Guia de Practicas Microbiologia

Guía Práctica de Microbiologia Veterinaria. M.V.Z. Boris A.
Dueñas Fernandez
INTRODUCCION
Aunque durante mucho tiempo se sospechó la existencia de criaturas demasiado pequeñas

para ser percibidas a simple vista, su descubrimiento estuvo relacionado con la invención del
microscopio. En 1664 Robert Hooke describió los cuerpos fructiferos de mohos (células
eucarióticas), pero la primera persona que vio microorganismos con detalle fue el holandés
Antonie van Leeuwenhoek quien, aficionado a construir microscopios, utilizó microscopios
simples fabricados por él mismo. Comparados con los de hoy, los microscopios de
Leeuwenhoek eran bastante primitivos pero mediante cuidadosa manipulación y un buen
enfoque fue capaz de ver microorganismos tan pequeños como los procariotas.
Durante el siglo XX la Microbiología ha experimentado un rápido desarrollo en dos

direcciones distintas, una básica y otra aplicada. En su aspecto aplicado, los progresos de
Koch condujeron a un extenso desarrollo de la microbiología médica y la inmunología en la
primera parte del siglo, con el descubrimiento de muchas nuevas bacterias patógenas y el
establecimiento de los principios por los que estos patógenos infectan el cuerpo y se hacen
resistentes a las defensas del mismo
Hacia los años setenta nuestros conocimientos sobre los procesos básicos de la fisiología, la
bioquímica y la genética bacteriana avanzaron de tal modo que hicieron posible manipular
experimentalmente el material genético de las células usando bacterias como instrumentos.
Esos conocimientos también permitieron introducir material genético (DNA) de origen
exógeno en bacterias y controlar su replicación y características. Esto llevó a la aparición de
la biotecnología. Aunque la biotecnología tuvo inicialmente sus orígenes en estudios
básicos, su aplicación al bienestar humano ha requerido la aplicación de principios
fisiológicos y de microbiología industrial.
Escuela Profesional de Mdicina Veterinaria y Zootecnia- UNAMAD pag. 1

Guía Práctica de Microbiologia Veterinaria. M.V.Z. Boris A. Dueñas Fernandez
CONTENIDO
INTRODUCCION Pag.
RECOMENDACIONES Y BIOSEGURIDAD
03
Prac, Nro. 1. MATERIAL Y EQUIPO DE LABORATORIO
07
Prac, Nro. 2. PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO
12
Prac. Nro. 3. PLAQUEO Y ENTUBADO DE MEDIOS DE CULTIVO
15
Prac. Nro. 4. MÉTODOS DE SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE
MICROORGANISMOS. 20
Prac. Nro. 5. SENCIBILIDAD BACTERIANA
24
Prac. Nro. 6. TINCIÓN GRAM
27
Prac. Nro. 7. TINCIÓN DE ZIEHL-NEELSEN (acido resistente)
31
Prac. Nro. 8. COLORACIÓN DE ESPORAS, TINCIÓN NEGATIVA
33
Prac. Nro. 9. RECUENTO TOTAL DE BACTERIAS AEROBIAS MESOFILAS.
35
Prac. Nro. 10. RECUENTO DE COLIFORMES: DETERMINACIÓN DEL NUMERO MAS
PROBABLE (NMP). 38

Prac. Nro. 11. IDENTIFICACIÓN DE COCOS GRAM POSITIVOS.
42
Prac. Nro. 12. IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM POSITIVOS
47
Prac. Nro. 13. IDENTIFICACION DE COCOS GRAM NEGATIVOS
52
Prac. Nro. 14. IDENTIFICACIÓN DE BACILOS GRAM NEGATIVOS
56

RECOMENDACIONES Y BIOSEGURIDAD
TECNICAS DE LABORATORIO MICROBIOLOGICO
El objetivo del Laboratorio de Microbiología es el aislamiento del agente

etiológico de la enfermedad que aqueja a nuestro paciente. Luego a partir de
éste, se procederá a la identificación y determinación de sensibilidad.
Con el objeto de lograr esto y para dar una orientación temprana al clínico, se
puede proceder a la tinción y observación directa de la muestra. Luego se
sembrará para obtener colonias aisladas del agente infeccioso. Es a partir de
estas colonias que se procederá a la identificación mediante pruebas
bioquímicas y a la determinación de la sensibilidad a los antibióticos.
Asimismo para emitir un dictamen sobre el grado de contaminación de los

alimentos y el agua.
En el Laboratorio de Microbiología deben tenerse especiales precauciones a fin

de evitar la contaminación de las muestras clínicas y de los cultivos, así como
la infección del operador.
Recomendaciones:
Antes de venir a clase lea el ejercicio o práctica que será ejecutada ese día, de
tal forma que Ud. Pueda entender lo que se hará en clase.
Siempre planifique su trabajo para evitar perdidas de tiempo. Tome nota de

todo lo que se está ejecutando durante las prácticas.
Asuma que todos lo microorganismos con que Ud. Está trabajando son
patógenos (causantes de enfermedad).

Bioseguridad en el Laboratorio de Microbiología
Se define como Bioseguridad al conjunto de medidas preventivas tendientes a

proteger la salud de las personas que trabajan en el Laboratorio, frente a los
riesgos que presentan los agentes biológicos, físicos o químicos, así como
también la protección del medio ambiente.
Riesgo por agentes biológicos
Este se produce por la inhalación, ingestión o contacto directo con la piel,

mucosas y conjuntiva de los microorganismos.
Riesgo por agentes químicos
Este se produce por la ingestión, inhalación y contacto directo de la piel,

mucosas y conjuntiva con sustancias tóxicas, corrosivas o irritantes.
Riesgo por agentes físicos
Este se produce al estar en contacto con sustancias radioactivas, radiaciones,

exposición a ruidos, fuego o electricidad.
Medidas mínimas de bioseguridad que deben ser aplicadas en el

Laboratorio de Microbiología
1. Uso obligatorio de guardapolvo o

mandil blanco.
2. Si tiene el pelo largo, éste debe ser
recogido.
3. No comer, fumar ni beber dentro del
Laboratorio.
4. Tener absoluto cuidado del material
y equipo, manteniéndola limpia y cumpliendo con las instrucciones del
jefe de prácticas.
5. En caso de derrame de material contaminado, avisar inmediatamente al
encargado.
6. Nunca usar la boca directamente para pipetear ni etiquetar o rotular los
envases.
7. Cualquier accidente (rotura de tubos, placas que contengan cultivos, así
como heridas de las personas) debe comunicar al técnico de laboratorio
para que tome las medidas necesarias.
8. Desechar el material contaminado en los recipientes adecuados.
9. Uso cuidadoso de los mecheros (guantes) para evitar quemaduras.
10. No amontonar material innecesario en la mesa de trabajo, sino tener lo
indispensable.
11. Prever una probeta que contenga solución de fenol al 2 %, lugol o amonio
cuaternario para introducir las pipetas usadas.
12. Debe dejarse las mesas de trabajo limpias y en orden y no botar basura a
las canaletas para evitar obstrucciones.
13. Cerrar el gas cada vez que no sea empleada así como las llaves de grifos
y lámparas.
14. Lavarse las manos con agua y jabón antes de retirarse del Laboratorio.
Control de la contaminación dentro del Laboratorio
Es de la mayor importancia el evitar la contaminación de las muestras, para así

obtener un buen diagnóstico. Es necesario por lo tanto que el operador trabaje
haciendo uso de una buena técnica aséptica y usando material estéril.
Esterilización
Proceso que elimina toda forma de vida. Elimina bacterias y sus formas de
resistencia, las esporas, elimina virus, y hongos.
Técnica aséptica
Tanto los medios de cultivo como las muestras deberán manipularse con
técnica aséptica, que será practicada en el laboratorio. Las técnicas de siembra
aséptica y de siembra de aislamiento también serán llevadas a la práctica.

PRACTICA Nro. 1
MATERIAL Y EQUIPO DE LABORATORIO
En el laboratorio de microbiología se usa una infinidad de materiales y equipos

desde las más simples hasta las más sofisticadas, a continuación se mostrarán
y conocerán su uso especialmente en microbiología.
1. Refrigeradoras y congeladoras.
Las refrigeradoras se requieren para almacenar medios de cultivo, sueros,

discos de sensibilidad. El uso de las
congeladoras son para el
almacenamiento más prolongado de
sueros, enzimas, etc.
Deben localizarse lejos de los hornos

de aire caliente, de radiadores y de
tuberías de agua caliente.
2. Autoclave.
Hay de diversos modelos y marcas, estos

pueden funcionar a electricidad o a gas
propano, cuya temperatura de funcionamiento
es de 121ºC por 15 Libras de presión durante
15 a 30 minutos. Se fundamenta en la
ebullición del agua a una presión superior al
normal, elevando la presión atmosférica así
como la temperatura, en consecuencia el
vapor de agua penetra por osmosis a la célula
coagulando su citoplasma, destruyéndose las

formas vegetativas y esporuladas.
3. Equipo para filtraciones.
En la actualidad se usan tres tipos de filtros, para la esterilización por filtración:
Filtro de membrana.- Disco de elevada porosidad de esteres de celulosa

