UNIVERSIDAD NACIONAL SAN AGUSTÍN DE AREQUIPA

FACULTAD DE INGENIERÍA DE PROCESOS

ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL

ASIGNATURA:
Biotecnología Ambiental
TEMA:
Guia de prácticas de Biotecnología ambiental
DOCENTE:
Mg. Paredes Fernandez Wilmer Julio
INTEGRANTES:
Chirinos Guzmán, Nicole Melany
Huanca Mamani, Kevin Alonso
Huarsaya Huillca, Jamilet Ariana
Pimentel Gonzales, Jhessica Ethel
GRUPO: A
SEMESTRE: IX

AREQUIPA- PERÚ
2022
PRESENTACIÓN 3
PRÁCTICA IX: CARACTERÍSTICAS CULTURALES DE LAS BACTERIAS 4
PRÁCTICA XII: AISLAMIENTO DE ADN 17
PRÁCTICA XIII: AMPLIFICACIÓN DEL GEN rRNA16S 23
PRÁCTICA XIV: IDENTIFICACIÓN MOLECULAR BACTERIAS 33
PRÁCTICA XV: CRIOPRESERVACIÓN DE BACTERIAS 39
PRÁCTICA XVI: SECUENCIACIÓN DE ADN 43
 PRESENTACIÓN

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en inglés Polymerase

Chain Reaction) es, sin lugar a dudas, la técnica más importante y revolucionaria en biología

molecular, debido a que permite obtener in vitro millones de copias de un fragmento de ácido

desoxirribonucleico (ADN) a partir de una sola molécula. La PCR se basa en la replicación

celular en la que actúan varias proteínas para sintetizar dos nuevas hebras de ADN a partir de

otra que funciona como molde. Amplificación de ADN mediante PCR. Un ciclo de

amplificación consta de tres etapas: separación de las hebras de ADN (desnaturalización),

unión de los iniciadores a una secuencia complementaria del ADN molde (alineamiento) y la

síntesis semiconservativa de una nueva cadena por adición de nucleótidos debido a la acción

de la ADN polimerasa (extensión). Además, del aislamiento y amplificación del gen de la

bacteria, también se deben evaluar sus colonias. Una colonia es una agrupación de bacterias

formada a partir de la reproducción de una Unidad Formadora de Colonia (UFC) sobre un

medio sólido; aunque varía de tamaño generalmente es visible a simple vista. Una UFC

puede ser un solo microorganismo o bien un grupo de microorganismos de una misma

especie como en el caso de bacterias que tienen tendencia a permanecer unidas como los

estafilococos o los estreptococos. Las colonias bacterianas tienen una medida, forma, textura

y en algunos casos color característicos, que aunque puede variar de acuerdo al medio en que

se encuentren, es constante bajo condiciones controladas y depende de la especie bacteriana

que la forme.
 PRÁCTICA IX: CARACTERÍSTICAS CULTURALES DE LAS BACTERIAS

INTRODUCCIÓN

Durante el curso de la formación de la colonia, una sola bacteria se divide para crear

una colonia compuesta de miles de millones de sus descendientes organizados en una notable

estructura ordenada. Estas divisiones celulares masivas están asociadas con la secreción de

varias moléculas, que comprenden la matriz extracelular, esencial para establecer una

estructura de colonias adecuada. Las colonias bacterianas muestran propiedades distintas,

como el tamaño, el color, la forma y la textura, que varían fundamentalmente entre las

diferentes especies. Estas características fueron los medios básicos para identificar, clasificar

y caracterizar las bacterias en los primeros días de la microbiología y en la actualidad todavía

se explotan para aplicaciones clínicas y de investigación. La formación de colonias

bacterianas es una estrategia de supervivencia constructiva que permite a las bacterias utilizar

una mayor variedad de nutrientes, soportar rápidos cambios ambientales y resistir las

amenazas de antibióticos.

La formación y el mantenimiento de colonias requieren actividades comunitarias coordinadas

para beneficiar a los miembros de la colonia. Tal notable coordinación se ejemplifica por la

bacteria Gram-negativa Myxococcus xanthus, que emplea la movilidad social para agrupar,

preceder y construir cuerpos fructíferos llenos de esporas similares a órganos. De forma

similar, las células de la bacteria Gram-positiva Paenibacillus dendritiformis utilizan el

agrupamiento para desarrollar patrones complejos de ramificación colonial. En la bacteria del

suelo Bacillus subtilis, las colonias maduras exhiben un alto grado de organización

espacio-temporal que se encontró afectado por genes implicados en motilidad, producción de

matriz y esporulación, destacando la complejidad de la arquitectura de colonias.

