos.

Gracias al estudio del tráfico de ChsB, InuA y EglC hemos encontrado diferencias en la
ruta que cada una de estas proteínas sigue para llegar a su destino final. En primer lugar, hemos
demostrado que la localización de ChsB en la membrana apical de las hifas, lejos de necesitar
un aporte continuo de enzima recién sintetizada, se mantiene por un reciclaje endocítico que
requiere la endocitosis de ChsB en la región subapical de la membrana, su reciclaje desde
endosomas al TGN (mediado, en parte, por la dineína, RabC y GARP) y su vuelta a la
membrana plasmática desde el TGN. En la salida de ChsB del TGN está implicada la proteína
HypB y probablemente el complejo TRAPPII y la GTPasa RabE. En segundo lugar, EglC
realiza una ruta a la superficie celular que depende del continuo transporte al aparato de Golgi
de vesículas COPII cargadas con EglC recién sintetizada en el RE, y de su exocitosis desde el
Golgi, probablemente en vesículas con RabE. La expresión de ChsB y EglC es constitutiva y los

Página 255
Discusión
‘endosomas RabB’ no intervienen en su transporte. En tercer lugar, la expresión de InuA está
regulada transcripcionalmente y su secreción está supeditada a la integridad de los endosomas
tempranos (=‘endosomas RabB’), pero no de los endosomas tardíos, lo que sugiere que transita
por los primeros antes de exocitarse.

A. nidulans debe coordinar la obtención de nutrientes del medio extracelular con su

crecimiento por extensión apical y la síntesis de pared celular [17]. En su conjunto, los
resultados de este trabajo sugieren que podrían existir diferentes rutas de tráfico intracelular
para satisfacer estas necesidades.

Página 256
CONCLUSIONES
 Conclusiones
1. La α-hélice C-terminal de SarA es clave para su función/estabilidad.

2. La inactivación de SarA desorganiza los sitios de salida del retículo (ERES) y

provoca la agregación de Sec23.

3. El bloqueo de la formación de las vesículas COPII provoca la desorganización del

aparato de Golgi y la parada de la extensión apical. Este efecto es sólo compatible con el
modelo de maduración de cisternas.

4. La desorganización del aparato de Golgi causada por el bloqueo del tráfico de salida
del retículo endoplasmático (RE) provoca la reabsorción de las membranas del Golgi temprano
en el RE y la disipación de las membranas del trans-Golgi (TGN).

5. El bloqueo del tráfico COPII tiene consecuencias morfogenéticas en la región apical

de las hifas de Aspergillus nidulans, que se traducen en la formación de globos apicales de ~10
µm de diámetro.

6. Las proteínas de la familia Arf/Sar y sus reguladores realizan funciones esenciales y

se encuentran altamente conservadas en A. nidulans con las de levaduras y humanos.

7. COPI y GeaA se localizan predominantemente en el Golgi temprano, siendo apenas

detectables en el TGN.

8. Las proteínas de la familia GBF/Gea contienen un motivo serina-residuo aromático-

residuo hidrofóbico (SΩϕ) universalmente conservado en eucariotas. La sustitución Tyr1022Cys
en el motivo SΩϕ de GeaA provoca la relocalización parcial al TGN y a la región apical de la
membrana plasmática.

9. La sustitución Tyr1022Cys en el motivo conservado SΩϕ de GeaA permite la

exocitosis y el crecimiento en ausencia de HypB.

10. La quitina sintasa ChsB se mantiene polarizada en el casquete apical de la

membrana plasmática mediante una ruta indirecta de reciclaje endocítico que comporta su
endocitosis en un anillo subapical de parches de actina, su viaje desde un compartimento
endocítico al TGN mediado por dineína, RabC y el complejo GARP, y su salida del TGN en
vesículas secretoras, de manera dependiente de HypB y Trs120.

11. La GTPasa RabO, que colocaliza con ChsB en el Spitzenkörper, es crítica para que
ChsB se localice en la membrana plasmática.

12. La ruta de reciclaje endocítico de ChsB es independiente de RabBRAB5 y del

exómero.

Página 259
Conclusiones
13. InuA es una inulinasa que se secreta al exterior celular por una ruta que requiere la
formación de las vesículas COPII, su llegada al aparato de Golgi, su paso por el TGN y la
funcionalidad de los endosomas tempranos, pero no de los endosomas tardíos.

14. Las proteínas ancladas a glicosil fosfatidilinositol (GPI) EglC y GelE presentan una
distribución “antipolarizada” en la superficie de las hifas.

15. La proteína anclada a GPI EglC se exocita por una ruta que implica la salida del RE
en vesículas COPII, su paso por el Golgi temprano y el TGN y su exocitosis directa desde el
TGN a la membrana plasmática de manera dependiente de Trs120.

16. En ausencia de RabDSec4 EglC se polariza al casquete apical.

Página 260
BIBLIOGRAFÍA
 Bibliografía
1. Breitling, J. & Aebi, M., N-linked protein glycosylation in the endoplasmic reticulum. Cold
Spring Harb Perspect Biol, 2013. 5(8): p. a013359.
2. Muñiz, M. & Riezman, H., Trafficking of glycosylphosphatidylinositol anchored proteins from
the endoplasmic reticulum to the cell surface. J Lipid Res, 2016. 57(3): p. 352-60.
3. Miller, E.A. & Schekman, R., COPII - a flexible vesicle formation system. Curr Opin Cell Biol,
2013. 25(4): p. 420-7.
4. Munro, S., What can yeast tell us about N-linked glycosylation in the Golgi apparatus? FEBS
Lett, 2001. 498(2-3): p. 223-7.
5. Berger, E.G. & Rohrer, J., Golgi glycosylation enzymes, en The Golgi Apparatus: State of the art
110 years after Camillo Golgi’s discovery, A.A. Mironov & M. Pavelka, Editors. 2008, Springer
Vienna: Vienna. p. 161-189.
6. Hutagalung, A.H. & Novick, P.J., Role of Rab GTPases in membrane traffic and cell physiology.
Physiol Rev, 2011. 91(1): p. 119-49.
7. Gillingham, A.K. & Munro, S., The small G proteins of the Arf family and their regulators.
Annu Rev Cell Dev Biol, 2007. 23: p. 579-611.
8. Mizuno-Yamasaki, E., Rivera-Molina, F., & Novick, P., GTPase networks in membrane traffic.
Annu Rev Biochem, 2012. 81: p. 637-59.
9. Allan, V. & Vale, R., Movement of membrane tubules along microtubules in vitro: evidence for
specialised sites of motor attachment. J Cell Sci, 1994. 107 ( Pt 7): p. 1885-97.
10. Guo, Y., Sirkis, D.W., & Schekman, R., Protein sorting at the trans-Golgi network. Annu Rev
Cell Dev Biol, 2014. 30: p. 169-206.
11. Deborde, S., Gravotta, D., Lakkaraju, A., & Rodriguez-Boulan, E., Golgi apparatus and
epithelial cell polarity, en The Golgi Apparatus: State of the art 110 years after Camillo Golgi’s
discovery, A.A. Mironov & M. Pavelka, Editors. 2008, Springer Vienna: Vienna. p. 563-579.
12. Taheri-Talesh, N., Horio, T., Araújo-Bazán, L., Dou, X., Espeso, E.A., Penalva, M.A., Osmani,
S.A., & Oakley, B.R., The tip growth apparatus of Aspergillus nidulans. Mol Biol Cell, 2008.
19(4): p. 1439-49.
13. Thuenauer, R., Hsu, Y.C., Carvajal-Gonzalez, J.M., Deborde, S., Chuang, J.Z., Romer, W.,
Sonnleitner, A., Rodriguez-Boulan, E., et al., Four-dimensional live imaging of apical
biosynthetic trafficking reveals a post-Golgi sorting role of apical endosomal intermediates.
Proc Natl Acad Sci U S A, 2014. 111(11): p. 4127-32.
14. Donovan, K.W. & Bretscher, A., Myosin-V is activated by binding secretory cargo and released
in coordination with Rab/exocyst function. Dev Cell, 2012. 23(4): p. 769-81.
15. Peñalva, M.A., Zhang, J., Xiang, X., & Pantazopoulou, A., Transport of fungal RAB11 secretory
vesicles involves myosin-5, dynein/dynactin/p25, and kinesin-1 and is independent of kinesin-3.
Mol Biol Cell, 2017. 28(7): p. 947-961.
16. Peñalva, M.A., Galindo, A., Abenza, J.F., Pinar, M., Calcagno-Pizarelli, A.M., Arst, H.N., &
Pantazopoulou, A., Searching for gold beyond mitosis: Mining intracellular membrane traffic in
Aspergillus nidulans. Cell Logist, 2012. 2(1): p. 2-14.
17. Steinberg, G., Peñalva, M.A., Riquelme, M., Wosten, H.A., & Harris, S.D., Cell Biology of
Hyphal Growth. Microbiol Spectr, 2017. 5(2).
18. Pinar, M., Pantazopoulou, A., Arst, H.N., Jr., & Peñalva, M.A., Acute inactivation of the
Aspergillus nidulans Golgi membrane fusion machinery: correlation of apical extension arrest
and tip swelling with cisternal disorganization. Mol Microbiol, 2013. 89(2): p. 228-48.
19. Shindiapina, P. & Barlowe, C., Requirements for transitional endoplasmic reticulum site
structure and function in Saccharomyces cerevisiae. Mol Biol Cell, 2010. 21(9): p. 1530-45.
20. Ivan, V., de Voer, G., Xanthakis, D., Spoorendonk, K.M., Kondylis, V., & Rabouille, C.,
Drosophila Sec16 mediates the biogenesis of tER sites upstream of Sar1 through an arginine-
rich motif. Mol Biol Cell, 2008. 19(10): p. 4352-65.
21. Glick, B.S. & Nakano, A., Membrane traffic within the Golgi apparatus. Annu Rev Cell Dev
Biol, 2009. 25: p. 113-32.
22. Jackson, C.L., Walch, L., & Verbavatz, J.M., Lipids and Their Trafficking: An Integral Part of
Cellular Organization. Dev Cell, 2016. 39(2): p. 139-153.
23. Sharpe, H.J., Stevens, T.J., & Munro, S., A comprehensive comparison of transmembrane
domains reveals organelle-specific properties. Cell, 2010. 142(1): p. 158-69.

