PREGUNTAS QUIZIZZ.

• Seleccione la respuesta correcta acerca de la cromatografía de gases.

a) Es una técnica que permite separar los componentes volátiles de una muestra.
b) Se utiliza para obtener compuestos químicos puros.
c) Técnica que consiste en separar los componentes mediante las interacciones
químicas entre la sustancia y la columna del cromatógrafo.
• Dentro de las fórmulas que se mencionó el Xp es igua a?

a) Proporción de la varianza total de “Y”

b) Estimador de medida de proporcionalidad.
c) Varianza del término independiente o intercepto.
• ¿Cuáles fueron las interferencias mencionadas?

a) Blanco.
b) Placebo
c) Placebo + P.A
d) Todas las anteriores.
• ¿Cuáles son los criterios de aceptación para el coeficiente de correlación "r"?

a) valores mayores a 1.
b) valores mayores a 0,999
c) valores menores a 0,999
• La desviación estándar relativa debe ser igual a:

a) =2%.
b) <2%.
c) ≤ 2%.
ESCUELA SUPERIOR POLITÉCNICA DE CHIMBORAZO
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA; BIOQUIMICA Y FARMACIA

INTEGRANTES CÓDIGOS.
Tatiana Guaspha 3811
Jessica Granizo 3788
Iván Mejía 3588
Anabel Montero 3481
Karen Moyano 3786
Jorge Rodríguez 3623
Johana Rosero 3767

GRUPO N°02

CROMATOGRAFIA DE GASES

2021-2022
 VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO POR CROMATOGRAFÍA DE GASES
PARA CUANTIFICAR MENTOL EN UN UNGÜENTO.
Cromatografía de gases
Es una técnica que permite separar los componentes volátiles de una muestra, se distribuyen
entre una fase gaseosa móvil y una fase estacionaria líquida o sólida contenida en una columna.
La muestra para analizar se volatiliza y se inyecta en la cabeza de una columna cromatográfica.
La elución se produce por el flujo de una fase móvil de un gas inerte, cual tiene la función de
transportar el analito a través de la columna.
Un cromatógrafo de gases consta de una fuente de gas transportador, un inyector, una columna,
un detector y un dispositivo registrador.
La inyección se realiza generalmente con una microjeringa hipodérmica a un alineador de vidrio
contenido en un bloque metálico, donde se vaporiza y es barrida hacia la columna. El bloque se
calienta a temperatura fija en un valor suficientemente alto para convertir una muestra líquida en
vapor. La cantidad de muestra inyectada es del orden de µL para líquidos, el volumen inyectado
no debe superar la capacidad de la columna y mientras más pequeño el volumen de la muestra
mayor será la eficiencia y reproductibilidad del análisis.
Las columnas cromatográficas varían en longitud, pero a fin de colocarse en el interior de un
termostato, normalmente se configuran como helicoides con diámetros de 10 a 30 cm. La
temperatura debe ser constante por ello se introduce dentro de un horno termostatizado. La
temperatura óptima depende del punto de ebullición de la muestra y el grado de separación
requerido.
Las sustancias presentes en la muestra pasan a través de la columna, donde se separan y llegan
al sistema de detección. El tipo de detector que se usa depende de la naturaleza de los
componentes que se analizan y es específica según las características. Debe tener 1) Adecuada
sensibilidad, 2) Buena estabilidad y reproductibilidad, 3) Una respuesta lineal para los analitos,
4) Un intervalo de temperaturas de trabajo desde la ambiental hasta al menos 400°C, 5) Alta
fiabilidad y manejo sencillo, 6) Respuesta semejante para todos los analitos y 7) No destructivo
con las muestras.
La señal de salida de los detectores se registra como respuesta del instrumento en función del
tiempo y la medida del área o altura del pico, es una función de la cantidad presente.
Para el siguiente análisis se consideró un producto farmacéutico en forma de ungüento asociado
a dos P.A. Mentol y Salicilato de metilo. Utilizando como método de validación analítico la
cuantificación del principio activo Mentol por cromatografía de gases, para ello verificamos si
el producto cumple con los parámetros de validación establecidos por la Farmacopea de EE.
UU. (USP 34).
1.1. Materiales, reactivos y equipos.
1.1.1 Materiales
De análisis