A pesar del hecho de que el análisis de las colonias bacterianas comenzó hace décadas,

relativamente poco se sabe sobre las etapas más tempranas de la formación de colonias.
Además, los factores que limitan el tamaño y la expansión de la colonia no se han revelado en

gran medida. En la presente práctica, estudiamos la caracterización de las colonias de un

cultivo puro, considerando su tamaño, forma, color, aspecto y consistencia de las colonias de

una bacteria aislada y crecida en medio Agar nutritivo (LB) durante 48 horas a 25 “C.

La Forma de colonia: incluye forma, elevación y margen de la colonia bacteriana.

Forma de la colonia bacteriana: - La forma se refiere a la forma de la colonia. Estas formas

representan las formas de colonia más comunes que es probable que encuentre. p.ej. Circular,

irregular, filamentoso, Rhizoid etc.

Elevación de la colonia bacteriana.- Elevación de la colonia bacteriana: esto describe la

"vista lateral" de una colonia. Estos son los más comunes. p.ej. Plano, levantado, umbonado

(con una protuberancia protuberante), crateriforme, convexo, pulvinado (en forma de cojín).

Margen de colonia bacteriana: el margen o el borde de una colonia puede ser una

característica importante para identificar un organismo. Ejemplos comunes son Completo

(liso), irregular, ondulado (ondulado), lobulado, rizado, filiforme, etc.

Las colonias que son de forma irregular y / o tienen márgenes irregulares es probable que

sean organismos móviles. Un organismo altamente móvil invadió los medios de cultivo. Tales

como Proteus spp.

Tamaño de la colonia bacteriana: el tamaño de la colonia puede ser una característica útil

para la identificación. El diámetro de una colonia representativa puede medirse en milímetros

o describirse en términos relativos, como punto de alfiler, pequeño, mediano, grande. Es

probable que las colonias de más de 5 mm sean organismos móviles.

Aspecto de la superficie de la colonia: las colonias bacterianas con frecuencia son brillantes

y de aspecto liso. Otras descripciones de superficie pueden ser: opacas (opuestas a brillantes),

veteadas, ásperas, arrugadas (o arrugadas), relucientes.

Consistencia / Textura: Varios términos que pueden ser apropiados para describir la textura

o consistencia del crecimiento bacteriano son: seco, húmedo, viscoso (se adhiere a un bucle,

difícil de desprender), quebradizo / desmenuzable (seco, se rompe), mucoide (pegajoso),

parecido a un moco)

Color de las colonias (pigmentación): Algunas bacterias producen pigmento cuando crecen

en el medio, p. Ej., Pigmento verde producido por Pseudomonas aeruginosa, colonias de

color beige de Mycobacterium tuberculosis en medio L.J, colonias rojas de Serratia

marcescens

Opacidad de la colonia bacteriana: Es la colonia transparente (transparente), opaca (no

transparente o transparente), translúcida (casi transparente, pero distorsionada como una

visión que mira a través del vidrio esmerilado), iridiscente (cambia de colores en la luz
OBJETIVO

● Caracterizar las colonias de un cultivo puro, considerando su tamaño, forma, color,

aspecto y consistencia de las colonias de una bacteria aislada y crecida en medio Agar

nutritivo (LB) durante 48 horas a 25 “C.

MATERIALES Y REACTIVOS

● Cultivo puro de una bacteria aislada y crecida en medio Agar nutritivo (LB) durante

48 horas a 25 “C.

● Lupa

● Stereoscopio

PROCEDIMIENTO

1. Seleccionamos de nuestro repique las colonias más aisladas para poder introducirlas

al Agar nutritivo. Todo esto lo realizamos cerca al fuego para no contaminar las

muestras, además del uso de guantes para no contaminar la placa ni la siembra.

Figura 1: Selección de colonias de la placa

Fuente: Elaboración propia

2. Con una asa calentada previamente con la llama del mechero, se extraen

cuidadosamente las colonias de la placa y se colocan en la nueva placa petri mediante

la técnica de agotamiento en la nueva placa petri.

Figura 2: Calentamiento del asa

Fuente: Elaboración propia

Figura 3: Agotamiento

Fuente: Elaboración propia

3. Se envuelven las muestras con papel y cordón para ponerlas a incubar por 48 hr a

25°C en la refrigeradora.

Figura 4: Placas petri obtenidas

Fuente: Elaboración propia

Figura 5: Envoltura de las placas con cinta y papel

Fuente: Elaboración propia

 4. Después de las 48 horas transcurridas se retiran y se observan todo esto con guantes y

cerca del fuego; ya que, estas se usarán para futuras experimentaciones. Se observaron

sus características culturales mediante el uso de la vista simplemente y se anotaron

aparte.