(acetato de celulosa), con variada gama de diámetro de poros, retienen en su
superficie aquellas partículas que sobrepasan un tamaño dado. La retención de
partículas se efectuará por medio de poros y no por atracción o adsorción
electrostática.
Filtro Seitz.- Discos formados por una

mezcla de amianto y celulosa. La
retención de bacterias se hace por
adsorción y atracción electrostática.
Filtros de placa filtrante de vidrio.-

Compuesto de fragmentos de vidrio
fundido formando un disco, y que
suelen utilizarse para volúmenes relativamente baratos y resultan útiles para
volúmenes grandes.
4. Centrifuga.
Son aparatos diseñados para acelerar la

separación de particular sólidas
suspendidas en líquidos. La velocidad a la
cual sedimentará las partículas en un
líquido depende de varios factores como;
Tamaño de partícula, viscosidad del

líquido, peso de la partícula y fuerza gravitacional.
Existen centrífugas de los más diversos tipos de acuerdo al uso al cual están
destinados. Las velocidades que se obtienen son también variables, hay
centrífugas de mano, centrífugas que dan 1,500 rpm y otras de 3,000 a 5,000
rpm y otras son ultra centrífugas que dan hasta 18,000 rpm.
Para trabajar con las centrífugas, se debe tener en cuenta las siguientes
recomendaciones:
- Asegurarse de conocer el manejo de una centrifuga determinada antes de

utilizarla, seleccionando los tubos adecuados a su velocidad.
- Cubrir los tubos a centrifugar con tapón de algodón (sujetado de tal forma
que no vaya al fondo) o con papel de aluminio.
- Contrapesar los tubos por centrifugar que van opuesto uno del otro.
- Subir la velocidad de la centrifuga lentamente, una vez terminada la
operación reducirla también lentamente.
5. Microscopio.
El tipo de microscopio más utilizado es el microscopio

óptico, que se sirve de la luz visible para crear una
imagen aumentada del objeto.
Algunos microscopios ópticos pueden aumentar un objeto

por encima de las 2.000 veces. El microscopio compuesto
consiste en dos sistemas de lentes,
el objetivo y el ocular, montados en
extremos opuestos de un tubo cerrado. El objetivo está
compuesto de varias lentes que crean una imagen real
aumentada del objeto examinado. Las lentes de los

microscopios están dispuestas de forma que el objetivo se encuentre en el
punto focal del ocular. Cuando se mira a través del ocular se ve una imagen
virtual aumentada de la imagen real. El aumento total del microscopio depende
de las distancias focales de los dos sistemas de lentes.
6. Estereoscopio.
También, llamado microscopio estereoscópico, utilizado en el laboratorio de

microbiología para realizar observaciones de la morfología de las colonias en
medios de cultivo en placas petri, etc.
7. Estufa eléctrica.
Equipo empleado para el cultivo de las

muestras clínicas, en medios de cultivo. La
temperatura de este equipo se gradúa de
acuerdo al tipo de microorganismo que se
quiere aislar (psicrófilos, mesófilos y
termófilos).
8. Horno eléctrico.
Equipo eléctrico cuyo funcionamiento es

automático llegando a un máximo de 220ºC de
temperatura por un tiempo de 2 horas. Se usa
para esterilizar material resistente al calor seco
como acero inoxidable, pirex, etc.
9. Cuenta colonias.
Equipo eléctrico, provista de una fuente de luz y

una lupa, con la finalidad de visualizar las colonias
pequeñas presentes en la placa petri, de esta

manera efectuar un conteo más exacto del número de colonias.
10. Balanza de precisión.
Este equipo es útil para el pesado de los

medios de cultivo en su preparación, así como
muestras clínicas, alimento que serán
sometidas a análisis y cuantificación de
gérmenes por gramo de muestra.
11. Jarras de anaeobiosis.
Este equipo sirve para proporcionar un

ambiente carente de oxigeno y muchas veces
proporcionarle un determinado porcentaje de
CO2, en el proceso de cultivo de
microorganismos anaeróbicos o microaerófilos.
12. Estuches
para pipetas y placas petri.
Necesarios para someter a las pipetas y placas

al proceso de esterilización. Posterior a esta
mantenerlos estériles hasta el momento de su
utilización.
Homogenizador.
Equipo eléctrico que a través de vibraciones

enérgicas se consigue el homogenizado del
contenido que generalmente es liquido mezclado
con partículas grandes.
13. Equipo de siembra.
Existe una variedad de materiales y equipos de siembra como; trípode, malla

de asbesto, mechero bunzen, guantes de asbesto, asa de kolle, aguja de kolle,
espátula de Drigalky, teas, placas petri, gradillas, etc. Algunos de ellos se
muestran en las siguientes fotos.

PRACTICA Nro. 2.
PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO
INTRODUCCIÓN
Los medios de cultivo son fuentes nutritivas, naturales o sintéticas, que

semejan el nicho ecológico de los microorganismos. Especies bacterianas
diferentes cultivadas en el mismo tipo de medio, pueden aparecer
diferentes, de este modo el conocimiento de la apariencia o de las
características culturales, de las especies bacterianas, es útil para el
reconocimiento de cierto tipo de bacterias.
FUNDAMENTO
Cada individuo tiene propio ambiente y forma de vida, y para cultivar o

hacer multiplicar a los microorganismos, se les somete a un ambiente
parecido donde haya alimentos, temperatura, pH, presión atmosférica, y
presión osmótica adecuados.
TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO
- Por su origen.
Naturales, medios a base de leche y papa.
Artificiales, siendo transformados por medios mecánicos o químicos

Ejm. Agar nutritivo, Agar Mc Conkey.
- Por su consistencia.
Líquidos, soluciones acuosas; Caldo nutritivo, caldo BHI.
Solidos el componente principal es el Agar-agar; el Agar nutritivo,

Agar sangre, Agar SS etc.
- Por su objetivo.
Medios de transporte, mantiene microorganismos viables y

conservados; Cary Blair, Medio Stuard.
Medios de enriquecimiento. Multiplica bacterias antes de su siembra;

Caldo selenito, Caldo tetrathionato.
Medios de enriquecimiento mejorados. Constituidos por un medio

base, se añade sustancias ricas en proteínas como el Agar sangre.
- Medios de aislamiento.
Medios de aislamiento no selectivos Sirven para aislar o cultivar

bacterias, no contienen inhibidores; Agar nutritivo Agar BHI, y mejorados
como el Agar sangre. Medios de aislamiento selectivos. Presentan el
medio base, además llevan un substrato más indicadores y de manera
especial inhibidores; sales, colorantes, como el Agar EMB, ENDO,
Manitol salado, Agar verde brillante.
De aislamiento especifico. Son altamente enriquecidos; Lowestein

(Mycobacterium) y el agar Sabouraud.
- Medios diferenciales o bioquímicos. Son aquellos que llevan un

medio corriente, caldo o Agar nutritivo al que se le ha añadido un
substrato conocido, además lleva indicador de pH, así tenemos el TSI,
SIM, LIA etc
MATERIALES
- Matraz de Erlyn meyer.

- Probeta graduada.

- Balanza de precisión.
- Medios de cultivo deshidratado.
- Mechero bunzen.
- Agua destilada.
- Potenciómetro.
- Autoclave.
- Estufa a 37°C.
FORMAS DE PREPARACIÓN E INTERPRETACIÓN DE LOS MEDIOS DE

CULTIVO
POCEDIMIENTO
1. Algunos se preparan pesando

ingrediente por ingrediente, otros medios
vienen ya preparados, para un litro.
2. No mezclar los medios con espátula
sucias, luego tapar herméticamente,
para evitar su deshidratación.
3. Pesar en papel manteca que no exceda del tamaño del platillo, y
no dejar partículas de medio en el papel.
4. Usar frascos bien lavados, preferiblemente secos, de tamaño adecuado
a la cantidad de medio de cultivo.
1. Usar agua destilada o bi-destilada y probeta limpia.
5. Se disuelven los substratos calentando a temperatura de ebullición, y

cuando esté a 40°C se le ajusta el pH de 7.2 a 7.4; para ajustar el pH, se
usa soluciones de NaOH y/o HCI.
6. Se tapona el frasco con algodón y papel craft con el nombre del
medio, fecha e iniciales del que lo preparó, se amarra sujetando el
papel al cuello del frasco.
2. Llevar a autoclave, lavado y limpio con

agua destilada.
7. Se esterilizan los medios de cultivo a

15 libras de presión, 121°C por 15
minutos.
10. Dejar que la presión y la temperatura bajen solas; cuando estos

estén a 45°C se reparten en placas o tubos.

PRACTICA Nro. 3.
PLAQUEO Y ENTUBADO DE MEDIOS DE CULTIVO
Existen medios de cultivo sólidos y líquidos, dependiendo de esta

característica se pueden utilizar placas petri y/o tubos para la siembra
respectiva:
PLAQUEO
El plaqueo consiste el reparto de los medios de cultivo especialmente de

consistencia sólida, utilizando para este fin placas petri, para cumplir los
siguientes objetivos:
OBJETIVOS
 Aislamiento.- Para la siembra de muestras, con el objeto de

conseguir colonias aisladas, la siembra es por estrías.
 Contaje de colonias.- Para contar el número de colonias por ml.,
se coloca en la placa 1 ml. De la muestra problema, luego 10 ml.
De medio de cultivo (TSA, BHI, Agar Mueller Hilton). La siembra se
realiza por difusión.
 Bacteriofagotipaje y/o antibiograma.- Se reparte el medio de
cultivo, luego de endurar, la siembra se hace por diseminación,
resbalando el cultivo bacteriano con la ayuda de la espátula de
Drigalsky o un hisopo.
CONSIDERACIONES PREVIAS
Se debe tener el ambiente limpio y desinfectado, el material de vidrio
esterilizado y frió.