 100 g de placebo ungüento

 Potes de ungüento conteniendo Mentol 8,18 g/100 g de Laboratorios Farmacéuticos
Markos S.A.
1.1.2 Estándares
Estándar primario Menthol USP

 USP Reference Standard MENTHOL 250 mg Potencia 99,9%

Estándar secundario Mentol

 Potencia 99,03% (Lote: 1011260)

1.2. Reactivos y solventes.

 1-Butanol Merck 2,5 L.

 Metanol grado HPLC Merck 4 L.
 Agua ultrapura.
1.3. Equipos

 Balanza analítica
 Baño María
 Cromatógrafo de gases
 Cabina de flujo laminar (Luz UV)
 Microbalanza
 Purificador de agua
 Ultrasonido

1.4 Otros

 Columna G16 (DB-WAX/Polietilenglicol 60 m Largo x 0,250 mm Ancho x 0,50 µm

Film). Límite de temperatura: 20-250 °C
 Termómetro de líquido en vidrio Silver Brand.
 Membrana de filtración Sartolon Polyamid, tamaño del poro 0,45 µm x 47 mm.
 Membrana de filtración Sartolon Polyamid, tamaño del poro 0,45 µm x 25 mm.
 Portafiltro descartable Agilent Technologies Econofilter 25 cm de diámetro x 0,2 µm de
tamaño de poro
 Tapas y septas Agilent Technologies
 Viales 100/PK Agilent Technologies
 Jeringas de plástico 5 mL 21G x 11/2”
 Papel Parafilm “M”
 Guantes de látex
2. Método
2.1 Selección y tamaño de la muestra
Se realizó un muestreo aleatorio de los potes de ungüento que contienen Mentol, teniendo en
cuenta el manejo de las tablas Militar Estándar 105E.
2.2 Condiciones cromatográficas.

 Columna: G16 (Polietilenglicol 60 m Largo x 0,259 mm Ancho x 0,50 µm Film) Limite

de temperatura: 20-250 °C.
 Gas Carrier: Helio
 Flujo: 2,01 mL/min
 Makeup Flow (He): 30,8 mL/min
 Flujo Columna + H: 31,2 mL/min
 Flujo Columna + Aire: 426 mL/min
  Flujo de venteo: 29,8 mL/min
 Purga: 2,58 mL/min
 Tipo de inyección: Split
 Detector: FID (Detector de ionización a la llama a 250°C)
 Temperatura Inyector: 250°C
 Temperatura inicial del horno: 70°C tiempo: 1 minuto
 Rampa 1: 7,5°C/min.
 Temperatura Horno Final: 180°C, tiempo: 9 minuto
 Volumen de Inyección: 1 µL
2.3. Preparación de las soluciones de trabajo
Preparación del estándar interno
En un matraz volumétrico de 100 mL, se adicionó 1 mL de 1-butanol, se enrasó con metanol,
homogenizó y filtro de a través de la membrana de 0,45 µm x 25 mm.
Preparación de la solución estándar
Se pesó 100 mg de mentol estándar y añadió en un matraz volumétrico de 50 mL, se enrasó con
metanol y homogeneizó. Luego se transfirió 5 mL de la solución en otro matraz volumétrico de
50 mL y se añadió 1 mL del estándar interno, disolvió y enrasó con metanol, homogenizándose
y filtrando a través de la membrana de 0,45 µm x 25 mm.
Preparación de la muestra
En un matraz volumétrico de 50 mL se pesó aproximadamente 1,32 g de muestra se añadió 30
mL de metanol, se colocó a baño María hasta obtener una solución homogénea, luego se enfrió
y enrasó con metanol, transfiriéndose 5 mL de esta solución en un matraz volumétrico de 50 mL
y se añadió 1 mL del estándar interno, enrasando con metanol, homogenizando y filtrando a
través de la membrana de 0,45 µm x 25 mm.
EXACTITUD PORCENTAJE DE MENTOL RECUPERADO.