Página 263
Bibliografía
24. Pantazopoulou, A. & Peñalva, M.A., Organization and dynamics of the Aspergillus nidulans
Golgi during apical extension and mitosis. Mol Biol Cell, 2009. 20(20): p. 4335-47.
25. Yang, Y., El-Ganiny, A.M., Bray, G.E., Sanders, D.A., & Kaminskyj, S.G., Aspergillus nidulans
hypB encodes a Sec7-domain protein important for hyphal morphogenesis. Fungal Genet Biol,
2008. 45(5): p. 749-59.
26. Breakspear, A., Langford, K.J., Momany, M., & Assinder, S.J., CopA:GFP localizes to putative
Golgi equivalents in Aspergillus nidulans. FEMS Microbiol Lett, 2007. 277(1): p. 90-7.
27. Papanikou, E., Day, K.J., Austin, J., & Glick, B.S., COPI selectively drives maturation of the
early Golgi. Elife, 2015. 4.
28. Fukuda, K., Yamada, K., Deoka, K., Yamashita, S., Ohta, A., & Horiuchi, H., Class III chitin
synthase ChsB of Aspergillus nidulans localizes at the sites of polarized cell wall synthesis and is
required for conidial development. Eukaryot Cell, 2009. 8(7): p. 945-56.
29. Harsay, E. & Bretscher, A., Parallel secretory pathways to the cell surface in yeast. J Cell Biol,
1995. 131(2): p. 297-310.
30. Harsay, E. & Schekman, R., A subset of yeast vacuolar protein sorting mutants is blocked in one
branch of the exocytic pathway. J Cell Biol, 2002. 156(2): p. 271-85.
31. Muñiz, M., Morsomme, P., & Riezman, H., Protein sorting upon exit from the endoplasmic
reticulum. Cell, 2001. 104(2): p. 313-20.
32. Valdez-Taubas, J. & Pelham, H.R., Slow diffusion of proteins in the yeast plasma membrane
allows polarity to be maintained by endocytic cycling. Curr Biol, 2003. 13(18): p. 1636-40.
33. Gurunathan, S., David, D., & Gerst, J.E., Dynamin and clathrin are required for the biogenesis
of a distinct class of secretory vesicles in yeast. EMBO J, 2002. 21(4): p. 602-14.
34. Bonifacino, J.S., Adaptor proteins involved in polarized sorting. J Cell Biol, 2014. 204(1): p. 7-
17.
35. Rodriguez-Boulan, E., Kreitzer, G., & Musch, A., Organization of vesicular trafficking in
epithelia. Nat Rev Mol Cell Biol, 2005. 6(3): p. 233-47.
36. Pantazopoulou, A., Pinar, M., Xiang, X., & Peñalva, M.A., Maturation of late Golgi cisternae
into RabERAB11 exocytic post-Golgi carriers visualized in vivo. Mol Biol Cell, 2014.
37. Pinar, M., Arst, H.N., Jr., Pantazopoulou, A., Tagua, V.G., de Los Ríos, V., Rodríguez-Salarichs,
J., Díaz, J.F., & Peñalva, M.A., TRAPPII regulates exocytic Golgi exit by mediating nucleotide
exchange on the Ypt31 ortholog RabERAB11. Proc Natl Acad Sci U S A, 2015. 112(14): p.
4346-51.
38. Pantazopoulou, A. & Peñalva, M.A., Characterization of Aspergillus nidulans RabC/Rab6.
Traffic, 2011. 12(4): p. 386-406.
39. Bonifacino, J.S. & Hierro, A., Transport according to GARP: receiving retrograde cargo at the
trans-Golgi network. Trends Cell Biol, 2011. 21(3): p. 159-67.
40. Siniossoglou, S., Peak-Chew, S.Y., & Pelham, H.R., Ric1p and Rgp1p form a complex that
catalyses nucleotide exchange on Ypt6p. EMBO J, 2000. 19(18): p. 4885-94.
41. MacDonald, C. & Piper, R.C., Genetic dissection of early endosomal recycling highlights a
TORC1-independent role for Rag GTPases. J Cell Biol, 2017. 216(10): p. 3275-3290.
42. Leitinger, B., Hille-Rehfeld, A., & Spiess, M., Biosynthetic transport of the asialoglycoprotein
receptor H1 to the cell surface occurs via endosomes. Proc Natl Acad Sci U S A, 1995. 92(22):
p. 10109-13.
43. Losev, E., Reinke, C.A., Jellen, J., Strongin, D.E., Bevis, B.J., & Glick, B.S., Golgi maturation
visualized in living yeast. Nature, 2006. 441(7096): p. 1002-6.
44. Matsuura-Tokita, K., Takeuchi, M., Ichihara, A., Mikuriya, K., & Nakano, A., Live imaging of
yeast Golgi cisternal maturation. Nature, 2006. 441(7096): p. 1007-10.
45. Ward, T.H., Polishchuk, R.S., Caplan, S., Hirschberg, K., & Lippincott-Schwartz, J.,
Maintenance of Golgi structure and function depends on the integrity of ER export. J Cell Biol,
2001. 155(4): p. 557-70.
46. Lippincott-Schwartz, J., Yuan, L., Tipper, C., Amherdt, M., Orci, L., & Klausner, R.D.,
Brefeldin A's effects on endosomes, lysosomes, and the TGN suggest a general mechanism for
regulating organelle structure and membrane traffic. Cell, 1991. 67(3): p. 601-16.
47. Johnson, A.E. & van Waes, M.A., The translocon: a dynamic gateway at the ER membrane.
Annu Rev Cell Dev Biol, 1999. 15: p. 799-842.

Página 264
 Bibliografía
48. Craven, R.A., Egerton, M., & Stirling, C.J., A novel Hsp70 of the yeast ER lumen is required for
the efficient translocation of a number of protein precursors. EMBO J, 1996. 15(11): p. 2640-50.
49. Jensen, D. & Schekman, R., COPII-mediated vesicle formation at a glance. J Cell Sci, 2011.
124(Pt 1): p. 1-4.
50. Bonifacino, J.S. & Glick, B.S., The mechanisms of vesicle budding and fusion. Cell, 2004.
116(2): p. 153-66.
51. Goto, M., Protein O-glycosylation in fungi: diverse structures and multiple functions. Biosci
Biotechnol Biochem, 2007. 71(6): p. 1415-27.
52. Sciaky, N., Presley, J., Smith, C., Zaal, K.J., Cole, N., Moreira, J.E., Terasaki, M., Siggia, E., et
al., Golgi tubule traffic and the effects of brefeldin A visualized in living cells. J Cell Biol, 1997.
139(5): p. 1137-55.
53. Szul, T. & Sztul, E., COPII and COPI traffic at the ER-Golgi interface. Physiology (Bethesda),
2011. 26(5): p. 348-64.
54. Mellman, I. & Simons, K., The Golgi complex: in vitro veritas? Cell, 1992. 68(5): p. 829-40.
55. Popoff, V., Adolf, F., Brugger, B., & Wieland, F., COPI budding within the Golgi stack. Cold
Spring Harb Perspect Biol, 2011. 3(11): p. a005231.
56. Wang, C.W., Hamamoto, S., Orci, L., & Schekman, R., Exomer: A coat complex for transport of
select membrane proteins from the trans-Golgi network to the plasma membrane in yeast. J Cell
Biol, 2006. 174(7): p. 973-83.
57. Brandizzi, F. & Barlowe, C., Organization of the ER-Golgi interface for membrane traffic
control. Nat Rev Mol Cell Biol, 2013. 14(6): p. 382-92.
58. Rossanese, O.W., Soderholm, J., Bevis, B.J., Sears, I.B., O'Connor, J., Williamson, E.K., &
Glick, B.S., Golgi structure correlates with transitional endoplasmic reticulum organization in
Pichia pastoris and Saccharomyces cerevisiae. J Cell Biol, 1999. 145(1): p. 69-81.
59. Connerly, P.L., Esaki, M., Montegna, E.A., Strongin, D.E., Levi, S., Soderholm, J., & Glick,
B.S., Sec16 is a determinant of transitional ER organization. Curr Biol, 2005. 15(16): p. 1439-
47.
60. Nakano, A. & Muramatsu, M., A novel GTP-binding protein, Sar1p, is involved in transport
from the endoplasmic reticulum to the Golgi apparatus. J Cell Biol, 1989. 109(6 Pt 1): p. 2677-
91.
61. Sato, K. & Nakano, A., Mechanisms of COPII vesicle formation and protein sorting. FEBS Lett,
2007. 581(11): p. 2076-82.
62. Lee, M.C., Orci, L., Hamamoto, S., Futai, E., Ravazzola, M., & Schekman, R., Sar1p N-terminal
helix initiates membrane curvature and completes the fission of a COPII vesicle. Cell, 2005.
122(4): p. 605-17.
63. Barlowe, C. & Schekman, R., SEC12 encodes a guanine-nucleotide-exchange factor essential
for transport vesicle budding from the ER. Nature, 1993. 365(6444): p. 347-9.
64. Futai, E., Hamamoto, S., Orci, L., & Schekman, R., GTP/GDP exchange by Sec12p enables
COPII vesicle bud formation on synthetic liposomes. EMBO J, 2004. 23(21): p. 4146-55.
65. Weissman, J.T., Plutner, H., & Balch, W.E., The mammalian guanine nucleotide exchange
factor mSec12 is essential for activation of the Sar1 GTPase directing endoplasmic reticulum
export. Traffic, 2001. 2(7): p. 465-75.
66. Wendeler, M.W., Paccaud, J.P., & Hauri, H.P., Role of Sec24 isoforms in selective export of
membrane proteins from the endoplasmic reticulum. EMBO Rep, 2007. 8(3): p. 258-64.
67. Miller, E.A., Beilharz, T.H., Malkus, P.N., Lee, M.C., Hamamoto, S., Orci, L., & Schekman, R.,
Multiple cargo binding sites on the COPII subunit Sec24p ensure capture of diverse membrane
proteins into transport vesicles. Cell, 2003. 114(4): p. 497-509.
68. Baines, A.C. & Zhang, B., Receptor-mediated protein transport in the early secretory pathway.
Trends Biochem Sci, 2007. 32(8): p. 381-8.
69. Bonfanti, L., Mironov, A.A., Jr., Martinez-Menarguez, J.A., Martella, O., Fusella, A.,
Baldassarre, M., Buccione, R., Geuze, H.J., et al., Procollagen traverses the Golgi stack without
leaving the lumen of cisternae: evidence for cisternal maturation. Cell, 1998. 95(7): p. 993-
1003.
70. Oka, T. & Nakano, A., Inhibition of GTP hydrolysis by Sar1p causes accumulation of vesicles
that are a functional intermediate of the ER-to-Golgi transport in yeast. J Cell Biol, 1994.
124(4): p. 425-34.