MATERIALES
- Placas petri.
- Tubos de ensayo.
- Frascos
- Mecheros con gas.
- Medios de cultivo esterilizado, licuados y a una temperatura entre 48 y
52°C.
- Matraz de Erlyn meyer.
- Baño maría.
- Lápiz de cera.
- Estufa.
PROCEDIMIENTO
1. Colocar todo el equipo necesario sobre la mesa de trabajo.

2. Abrir las placas Petri, del estuche o quitando el hilo y papel.
3. Abrir el medio a repartir, y flamear un ida y vuelta sobre la llama.
4. Con la mano izquierda coger la placa Petri, los dedos anular y meñique
van por debajo de la placa, pulgar y medio cogen por el borde, el índice
toca la superficie externa de la placa.
5. Abrir lentamente la placa hasta el ángulo de 45°, manteniéndola cerca
de la llama.
6. Con la mano derecha coger el frasco
que contiene el medio de cultivo, agitar
suavemente rotando, flamear la boca
del frasco y verter dentro de la placa
una cantidad adecuada, más o menos
12 ml.
1. Cerrar la placa y dejar sobre la mesa sin que el medio toque la tapa.
2. Proseguir con el resto del medio y placas, flameando con una ida y
vuelta la boca del frasco.
3. Una vez acabado de repartir, se debe enjuagar con agua de caño, los
frascos.
10. Una vez enfriado y endurado los medios en las placas, se voltean y
rotulan con lápiz de cera.
11. Se deja en refrigeradora a 4°C.
REPARTO DE LOS MEDIOS DE CULTIVO EN TUBOS.
- Medios líquidos.
Conocido también como "Caldo", si el medio es corriente puede servir

para estudios de desarrollo bacteriano, turbidez, sedimento. Si el medio
presenta un substrato conocido, se estudiará metabolismo, ejemplo, en
caldo peptonado se estudiará la prueba del Indol.
- Medios sólidos.
Este tipo de medio es aquel que lleva 1.5 % de agar-agar, y los medios
pueden adoptar las siguientes formas:
En columna.- Cuando no se inclina, se siembra por picadura o

puntura, por lo general sirve para conservar cepas.
En plano inclinado.- Se reparte la quinta parte del tubo, más o

menos, 2 ml. De medio, luego se le inclina en una varilla, el medio
debe estar por debajo de la tapa de algodón a 2 cm. En este medio
se puede estudiar desarrollo bacteriano, si el medio lleva un substrato
conocido más indicador, entonces se estudiará la bioquímica,
ejemplo: Agar úrea, se estudiará el metabolismo de la úrea; en el
Citrato de simons, se estudiará el desdoblamiento del Citrato.
En plano semi inclinado.- El medio se reparte en 1/4 ó 1/3 del

volumen del tubo, se semi-inclina, recostándolo sobre una tablita que
tenga una altura o ancho de 3 cm. Este medio se siembra en la
superficie por estrías y por picadura en el fondo, generalmente son
medios de diferenciación, sirve para el estudio bioquímico, Ejm. TSI,
LIA.
- Medios semi-sólidos.
Este medio es aquel que lleva solo el 0.5% de Agar-agar, al mismo

tiempo contiene substratos conocidos para estudios bioquímicos, por
ejemplo; el medio fluido de Thioglicolato, sirve para el control de
esterilidad de substancias, puede usarse para mantener Cepas: el
medio SIM sirve para estudiar las siguientes pruebas bioquímicas; H 2S,
Indol y Motilidad.
Para repartir los medios de cultivo en tubos, sean líquidos o sólidos, el

medio debe estar estéril, bien homogenizado, licuado y a una
temperatura de 40°C, en la que el operador no sufra por el calor, los
tubos deben estar estériles y fríos, la mesa de trabajo debe estar
desinfectado, el operador debe sentase cómodamente, colocando los
tubos al lado izquierdo y el medio a repartir al lado derecho.
PROCEDIMIENTO.
1. Se desatan los hilos de los paquetes de tubos y de la boca del frasco.

2. Se abre el frasco tomándolo con la mano derecha y con la izquierda se
destapa, y se deja el tapón de algodón dentro del papel del capuchón
que la mantenía envuelto.
3. Se flamea 2 a 3 ida y vueltas, la boca del frasco y se mantiene en
posición semi-inclinado este frasco cerca del mechero.
4. Con la mano izquierda se coge el tubo de la parte central, y se lleva
arriba a la altura del tórax del operador, cerca del mechero, con el

borde del margen inferior de la mano derecha y utilizando el dedo
meñique, se retira el tapón del tubo. Debe rotarse el tubo y tapón para
mantener estable el tapón.
5. Se flamea el tubo y se lleva cerca del pico del frasco.
6. Se vierte una cantidad adecuada de medio de cultivo, en forma lenta.
7. Luego se flamea el tubo, se vuelve a taponar y se deja en una gradilla o
se inclina sobre un soporte en la mesa de trabajo.
8. Se continúa de idéntica manera.
9. Si sobra medio de cultivo en el frasco se flamea la boca, y se tapona,
se coloca el papel rotulado, se amarra el hilo y se deja en la
refrigeradora.
10. Si se acabó el medio de cultivo, se debe enjuagar el frasco antes que se

enfríe, para evitar que el medio se enfrié dentro del recipiente.
11. Se rotula los tubos, se colocan en una misma gradilla y se dejan en la

refrigeradora.
La siembra debe hacerse cuando el medio de cultivo esté bien duro, esto en el
caso de medios sólidos.

PRACTICA Nro. 4
MÉTODOS DE SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS.
SIEMBRA.- Es el procedimiento que consiste en acondicionar el

microorganismo en un medio de cultivo fértil, de acuerdo a sus exigencias
vitales, para que en condiciones óptimas de temperatura y tiempo de
incubación pueda desarrollar y multiplicarse IN VITRO.
Todo aislamiento implica el agotamiento de una muestra sobre la superficie

de un medio sólido.
OBJETIVOS
L a siembra tiene los siguientes objetivos para llegar a los siguientes objetivos:
 Conocer las diferentes técnicas de siembra.

 Realizar un correcto aislamiento de colonias.
 Hacer un transplante de microorganismos.
 Conocer la técnica de siembra para recuento de microorganismos.
IMPORTANCIA
 En el aislamiento permite la separación de los microorganismos al

estado de pureza a partir de una muestra problema, y generar su
progenie (cepa).
 Si se aíslan especies distintas, cada colonia tendrá caracteres
especiales necesarios para la identificación de un determinado
microorganismo.
 Se realiza trasplante con la finalidad de mantener en la fase exponencial
una cepa determinada.
 El transplante en medios de cultivo especiales se logra conocer sus
características bioquímicas.
 Una correcta siembra para recuento permite obtener resultados
reales.
MATERIALES
- Estufa de incubación.
- Tubo de ensayo.
- Espátula de Drigalsky.
- Asa de Kolle.
- Pipeta graduada de 5 - 10 ml.
- Mortero.
- Gradilla y canastillas.
- Matraz de Erlyn Meyer.
- Mechero bunzen.
- Probeta graduada de 100 ml.
- Placas petri, con medios de cultivo.
- Cepas.
METODOLOGÍA
A. SIEMBRAS DIRECTAS:
1. Siembra por estría.
 Poseer la muestra, tomada ya

sea con un hisopo o torunda,
aguja hipodérmica o asa de kolle.
 La muestra tomada se toca la
superficie del medio de
cultivo depositado en la placa
petri, colocándola en un
extremo del medio.

 Con un asa de siembra estéril, se da inicio a la siembra, a partir de donde
se depositó la muestra, produciendo líneas sigzageantes.
 Concluida la siembra, cerrar la placa y dejarla sobre la mesa con la base
hacia arriba.
 Etiquetar la placa, y dejarla en la estufa a 37°C por 24 a 48 horas
 Realizar este procedimiento con asepsia cerca del mechero bunzen.
B. SIEBRA A PARTIR DE DILUCIONES SERIADAS. PREPARACIÓN Y

DILUCIÓN DE LA MUESTRA.
Las siembras a partir de diluciones seriadas es un método por agotamiento y se realiza

con la finalidad de cuantificar el número de colonias por una cantidad de muestra
determinada Ejm. El Número más Probable de Coliformes, cuantificar mesófilos
viables, etc.
 En un mortero estéril pesar un gramo de muestra, adicionar 9 ml. De

agua peptonada para obtener la dilución 1 : 10 ml.
 Pipetear 1 ml. De la dilución anterior y trasvasarlo a otro tubo de ensayo
que contenga 9 ml de agua peptonada. Proseguir hasta obtener la
dilución 1 : 1000000.
2. Siembra por diseminación.
Método de siembra mayormente usado

para el Recuento total de mesófilos
viables. El resultado de dicha siembra
presenta un crecimiento de las colonias
sobre la superficie de medio de cultivo
en forma diseminada, no siguiendo una
línea de siembra como en el caso de la
siembra por estrías.
 Obtener el inoculo preferentemente de muestras líquidas o a partir de

diluciones de muestras.
 Añadir a cada placa 15 ml. de agar para recuento y enfriarlos a
45 a 60°C y dejar solidificar.
 Utilizando una única pipeta, tomar O.1 ml. de cada una de la
diluciones, y depositarlo en la superficie del agar. Comenzar por la
dilución más baja, llenando y vaciando la pipeta 3 veces antes de
transferir 0.1 ml. a la placa.
 Extender las muestras de 0.1 ml. pronto después de depositarlas
sobre la superficie del agar con la ayuda de la espátula de Drigalsky,
dejar secar la superficie del agar durante 15 minutos.
 Incubar las placas invertidas por dos días a 37 °C.
 Contar las colonias en las placas que presenten entre 30 y 300 colonias.
3. Siembra por difusión.
A diferencia de la siembra por diseminación, en esta en el que el

procedimiento es fundir el medio de cultivo con el inóculo o la muestra diluida,
el crecimiento de las colonias además de observarse en la superficie del medio,
hay crecimiento en el fondo así como en el medio del agar.
 Pipetear en placas petri 1 ml. De las diluciones efectuadas en el punto B.