mg (h) Criterio de aceptación: El porcentaje de recuperación

R  x 100 promedio (R) deberá acercarse al 100%. En este caso, por
mg (a) tratarse de análisis de un principio activo en producto terminado
se considera como indicativo de exactitud valores de 98- 102%.
Concentración en la variabilidad de los resultados mediante la aplicación de la prueba
estadística G de Cochran:

Criterio de aceptación: Si G experimental (Gexp) es menor al

G de tabla (Gtabla) para un valor de p=0,05; 3 grupos de
concentraciones (k=3) y 3 número de determinaciones por grupo
(n=3), entonces el factor de concentración no influye en la variabilidad de los resultados.

Exactitud se determinó mediante la aplicación del test de Student:

Criterio de aceptación: Si el texp es menor al ttabla; para (n-
1) grados de libertad y un nivel de confianza del 95 % (α=0,05),
entonces no existirá diferencia significativa entre la
recuperación promedio y la cantidad añadida de mentol

CÁLCULOS Y ANÁLISIS ESTADÍSTICO:

Cálculo de la recta de regresión:
Se determinó la curva de calibración relacionando la respuesta (ratio) con la
concentración del analito sobre los puntos sin promedio.

Coeficiente de correlación (r)

El coeficiente de correlación "r" refleja el grado de relación o ligazón existente entre
las variables X (concentración) e Y (respuesta). Si es cercano a la unidad significa
que existe correlación con una probabilidad elevada.

Criterio de aceptacion: r no debe ser significativamente diferente de 1. Valores

mayores a 0,999 se consideran como aceptables.
Coeficiente de correlacion “r2”.
Es el cuadrado del coeficiente de correlación “r” e indica la proporción de la varianza total de “Y”
CRITERIO DE ACEPTACION: r2 no debe ser significativamente diferente de 1

TEST DE VERIFICACIÓN DE LA PENDIENTE “B” O DE LA LINEALIDAD.

Criterios de aceptación: En los límites de confianza de la pendiente, estos no incluyen el cero.
Test de t, texp > ttabla para n-2 grados de libertad y un nivel de confianza del 95% (p=0,05), para
que “b” sea diferente de cero (Ha).

PARÁMETROS DE VALIDACIÓN
SELECTIVIDAD.
a. Identificación del pico del mentol en la muestra.
La solución estándar preparada con anterioridad se inyecta por duplicado, en el criterio
de aceptación se tiene que el tiempo de retención que presenta el pico resultante de la
muestra es igual al tiempo de retención del pico de la solución estándar.
b. Interferencias.
Dentro de las interferencias tenemos: Blanco, placebo solo, placebo más principio activo.
Blanco: Utilización de metanol y filtración a través de membrana posteriormente se da
la inyección por duplicado.
Placebo solo: Para la preparación del placebo solo se peso 1,32 gramos de placebo, se
transfirió a un matraz volumétrico de 50 ml y al mismo se le añadió 30 ml de etanol, esta
solución se la llevo a baño maría hasta obtener una solución homogénea, posteriormente
se enraso con metanol, se transfirió 5 ml de la solución y se añadió 1 ml de estándar
interno, se disolvió, se enraso con metanol y se homogeneizo, por último se filtró y se
inyecto por duplicado.
Placebo más principio activo: Se peso 1,32 gramos de placebo más 383 miligramos de
salicilato de metilo, se transfirió a un matra volumétrico de 50 ml, se añadió 30 ml de
etanol y fue llevado a baño maría hasta obtener una solución homogénea, esta solución
se dejo enfriar y se enraso con metanol, posteriormente se transfirió 5ml de la solución y
se añadió 1 m de estándar interno, se disolvió, enraso con metanol, se homogeneizó,
finalmente se filtro y se inyecto por duplicado.
Solución estándar y muestra: Ambas fueron preparadas y filtradas con anterioridad por
lo que se procedió a inyectar por duplicado. Para el criterio de aceptación se tomo en
cuenta la ausencia de pico en el tiempo de retención del mentol en la solución: Blanco,
placebo y placebo más principio activo siendo el principio activo el salicilato de metilo.
Análisis de muestras sometidas a condiciones de estrés: Se realizo el estudio en la
muestra y en el placebo para generar compuestos interferentes.
Además, se realizó los siguientes procesos:

Termólisis:

Fotólisis:

Hidrólisis alcalina.
Hidrólisis Ácida

Oxidación.