Página 265
Bibliografía
71. Morsomme, P. & Riezman, H., The Rab GTPase Ypt1p and tethering factors couple protein
sorting at the ER to vesicle targeting to the Golgi apparatus. Dev Cell, 2002. 2(3): p. 307-17.
72. Cai, Y., Chin, H.F., Lazarova, D., Menon, S., Fu, C., Cai, H., Sclafani, A., Rodgers, D.W., et al.,
The structural basis for activation of the Rab Ypt1p by the TRAPP membrane-tethering
complexes. Cell, 2008. 133(7): p. 1202-13.
73. Cai, H., Yu, S., Menon, S., Cai, Y., Lazarova, D., Fu, C., Reinisch, K., Hay, J.C., et al., TRAPPI
tethers COPII vesicles by binding the coat subunit Sec23. Nature, 2007. 445(7130): p. 941-4.
74. Wang, W., Sacher, M., & Ferro-Novick, S., TRAPP stimulates guanine nucleotide exchange on
Ypt1p. J Cell Biol, 2000. 151(2): p. 289-96.
75. Hardwick, K.G. & Pelham, H.R., SED5 encodes a 39-kD integral membrane protein required
for vesicular transport between the ER and the Golgi complex. J Cell Biol, 1992. 119(3): p. 513-
21.
76. Barlowe, C. & Helenius, A., Cargo Capture and Bulk Flow in the Early Secretory Pathway.
Annu Rev Cell Dev Biol, 2016. 32: p. 197-222.
77. Spang, A., Herrmann, J.M., Hamamoto, S., & Schekman, R., The ADP ribosylation factor-
nucleotide exchange factors Gea1p and Gea2p have overlapping, but not redundant functions in
retrograde transport from the Golgi to the endoplasmic reticulum. Mol Biol Cell, 2001. 12(4): p.
1035-45.
78. Duden, R., Griffiths, G., Frank, R., Argos, P., & Kreis, T.E., Beta-COP, a 110 kd protein
associated with non-clathrin-coated vesicles and the Golgi complex, shows homology to beta-
adaptin. Cell, 1991. 64(3): p. 649-65.
79. Watson, P.J., Frigerio, G., Collins, B.M., Duden, R., & Owen, D.J., Gamma-COP appendage
domain - structure and function. Traffic, 2004. 5(2): p. 79-88.
80. Yu, W., Lin, J., Jin, C., & Xia, B., Solution structure of human zeta-COP: direct evidences for
structural similarity between COP I and clathrin-adaptor coats. J Mol Biol, 2009. 386(4): p.
903-12.
81. Lee, C. & Goldberg, J., Structure of coatomer cage proteins and the relationship among COPI,
COPII, and clathrin vesicle coats. Cell, 2010. 142(1): p. 123-32.
82. Serafini, T., Orci, L., Amherdt, M., Brunner, M., Kahn, R.A., & Rothman, J.E., ADP-
ribosylation factor is a subunit of the coat of Golgi-derived COP-coated vesicles: a novel role
for a GTP-binding protein. Cell, 1991. 67(2): p. 239-53.
83. Yu, X., Breitman, M., & Goldberg, J., A structure-based mechanism for Arf1-dependent
recruitment of coatomer to membranes. Cell, 2012. 148(3): p. 530-42.
84. Antonny, B., Beraud-Dufour, S., Chardin, P., & Chabre, M., N-terminal hydrophobic residues of
the G-protein ADP-ribosylation factor-1 insert into membrane phospholipids upon GDP to GTP
exchange. Biochemistry, 1997. 36(15): p. 4675-84.
85. Franco, M., Chardin, P., Chabre, M., & Paris, S., Myristoylation-facilitated binding of the G
protein ARF1GDP to membrane phospholipids is required for its activation by a soluble
nucleotide exchange factor. J Biol Chem, 1996. 271(3): p. 1573-8.
86. Paczkowski, J.E., Richardson, B.C., & Fromme, J.C., Cargo adaptors: structures illuminate
mechanisms regulating vesicle biogenesis. Trends Cell Biol, 2015.
87. Farquhar, M.G. & Palade, G.E., The Golgi apparatus (complex)-(1954-1981)-from artifact to
center stage. J Cell Biol, 1981. 91(3 Pt 2): p. 77s-103s.
88. Glick, B.S. & Luini, A., Models for Golgi traffic: a critical assessment. Cold Spring Harb
Perspect Biol, 2011. 3(11): p. a005215.
89. Pelham, H.R. & Rothman, J.E., The debate about transport in the Golgi--two sides of the same
coin? Cell, 2000. 102(6): p. 713-9.
90. Marsh, B.J., Volkmann, N., McIntosh, J.R., & Howell, K.E., Direct continuities between
cisternae at different levels of the Golgi complex in glucose-stimulated mouse islet beta cells.
Proc Natl Acad Sci U S A, 2004. 101(15): p. 5565-70.
91. Patterson, G.H., Hirschberg, K., Polishchuk, R.S., Gerlich, D., Phair, R.D., & Lippincott-
Schwartz, J., Transport through the Golgi apparatus by rapid partitioning within a two-phase
membrane system. Cell, 2008. 133(6): p. 1055-67.
92. Pfeffer, S.R., How the Golgi works: a cisternal progenitor model. Proc Natl Acad Sci U S A,
2010. 107(46): p. 19614-8.
93. Bigay, J. & Antonny, B., Curvature, lipid packing, and electrostatics of membrane organelles:
defining cellular territories in determining specificity. Dev Cell, 2012. 23(5): p. 886-95.

Página 266
 Bibliografía
94. van Meer, G., Voelker, D.R., & Feigenson, G.W., Membrane lipids: where they are and how
they behave. Nat Rev Mol Cell Biol, 2008. 9(2): p. 112-24.
95. Andersen, O.S. & Koeppe, R.E., 2nd, Bilayer thickness and membrane protein function: an
energetic perspective. Annu Rev Biophys Biomol Struct, 2007. 36: p. 107-30.
96. McMahon, H.T. & Boucrot, E., Membrane curvature at a glance. J Cell Sci, 2015. 128(6): p.
1065-70.
97. Simons, K. & Ikonen, E., Functional rafts in cell membranes. Nature, 1997. 387(6633): p. 569-
72.
98. Bigay, J., Casella, J.F., Drin, G., Mesmin, B., & Antonny, B., ArfGAP1 responds to membrane
curvature through the folding of a lipid packing sensor motif. EMBO J, 2005. 24(13): p. 2244-
53.
99. Johansen, J., Ramanathan, V., & Beh, C.T., Vesicle trafficking from a lipid perspective: Lipid
regulation of exocytosis in Saccharomyces cerevisiae. Cell Logist, 2012. 2(3): p. 151-160.
100. Kearns, B.G., McGee, T.P., Mayinger, P., Gedvilaite, A., Phillips, S.E., Kagiwada, S., &
Bankaitis, V.A., Essential role for diacylglycerol in protein transport from the yeast Golgi
complex. Nature, 1997. 387(6628): p. 101-5.
101. Alder-Baerens, N., Lisman, Q., Luong, L., Pomorski, T., & Holthuis, J.C., Loss of P4 ATPases
Drs2p and Dnf3p disrupts aminophospholipid transport and asymmetry in yeast post-Golgi
secretory vesicles. Mol Biol Cell, 2006. 17(4): p. 1632-42.
102. Sheetz, M.P. & Singer, S.J., Biological membranes as bilayer couples. A molecular mechanism
of drug-erythrocyte interactions. Proc Natl Acad Sci U S A, 1974. 71(11): p. 4457-61.
103. Chen, C.Y. & Graham, T.R., An arf1Delta synthetic lethal screen identifies a new clathrin heavy
chain conditional allele that perturbs vacuolar protein transport in Saccharomyces cerevisiae.
Genetics, 1998. 150(2): p. 577-89.
104. Klemm, R.W., Ejsing, C.S., Surma, M.A., Kaiser, H.J., Gerl, M.J., Sampaio, J.L., de Robillard,
Q., Ferguson, C., et al., Segregation of sphingolipids and sterols during formation of secretory
vesicles at the trans-Golgi network. J Cell Biol, 2009. 185(4): p. 601-12.
105. Bagnat, M., Chang, A., & Simons, K., Plasma membrane proton ATPase Pma1p requires raft
association for surface delivery in yeast. Mol Biol Cell, 2001. 12(12): p. 4129-38.
106. Santiago-Tirado, F.H., Legesse-Miller, A., Schott, D., & Bretscher, A., PI4P and Rab inputs
collaborate in myosin-V-dependent transport of secretory compartments in yeast. Dev Cell,
2011. 20(1): p. 47-59.
107. Silberstein, S. & Gilmore, R., Biochemistry, molecular biology, and genetics of the
oligosaccharyltransferase. FASEB J, 1996. 10(8): p. 849-58.
108. Bause, E., Structural requirements of N-glycosylation of proteins. Studies with proline peptides
as conformational probes. Biochem J, 1983. 209(2): p. 331-6.
109. Imperiali, B. & Rickert, K.W., Conformational implications of asparagine-linked glycosylation.
Proc Natl Acad Sci U S A, 1995. 92(1): p. 97-101.
110. Imperiali, B. & O'Connor, S.E., Effect of N-linked glycosylation on glycopeptide and
glycoprotein structure. Curr Opin Chem Biol, 1999. 3(6): p. 643-9.
111. Wormald, M.R. & Dwek, R.A., Glycoproteins: glycan presentation and protein-fold stability.
Structure, 1999. 7(7): p. R155-60.
112. Paulson, J.C., Glycoproteins: what are the sugar chains for? Trends Biochem Sci, 1989. 14(7):
p. 272-6.
113. Guan, J.L., Machamer, C.E., & Rose, J.K., Glycosylation allows cell-surface transport of an
anchored secretory protein. Cell, 1985. 42(2): p. 489-96.
114. Helenius, A. & Aebi, M., Intracellular functions of N-linked glycans. Science, 2001. 291(5512):
p. 2364-9.
115. Trombetta, E.S. & Helenius, A., Lectins as chaperones in glycoprotein folding. Curr Opin Struct
Biol, 1998. 8(5): p. 587-92.
116. Thiele, C., Gerdes, H.H., & Huttner, W.B., Protein secretion: puzzling receptors. Curr Biol,
1997. 7(8): p. R496-500.
117. Morelle, W., Bernard, M., Debeaupuis, J.P., Buitrago, M., Tabouret, M., & Latge, J.P.,
Galactomannoproteins of Aspergillus fumigatus. Eukaryot Cell, 2005. 4(7): p. 1308-16.
118. Deshpande, N., Wilkins, M.R., Packer, N., & Nevalainen, H., Protein glycosylation pathways in
filamentous fungi. Glycobiology, 2008. 18(8): p. 626-37.