 Inmediatamente verter en las placas inoculadas 10 a 15 ml. De agar
Estándar fundido y templado a 45°C.
 Mezclar el inoculo de siembra con el medio de cultivo
 Una vez solidificado el agar invertir las placas e incubarlas a 35 °C
durante 24 a 48 horas.
 Utilizando el contador de
colonias, y el dispositivo de
registro automático, contar
todas las colonias en las placas
que presenten 30-300

colonias

PRÁCTICA Nro 5
SENSIBILIDAD BACTERIANA
INTRODUCCION.
El aislamiento de un agente infeccioso a partir de un paciente no es con

frecuencia suficiente para establecer la terapia adecuada. Muchas bacterias y
algunos hongos presentan resistencia a los agentes antimicrobianos y algunos
virus han desarrollado resistencia a los agentes antivirales más actuales. Los
patrones de resistencia cambian en forma constante y no importa lo
rápidamente que se introduzcan los nuevos agentes terapéuticos porque los
microbios parecen siempre dispuestos a superarlos.
Ya que no se puede predecir la susceptibilidad de las bacterias, hongos y virus

a los agentes antimicrobianos, con frecuencia es necesario estudiar la
sensibilidad individual de cada patógeno a estas drogas, pudiéndose elegir
entonces el agente apropiado (el más activo contra el patógeno, el menos
tóxico para el huésped, con las características farmacológicas apropiadas y el
más económico), que proporciona mayores posibilidades de una evolución
favorable.
Un concepto importante sobre el que es necesario insistir es que no se pueden

realizar pruebas de sensibilidad in vitro con cultivos mixtos, sólo los cultivos
puros proporcionarán resultados válidos sobre la eficacia de un antibiótico.
OBJETIVOS.
 Medir la sensibilidad de una cepa bacteriana que se sospecha es la

responsable de una infección a uno o varios antibióticos.
 Seguir la evolución de las resistencias bacterianas. Gracias a este
seguimiento epidemiológico, a escala de un servicio, un centro de

atención médica, una región o un país puede adoptar medidas de control.
FUNDAMENTO.
Las primeras pruebas se realizaron inoculando la

superficie de una placa de agar con el
microorganismo en estudio, colocando pequeñas
cubetas (de metal o vidrio) sobre el agar y
agregando las soluciones de los diferentes
antimicrobianos dentro de dichas cubetas. Los
agentes antimicrobianos difundían en el medio en
forma radial alrededor de la cubeta e inhibían el
desarrollo del microorganismo en la zona donde su concentración era
suficientemente alta. Las áreas de inhibición grandes indicaban una actividad
antimicrobiana más efectiva.
MATERIALES
- Cultivo de bacterias de 24 horas de crecimiento.

- Agua destilada estéril.
- Tubos de ensayo.
- Asa de kolle, y espátula de drigalsky.
- Pipetas graduadas.
- Mechero bunzen.
- Estufa eléctrica a 25ºC.
- Placas petri con medio Mueller-Hinton.
PROCEDIMIENTO.

El microorganismo a investigar se inocula cepas recientemente incubadas y
previamente diluidas en agua destilada. en una o varias placas de agar.
Sobre su superficie se disponen los discos correspondientes a varios

antibióticos.
Se incuban las placas durante 16-24 horas a 35ºC y al cabo de este tiempo
se estudia el crecimiento en ellas.
Se valora el diámetro de la zona de inhibición que se forma alrededor de

cada disco y se compara con las referencias publicadas por el NCCLS.
Con esta referencia podemos informar si el microorganismo es Sensible,

Intermedio o Resistente (S, I, R) a cada uno de los antibióticos
ensayados en las placas.
En la imagen de la izquierda se muestra una vista general de una placa con

crecimiento bacteriano y con seis discos de antibióticos. La zona de color claro
que ocupa la mayor parte de la placa es el crecimiento bacteriano en las zonas
no inhibidas. Los círculos negros que rodean a cinco de los seis discos marcan
las zonas en que los respectivos antibióticos han inhibido, con mayor o menor
eficacia, el crecimiento del microorganismo a estudio. El sexto disco (AM-10)
no tiene a su alrededor halo de inhibición lo que indica la resistencia del
microorganismo a ese antibiótico.

PRACTICA Nro.6
TINCIÓN GRAM
INTRODUCCIÓN
La observación de las bacterias fijadas sobre una lámina portaobjetos debe

hacerse mediante el empleo de tinciones. El tamaño de la mayoría de las
células bacterianas es tal que resultan difíciles de ver con el microscopio
óptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la célula y el medio
que la rodea. El modo más simple de aumentar el contraste es la utilización de
colorantes, uno muy usado en microbiología es la tinción Gram.
Esta tinción fue desarrollada empíricamente por Christian Gram en 1884. A

pesar del tiempo transcurrido, la tinción apenas se ha modificado y es uno
de los primeros pasos que se realiza para cualquier identificación bacteriana.
La técnica es capaz de diferenciar dos grandes grupos de eubacterias: Gram
positivas (G+) y Gram negativas (G -).
Esta tinción tiene gran importancia en taxonomía bacteriana ya que indica

diferencias fundamentales de la pared celular de las distintas bacterias.
Mientras que las bacterias gram-negativas son constantes en su reacción, los

microorganismos gram-positivos pueden presentar respuestas variables en
ciertas condiciones (son gram-lábiles). Por ejemplo, los cultivos viejos de
algunas bacterias gram-positivas pierden la propiedad de retener el cristal
violeta, y en consecuencia, se tiñen por la safranina apareciendo como
gram-negativas. Análogo efecto se produce en ocasiones por cambio en el
medio del organismo, o por ligeras modificaciones en la ejecución de la
técnica.
Para explicar el mecanismo de la tinción de Gram se han propuesto varias

hipótesis fundadas en la naturaleza química de las paredes celulares de los
microorganismos. Diferencias estructurales y químicas de los dos tipos de
pared bacteriana:
OBJETIVOS:
Iniciación en las técnicas del estudio de microorganismos: cultivo, tinción y

morfología.
Entrenamiento en preparación de extendidos y realización de coloraciones.
Observación microscópica de morfología y agrupamientos bacterianos.
MATERIAL NECESARIO:
Cultivo de bacterias.
Cristal violeta (1 g. de cristal violeta en 100 ce de agua destilada).
Lugol (1 g. de yodo en 2 g. de yoduro potásico en 100 cc de agua

destilada).
Safranina (1 g. de safranina en
100 cc de agua destilada).
Aceite de inmersión.
Microscopio binocular.
Portaobjetos.
Asas de cultivo.
Mechero.
Placas de Petri,

TÉCNICAS DE FROTIS Y TINCIÓN GRAM.
Para ello se debe limpiar un

portaobjeto con alcohol se evapora
este pasándolo rápidamente por el
mechero, se deja enfriar y se marca con un lápiz la parte que vamos a tomar.
PREPARACIÓN DEL FROTIS:
El frotis tiene como finalidad una delgada película del preparado para
una adecuada tinción y observación microscópica. La preparación de un frotis
se hace de la siguiente manera:
EXTENSIÓN:
Se coloca una gota de agua destilada en el centro del porta y enseguida

se esteriliza un asa de argolla colocándola directamente en el mechero y se
toma un poco del material biológico a examinar. Se emulsiona la pequeña
cantidad de bacteria con la gota de agua del porta, luego, se incinera el asa
en el mechero.
SECADO:
Pasamos el porta por la parte mas alta del mechero (flamear) hasta que
la gota con bacterias quede seca (se hace sin que el porta se queme ya que
puede carbonizar las células), hasta que obtenemos una marca de una gota
con material biológico en el porta.
Fundamento
Se usa primero el cristal violeta (violeta genciana) el que penetra la pared

celular tanto de bacterias gram-positivas como gram-negativas. A
continuación se agrega el lugol (yodo + yoduro), que actúa como mordiente
formando un complejo con el cristal violeta. Al decolorar con una mezcla de
alcohol y acetona, la pared de los gram-positivos formada por una gruesa
capa de peptidoglicano impide la salida del complejo cristal violeta-lugol,
manteniéndose la coloración violeta. En los gram-negativos por el contrario el
complejo cristal violeta-lugol sale por los poros que ha generado el alcohol-
acetona en la membrana externa de la pared celular. La bacteria por lo tanto
se decolora y al agregar la safranina se tiñe de rojo.
PROCEDIMIENTO DE LA TINCIÓN GRAM
1. Rotular convenientemente cada uno de los portaobjetos.