Comparación.
𝑻𝑹 pico del mentol con resultando de la inyección placebo y muestra sometidos a
estrés.
Resolución con respecto al pico del mentol.
Criterio de aceptación.
Muestras sometidas a estrés: No presenta productos de degradación que
interfieran con 𝑻𝑹 del mentol (Interferente debe tener resolución mayor o igual a
1,5.
Placebo en estrés: No presenta productos de degradación que interfieran con el
𝑇𝑅 del Mentol.
a. EXACTITUD.
Solución estándar: Preparada con anterioridad y filtrado, inyectado por veces.
b. Preparación de las muestras.
Muestra al 80%

Muestra al 100%

Muestra al 120 %
EXACTITUD PORCENTAJE DE MENTOL RECUPERADO.

mg (h) Criterio de aceptación: El porcentaje de recuperación

R  x 100 promedio (R) deberá acercarse al 100%. En este caso, por
mg (a) tratarse de análisis de un principio activo en producto terminado
se considera como indicativo de exactitud valores de 98- 102%.

Concentración en la variabilidad de los resultados mediante la aplicación de la prueba

estadística G de Cochran:

Criterio de aceptación: Si G experimental (Gexp) es menor al

G de tabla (Gtabla) para un valor de p=0,05; 3 grupos de
concentraciones (k=3) y 3 número de determinaciones por grupo
(n=3), entonces el factor de concentración no influye en la variabilidad de los resultados.
Exactitud se determinó mediante la aplicación del test de Student:
Criterio de aceptación: Si el texp es menor al ttabla; para (n-
1) grados de libertad y un nivel de confianza del 95 % (α=0,05),
entonces no existirá diferencia significativa entre la
recuperación promedio y la cantidad añadida de mentol

CÁLCULOS Y ANÁLISIS ESTADÍSTICO:

Cálculo de la recta de regresión:
Se determinó la curva de calibración relacionando la respuesta (ratio) con la
concentración del analito sobre los puntos sin promedio.

Coeficiente de correlación (r)

El coeficiente de correlación "r" refleja el grado de relación o ligazón existente entre
las variables X (concentración) e Y (respuesta). Si es cercano a la unidad significa
que existe correlación con una probabilidad elevada.

Criterio de aceptacion: r no debe ser significativamente diferente de 1. Valores

mayores a 0,999 se consideran como aceptables.
Coeficiente de correlacion “r2”.
Es el cuadrado del coeficiente de correlación “r” e indica la proporción de la varianza total de “Y”
CRITERIO DE ACEPTACION: r2 no debe ser significativamente diferente de 1
TEST DE VERIFICACIÓN DE LA PENDIENTE “B” O DE LA LINEALIDAD.
Criterios de aceptación: En los límites de confianza de la pendiente, estos no incluyen el cero.
Test de t, texp > ttabla para n-2 grados de libertad y un nivel de confianza del 95% (p=0,05), para
que “b” sea diferente de cero (Ha).

CRITERIOS DE ACEPTACION
En los límites de confianza de la pendiente, estos no incluyen el cero.
Test de t, texp>ttabla para n-2 grados de libertad y un nivel de confianza del 95% (p=0,05)
para que “b” sea diferente de cero. (Ha).
Test de verificación de la variable independiente (intercepto) o de proporcionalidad
“a” (Límites de confianza del término independiente y test de t para n-2 grados de
libertad y p=0,005.
Varianza del término independiente o intercepto (S2a).
∑ 𝑥2
𝑆 2 𝑎 = 𝑆 2 𝑏𝑋
𝑛
Desviación estándar del término independiente o intercepto Sa.