Página 267
Bibliografía
119. Costachel, C., Coddeville, B., Latge, J.P., & Fontaine, T., Glycosylphosphatidylinositol-
anchored fungal polysaccharide in Aspergillus fumigatus. J Biol Chem, 2005. 280(48): p.
39835-42.
120. Wennerberg, K., Rossman, K.L., & Der, C.J., The Ras superfamily at a glance. J Cell Sci, 2005.
118(Pt 5): p. 843-6.
121. Behnia, R., Panic, B., Whyte, J.R., & Munro, S., Targeting of the Arf-like GTPase Arl3p to the
Golgi requires N-terminal acetylation and the membrane protein Sys1p. Nat Cell Biol, 2004.
6(5): p. 405-13.
122. Chen, K.Y., Tsai, P.C., Hsu, J.W., Hsu, H.C., Fang, C.Y., Chang, L.C., Tsai, Y.T., Yu, C.J., et
al., Syt1p promotes activation of Arl1p at the late Golgi to recruit Imh1p. J Cell Sci, 2010.
123(Pt 20): p. 3478-89.
123. Panic, B., Perisic, O., Veprintsev, D.B., Williams, R.L., & Munro, S., Structural basis for Arl1-
dependent targeting of homodimeric GRIP domains to the Golgi apparatus. Mol Cell, 2003.
12(4): p. 863-74.
124. Tsai, P.C., Hsu, J.W., Liu, Y.W., Chen, K.Y., & Lee, F.J., Arl1p regulates spatial membrane
organization at the trans-Golgi network through interaction with Arf-GEF Gea2p and flippase
Drs2p. Proc Natl Acad Sci U S A, 2013. 110(8): p. E668-77.
125. Hoyt, M.A., Stearns, T., & Botstein, D., Chromosome instability mutants of Saccharomyces
cerevisiae that are defective in microtubule-mediated processes. Mol Cell Biol, 1990. 10(1): p.
223-34.
126. Wright, Z.C., Singh, R.K., Alpino, R., Goldberg, A.F., Sokolov, M., & Ramamurthy, V., ARL3
regulates trafficking of prenylated phototransduction proteins to the rod outer segment. Hum
Mol Genet, 2016. 25(10): p. 2031-2044.
127. Strom, S.P., Clark, M.J., Martinez, A., Garcia, S., Abelazeem, A.A., Matynia, A., Parikh, S.,
Sullivan, L.S., et al., De Novo Occurrence of a Variant in ARL3 and Apparent Autosomal
Dominant Transmission of Retinitis Pigmentosa. PLoS One, 2016. 11(3): p. e0150944.
128. Chardin, P., Paris, S., Antonny, B., Robineau, S., Beraud-Dufour, S., Jackson, C.L., & Chabre,
M., A human exchange factor for ARF contains Sec7- and pleckstrin-homology domains. Nature,
1996. 384(6608): p. 481-4.
129. Peyroche, A., Paris, S., & Jackson, C.L., Nucleotide exchange on ARF mediated by yeast Gea1
protein. Nature, 1996. 384(6608): p. 479-81.
130. Mouratou, B., Biou, V., Joubert, A., Cohen, J., Shields, D.J., Geldner, N., Jurgens, G.,
Melancon, P., et al., The domain architecture of large guanine nucleotide exchange factors for
the small GTP-binding protein Arf. BMC Genomics, 2005. 6: p. 20.
131. Kawamoto, K., Yoshida, Y., Tamaki, H., Torii, S., Shinotsuka, C., Yamashina, S., & Nakayama,
K., GBF1, a guanine nucleotide exchange factor for ADP-ribosylation factors, is localized to the
cis-Golgi and involved in membrane association of the COPI coat. Traffic, 2002. 3(7): p. 483-
95.
132. Stalder, D. & Antonny, B., Arf GTPase regulation through cascade mechanisms and positive
feedback loops. FEBS Lett, 2013. 587(13): p. 2028-35.
133. McDonold, C.M. & Fromme, J.C., Four GTPases differentially regulate the Sec7 Arf-GEF to
direct traffic at the trans-golgi network. Dev Cell, 2014. 30(6): p. 759-67.
134. Mandiyan, V., Andreev, J., Schlessinger, J., & Hubbard, S.R., Crystal structure of the ARF-GAP
domain and ankyrin repeats of PYK2-associated protein beta. EMBO J, 1999. 18(24): p. 6890-8.
135. Papanikou, E. & Glick, B.S., Golgi compartmentation and identity. Curr Opin Cell Biol, 2014.
29: p. 74-81.
136. Crottet, P., Meyer, D.M., Rohrer, J., & Spiess, M., ARF1.GTP, tyrosine-based signals, and
phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate constitute a minimal machinery to recruit the AP-1
clathrin adaptor to membranes. Mol Biol Cell, 2002. 13(10): p. 3672-82.
137. Lee, I., Drake, M.T., Traub, L.M., & Kornfeld, S., Cargo-sorting signals promote
polymerization of adaptor protein-1 in an Arf-1.GTP-independent manner. Arch Biochem
Biophys, 2008. 479(1): p. 63-8.
138. Costaguta, G., Duncan, M.C., Fernandez, G.E., Huang, G.H., & Payne, G.S., Distinct roles for
TGN/endosome epsin-like adaptors Ent3p and Ent5p. Mol Biol Cell, 2006. 17(9): p. 3907-20.
139. Hirschberg, K., Miller, C.M., Ellenberg, J., Presley, J.F., Siggia, E.D., Phair, R.D., & Lippincott-
Schwartz, J., Kinetic analysis of secretory protein traffic and characterization of golgi to plasma
membrane transport intermediates in living cells. J Cell Biol, 1998. 143(6): p. 1485-503.