Figura 6: Colonias de bacterias obtenidas

Fuente: Elaboración propia

ACTIVIDADES

Observar una colonia aislada de un cultivo puro, dibujar y anotar:

A. Forma de la colonia bacteriana

COLONIA CIRCULAR
B. Elevación de la colonia bacteriana

CONVEXA

C. Margen de la colonia bacteriana

BORDES LISOS

D. Tamaño de la colonia bacteriana

El más pequeño es del tamaño de la punta de una alfiler

E. Aspecto de la superficie de la colonia

ASPECTO LISO Y BRILLANTE

F. Consistencia / Textura

MUCOIDE
G. Color de las colonias (pigmentación)

ANARANJADO LADRILLO

H. Opacidad de la colonia bacteriana

OPACA
DISCUSIÓN

Mediante el aislamiento de ADN se pudo obtener que nuestra bacteria es de tipo

Enterobacteriaceae por lo que mediante investigación bibliográfica se puede demostrar

caracterizar que la E. coli y la mayor parte de las otras bacterias entéricas forman colonias

circulares, convexas y lisas con bordes distintivos. Las colonias de Enterobacter son similares

pero un poco más mucoides. Las colonias de Klebsiella son grandes y muy mucoides y

tienden a experimentar coalescencia con la incubación prolongada. Las salmonelas y las

shigelas producen colonias similares a E. coli pero no fermentan lactosa. Algunas cepas de E.

coli producen hemólisis en agar sangre (Carrot et al, 2016). En cuánto al crecimiento y

tamaño las enterobacterias proliferan con facilidad en medios simples, a menudo con sólo una

fuente energética de carbono. El crecimiento es rápido bajo condiciones aerobias y

anaerobias, produciendo colonias de 2 a 5 mm en medios de agar y con turbidez difusa en

caldos de cultivo después de 12 a 18 horas de incubación (Ryan & Ray, 2017).

CONCLUSIONES

● Mediante la observación directa se pudo observar que las colonias de cultivo

obtenidas mediante repique y en medio Agar nutritivo (LB) durante 48 horas a 25 “C.,

de nuestra muestra se puede decir que presenta un tamaño mínimo de la punta de un

alfiler, forma circular, color anaranjado ladrillo, consistencia mucoide, aspecto liso y

brillante, opaca, de bordes lisos y convexa.

CUESTIONARIO:

1. ¿Qué recomendaciones se deben de tener presentes para el estudio de

características culturales?

Se deben evaluar de manera objetiva las medidas de seguridad debidas de acuerdo al

tipo de bacteria que estemos manejando en ese momento o el tipo de cultivo que tengamos.

Así mismo, debemos empezar con características más generales y observables a simple vista

para así no contaminar la muestra innecesariamente. Si se evaluará la elevación se debe

hacer con cuidado y en una colonia lo más cercana al vidrio para así no contaminar la

muestra y obtener datos claros. También, en todo momento se debe utilizar guantes para

manipular la placa y no ingresen organismos no deseados.

2. ¿Qué tipos de seguridad se deben de tener en cuenta cuando se estudian las

características de una colonia?

Se debe utilizar implementos de seguridad como guantes quirúrgicos por si poseemos

una bacteria que pueda ser peligrosa o no tengamos conocimiento de la bacteria que estamos

analizando por lo que podríamos contagiarnos de alguna enfermedad inintencionadamente.

También se debe realizar junto al fuego todo el momento para así no contaminar las muestras,

además las placas petri no deben ser abiertas sin un propósito específico por lo que deben

estar cerradas cerca del fuego. Se debe esterilizar todo el material que se vaya a utilizar para

evitar contaminación de la muestra.

BIBLIOGRAFÍA

- Carroll K.C., & Hobden J.A., & Miller S, & Morse S.A., & Mietzner T.A., & Detrick

B, & Mitchell T.G., & McKerrow J.H., & Sakanari J.A.(Eds.), (2016). Bacilos

gramnegativos entéricos (enterobacteriaceae). Microbiología médica, 27e. McGraw

Hill.

https://accessmedicina.mhmedical.com/content.aspx?bookid=1837&sectionid=12895

7405

- Ryan K.J., & Ray C(Eds.), (2017). Enterobacterias. Microbiología médica, 6e.

McGraw Hill.

https://accessmedicina.mhmedical.com/content.aspx?bookid=2169&sectionid=16298

4036
 PRÁCTICA XII: AISLAMIENTO DE ADN

INTRODUCCIÓN

En la presente práctica se extrae el DNA de bacterias mediante protocolos básicos en

donde se usan los reactivos necesarios para recuperar de ácidos nucleicos de un cultivo puro

de bacterias. Esta técnica utiliza un rápido proceso para remover macromoléculas

contaminantes,. El ácido nucleico purificado puede ser usado subsecuentemente en muchas

aplicaciones incluyendo hibridización, digestión con enzimas de restricción, amplificación

por la PCR. Para información sobre las bases de los protocolos utilizados, sugerimos revisar

la bibliografía adjunta.