Desviación estándar relativa del término independiente o intercepto (S arel. (%):).

Límites de confianza del término independiente o intercepto:

𝑎 ± 𝑡𝑆𝑎
Test de t:

Criterios de aceptación
En los límites de confianza del término independiente o intercepto, estos incluyen el cero.
Test de t, texp>ttabla n-2 grados de libertad y un nivel de confianza del 95% (p=0,05)
para que “a” sea estadísticamente igual a cero (Ho).
Test estadístico del coeficiente de correlación “r”
Ho: No hay correlación entre X e Y
Ha: Hay correlación entre X e Y.

Donde:
r: Coeficiente de correlación lineal.
n: Número de determinaciones.

CRITERIOS DE ACEPTACION
Si el valor de t, obtenido es mayor que el tabla calculado para n-2 grados de libertad
y un nivel de confianza del 95% (α=0.06), entonces existe correlación lineal especifica
Test de linealidad
Obteniendo el factor de respuesta (f) por cada determinación.

Donde:
X: Concentración de analito (mg/mL)
Y: Radio del pico cromatográfico.

Criterios de aceptación
DSR f ≤ 2% DESVIACION ESTANDAR RELATIVA
Linealidad de la muestra
Se determino preparando soluciones de muestra en concentraciones del 40 80 100 120
160% por triplicado considerándose como 100% la cantidad de 1.32g de muestra
Preparación de la muestra
Muestra 40%
En un matraz volumétrico de 50ml se pesó un aproximado de 0,53g de muestra, se añadió
30ml de metanol, coloco a baño maría hasta obtener una solución homogénea, se dejó
enfriar y enraso con metanol y luego se transfirió 5ml de esta solución en un matraz
volumétrico de 50ml y añadió 1ml d estándar interno, se disolvió y enrasó con metanol
homogeneizó y filtro a través de membrana de 0,45µm x 25mm.
Muestra 80% se pesó un aproximado de 1.06g.
Muestra 100% se pesó un aproximado de 1,32g.
Muestra 120% se pesó un aproximado de 1,58g.
Muestra 160% se pesó un aproximado de 2,11g.
Precisión
Aptitud del sistema
Se preparo la solución estándar, y se inyecto 6 veces consecutivas, para evaluar la
descripción de las mismas.
Cálculos
Se calculo la desviación estándar relativa RSD

Criterio de acpetacion3
La desviación estándar relativa de los ratios halladas debe ser ≤ 2.
Precisión del método
a. Solución estándar
b. Soluciones muestra
Muestra 80% se pesó un aproximado de 1.06g.
Muestra 100% se pesó un aproximado de 1,32g.
Muestra 120% se pesó un aproximado de 1,58g.
Se repitió el análisis de la misma muestra 2 veces adicionales, en 2 días diferentes y por
un analista diferente cada vez.
Cálculos y análisis estadísticos

Donde:
n: Número de determinaciones
Xi: Valor medido por el ensayo i.
Xp: Estimador
La desviación estándar relativa RSD se calculó comode la media proporcional

Se evaluó la precisión del método a nivel de repetibilidad intermedia.

Repetibilidad:
Se evaluó los resultados obtenidos por un mismo analista en el mismo día y en la misma
serie de análisis,
Precisión intermedia:
Se evaluó los resultados obtenidos en el análisis de la muestra por los tres analistas en los
tres diferentes días.
Criterio de aceptación3:
Repetibilidad: DSR ≤ 2%
Precisión intermedia: DSR ≤ 2%
CONCLUSIONES:
El método desarrollado para la cuantificación de mentol en ungüento para cromatografía
de gases cumple con los parámetros de validación (Especificidad, Exactitud Linealidad y
Precisión) establecidos para la USP 34 para el uso especifico previsto.
 DETECCIÓN DE GRASA EXTRAÑA EN GRASA LÁCTEA POR
CROMATOGRAFÍA DE GASES Y ESTADÍSTICA MULTIVARIABLE
MÉTODO APLICADO
Análisis cromatográfico  EQUIPO