Página 268
 Bibliografía
140. Bard, F. & Malhotra, V., The formation of TGN-to-plasma-membrane transport carriers. Annu
Rev Cell Dev Biol, 2006. 22: p. 439-55.
141. Puertollano, R., van der Wel, N.N., Greene, L.E., Eisenberg, E., Peters, P.J., & Bonifacino, J.S.,
Morphology and dynamics of clathrin/GGA1-coated carriers budding from the trans-Golgi
network. Mol Biol Cell, 2003. 14(4): p. 1545-57.
142. Paczkowski, J.E., Richardson, B.C., Strassner, A.M., & Fromme, J.C., The exomer cargo
adaptor structure reveals a novel GTPase-binding domain. EMBO J, 2012. 31(21): p. 4191-203.
143. Castillon, G.A., Watanabe, R., Taylor, M., Schwabe, T.M., & Riezman, H., Concentration of
GPI-anchored proteins upon ER exit in yeast. Traffic, 2009. 10(2): p. 186-200.
144. Watanabe, R., Funato, K., Venkataraman, K., Futerman, A.H., & Riezman, H., Sphingolipids are
required for the stable membrane association of glycosylphosphatidylinositol-anchored proteins
in yeast. J Biol Chem, 2002. 277(51): p. 49538-44.
145. Maeda, Y., Tashima, Y., Houjou, T., Fujita, M., Yoko-o, T., Jigami, Y., Taguchi, R., &
Kinoshita, T., Fatty acid remodeling of GPI-anchored proteins is required for their raft
association. Mol Biol Cell, 2007. 18(4): p. 1497-506.
146. Rivier, A.S., Castillon, G.A., Michon, L., Fukasawa, M., Romanova-Michaelides, M., Jaensch,
N., Hanada, K., & Watanabe, R., Exit of GPI-anchored proteins from the ER differs in yeast and
mammalian cells. Traffic, 2010. 11(8): p. 1017-33.
147. Paladino, S., Sarnataro, D., Pillich, R., Tivodar, S., Nitsch, L., & Zurzolo, C., Protein
oligomerization modulates raft partitioning and apical sorting of GPI-anchored proteins. J Cell
Biol, 2004. 167(4): p. 699-709.
148. Paladino, S., Sarnataro, D., Tivodar, S., & Zurzolo, C., Oligomerization is a specific requirement
for apical sorting of glycosyl-phosphatidylinositol-anchored proteins but not for non-raft-
associated apical proteins. Traffic, 2007. 8(3): p. 251-8.
149. Castillon, G.A., Michon, L., & Watanabe, R., Apical sorting of lysoGPI-anchored proteins
occurs independent of association with detergent-resistant membranes but dependent on their N-
glycosylation. Mol Biol Cell, 2013. 24(12): p. 2021-33.
150. Simons, K. & van Meer, G., Lipid sorting in epithelial cells. Biochemistry, 1988. 27(17): p.
6197-202.
151. Etxebeste, O., Garzia, A., Espeso, E.A., & Ugalde, U., Aspergillus nidulans asexual
development: making the most of cellular modules. Trends Microbiol, 2010. 18(12): p. 569-76.
152. Todd, R.B., Davis, M.A., & Hynes, M.J., Genetic manipulation of Aspergillus nidulans: meiotic
progeny for genetic analysis and strain construction. Nat Protoc, 2007. 2(4): p. 811-21.
153. Dyer, P.S. & O'Gorman, C.M., Sexual development and cryptic sexuality in fungi: insights from
Aspergillus species. FEMS Microbiol Rev, 2012. 36(1): p. 165-92.
154. Yoshimi, A., Miyazawa, K., & Abe, K., Cell wall structure and biogenesis in Aspergillus
species. Biosci Biotechnol Biochem, 2016. 80(9): p. 1700-11.
155. Peñalva, M.A., Tracing the endocytic pathway of Aspergillus nidulans with FM4-64. Fungal
Genet Biol, 2005. 42(12): p. 963-75.
156. Peñalva, M.A., Endocytosis in filamentous fungi: Cinderella gets her reward. Curr Opin
Microbiol, 2010. 13(6): p. 684-92.
157. Abenza, J.F., Pantazopoulou, A., Rodríguez, J.M., Galindo, A., & Peñalva, M.A., Long-distance
movement of Aspergillus nidulans early endosomes on microtubule tracks. Traffic, 2009. 10(1):
p. 57-75.
158. Abenza, J.F., Galindo, A., Pantazopoulou, A., Gil, C., de los Ríos, V., & Peñalva, M.A.,
Aspergillus RabB Rab5 integrates acquisition of degradative identity with the long distance
movement of early endosomes. Mol Biol Cell, 2010. 21(15): p. 2756-69.
159. Markina-Iñarrairaegui, A., Pantazopoulou, A., Espeso, E.A., & Peñalva, M.A., The Aspergillus
nidulans peripheral ER: disorganization by ER stress and persistence during mitosis. PLoS One,
2013. 8(6): p. e67154.
160. Pantazopoulou, A., The Golgi apparatus: insights from filamentous fungi. Mycologia, 2016.
108(3): p. 603-22.
161. López-Berges, M.S., Pinar, M., Abenza, J.F., Arst, H.N., Jr., & Peñalva, M.A., The Aspergillus
nidulans syntaxin PepA(Pep12) is regulated by two Sec1/Munc-18 proteins to mediate fusion
events at early endosomes, late endosomes and vacuoles. Mol Microbiol, 2016. 99(1): p. 199-
216.

Página 269
Bibliografía
162. Jackson-Hayes, L., Hill, T.W., Loprete, D.M., Fay, L.M., Gordon, B.S., Nkashama, S.A., Patel,
R.K., & Sartain, C.V., Two GDP-mannose transporters contribute to hyphal form and cell wall
integrity in Aspergillus nidulans. Microbiology, 2008. 154(Pt 7): p. 2037-47.
163. Whyte, J.R. & Munro, S., The Sec34/35 Golgi transport complex is related to the exocyst,
defining a family of complexes involved in multiple steps of membrane traffic. Dev Cell, 2001.
1(4): p. 527-37.
164. Ungar, D., Oka, T., Krieger, M., & Hughson, F.M., Retrograde transport on the COG railway.
Trends Cell Biol, 2006. 16(2): p. 113-20.
165. Gremillion, S.K., Harris, S.D., Jackson-Hayes, L., Kaminskyj, S.G., Loprete, D.M., Gauthier,
A.C., Mercer, S., Ravita, A.J., et al., Mutations in proteins of the Conserved Oligomeric Golgi
Complex affect polarity, cell wall structure, and glycosylation in the filamentous fungus
Aspergillus nidulans. Fungal Genet Biol, 2014. 73: p. 69-82.
166. Pinar, M., Pantazopoulou, A., & Peñalva, M.A., Live-cell imaging of Aspergillus nidulans
autophagy: RAB1 dependence, Golgi independence and ER involvement. Autophagy, 2013. 9(7):
p. 1024-43.
167. Levine, T.P. & Munro, S., Dual targeting of Osh1p, a yeast homologue of oxysterol-binding
protein, to both the Golgi and the nucleus-vacuole junction. Mol Biol Cell, 2001. 12(6): p. 1633-
44.
168. Daboussi, L., Costaguta, G., & Payne, G.S., Phosphoinositide-mediated clathrin adaptor
progression at the trans-Golgi network. Nat Cell Biol, 2012. 14(3): p. 239-48.
169. Schultzhaus, Z., Johnson, T.B., & Shaw, B.D., Clathrin Localization and Dynamics in
Aspergillus nidulans. Mol Microbiol, 2016.
170. Takeshita, N., Yamashita, S., Ohta, A., & Horiuchi, H., Aspergillus nidulans class V and VI
chitin synthases CsmA and CsmB, each with a myosin motor-like domain, perform compensatory
functions that are essential for hyphal tip growth. Mol Microbiol, 2006. 59(5): p. 1380-94.
171. Hervás-Aguilar, A. & Peñalva, M.A., Endocytic machinery protein SlaB is dispensable for
polarity establishment but necessary for polarity maintenance in hyphal tip cells of Aspergillus
nidulans. Eukaryot Cell, 2010. 9(10): p. 1504-18.
172. Lucena-Agell, D., Galindo, A., Arst, H.N., Jr., & Peñalva, M.A., Aspergillus nidulans Ambient
pH Signaling Does Not Require Endocytosis. Eukaryot Cell, 2015. 14(6): p. 545-53.
173. Schultzhaus, Z., Yan, H., & Shaw, B.D., Aspergillus nidulans flippase DnfA is cargo of the
endocytic collar and plays complementary roles in growth and phosphatidylserine asymmetry
with another flippase, DnfB. Mol Microbiol, 2015.
174. Lee, S.C. & Shaw, B.D., Localization and function of ADP ribosylation factor A in Aspergillus
nidulans. FEMS Microbiol Lett, 2008. 283(2): p. 216-22.
175. Shi, X., Sha, Y., & Kaminskyj, S., Aspergillus nidulans hypA regulates morphogenesis through
the secretion pathway. Fungal Genet Biol, 2004. 41(1): p. 75-88.
176. Taheri-Talesh, N., Xiong, Y., & Oakley, B.R., The functions of myosin II and myosin V
homologs in tip growth and septation in Aspergillus nidulans. PLoS One, 2012. 7(2): p. e31218.
177. Bartnicki-Garcia, S. & Lippman, E., Fungal morphogenesis: cell wall construction in Mucor
rouxii. Science, 1969. 165(3890): p. 302-4.
178. Robertson, N.F., Presidential address: The fungal hypha. Transactions of the British
Mycological Society, 1965. 48(1): p. 1-8.
179. Green, P.B., Cell Morphogenesis. Annual Review of Plant Physiology, 1969. 20(1): p. 365-394.
180. Wessels, J.G.H., A steady-state model for apical wall growth in fungi. Acta Botanica
Neerlandica, 1988. 37(1): p. 3-16.
181. Riquelme, M., Bartnicki-Garcia, S., Gonzalez-Prieto, J.M., Sanchez-Leon, E., Verdin-Ramos,
J.A., Beltran-Aguilar, A., & Freitag, M., Spitzenkorper localization and intracellular traffic of
green fluorescent protein-labeled CHS-3 and CHS-6 chitin synthases in living hyphae of
Neurospora crassa. Eukaryot Cell, 2007. 6(10): p. 1853-64.
182. Verdín, J., Bartnicki-Garcia, S., & Riquelme, M., Functional stratification of the Spitzenkörper
of Neurospora crassa. Molecular Microbiology, 2009. 74(5): p. 1044-1053.
183. Takeshita, N., Evangelinos, M., Zhou, L., Serizawa, T., Somera-Fajardo, R.A., Lu, L., Takaya,
N., Nienhaus, G.U., et al., Pulses of Ca2+ coordinate actin assembly and exocytosis for stepwise
cell extension. Proc Natl Acad Sci U S A, 2017. 114(22): p. 5701-5706.
184. Peñalva, M.A., A lipid-managing program maintains a stout Spitzenkorper. Mol Microbiol,
2015.