2. Preparar extendidos de los microorganismos indicados por el docente.
1. Tomar material de la colonia elegida, con un asa previamente

esterilizada a la llama y suspender este material en una gota de agua
colocada en la mitad del portaobjetos. Extender el material sobre toda
la superficie del portaobjeto.
3. Dejar secar al aire junto a la llama del mechero.
2. Se cubre completamente el frotis con una solución de "cristal violeta",

y se deja actuar durante 60 segundos.
3. Lavar con abundante agua destilada.
4. Agregar una solución de "lugol" y dejar

actuar durante 30 segundos.
4. Decolorar el frotis obtenido

colocándole sobre este alcohol acetona dejando actuar durante 10 a
20 segundos.
5. Cubrir el frotis con gotas de una solución llamada "safranina",

dejándola actuar durante 30 segundos.
7. Lavar con abundante agua destilada nuevamente.

8. Observar al microscopio con el objetivo de 100X
Secar el preparado colocando el porta objeto en papel absorbente, y si

queda mucha agua se puede flamear
suavemente sin que se quemen las
muestras, y se observa bajo inmersión.
A la observación en el microscopio
binocular de investigación, esta se
presenta como en la lámina abajo
expuesta, donde se observa
microorganismos bacilos gram-positivos teñidos de azul, y los bacilos
gram-negativos teñidos de color fucsia.

PRACTICA Nro. 7
TINCIÓN DE ZIEHL-NEELSEN (acido resistente)
Tiene una enorme importancia en microbiología puesto que permite poner en

evidencia la presencia de bacilos ácido-alcohol resistentes (BAAR) tales como
el Mycobacterium tuberculosis, agente causal de la tuberculosis. También
puede ser usada para detectar la presencia de Cryptosporidium en
deposiciones.
Fundamento
El colorante que se usa en esta tinción, la fucsina forma un complejo con los
ácidos micólicos de la pared celular de las Mycobacterias. Este complejo
resiste la decoloración con alcohol-ácido clorhídrico permaneciendo de color
fucsia, en cambio las otras bacterias pierden la coloración. Al usarse el azul
de metileno como colorante de contraste éstas se coloran de azul.
INSTRUCCIONES:
1. Preparar extendidos de los microorganismos a estudiar.

2. Fijar con calor.
3. Cubrir todo el porta con fucsina básica fenolada (carbolfucsina)
4. Calentar hasta emisión de vapores y seguir dicho calentamiento
durante 2 minutos más. Si se
seca alguna parte del porta
objeto, agregar el colorante sobre
el preexistente y no sobre la parte
seca, hasta cubrirlo nuevamente.
5. Lavar con agua.
6. Decolorar con alcohol-ácido hasta
que no se desprenda más

colorante.
7. Lavar con agua.
8. Cubrir el extendido con azul de metileno. Dejar en contacto
durante 30 segundos.
9. Lavar con agua. Secar.
10. Observar con objetivo de inmersión.
A la observación en el microscopio se
observa teñido de color azul todas las
células que corresponden a tejido
epitelial, si la muestra procede de
esputo. Pero el bacilo acido resistente
se presenta de un color fucsia,
manteniendo el colorante primario, tal
como se muestra en la siguiente
lámina.
PREPARACION DE COLORANTES:
Solución de Ziehl (Fucsina fenicada)

1. Fucsina básica 0.3 g
Alcohol etílico 10 ml.
2. Fenol 5g
Agua destilada 95 ml.
Mezclar soluciones 1 y 2.
Alcohol ácido
HCI (densidad 1.19) 3 ml.
Alcohol etílico 97 ml.
Solución de azul de metileno

Azul de metileno 1.4 g
Agua destilada 100 ml.

PRACTICA Nro. 8
COLORACIÓN DE ESPORAS, TINCIÓN NEGATIVA
Coloración de esporas
OBJETIVO:
Esta técnica permite distinguir las esporas, del cuerpo vegetativo del
microorganismo, como así también ver su localización y forma.
INSTRUCCIONES:
1. Prepare un extendido del microorganismo.

2. Fijar por calor y cubrir todo el portaobjeto con una solución de
Verde de malaquita.
3. Calentar hasta emisión de vapores y seguir dicho calentamiento
durante 3 minutos (no permitir que se seque el colorante. Si esto
ocurriera, agregar colorante, sobre el preexistente y no sobre la
parte seca, hasta cubrirlo nuevamente.)
4. Lavar con agua y cubrir con solución de Safranina. Dejar actuar 30
segundos.
5. Lavar con agua, secar y observar
con objetivo de inmersión.
6. lnformar: morfología, color y tipo de
espora.
Solución de Verde de Malaquita.
 Verde de Malaquita al 5 % en agua destilada.

 Solución de Safranina
 Safranina 0.5 g. en agua destilada.

Tinción negativa
Es un método de coloración sencillo, se puede emplear para un frotis directo de

la muestra clínica en caso de no contar con la batería de coloración Gram esto
puede evidenciar solo si se trata de cocos o bacilos. También se puede emplear
para la prueba de motilidad en porta objetos.
INSTRUCCIONES
1. Colocar una pequeña gota de tinta china en la parte central del

portaobjetos.
2. Utilizando el asa de kolle, colocar una gota de la suspensión de
microorganismos sobre la tinta china.
3. Colocar sobre el preparado un cubreobjeto para que se forme un film
(tinta-cultivo).
4. Observar con objetivo de inmersión.

PRACTICA Nro. 9
RECUENTO TOTAL DE BACTERIAS AEROBIAS MESOFILAS.
Recuento Estándar en Placa (REP): también conocido como

recuento de aerobios mesófilos, es el análisis directo mayormente
empleado para determinar la calidad microbiológica de la leche y
otros alimentos.
OBJETIVOS
 El objetivo de realizar este análisis es conocer el " número de

microorganismos aerobios mesófilos que contiene un alimento.
 Conocer el grado de contaminación bacteriana, siendo indicador de la
posible presencias de microorganismos patógenos
 Se aplica a todos los alimentos con excepción de los productos
fermentados o madurados tales como queso, ciertos tipos de
embutidos, yogurt, etc.
IMPORTANCIA
 Los resultados de este análisis permiten verificar la efectividad de los

procedimientos de limpieza y desinfección.
 Determinar si las temperaturas aplicadas en los procesos fueron las
adecuadas.
 Determinar el origen de la contaminación durante los procesos de
elaboración de los alimentos. Verificar condiciones óptimas de
almacenamiento y transporte.
 Obtener información acerca de la vida útil de los alimentos.
 Indicar alteración incipiente en ciertos alimentos.
MATERIALES

- Autoclave.
- Balanza de precisión.
- Mechero Bunzen.
- Asa de kolle.
- Espátula de Drigalsky
- Mortero y pistilo.
- Gradilla y canastillas
- Cuenta colonia.
- Tubos de ensayo.
- Placas petri.
- Medio de cultivo.
METODOLOGÍA
A. PREPARACIÓN Y DILUCIÓN DE LA MUESTRA.
En un mortero estéril pesar un gramo de muestra, adicionar 9 ml. De agua

peptonada para obtener la dilución 1 : 10 ml.
Pipetear 1 ml. De la dilución anterior y trasvasarlo a otro tubo de ensayo que

contenga 9 ml. de agua peptonada. Proseguir hasta obtener la dilución 1 :
1000000
B. SIEMBRA.
1. MÉTODO STANDARD DE RECUENTO EN PLACA POR SIEMBRA EN

PROFUNDIDAD.
 Pipetear en placas petri 1 ml. De las diluciones efectuadas en el punto A.

 Inmediatamente verter en las placas inoculadas 10 a 15 ml. De agar Estándar
fundido y templado a 45°C.
 Mezclar el inoculo de siembra con el medio de cultivo
 Una vez solidificado el agar invertir las placas e incubarlas a 35 °C durante
24 a 48 horas.
 Utilizando el contador de colonias, y el dispositivo de registro automático,
contar todas las colonias en las placas que presenten 30-300
colonias.
2. MÉTODO DE RECUENTO EN PLACA DE SIEMBRA POR

EXTENSIÓN EN SUPERFICIE.
 Añadir a cada placa 15 ml de agar para recuento y enfriarlos a 45 a 60°C

y dejar solidificar.
 Utilizando una única pipeta, tomar 0.1 ml. de cada una de la diluciones
a ensayar, y depositarlo en la superficie del agar (2 placas por
dilución). Comenzar por la dilución más baja, llenando y vaciando la
pipeta 3 veces antes de transferir 0.1 ml a la placa.
 Extender las alícuotas de 0.1 ml. pronto después de depositarlas sobre
la superficie del agar (espátula de Drigalsky), dejar secar la
superficie del agar durante 15 minutos.
 Incubar las placas invertidas por tres días a 35 °C .
 Contar todas las colonias en las placas que presenten entre 30 y 300
colonias.