Cromatógrafo de gases Perkin Elmer Autosystem 9000, con detector de ionización de

flama e integrador de áreas PE Nelson modelo 1022

CONDICIONES DE OPERACIÓN
 Columna de fenil metil silicón a 5% con polaridad intermedia (HP5) y longitud
2 m×0.25 D.I.×0.25 grosor de capa.
 T°=De inyector 340 °C,temperatura del detector 350 °C

 Flujo del gas de arrastre (He) 1 mL min

 Programa de temperaturas del horno: 1 = 200 °C 0 min, con incrementos de 5 °C
min−1 hasta 325 °C; 2 = 325 °C 6 min

 Tiempo total de corrida 31 min

 Modo de inyección: splitless
 Tiempo de purga 0.75 min

 volumen de inyección: 1 μL

Los resultados se corrigieron usando una mezcla estándar de cinco TAG (20% cada
uno). Pureza mayor a 99% (Sigma 178- 11),

- Concentración de 20 mg mL−1 en hexano de tricaprilina, C24; tricaprina, C30;

trilaurina, C36; trimiristina, C42; tripalmitina, C48

Para identificar y cuantificar los TAG

Se compararon los cromatogramas (tiempos de retención y áreas de los picos) obtenidos
de grasa de leche con el cromatograma de la mezcla estándar. Los porcentajes de TAG
logrados se normalizaron con los factores de corrección determinados para los estándares
C24, C30, C36, C42 y C48, considerando que el C36 (trilaurina) es recuperado
completamente de la columna. Los factores de corrección para cada uno de los restantes
TAG se calcularon con la ecuación

Donde, fi = factor de corrección del TAG i; A1 = área de trilaurina; Asi = área del TAG
estándar i; C1 = concentración (mg mL−1 ) de trilaurina; Csi = concentración (mg mL−1
) del TAG estándar i.

Factores de corrección se determinaron inyectando siete veces 1 μL de la mezcla

estándar de TAG.
Se realizó un análisis de regresión simple, tomando como variable dependiente el tiempo
de retención de cada pico de TAG y como variable independiente el número de carbonos
correspondiente

La ecuación de la recta encontrada se usó para determinar los tiempos de

retención del resto de TAG.
• El intervalo de los factores de corrección fue 0.96 a 1.15, el cual es aceptado para
la corrección de los valores de TAG
• Factores de corrección mayores a 1.15 son insatisfactorios y se aumenta el flujo
del gas de arrastre para obtener factores aceptables.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

 Triacilgliceroles presentes en grasa láctea

Las condiciones cromatográficas permitieron obtener en grasa de leche cruda picos bien
desarrollados desde los TAG de peso molecular (PM) bajo
TAG bajo (C28 a C32) hasta los de PM alto (C34 a C54).

Estos resultados se deben a que el contenido de AG de cadena larga en la molécula del

TAG es alto, principalmente AG saturados e insaturados con 16 y 18 carbonos

 Detección de grasa no láctea en grasa láctea regresión múltiple y su

aplicación en la detección de adulteraciones en grasa láctea
Tomando en cuenta los intervalos de confianza para GL puras a un nivel de 95%, se
clasificó correctamente 100% de las muestras adulteradas con 10, 15 y 20% con aceites
de canola, girasol y manteca, es decir, todos los valores YMEZ quedaron fuera de los
intervalos definidos para grasas puras.

CONCLUSIONES
El análisis por cromatografía de gases de la grasa de leche de vaca en el Altiplano
Mexicano, reveló la presencia de triacilgliceroles de C28 hatsa C54. Cuando se
estudiaron mezclas de grasa láctea con grasa no láctea de origen vegetal y de origen
animal se encontraron modificado los perfiles de triacilgliceroles

REFERENCIA:
Vargas M. Vásquez P. Del Pilar G. (2012). Validación del método analítico por cromatografía de
gases para cuantificar mentol en ungüento. Universidad Nacional de Trujillo. Pag 01-40