Página 270
 Bibliografía
185. Whittaker, S.L., Lunness, P., Milward, K.J., Doonan, J.H., & Assinder, S.J., sodVIC is an alpha-
COP-related gene which is essential for establishing and maintaining polarized growth in
Aspergillus nidulans. Fungal Genet Biol, 1999. 26(3): p. 236-52.
186. Abenza, J.F., Galindo, A., Pinar, M., Pantazopoulou, A., de los Ríos, V., & Peñalva, M.A.,
Endosomal maturation by Rab conversion in Aspergillus nidulans is coupled to dynein-mediated
basipetal movement. Mol Biol Cell, 2012. 23(10): p. 1889-901.
187. Zhang, J., Zhuang, L., Lee, Y., Abenza, J.F., Peñalva, M.A., & Xiang, X., The microtubule plus-
end localization of Aspergillus dynein is important for dynein-early-endosome interaction but
not for dynein ATPase activation. J Cell Sci, 2010. 123(Pt 20): p. 3596-604.
188. Cove, D.J., The induction and repression of nitrate reductase in the fungus Aspergillus nidulans.
Biochim Biophys Acta, 1966. 113(1): p. 51-6.
189. Mooney, J.L. & Yager, L.N., Light is required for conidiation in Aspergillus nidulans. Genes
Dev, 1990. 4(9): p. 1473-82.
190. Araújo-Bazán, L., Peñalva, M.A., & Espeso, E.A., Preferential localization of the endocytic
internalization machinery to hyphal tips underlies polarization of the actin cytoskeleton in
Aspergillus nidulans. Mol Microbiol, 2008. 67(4): p. 891-905.
191. Hanahan, D., Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J Mol Biol, 1983.
166(4): p. 557-80.
192. Tilburn, J., Scazzocchio, C., Taylor, G.G., Zabicky-Zissman, J.H., Lockington, R.A., & Davies,
R.W., Transformation by integration in Aspergillus nidulans. Gene, 1983. 26(2-3): p. 205-21.
193. McCluskey, K., The Fungal Genetics Stock Center: from molds to molecules. Adv Appl
Microbiol, 2003. 52: p. 245-62.
194. Szewczyk, E., Nayak, T., Oakley, C.E., Edgerton, H., Xiong, Y., Taheri-Talesh, N., Osmani,
S.A., & Oakley, B.R., Fusion PCR and gene targeting in Aspergillus nidulans. Nat Protoc, 2006.
1(6): p. 3111-20.
195. Bolte, S. & Cordelieres, F.P., A guided tour into subcellular colocalization analysis in light
microscopy. J Microsc, 2006. 224(Pt 3): p. 213-32.
196. Robert, X. & Gouet, P., Deciphering key features in protein structures with the new ENDscript
server. Nucleic Acids Res, 2014. 42(Web Server issue): p. W320-4.
197. Barlowe, C.K. & Miller, E.A., Secretory protein biogenesis and traffic in the early secretory
pathway. Genetics, 2013. 193(2): p. 383-410.
198. Sims, A.H., Gent, M.E., Lanthaler, K., Dunn-Coleman, N.S., Oliver, S.G., & Robson, G.D.,
Transcriptome analysis of recombinant protein secretion by Aspergillus nidulans and the
unfolded-protein response in vivo. Appl Environ Microbiol, 2005. 71(5): p. 2737-47.
199. Giaever, G., Chu, A.M., Ni, L., Connelly, C., Riles, L., Veronneau, S., Dow, S., Lucau-Danila,
A., et al., Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome. Nature, 2002.
418(6896): p. 387-91.
200. Osmani, A.H., Oakley, B.R., & Osmani, S.A., Identification and analysis of essential
Aspergillus nidulans genes using the heterokaryon rescue technique. Nat Protoc, 2006. 1(5): p.
2517-26.
201. Mackay, E.M. & Pateman, J.A., The regulation of urease activity in Aspergillus nidulans.
Biochem Genet, 1982. 20(7-8): p. 763-76.
202. Huang, M., Weissman, J.T., Beraud-Dufour, S., Luan, P., Wang, C., Chen, W., Aridor, M.,
Wilson, I.A., et al., Crystal structure of Sar1-GDP at 1.7 A resolution and the role of the NH2
terminus in ER export. J Cell Biol, 2001. 155(6): p. 937-48.
203. Saraste, M., Sibbald, P.R., & Wittinghofer, A., The P-loop--a common motif in ATP- and GTP-
binding proteins. Trends Biochem Sci, 1990. 15(11): p. 430-4.
204. Via, A., Ferre, F., Brannetti, B., Valencia, A., & Helmer-Citterich, M., Three-dimensional view
of the surface motif associated with the P-loop structure: cis and trans cases of convergent
evolution. J Mol Biol, 2000. 303(4): p. 455-65.
205. Schlacht, A. & Dacks, J.B., Unexpected ancient paralogues and an evolutionary model for the
COPII coat complex. Genome Biol Evol, 2015.
206. Sato, K., Sato, M., & Nakano, A., Rer1p, a retrieval receptor for ER membrane proteins,
recognizes transmembrane domains in multiple modes, in Mol Biol Cell2003. p. 3605-16.
207. Ishii, M., Suda, Y., Kurokawa, K., & Nakano, A., COPI is essential for Golgi cisternal
maturation and dynamics. J Cell Sci, 2016. 129(17): p. 3251-61.

Página 271
Bibliografía
208. Hamer, E.C., Moore, C.B., & Denning, D.W., Comparison of two fluorescent whiteners,
Calcofluor and Blankophor, for the detection of fungal elements in clinical specimens in the
diagnostic laboratory. Clin Microbiol Infect, 2006. 12(2): p. 181-4.
209. Saito, Y., Yamanushi, T., Oka, T., & Nakano, A., Identification of SEC12, SED4, truncated
SEC16, and EKS1/HRD3 as multicopy suppressors of ts mutants of Sar1 GTPase. J Biochem,
1999. 125(1): p. 130-7.
210. Lee, S.C., Schmidtke, S.N., Dangott, L.J., & Shaw, B.D., Aspergillus nidulans ArfB plays a role
in endocytosis and polarized growth. Eukaryot Cell, 2008. 7(8): p. 1278-88.
211. Lee, S.C. & Shaw, B.D., ArfB links protein lipidation and endocytosis to polarized growth of
Aspergillus nidulans. Commun Integr Biol, 2008. 1(1): p. 51-2.
212. McMahon, C., Studer, S.M., Clendinen, C., Dann, G.P., Jeffrey, P.D., & Hughson, F.M., The
structure of Sec12 implicates potassium ion coordination in Sar1 activation. J Biol Chem, 2012.
287(52): p. 43599-606.
213. Tusnady, G.E. & Simon, I., Principles governing amino acid composition of integral membrane
proteins: application to topology prediction. J Mol Biol, 1998. 283(2): p. 489-506.
214. Stearns, T., Kahn, R.A., Botstein, D., & Hoyt, M.A., ADP ribosylation factor is an essential
protein in Saccharomyces cerevisiae and is encoded by two genes. Mol Cell Biol, 1990. 10(12):
p. 6690-9.
215. Benjamin, J.J., Poon, P.P., Drysdale, J.D., Wang, X., Singer, R.A., & Johnston, G.C.,
Dysregulated Arl1, a regulator of post-Golgi vesicle tethering, can inhibit endosomal transport
and cell proliferation in yeast. Mol Biol Cell, 2011. 22(13): p. 2337-47.
216. Achstetter, T., Franzusoff, A., Field, C., & Schekman, R., SEC7 encodes an unusual, high
molecular weight protein required for membrane traffic from the yeast Golgi apparatus. J Biol
Chem, 1988. 263(24): p. 11711-7.
217. Harris, S.D., Morrell, J.L., & Hamer, J.E., Identification and characterization of Aspergillus
nidulans mutants defective in cytokinesis. Genetics, 1994. 136(2): p. 517-32.
218. Kaminskyj, S.G. & Hamer, J.E., hyp loci control cell pattern formation in the vegetative
mycelium of Aspergillus nidulans. Genetics, 1998. 148(2): p. 669-80.
219. Zhao, X., Lasell, T.K., & Melancon, P., Localization of large ADP-ribosylation factor-guanine
nucleotide exchange factors to different Golgi compartments: evidence for distinct functions in
protein traffic. Mol Biol Cell, 2002. 13(1): p. 119-33.
220. Ackema, K.B., Sauder, U., Solinger, J.A., & Spang, A., The ArfGEF GBF-1 Is Required for ER
Structure, Secretion and Endocytic Transport in C. elegans. PLoS One, 2013. 8(6): p. e67076.
221. Chantalat, S., Courbeyrette, R., Senic-Matuglia, F., Jackson, C.L., Goud, B., & Peyroche, A., A
novel Golgi membrane protein is a partner of the ARF exchange factors Gea1p and Gea2p. Mol
Biol Cell, 2003. 14(6): p. 2357-71.
222. Panic, B., Whyte, J.R., & Munro, S., The ARF-like GTPases Arl1p and Arl3p act in a pathway
that interacts with vesicle-tethering factors at the Golgi apparatus. Curr Biol, 2003. 13(5): p.
405-10.
223. Lee, H.H., Park, J.S., Chae, S.K., Maeng, P.J., & Park, H.M., Aspergillus nidulans sod(VI)C1
mutation causes defects in cell wall biogenesis and protein secretion. FEMS Microbiol Lett,
2002. 208(2): p. 253-7.
224. Rambourg, A., Clermont, Y., Jackson, C.L., & Kepes, F., Effects of brefeldin A on the three-
dimensional structure of the Golgi apparatus in a sensitive strain of Saccharomyces cerevisiae.
Anat Rec, 1995. 241(1): p. 1-9.
225. Donaldson, J.G., Lippincott-Schwartz, J., Bloom, G.S., Kreis, T.E., & Klausner, R.D.,
Dissociation of a 110-kD peripheral membrane protein from the Golgi apparatus is an early
event in brefeldin A action. J Cell Biol, 1990. 111(6 Pt 1): p. 2295-306.
226. Borgia, P.T., Iartchouk, N., Riggle, P.J., Winter, K.R., Koltin, Y., & Bulawa, C.E., The chsB
gene of Aspergillus nidulans is necessary for normal hyphal growth and development. Fungal
Genet Biol, 1996. 20(3): p. 193-203.
227. Takeshita, N., Wernet, V., Tsuizaki, M., Grun, N., Hoshi, H.O., Ohta, A., Fischer, R., &
Horiuchi, H., Transportation of Aspergillus nidulans Class III and V Chitin Synthases to the
Hyphal Tips Depends on Conventional Kinesin. PLoS One, 2015. 10(5): p. e0125937.
228. Morton, W.M., Ayscough, K.R., & McLaughlin, P.J., Latrunculin alters the actin-monomer
subunit interface to prevent polymerization. Nat Cell Biol, 2000. 2(6): p. 376-8.