PRACTICA Nro 10
RECUENTO DE COLIFORMES: DETERMINACIÓN DEL NUMERO MAS

PROBABLE (NMP).
El empleo de coliformes como indicadores de organismos patógenos en el

agua es una práctica vigente en la actualidad. Las bacterias Coliformes,
comprenden la E. Coli y Enterobacter aerogenes. Ambos organismos son
bacilos cortos, gram-negativos que fermentan la lactosa con producción gas.
E. Coli tiene su localización primaria en el tracto intestinal del hombre y de
los animales, y de allí su nombre "Coli", que deriva del colon. E. Coli se
encuentra normalmente en el tracto gastrointestinal de los animales, donde
no suele causar enfermedad.
Los organismos coliformes son buenos indicadores de la calidad higiénica

de los alimentos, se basa en la experiencia positiva adquirida en el agua. El
hallazgo de gran número de organismos en los alimentos y en el agua indica
la polución o contaminación fecal. Ya que las enfermedades transmitidas por el
agua generalmente son de carácter intestinal, la presencia de polución indica
la posibilidad de que existan agentes etiológicos productores de
enfermedades gastrointestinales.
OBJETIVOS
 Precisar el número de microorganismos (coliformes) presentes en muestras

de alimentos líquidos o el agua.
 Conocer la metodología del NMP coliformes como, indicador de
contaminación de los diferentes alimentos.
 Determinar la presencia de coliformes, procesando tres diluciones
proporcionales seriadas, sembradas en 9 tubos con el medio adecuado para
comparar con la tabla estándar.

IMPORTANCIA
Los resultados de este análisis permiten:
 Revelar el índice de contaminación fecal, proveniente de heces del

hombre y animales de sangre caliente.
 Conocer que la presencia de coliformes es indicador de que pueda existir
la presencia de patógenos como salmonelas y E.coli enterotixigénica.
 Determinar el origen de la contaminación durante los procesos de
elaboración de los alimentos.
MATERIALES
- Autoclave.
- Balanza analítica.
- Mechero Bunzen.
- Asa de colle.
- Campanas Durham.
- Tubos de ensayo.
- Placas petri.
- Medios de cultivo.
METODOLOGÍA
1. Preparar las muestras de alimento hasta la obtención de las diluciones.

2. Pipetear 1 ml. De cada uno de las diluciones del homogenizado del

alimento en tubos con medio de cultivo (tres tubos por dilución).
3. Incubar los tubos a 35°C durante 24 a 48 horas.
4. Pasadas las 24 horas, anotar los tubos que muestren producción de
gas. Volver a la estufa los tubos gas negativos para su incubación
durante 24 horas más.
5. Pasadas las 48 horas,
anotar los tubos que
muestren producción de gas.
6. Elegir la dilución más alta
(positivos a gas), los tres
tubos y las dos diluciones
superiores más próximas. Si
no fuese factible seleccionar
las tres últimas diluciones y anotar el número de tubos positivos en
cada una.
7. Confirmar que los tubos inoculados y seleccionados, sean positivos a
coliformes, transfiriendo un asa de cada tubo a aplacas de agar eosina
azul de metileno (EMB), ENDO o McConkey, observar colonias
típicas de coliformes después de 24 a 48 horas de incubación a 37°C.
8. Para obtener el NMP, ver en cada una de las tres diluciones
seleccionadas el número de tubos en los que se confirmo la presencia de
coliformes. Buscar en la tabla del NMP.
Para obtener el Número Más Probable (NMP); Ver en cada una de las 3 diluciones
seleccionadas, el número de tubos en los que se determinó la presencia de coniformes
previa confirmación. Buscar en la tabla del NMP y anotar el NMP que corresponda al número
de tubos positivos de cada dilución. Así si como ejemplo tenemos una lectura 3, 1, 0, la tabla
indica que este resultado significa un NMP de 43/100 ml. Para obtener el NMP de
coniformes por gramo de alimento se utiliza la siguiente formula:
NMP de la tabla X El factor de dilución intermedio = NMP/ g.

100
Si el factor de dilución intermedio empleado para la prueba es; 1 : 100, 1 : 1000, y 1: 10000
Entonces se reemplaza la formula de la siguiente manera:
43 X 1,000 = 430 coliformes por gramo
100
TABLA NMP
Indice del NMP y límites de confianza 95% para varias combinaciones de resultados positivos
y negativos cuando se utilizan tres alícuotas de 10 ml., tres de 1 ml., y otras tres de 0,1 ml.
Número de tubos positivos del total de: Indice del Limites de confianza 95%
3 tubos; 3 tubos; 1 3 tubos; NMP por 100 Inferior Superior
10 ml. ml. 0.1 ml. ml.
0 0 1 3 0.5 9
0 1 0 3 0.5 13
1 0 0 4 0.5 20
1 0 1 7 1 21
1 1 0 7 1 23
1 1 1 11 3 36
1 2 0 11 3 36
2 0 0 9 1 36
2 0 1 14 3 37
2 1 0 15 3 44
2 1 1 20 7 89
2 2 0 21 4 47
2 2 1 28 10 150
3 0 0 23 4 120
3 0 1 39 7 130
3 0 2 64 15 380
3 1 0 43 7 210
3 1 1 75 14 230
3 1 2 120 30 380
3 2 0 93 15 380
3 2 1 150 30 440
3 2 2 210 35 470
3 3 0 240 36 1300
3 3 1 460 71 2400
3 3 2 1100 150 4800

Fuente: F.S. Thatcher y D.S. Clark 1972

PRACTICA Nro 11
IDENTIFICACIÓN DE COCOS GRAM POSITIVOS.
Normalmente se encuentran Staphylococcus patógenos en procesos

pyogenos, en todas las especies animales y en pájaros. Ellos son
frecuentemente aislados de septicemias en animales, así como de los
casos de artritis y mastitis. Normalmente se encuentran patógenos en las
superficies de la piel y en la nariz de personas sanas y algunas especies
animales.
Cultivo
Los estafilococos patógenas crecen eficazmente bajo condiciones aeróbicas

en la mayoría de los medios bacteriológicos usuales de extracto de carne y
peptona, pero lo hacen de manera mas profusa en agar sangre que se usa
por lo común para aislar formas. Estos crecen rápidamente a 37°C pero
tienden a formar pigmentos mejor a temperatura ambiente (20°C). Las
colonias en medio sólido son redondeadas, uniformes, sobresalientes y
resplandecientes. Pueden formar varios tipos de pigmentos: Staphylococcus
aureus presenta un color amarillo oro intenso; S epidermis es de color blanco
porcelana; también pueden observarse coloraciones intermedias. Muchas
colonias desarrollan pigmentos solo después de una prolongada incubación a
20°C.
En general las cepas recién aisladas de S. aeureus son las mas exigentes en
sus necesidades alimenticias; los viejos cultivos de laboratorio y S. epidermis
lo son menos.
EL AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE ESTREPTOCOCOS Los

estreptococos son uno de los grupos más importantes de organismos que
son patógenos para los animales y hombre. Las especies domésticas

padecen de estreptococosis que varia desde lesiones supurativas
localizadas, mastitis, meningitis, artritis y septicemias. Ellos también pueden
aislarse de la nariz, garganta, piel y cavidad bucal de animales sanos.
EL AISLAMIENTO
El cultivo de muestras provenientes de lesiones supurativas locales, o del

hígado, bazo, glándula linfática, riñón, fluido cerebro-espinal y sangre así
como en condiciones del septicemia, en agar sangre y agar MacConkey.
También es aconsejable inocular en caldo de suero o caldo de Todd-Hewitt
al mismo tiempo. Se incuba a 37°C. La incubación anaerobio mejora
actividad hemolítica.
IDENTIFICACIÓN
Las características culturales En agar sangre de oveja forman las colonias

pequeñas, elevadas, semi-translúcidas después de 24 horas. Ellos pueden
ser alfa hemolíticas o beta, cultivos recientes puede ser los mucoides si los
cocos presentan una cápsula.
Características bioquímicas que Ellos son los llamados catalasa-

negativos y oxidasa-negativo. Ellos fermentan los azúcares pero no producen
gas.
OBJETIVOS
 Describir las características microscópicas culturales y bioquímicas que

permiten ejecutar el aislamiento y la diferenciación entre Staphylococcus
aureus y los estafilococos coagulasa negativa.
 Seleccionar los medios de cultivo empleados para llevar a cabo la detección
de los estafilococos.
 Elegir, leer e interpretar las pruebas que permiten identificar a los
estafilococos.

 Describir los fundamentos, técnicas y limitaciones de las metodologías
asociadas a la detección de los estafilococos en las muestras clínicas.
IMPORTANCIA
Los resultados de este análisis permiten identificar al agente causal de la enfermedad

materia de análisis de laboratorio.
MATERIALES
- Autoclave.
- Mechero Bunzen.
- Asa de colle.
- Pipeta graduada de 5 - 10 mi
- Campanas Durham.
- Probeta graduada de 100 mi.
- Placas petri.
- Muestras clínicas.
- Batería de coloración Gram
METODOLOGÍA
1. Ponga a alcance los materiales y muestras junto al mechero.

2. Prepare la muestra a sembrar con estricta asepsia.
3. Tome un hisopo o asa de kolle
4. Retire todo tipo de protección de las muestras obtenidas.

