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    Cultivo de Callos y Suspensiones Fva Udc

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    Leticia Lage
    Este documento describe los métodos de cultivo in vitro de callos y suspensiones celulares. Explica los procedimientos para iniciar cultivos a partir de explantos como semillas u órganos vegetativos, incluyendo la esterilización superficial y la selección del medio de cultivo. También describe cómo medir el crecimiento de callos y suspensiones, y tratar posibles contaminaciones.

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    Cultivo de Callos y Suspensiones Fva Udc

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    Este documento describe los métodos de cultivo in vitro de callos y suspensiones celulares. Explica los procedimientos para iniciar cultivos a partir de explantos como semillas u órganos vegetativos, incluyendo la esterilización superficial y la selección del medio de cultivo. También describe cómo medir el crecimiento de callos y suspensiones, y tratar posibles contaminaciones.

    Título original

    CULTIVO DE CALLOS Y SUSPENSIONES FVA UDC

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    Este documento describe los métodos de cultivo in vitro de callos y suspensiones celulares. Explica los procedimientos para iniciar cultivos a partir de explantos como semillas u órganos vegetativos, incluyendo la esterilización superficial y la selección del medio de cultivo. También describe cómo medir el crecimiento de callos y suspensiones, y tratar posibles contaminaciones.

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    de 33

    Tema 6.

    Cultivos in vitro de callos


    y suspensiones.
    1.2 Cultivo in vitro

    Uso de medio de cultivo + Condiciones de asepsia controlada

    Cultivo in vitro vs cultivo tradicional


     Independencia geográfica, estacional y ambiental
     Producción ininterrumpida
     Ni pesticidas ni herbicidas
     Ciclos de crecimiento más cortos
    × Alto coste

    Suspensiones
    Callos
    celulares
    INICIACIÓN DEL CULTIVO
    DE CALLOS.
    Procedimiento:

    • 1.- Elegir el explanto.


    • 2.- Elegir el método de esterilización de superficie.
    • 3.- Elegir la composición del medio.
    Fuentes de explanto para los cultivos:

    • Cualquier parte de la planta:


    - Órganos.
    - Tejidos específicos.
    • Características:
    - Con células vivas activamente en división.
    - Jóvenes.
    - Saludables.
    - Libre de signos de decaimiento
    - Libre de enfermedades y plagas.
    - Que no entren en periodo de latencia
    Métodos de Esterilización para Eliminar los
    contaminantes de superficie:

    • Objetivo:
    - Eliminar la flora microbiológica de superficie.
    - No destruir muchas células del explanto.
    • SEMILLAS:
    - Sencillas de esterilizar.
    - Depende del tipo de semilla:
    - La exposición y concentración pueden variar
    en función de las especies y genotipos.
    SEMILLAS

    Sumergir en etanol al 70% 2 min


    Sumergir en Hipoclorito Na 20% 20 min

    INTERIOR CABINA DE FLUJO


    LAMINAR
    Lavados sucesivos en agua.
    Dejar secar en asepsia.
    Transferir a los medios
    Inicio de una línea celular

    Semillas Etanol Lejía Lavado


    de 70% 20% Agua estéril
    pimiento
    • TEJIDOS VEGETATIVOS:
    - Generalmente hojas y tallos.
    - Problema por contaminantes endógenos.
    - Procedimiento:
    -Lavar para eliminar la tierra.
    -Lavar con etanol al 70-100%.
    -Superficie se esteriliza con lejía al 5-20%
    -Lavar con agua.
    Obtención de vitro plant
    Iniciación de callos desde los explantos:

    • Quitar las plántulas de los contenedores y llevar


    a una placa estéril.
    • Cortar las partes en tamaños uniformes y colocar
    en recipientes con medio.
    • Sellarlos e incubar a 25ºC, en luz- oscuridad
    dependiendo del genotipo.
    • Si no se inician dentro de 3-8 semanas hay que
    reexaminar el método de esterilización y la
    composición del medio.
    Obtención de callos y repicado