Página 272
 Bibliografía
229. Bretscher, A., Fimbrin is a cytoskeletal protein that crosslinks F-actin in vitro. Proc Natl Acad
Sci U S A, 1981. 78(11): p. 6849-53.
230. Adams, A.E., Botstein, D., & Drubin, D.G., Requirement of yeast fimbrin for actin organization
and morphogenesis in vivo. Nature, 1991. 354(6352): p. 404-8.
231. Upadhyay, S. & Shaw, B.D., The role of actin, fimbrin and endocytosis in growth of hyphae in
Aspergillus nidulans. Mol Microbiol, 2008. 68(3): p. 690-705.
232. Kaksonen, M., Sun, Y., & Drubin, D.G., A pathway for association of receptors, adaptors, and
actin during endocytic internalization. Cell, 2003. 115(4): p. 475-87.
233. Kurtz, A.K. & Mayo, S.T., Pearson Product Moment Coefficient of Correlation, en Statistical
Methods in Education and Psychology. 1979, Springer New York: New York, NY. p. 192-277.
234. Lewis, M.J., Nichols, B.J., Prescianotto-Baschong, C., Riezman, H., & Pelham, H.R., Specific
retrieval of the exocytic SNARE Snc1p from early yeast endosomes. Mol Biol Cell, 2000. 11(1):
p. 23-38.
235. Sanchez-Leon, E., Bowman, B., Seidel, C., Fischer, R., Novick, P., & Riquelme, M., The Rab
GTPase YPT-1 associates with Golgi cisternae and Spitzenkorper microvesicles in Neurospora
crassa. Mol Microbiol, 2015. 95(3): p. 472-90.
236. Xu, P., Baldridge, R.D., Chi, R.J., Burd, C.G., & Graham, T.R., Phosphatidylserine flipping
enhances membrane curvature and negative charge required for vesicular transport. J Cell Biol,
2013. 202(6): p. 875-86.
237. Lopez-Berges, M.S., Arst, H.N., Pinar, M., & Penalva, M.A., Genetic studies on the
physiological role of CORVET in Aspergillus nidulans. FEMS Microbiol Lett, 2017.
238. Xiang, X., Qiu, R., Yao, X., Arst, H.N., Jr., Penalva, M.A., & Zhang, J., Cytoplasmic dynein and
early endosome transport. Cell Mol Life Sci, 2015. 72(17): p. 3267-80.
239. Zhang, J., Qiu, R., Arst, H.N., Jr., Penalva, M.A., & Xiang, X., HookA is a novel dynein-early
endosome linker critical for cargo movement in vivo. J Cell Biol, 2014. 204(6): p. 1009-26.
240. Hettema, E.H., Lewis, M.J., Black, M.W., & Pelham, H.R., Retromer and the sorting nexins
Snx4/41/42 mediate distinct retrieval pathways from yeast endosomes. EMBO J, 2003. 22(3): p.
548-57.
241. Bonifacino, J.S. & Rojas, R., Retrograde transport from endosomes to the trans-Golgi network.
Nat Rev Mol Cell Biol, 2006. 7(8): p. 568-79.
242. Conibear, E. & Stevens, T.H., Vps52p, Vps53p, and Vps54p form a novel multisubunit complex
required for protein sorting at the yeast late Golgi. Mol Biol Cell, 2000. 11(1): p. 305-23.
243. Siniossoglou, S. & Pelham, H.R., Vps51p links the VFT complex to the SNARE Tlg1p. J Biol
Chem, 2002. 277(50): p. 48318-24.
244. Siniossoglou, S. & Pelham, H.R., An effector of Ypt6p binds the SNARE Tlg1p and mediates
selective fusion of vesicles with late Golgi membranes. EMBO J, 2001. 20(21): p. 5991-8.
245. Chen, J.S., Saxton, J., Hemming, F.W., & Peberdy, J.F., Purification and partial
characterization of the high and low molecular weight form (S- and F-form) of invertase
secreted by Aspergillus nidulans. Biochim Biophys Acta, 1996. 1296(2): p. 207-18.
246. Vainstein, M.H. & Peberdy, J.F., Solubilisation of a cell wall bound invertase in Aspergillus
nidulans. FEMS Microbiol Lett, 1990. 59(3): p. 265-9.
247. Nagem, R.A., Rojas, A.L., Golubev, A.M., Korneeva, O.S., Eneyskaya, E.V., Kulminskaya,
A.A., Neustroev, K.N., & Polikarpov, I., Crystal structure of exo-inulinase from Aspergillus
awamori: the enzyme fold and structural determinants of substrate recognition. J Mol Biol,
2004. 344(2): p. 471-80.
248. Esmon, B., Novick, P., & Schekman, R., Compartmentalized assembly of oligosaccharides on
exported glycoproteins in yeast. Cell, 1981. 25(2): p. 451-60.
249. Ettalibi, M. & Baratti, J.C., Sucrose hydrolysis by thermostable immobilized inulinases from
aspergillus ficuum. Enzyme Microb Technol, 2001. 28(7-8): p. 596-601.
250. Vainstein, M.H. & Peberdy, J.F., Regulation of invertase in Aspergillus nidulans: effect of
different carbon sources. J Gen Microbiol, 1991. 137(2): p. 315-21.
251. Gibson, R.K. & Peberdy, J.F., Fine structure of protoplasts of Aspergillus nidulans. J Gen
Microbiol, 1972. 72(3): p. 529-38.
252. Maley, F., Trimble, R.B., Tarentino, A.L., & Plummer, T.H., Jr., Characterization of
glycoproteins and their associated oligosaccharides through the use of endoglycosidases. Anal
Biochem, 1989. 180(2): p. 195-204.

Página 273
Bibliografía
253. Miller, V.J. & Ungar, D., Re'COG'nition at the Golgi. Traffic, 2012. 13(7): p. 891-7.
254. Yoon, J., Aishan, T., Maruyama, J., & Kitamoto, K., Enhanced production and secretion of
heterologous proteins by the filamentous fungus Aspergillus oryzae via disruption of vacuolar
protein sorting receptor gene Aovps10. Appl Environ Microbiol, 2010. 76(17): p. 5718-27.
255. de Groot, P.W., Brandt, B.W., Horiuchi, H., Ram, A.F., de Koster, C.G., & Klis, F.M.,
Comprehensive genomic analysis of cell wall genes in Aspergillus nidulans. Fungal Genet Biol,
2009. 46 Suppl 1: p. S72-81.
256. Hurtado-Guerrero, R., Schuttelkopf, A.W., Mouyna, I., Ibrahim, A.F., Shepherd, S., Fontaine,
T., Latge, J.P., & van Aalten, D.M., Molecular mechanisms of yeast cell wall glucan remodeling.
J Biol Chem, 2009. 284(13): p. 8461-9.
257. Mouyna, I., Fontaine, T., Vai, M., Monod, M., Fonzi, W.A., Diaquin, M., Popolo, L., Hartland,
R.P., et al., Glycosylphosphatidylinositol-anchored glucanosyltransferases play an active role in
the biosynthesis of the fungal cell wall. J Biol Chem, 2000. 275(20): p. 14882-9.
258. Martinez-Nunez, L. & Riquelme, M., Role of BGT-1 and BGT-2, two predicted GPI-anchored
glycoside hydrolases/glycosyltransferases, in cell wall remodeling in Neurospora crassa. Fungal
Genet Biol, 2015. 85: p. 58-70.
259. Mouyna, I., Morelle, W., Vai, M., Monod, M., Lechenne, B., Fontaine, T., Beauvais, A., Sarfati,
J., et al., Deletion of GEL2 encoding for a beta(1-3)glucanosyltransferase affects morphogenesis
and virulence in Aspergillus fumigatus. Mol Microbiol, 2005. 56(6): p. 1675-88.
260. Receveur-Brechot, V., Czjzek, M., Barre, A., Roussel, A., Peumans, W.J., Van Damme, E.J., &
Rouge, P., Crystal structure at 1.45-A resolution of the major allergen endo-beta-1,3-glucanase
of banana as a molecular basis for the latex-fruit syndrome. Proteins, 2006. 63(1): p. 235-42.
261. Ortiz, D., Medkova, M., Walch-Solimena, C., & Novick, P., Ypt32 recruits the Sec4p guanine
nucleotide exchange factor, Sec2p, to secretory vesicles; evidence for a Rab cascade in yeast. J
Cell Biol, 2002. 157(6): p. 1005-15.
262. Yamanushi, T., Hirata, A., Oka, T., & Nakano, A., Characterization of yeast sar1 temperature-
sensitive mutants, which are defective in protein transport from the endoplasmic reticulum. J
Biochem, 1996. 120(2): p. 452-8.
263. Saito, Y., Kimura, K., Oka, T., & Nakano, A., Activities of mutant Sar1 proteins in guanine
nucleotide binding, GTP hydrolysis, and cell-free transport from the endoplasmic reticulum to
the Golgi apparatus. J Biochem, 1998. 124(4): p. 816-23.
264. Manzano-Lopez, J., Perez-Linero, A.M., Aguilera-Romero, A., Martin, M.E., Okano, T., Silva,
D.V., Seeberger, P.H., Riezman, H., et al., COPII Coat Composition Is Actively Regulated by
Luminal Cargo Maturation. Curr Biol, 2014.
265. Cole, G.T., Patterns of development in conidial fungi / Garry T. Cole and Robert A. Samson, ed.
R.A. Samson. 1979, London ; San Francisco: Pitman.
266. Wilson, R.A. & Talbot, N.J., Under pressure: investigating the biology of plant infection by
Magnaporthe oryzae. Nat Rev Microbiol, 2009. 7(3): p. 185-95.
267. Staib, P. & Morschhauser, J., Chlamydospore formation in Candida albicans and Candida
dubliniensis--an enigmatic developmental programme. Mycoses, 2007. 50(1): p. 1-12.
268. Shannon, J.L., Scanning and transmission electron microscopy of Candida albicans
chlamydospores. J Gen Microbiol, 1981. 125(1): p. 199-203.
269. Valentine, B.P. & Bainbridge, B.W., The Relevance of a Study of a Temperature-sensitive
Ballooning Mutant of Aspergillus nidulans Defective in Mannose Metabolism to our
Understanding of Mannose as a Wall Component and Carbon/Energy Source. Microbiology,
1978. 109(1): p. 155-168.
270. Markham, P. & Bainbridge, B.W., Effect of choline deprivation on the growth, morphology and
ultrastructure of a choline-requiring mutant of Aspergillus nidulans. FEMS Microbiology
Letters, 1992. 90(3): p. 217-222.
271. Tao, L., Gao, N., Chen, S., & Yu, J.-H., The choC gene encoding a putative phospholipid
methyltransferase is essential for growth and development in Aspergillus nidulans. Current
Genetics, 2010. 56(3): p. 283-296.
272. Ruohola, H. & Ferro-Novick, S., Sec53, a protein required for an early step in secretory protein
processing and transport in yeast, interacts with the cytoplasmic surface of the endoplasmic
reticulum. Proc Natl Acad Sci U S A, 1987. 84(23): p. 8468-72.
273. Glick, B.S. & Malhotra, V., The curious status of the Golgi apparatus. Cell, 1998. 95(7): p. 883-
9.