5. Con el mechero de Bunsen encendido y respetando el margen de
esterilidad inocule con el hisopo o asa el material, en una placa con agar
sangre y agar S110, empleando la técnica de estriación.
6. Queme su hisopo para que no sea nuevamente utilizado
7. Incube a 37°C durante 24 horas.
8. Transcurrido las 24 horas, saque las cajas de la incubadora y encienda el
mechero, para realizar el repique correspondiente en agar sangre.
9. Haga un frotis de las colonias que crecieron en el agar sangre
10. Tina con la técnica de Gram

11. Observe con aceite de inmersión el
frotis
12. De acuerdo a lo observado en cada
uno de los frotis realice las pruebas
correspondientes.
PRUEBAS BIOQUÍMICAS USADAS EN LA IDENTIFICACIÓN DE COCÁCEAS
Catalasa
Este test busca la presencia de la

enzima catalasa que desdobla el agua
oxigenada en agua + oxígeno. Esta
enzima la poseen los Staphylococcus,
Micrococcus y Listeria. No poseen
catalasa los Streptococcus. Se coloca
una gota de peróxido de hidrógeno
sobre un portaobjetos y luego se
agrega la colonia en estudio, la aparición rápida y mantenida de burbujas
indica que el test es (+).
Coagulasa

Este test busca la presencia de la enzima coagulasa producida por el
Staphylococcus aureus. Esta enzima es un activador del fibrinógeno,
transformándolo en fibrina. La pared del Staphylococcus aureus además
posee un receptor del fibrinógeno lo que permite la formación de uniones entre
bacteria y bacteria, formándose un coágulo. Permite diferenciar los
estafilococos coagulasa (+) de los estafilococos coagulasa (-). Se realiza
usando de preferencia el plasma de conejo.

PRACTICA Nro. 12
IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM POSITIVOS
INTRODUCCION.
El grupo de bacilos anaeróbicos esporulados incluye diversas formas, algunas
de éstas son patógenas para el hombre y animales. La patogenicidad de estos
bacilos se atribuye más bien a la capacidad de formar potentes exotoxinas. Por
tanto las infecciones por anaerobios esporulados no es común en
circunstancias ordinarias, ya que en la mayor parte de los casos hay una lesión
traumática antes de la infección.
Dentro de este gran grupo de microorganismos se puede diferenciar bacilos

gram positivos anaeróbicos que generalmente son miembros del genero
Clostridium, y los del grupo de aerobios son muchos, dentro de los cuales
están el Genero Listeria, Lactobacilos y Bacilus.
Todos los bacilos gram-positivos anaeróbicos esporulados son por definición

miembros del género Clostridium. Además indica que la prueba de la catalasa
es útil para diferenciar las especies de Clostridium de las de Bacillus si las
pruebas de aerotolerancia resultan dudosas.
Los bacilos del género Clostridium, se encuentran como comensales normales

de los tractos; gastrointestinal, respiratorio y urogenital del hombre y los
animales. Los Clostridiums también se hallan en múltiples substratos como:
suelo, agua, aguas residuales, plantas, alimentos, etc., como consecuencia de
la contaminación fecal.
MUESTRAS.
Las muestras para esta práctica se pueden obtener de pus, y líquidos de lesión
local, sangre, esputo, incluso del suelo.

CARACTERISTICAS CULTURALES;
Dentro del Género Clostridium existe una variedad de especies dentro de las
cuales están el Cl. perfringens, Cl. botulinum, Cl, sépticum, Cl. novy, Cl,
tetani, etc. Estas difieren enormemente en cuanto a sus características
culturales. El aspecto de las colonias de Cl. perfringens en agar yema de
huevo son pequeñas, globosas, traslúcidas, mucosas y que producen
opalescencia. En agar-sangre las colonias que forman una fina película rizoide
y con tendencia a proliferar en el medio son consideradas como Clostridium
sépticum y Clostridium tétani y que además producen una discreta hemólisis
en el medio.
Las características morfológicas a la coloración de Gram son: el Clostridium

perfringens en el frotis demuestran ser bacilos gram-positivos gruesos de
bordes redondeados y de longitud poco variable. El Clostridium tétani son
bacilos gram-positivos delgados con una
longitud variable en cuyos extremos se
encuentra la espora terminal. El
Clostridium sépticum demuestran ser
bacilos muy variables en cuanto a sus
dimensiones y se colorean irregularmente.
OBJETIVOS.
 La presente práctica tiene por finalidad hacer que los alumnos se

familiaricen con la identificación de los bacilos gram-positivos.
 Aislar e identificar miembros del Género Clostridium y Bacillus a partir de
muestras clínicas y substratos.
 Seleccionar los medios de cultivo empleados para llevar a cabo la
detección de los Bacilos gram - positivos.
 Elegir, leer e interpretar las pruebas que permiten identificar a los
Clostridios.
MATERIALES.
- Mechero Bunzen.
- Asa de kolle.
- Tubos de ensayo.
- Placas petri.
- Batería de coloración Gram
METODOLOGÍA

5. Con el mechero de Bunzen encendido y respetando el margen de
sangre empleando la técnica de agotamiento por estría.
6. Queme su hisopo para que no sea
nuevamente utilizado
7. Incube en jarras de anaerobiosis a
37°C durante 48 horas.
8. Transcurrido las 48 horas, saque las
placas petri de la jarra de
anaerobiosis y encienda el mechero, para realizar el repique
correspondiente nuevamente en agar sangre.
9. Haga un frotis de las colonias que crecieron en el agar sangre
11. Observe con aceite de inmersión el frotis
12. De acuerdo a lo observado en cada uno de los frotis realice las
pruebas correspondientes. Para la identificación definitiva
Se ejecutaron las siguientes pruebas:

HIDROLISIS DE LA ESCULINA.
Para esta prueba se puede utilizar el medio base VL recomendado para
anaerobios por el "Círculo de Estudios e Investigación Galeno" (1988), con la
adición de 0.5% de esculina. La siembra se realiza utilizando el asa de Kolle, e
incubándolas a 37oC durante 48 horas en
anaerobiosis. Luego se procede a adicionar 2 a 3
gotas de solución de citrato férrico amoniacal al
1%. La presencia de una coloración obscura
indica una reacción positiva.
PRODUCCION DE INDOL.
Dado que el medio base VL para anaerobios
contiene triptona, se utiliza el reáctivo de Kovac
(tiras de papel), el cual se introduce en los tubos
inoculados e incubados. El viraje del reactivo a un
color rosado, indica una reacción positiva.
REDUCCION DE NITRATOS.
Para la ejecución de esta prueba se utilizó el caldo nitrato (CN), la preparación
y distribución de este medio fue siguiendo la técnica dada por el "Círculo de
Estudios e Investigación Galeno" (1988). Luego de la inoculación de las cépas
en los tubos se incuba a 37 oC durante 48 horas, posteriormente se agrega 2
gotas del reactivo A (*) y dos gotas del reactivo B (**). La aparición de un color

rojo indica la presencia de nitritos, si no aparece el color rojo vinoso se agrega
mallas de zinc, si hubiera nitratos NO 3 en el medio
este será reducido a nitritos y aparecerá el color
rojo vinoso, por tanto la bacteria no ha degradado
el nitrato. Por el contrario si no aparece el color
rojo vinoso se debe a la ausencia de nitratos, es
decir que la bacteria ha reducido hasta NH3 y N2.
* Reactivo A: - Acido sulfanílico 0.8 g

- Acido acético (5N) 100.00 ml.
** Reactivo B: - Alfa naftilamina 0.6 g.
- Acido acético (5N) 100.00 ml.

PRACTICA Nro. 13
IDENTIFICACION DE COCOS GRAM NEGATIVOS
La gonorrea es una enfermedad de transmisión sexual (ETS), provocada por la

Neisseria gonorrhoeae, una bacteria que puede crecer y multiplicarse
fácilmente en áreas húmedas y tibias del tracto reproductivo, incluidos el
cuello uterino (la abertura de la matriz), el útero y las trompas de Falopio
(también llamadas oviductos) en la mujer, y en la uretra (conducto urinario)
en la mujer y en el hombre. Esta bacteria también puede crecer en la boca, la
garganta, los ojos y el ano.
MORFOLOGÍA E IDENTIFICACIÓN
Los microorganismos del grupo Neisseria son diplococos gram-negativos, no

mótiles con un diámetro aproximado de 0.8 micrómetros, de manera
individual estos cocos tienen la forma de un riñón.
CULTIVO
A las 48 Horas de cultivo en medios enriquecidos (Mueller-Hinton, medio

Séller-Martin y otros) los gonococos y meningococos forman colonias
mucoides convexas, resplandecientes y elevadas, con un diámetro de 1 a 5
mm. La coloración depende de la especie variando desde no pigmentadas,
opacas hasta amarillas. Son aerobios estrictos pero también requieren para su
crecimiento un 5% de CO2 o microaerofilia.
IDENTIFICACIÓN
La mayor parte fermentan los carbohidratos y producen ácido, pero no gas,

tiene reacción oxidasa positivas.
OBJETIVOS

 Describir las características microscópicas culturales y bioquímicas que
permiten ejecutar el aislamiento y la diferenciación cocos gram negativos.
 Seleccionar los medios de cultivo empleados para llevar a cabo la
detección de Neisseria.
 Elegir, leer e interpretar las pruebas que permiten identificar a las
Neiserias.
IMPORTANCIA.
Los resultados de este análisis permiten:
 Determinar la presencia de cocos gram negativos en infecciones génito

urinarias.
 Familiarizarse con la identificación de cocos gram negativos.
MATERIALES
- Autoclave.
- Mechero Bunzen.
- Asa de colle.
- Pipeta graduada de 5 - 10 mi
- Tubos de ensayo.
- Placas petri.
- Batería de coloración Gram.
METODOLOGÍA

5. Con el mechero de Bunsen encendido y respetando el margen de
BHI, Mueller-Hintons, agar sangre, empleando la técnica de estriación.
8. Transcurrido las 48 horas, saque
las cajas de la incubadora y
encienda el mechero, para realizar
el repique correspondiente en
agar sangre.
9. Haga un frotis de las colonias que
crecieron en el agar sangre.
10.Tiña con la técnica de Gram.
11. Observe con aceite de
inmersión el frotis
12. De acuerdo a lo observado en cada uno de los frotis realice las pruebas
correspondientes.
PRUEBAS COMPLEMENTARIAS.
 Prueba de la oxidasa.
Se requiere de discos impregnados con oxidasa, se humedecen estos con

agua destilada esteril, luego se cologa sobre una colonia sospechosa, incubar
a 35ºC por 25 minutos, obserbar los cambios de color que se presenten.
Las colonias oxidasa positivas toman un color rosado, después marron y

finalmente negro.