    Formación de
    plantas in vitro
    10-15 días
     Esterilización
     Medio de cultivo
    CRECIMIENTO DE CALLOS Y
    CULTIVO DE SUSPENSIONES
    CELULARES
    • MEDIDA DEL CRECIMIENTO DE
    LOS CALLOS:
    - Cálculo del peso fresco y peso seco (se
    envuelve el callo en papel de aluminio y se
    mantiene en la estufa a 80ºC durante 2
    días)
    - Curva de crecimiento: fase lag inicial –
    crecimiento exponencial – disminución del
    crecimiento – fase estacionaria –
    senescencia.
    • CONTAMINACIÓN DE LOS CULTIVOS:
    - Bacterias: aparecen en 1 semana. Anillo
    blanquecino cerca del callo.
    - Hongos: hifas a las 2 semanas de repicar.
    - Levaduras: detección al microscopio.
    - Consecuencias:
    - disminución del crecimiento del callo
    - pardeamiento
    - Soluciones:
    - eliminación de la placa contaminada
    - tratamiento con antibióticos
    Inoculación in vitro
    27 de julio 2020
    11 agosto 2020
    Inicio de callo
    7 septiembre 2020
    1 repicado
    Semana
    16 nov
    Obtención de suspensiones celulares
    INICIO DE SUSPENSIONES CELULARES:

    • Suspensiones:
    - Pueden crecer en masa.
    - Tasa de crecimiento muy rápida.
    - Todas las células uniformemente expuestas
    al medio.
    • Usos:
    -Protoplastos para fusión o manipulación
    genética.
    -Embriogénesis a mayor escala.
    -Producción comercial de metabolitos
    secundarios.

    • Cultivo: medio agitado a 100 r.p.m. y 25ºC.


    • La curva de crecimiento es similar a los
    callos: fase lag inicial – fase exponencial –
    fase estacionaria.
    • El ciclo de crecimiento se completa más
    rápido, se debe repicar a las 1 – 3
    semanas.
    • Se puede alterar la curva de crecimiento
    alterando las condiciones del cultivo.
    • Existe fuente de variación que proporciona
    las bases de la selección celular in vitro.
    • Si existen problemas al iniciar la
    suspensión:
    • 1. Seleccionar células que crecerán
    en el medio líquido. Se cogen porciones
    friables y no pardeadas, en un volumen
    de 10 ml. Según crezcan las células se
    añade un pequeño volumen de nuevo
    medio.
    • 2. Modificar el medio cambiando las
    concentraciones de auxinas y
    citoquininas basándose en un cuadro
    latino. Al principio se elimina el medio
    viejo y se cultivan en medio nuevo. Luego
    se procede como en el caso anterior.
    Obtención y caracterización de suspensiones
    celulares

    12

    pH / con (mS. cm-1)


    40 Parámetros de crecimiento
    9 de suspensiones celulares
    PCV (%)

    30
    de G. biloba
    6
    20
    3
    10

    0 7 14 21 28
    Días
    PCV
    pH
    conductividad
    Obtención y caracterización de suspensiones
    celulares

    50 12

    pH / con (mS. cm-1)


    Parámetros de crecimiento
    40 9
    de suspensiones celulares
    PCV (%)

    de B. pendula
    30 6

    20 3

    0 3 6 9 12 15 18 21

    PCV Días
    pH
    conductividad
    • MEDIDA DEL CRECIMIENTO DE
    SUSPENSIONES CELULARES:

    Filtración al vacío de la suspensión


    - Peso fresco: se raspan las células y se pesan
    en papel de aluminio
    - Peso seco: se mantienen 2 días en estufa a
    80ºC.
    - Volumen de empaquetamiento celular (PCV).
    El volumen se suspensión se centrifuga (100
    rpm, 10 min) y se expresa como % de
    volumen. Crecimiento vigoroso: 40 – 50 %
    PCV.
    - Contaje del número de células. Problema:
    dificultad en separar los agregados.
    • CONTAMINACIÓN EN LOS CULTIVOS
    CELULARES:
    - Bacterias: se detecta por un color azulado del
    medio; el menisco es azul.
    - Hongos: aparecen como pelotas de micelio.
    - Levaduras: suspensiones color crema.
    - Descartar las suspensiones contaminadas.

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