Página 274
 Bibliografía
274. Gerich, B., Orci, L., Tschochner, H., Lottspeich, F., Ravazzola, M., Amherdt, M., Wieland, F., &
Harter, C., Non-clathrin-coat protein alpha is a conserved subunit of coatomer and in
Saccharomyces cerevisiae is essential for growth. Proc Natl Acad Sci U S A, 1995. 92(8): p.
3229-33.
275. Huh, W.K., Falvo, J.V., Gerke, L.C., Carroll, A.S., Howson, R.W., Weissman, J.S., & O'Shea,
E.K., Global analysis of protein localization in budding yeast. Nature, 2003. 425(6959): p. 686-
91.
276. Valdivia, R.H., Baggott, D., Chuang, J.S., & Schekman, R.W., The yeast clathrin adaptor
protein complex 1 is required for the efficient retention of a subset of late Golgi membrane
proteins. Dev Cell, 2002. 2(3): p. 283-94.
277. Foote, C. & Nothwehr, S.F., The clathrin adaptor complex 1 directly binds to a sorting signal in
Ste13p to reduce the rate of its trafficking to the late endosome of yeast. J Cell Biol, 2006.
173(4): p. 615-26.
278. Liu, K., Surendhran, K., Nothwehr, S.F., & Graham, T.R., P4-ATPase requirement for AP-
1/clathrin function in protein transport from the trans-Golgi network and early endosomes. Mol
Biol Cell, 2008. 19(8): p. 3526-35.
279. Barfield, R.M., Fromme, J.C., & Schekman, R., The exomer coat complex transports Fus1p to
the plasma membrane via a novel plasma membrane sorting signal in yeast. Mol Biol Cell,
2009. 20(23): p. 4985-96.
280. Ritz, A.M., Trautwein, M., Grassinger, F., & Spang, A., The prion-like domain in the exomer-
dependent cargo Pin2 serves as a trans-Golgi retention motif. Cell Rep, 2014. 7(1): p. 249-60.
281. Jones, B., Jones, E.L., Bonney, S.A., Patel, H.N., Mensenkamp, A.R., Eichenbaum-Voline, S.,
Rudling, M., Myrdal, U., et al., Mutations in a Sar1 GTPase of COPII vesicles are associated
with lipid absorption disorders. Nat Genet, 2003. 34(1): p. 29-31.
282. Hoyt, M.A., Macke, J.P., Roberts, B.T., & Geiser, J.R., Saccharomyces cerevisiae PAC2
functions with CIN1, 2 and 4 in a pathway leading to normal microtubule stability. Genetics,
1997. 146(3): p. 849-57.
283. Peyroche, A., Courbeyrette, R., Rambourg, A., & Jackson, C.L., The ARF exchange factors
Gea1p and Gea2p regulate Golgi structure and function in yeast. J Cell Sci, 2001. 114(Pt 12): p.
2241-53.
284. Hsu, N.Y., Ilnytska, O., Belov, G., Santiana, M., Chen, Y.H., Takvorian, P.M., Pau, C., van der
Schaar, H., et al., Viral reorganization of the secretory pathway generates distinct organelles for
RNA replication. Cell, 2010. 141(5): p. 799-811.
285. Mazaki, Y., Nishimura, Y., & Sabe, H., GBF1 bears a novel phosphatidylinositol-phosphate
binding module, BP3K, to link PI3Kgamma activity with Arf1 activation involved in GPCR-
mediated neutrophil chemotaxis and superoxide production. Mol Biol Cell, 2012. 23(13): p.
2457-67.
286. Roncero, C., Sanchez-Diaz, A., & Valdivieso, M.-H., Chitin Synthesis and Fungal Cell
Morphogenesis, en Biochemistry and Molecular Biology, D. Hoffmeister, Editor. 2016, Springer
International Publishing: Cham. p. 167-190.
287. Schuster, M., Martin-Urdiroz, M., Higuchi, Y., Hacker, C., Kilaru, S., Gurr, S.J., & Steinberg,
G., Co-delivery of cell-wall-forming enzymes in the same vesicle for coordinated fungal cell wall
formation. Nat Microbiol, 2016. 1: p. 16149.
288. Bouchet, J., McCaffrey, M.W., Graziani, A., & Alcover, A., The functional interplay of Rab11,
FIP3 and Rho proteins on the endosomal recycling pathway controls cell shape and symmetry.
Small GTPases, 2016: p. 1-6.
289. Chen, S.H., Chen, S., Tokarev, A.A., Liu, F., Jedd, G., & Segev, N., Ypt31/32 GTPases and their
novel F-box effector protein Rcy1 regulate protein recycling. Mol Biol Cell, 2005. 16(1): p. 178-
92.
290. Horgan, C.P., Hanscom, S.R., Jolly, R.S., Futter, C.E., & McCaffrey, M.W., Rab11-FIP3 links
the Rab11 GTPase and cytoplasmic dynein to mediate transport to the endosomal-recycling
compartment. J Cell Sci, 2010. 123(Pt 2): p. 181-91.
291. Ullrich, O., Reinsch, S., Urbe, S., Zerial, M., & Parton, R.G., Rab11 regulates recycling through
the pericentriolar recycling endosome. J Cell Biol, 1996. 135(4): p. 913-24.
292. Bielska, E., Schuster, M., Roger, Y., Berepiki, A., Soanes, D.M., Talbot, N.J., & Steinberg, G.,
Hook is an adapter that coordinates kinesin-3 and dynein cargo attachment on early endosomes.
J Cell Biol, 2014. 204(6): p. 989-1007.

Página 275
Bibliografía
293. Egan, M.J., Tan, K., & Reck-Peterson, S.L., Lis1 is an initiation factor for dynein-driven
organelle transport. J Cell Biol, 2012. 197(7): p. 971-82.
294. Lenz, J.H., Schuchardt, I., Straube, A., & Steinberg, G., A dynein loading zone for retrograde
endosome motility at microtubule plus-ends. EMBO J, 2006. 25(11): p. 2275-86.
295. Zhang, J., Yao, X., Fischer, L., Abenza, J.F., Penalva, M.A., & Xiang, X., The p25 subunit of the
dynactin complex is required for dynein-early endosome interaction. J Cell Biol, 2011. 193(7):
p. 1245-55.
296. Ha, J.Y., Chou, H.T., Ungar, D., Yip, C.K., Walz, T., & Hughson, F.M., Molecular architecture
of the complete COG tethering complex. Nat Struct Mol Biol, 2016. 23(8): p. 758-60.
297. Suvorova, E.S., Duden, R., & Lupashin, V.V., The Sec34/Sec35p complex, a Ypt1p effector
required for retrograde intra-Golgi trafficking, interacts with Golgi SNAREs and COPI vesicle
coat proteins. J Cell Biol, 2002. 157(4): p. 631-43.
298. Willett, R., Ungar, D., & Lupashin, V., The Golgi puppet master: COG complex at center stage
of membrane trafficking interactions. Histochem Cell Biol, 2013. 140(3): p. 271-83.
299. Laufman, O., Hong, W., & Lev, S., The COG complex interacts directly with Syntaxin 6 and
positively regulates endosome-to-TGN retrograde transport. J Cell Biol, 2011. 194(3): p. 459-
72.
300. Gaynor, E.C. & Emr, S.D., COPI-independent anterograde transport: cargo-selective ER to
Golgi protein transport in yeast COPI mutants. J Cell Biol, 1997. 136(4): p. 789-802.
301. Xu, C. & Ng, D.T., Glycosylation-directed quality control of protein folding. Nat Rev Mol Cell
Biol, 2015. 16(12): p. 742-52.
302. Bruns, C., McCaffery, J.M., Curwin, A.J., Duran, J.M., & Malhotra, V., Biogenesis of a novel
compartment for autophagosome-mediated unconventional protein secretion. J Cell Biol, 2011.
195(6): p. 979-92.
303. Malhotra, V., Unconventional protein secretion: an evolving mechanism. EMBO J, 2013.
32(12): p. 1660-4.
304. Cruz-Garcia, D., Curwin, A.J., Popoff, J.F., Bruns, C., Duran, J.M., & Malhotra, V., Remodeling
of secretory compartments creates CUPS during nutrient starvation. J Cell Biol, 2014. 207(6): p.
695-703.
305. Thibault, G. & Ng, D.T., The endoplasmic reticulum-associated degradation pathways of
budding yeast. Cold Spring Harb Perspect Biol, 2012. 4(12).
306. Rothman, J.H. & Stevens, T.H., Protein sorting in yeast: mutants defective in vacuole biogenesis
mislocalize vacuolar proteins into the late secretory pathway. Cell, 1986. 47(6): p. 1041-51.
307. Apostolaki, A., Erpapazoglou, Z., Harispe, L., Billini, M., Kafasla, P., Kizis, D., Peñalva, M.A.,
Scazzocchio, C., et al., AgtA, the dicarboxylic amino acid transporter of Aspergillus nidulans, is
concertedly down-regulated by exquisite sensitivity to nitrogen metabolite repression and
ammonium-elicited endocytosis. Eukaryot Cell, 2009. 8(3): p. 339-52.

Página 276