Las colonias oxidasa negativas no produce cambio de color en las colonias o
solo adquiere un ligero color rosado debido al reactivo.
 Fermentación de carbohidratos; Lactosa, maltosa y sucrosa
Para la realización de esta prueba se utiliza un medio base al cual se le

adiciona el carbohidrato a testar (Glucosa, sacarosa, etc.). Una vez inoculado
la cepa a testar se lleba a incubación a 37ºC por 24 horas. La fermentación del
carbohidrato se evidencia por el grado de turbidez en el medio de cultivo
ocasionado por el crecimiento del germen.

PRACTICA Nro. 14
IDENTIFICACIÓN DE BACILOS GRAM NEGATIVOS
La familia de las enterobacteriaceae incluyen muchos géneros como

Escherichia, Shigella, Salmonella, Enterobacter, Klebsiella, Serratia y
Proteus. Algunos microorganismos intestinales por Ejemplo Escherichia
coli son parte de la microbiota normal y producen de manera accidental
enfermedad, en tanto que otros como Salmonelas y Shigelas son
patógenos de manera regular para el hombre y los animales.
Escherichia coli. es causante de muchas infecciones intestinales

especialmente en neonatos de muchos animales y es la causa de
mortalidad, así como enterotoxemias e infecciones por Escherichia coli en
cerdos destetados . En la alpaca han sido observados cuadros diarreicos
en crías dentro de sus dos primeros meses de vida, de algunos de estos
casos se aislaron Escherichia coli de heces diarreicas.
MORFOLOGÍA E IDENTIFICACIÓN
Son gram-negativos variando desde formas cocoides, bipolares hasta

largos filamentosos, frecuentemente se presenta aislados pero no son raras
las cadenas cortas, no presentan esporas. Los bacilos son cortos de 0.5
um. de ancho por 1 - 3 um. de largo entendiéndose que se trata de
bacilos delgados. Pero otros autores señalan que se trata de bacilos
gruesos y que mide 1.5 x 4 um.
CULTIVO
Cultivos fecales en agar McConkey muestran colonias circulares,

convexas y lisas con bordes definidos de un color rosado. En agar eosina -
azul de metileno las colonias presentan centros ennegrecidos con un

brillo metálico característico. Aparte de las características mencionadas
existe variaciones de colonias lisas y rugosas, y las cepas recién
aisladas son generalmente lisas. El desarrollo en la mayoría de los
medios artificiales de cultivo es rápido y pueden aparecer sobre ellos
como colonias lisas, rugosas ó

mucoides, generalmente las colonias rugosas no son patógenas, a
diferencia de las colonias mucoides las cuales están asociadas a procesos
enteropatogénicos o septisémicos.
En medios selectivos como agar Salmonella - Shiguella (S-S) el desarrollo

de las colonias de Salmonella son incoloras con centro negro debido a
la producción de gas, H2S. Las especies de Shiguella muestran
inhibiciones variables y sus colonias incoloras no presentan
ennegrecimiento. En agar Xilosa Lisina Desoxicolato (XLD) la mayor parte
de las especies de Salmonella y Arizona forman colonias rojas, la mayoría
con centro negro por el gas, H2S. Los géneros Providencia y Shiguella y
muchas especies de Proteus no utilizan ningún hidrato de carbono y forman
colonias traslúcidas.
IDENTIFICACIÓN Y DIFERENCIACIÓN
Se emplean básicamente los patrones de reacción bioquímica, los patrones

de fermentación de los carbohidratos y la actividad de las descarboxilasas

de los aminoácidos y otras enzimas.
OBJETIVOS
13. Describir las características microscópicas culturales y

bioquímicas que permiten ejecutar el aislamiento y la diferenciación
bacilos gram negativos.
14. Seleccionar los medios de cultivo empleados para llevar a cabo la
detección de las enterobacterias.
15. Elegir, leer e interpretar las pruebas que permiten identificar a las
enterobacterias.
IMPORTANCIA
√ Los resultados de este análisis permiten:

√ Determinar la presencia de bacilos negativos en infecciones
gastrointestinales.
√ Familiarizarse con la identificación de bacilos gram negativos.
√ Interpretar las pruebas bioquímicas para la diferenciación de las
enterobacterias y otros bacilos gram negativos.
MATERIALES
- Autoclave.
- Microscopio.
- Estereoscopio
- Mechero Bunzen.
- Asa de kolle.
- Pipeta graduada de 5 - 10 ml
- Tubos de ensayo.

- Placas petri.
- Batería de coloración Gram.
- Laminas porta objetos.
METODOLOGÍA

3. Tome un hisopo o asa de colle
5. Con el mechero Bunzen encendido y respetando el margen de esterilidad
inocule con el hisopo o asa, el material, en una placa con agar McConkey,
EMB, SS agar, empleando la técnica de agotamiento en estrías.
8. Transcurrido las 24 horas, saque las placas de la incubadora y encienda
el mechero, para realizar el repique
correspondiente en agar McConkey.
9. Haga un frotis de las colonias que
crecieron en el agar McConkey.
11. Observe con aceite de inmersión el
frotis
12. De acuerdo a lo observado en cada
uno de los frotis realice las pruebas
correspondientes.
PRUEBAS COMPLEMENTARIAS.
SIEMBRA EN AGAR TRIPLE AZÚCAR

HIERRO (TSI).
Empleando el asa de kolle se sembró en el fondo por picadura y en la

superficie en estría. La fermentación de los carbohidratos se demuestra por el
viraje del color del medio de rojizo a amarillo; la glucosa en el fondo del tubo,
sacarosa en la parte intermedia y la lactosa en la superficie.
SIEMBRA EN AGAR CITRATO DE SIMMONS.

Solo crecen en este medio los gérmenes que
utilizan el citrato como fuente de carbono. Se
consideran citrato (-) si no muestran
crecimiento tras 4 días de incubación.
SIEMBRA EN CALDO O AGAR UREA. Los

microorganismos que tienen la enzima ureasa,
desdoblan la urea en amoniaco y en
anhídrido carbónico, los cuales hacen virar el
indicador rojo de fenol al color rojo cereza.
SIEMBRA EN LISINA DESCARBOXILASA

AGAR. Las descarboxilasas (+), hacen
virar el color al violeta. También se lee
la reducción de tiosulfato a sulfuro de
hidrógeno, produce ennegrecimiento por la
sal de Fe.
PRODUCCION DE INDOL.
Para esta prueba se utilizan medios de cultivo que contengan tristona o
peptona, luego de la incubación por 24 horas, se emplea el reactivo de Kovac
(tiras de papel), el cual se introduce en los tubos inoculados El viraje del
reactivo a un color rosado, indica una reacción positiva.

BIBLIOGRAFIA
1. AGURTO SAENZ T. 1999. Manual de Técnicas en Microbiología. Auspiciado por el consejo Nacional
de Ciencia y Tecnología.
2. CIRCULO DE ESTUDIOS E INVESTIGACION GALENO. Medios de Cultivo en Microbiología. Manual
de Laboratorio I y II parte. U.N.M.S.M., Lima 1988.
3. D.I.F.C.O. Manual de Bacteriología. Editorial Mirasa, Madrid.1978.
4. Frazier, w. 1985. "Microbiología de los Alimentos" 3ra. Edición Edit. Acribia. Zaragoza España.
5. Freeman B. 1983. "Tratado de Microbiología" 12va Edición Edit. Nueva Editorial Latinoamericana S.A.
CU. México D.F.
6. Jawetz E. Melnick J. y Adelberg E. 1990. "Microbiología Médica" 13va Edición Edit. El Manual Moderno
S.A. México.
7. MERK KGaA 2000. Microbiology Manual.
8. NICOLET, J. Compendio de Bacteriología Médica Veterinaria. Editorial Acribia Zaragoza, España 1986.
9. OSBALDISTON, G. Técnicas de Laboratoria en Bacteriología Clínica Veterinaria. Editorial Acribia
Zaragoza, España 1975.
10. OROS, O, 1991. Aislamiento de los Géneros; Bacteroides, Clostridium, y Escherichia, En El Intestino
Grueso de la Vicuña – PUNO.1990. Tesis UNA.
11. Thatcher F. y Clarck D. 1973. "Análisis Microbiológico de los Alimentos" Edit. Acribia Zaragoza España.

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