OBJETIVOS

● Aislar ADN a partir de un cultivo puro

MATERIALES Y REACTIVOS

● Cultivo de bacterias

● Solución de Lisis

● Mezcla Fenol- cloroformo- alcohol isoamilico 25:24;1

● Isopropanol

● Alcohol etanol 75 %

● TE buffer

● RNase A 5 ug/ml

● Proteinasa K 50 ug/ul

PROCEDIMIENTO

PARTE I: PROTOCOLO PARA PURIFICACION DE ACIDOS NUCLEICOS.

1. Colectar 1 – 5 colonias de un cultivo de bacterias en placa y resuspender en 300 ul de

Solución Buffer TE, para cada muestra.

2. Sonicar 3 veces por 10 segundos cada vez, en un baño de hielo. Otra opción es añadir 200

mg de glass beads (micro perlas de vidrio) y vortex por 3 minutos

3. Colocar la muestra en hielo por 3- 5 minutos y luego proceder con la precipitación del

ADN en la parte II (siguiente página).

PARTE II: PRECIPITACIÓN DE DNA TOTAL (para todas las muestras biológicas)

1. Colocar 500 ul de la mezcla Fenol-cloroformo-alcohol isoamílico a 300 ul de muestra

lizada y mezclar por vortex por 60 seg.

2. Centrifugar por 10 minutos a 12000 RPM

3. Transferir la fase acuosa (300 ul) a un nuevo tubo eppendorf, use tip nuevo para cada

muestra. Descarte el tubo con las fases orgánica e intermedia.

4. Adicionar 2 volúmenes de Isopropanol absoluto, mezclar (Invertir) el tubo varias (30-40)

veces. Y dejar en reposo por 10 min a 0°C

5. Centrifugar los tubos por 5 minutos a temperatura ambiente, en una microcentrífuga.

6. Descarte el sobrenadante.

7. Enjuague en pellet con 0.5 ml etanol frío al 70%, el etanol de debe añadir muy despacio sin

destruir o disolver el pellet.

8. Centrifugar los tubos por 5 minutos a temperatura ambiente, en una microcentrifuga.

9. Remover el sobrenadante, deje los tubos abiertos e invertidos para secar los pellet.

10. Resuspender el pellet en 50 ul de agua desionizada o TE.

RESULTADOS

1. Añadir fotos del Procedimiento:

Figura 7. Se extrae 300 uL de solución buffer

Figura 8. Se agrega la solución buffer a los tubos eppendorf

Figura 9 Esterilización de la barra de inoculación

Figura 10 Extracción de colonias de la muestra bacteriana

Figura 11. Se coloca la muestra en los tubos eppendorf

Figura 12. Se agrega las microperlas al tubo eppendorf

Figura 13 Resultado después de la agitación

 Figura 14 Fenol-Cloroformo

Figura 15. Distribución de los tubos eppendorf

Figura 16. Configuración de la microcentrífuga

DISCUSIÓN

Los tubos Eppendorf comprados eran de mala calidad, tenían grietas y derrames, por lo

que no se podían ver los resultados finales de la prueba. A continuación, el maestro concluyó que

el experimento con tubos de mejor calidad debería haber obtenido los resultados esperados y

realizó una buena determinación de la secuencia de ADN. Todos los demás pasos se completaron

con éxito, las bacterias, el tampón y las colonias bacterianas se mezclaron y se observó un color

amarillo lechoso a medida que las partículas finas se diluían en la mezcla.

CONCLUSIÓN

El aislamiento del ADN bacteriano es una propuesta práctica que permite desarrollar

una estrategia educativa in vitro multidisciplinaria para comprender por qué y cómo se puede

aislar el ADN de una sola bacteria, incluyendo conceptos relacionados que han sido

expuestos por muchas disciplinas diferentes. científico. Esta actividad ayuda a aplicar los

conceptos básicos de química, física y biología que ilustran la naturaleza interdisciplinaria de

la ciencia y brinda la oportunidad de transferir el conocimiento científico, desde su base

científica hasta los avances recientes en biotecnología. su impacto social y su impacto moral.
 PRÁCTICA XIII: AMPLIFICACIÓN DEL GEN rRNA16S

INTRODUCCIÓN

El uso de las secuencias del gen 16S rRNA para estudiar la filogenia bacteriana y la

taxonomía ha sido, con mucho, el marcador genético de limpieza más común utilizado por

una serie de razones. Estas razones incluyen su presencia en casi todas las bacterias, a

menudo existentes como una familia multigene u operones; la función del gen 16S rRNA a lo

largo del tiempo no ha cambiado, lo que sugiere que los cambios de secuencia aleatoria son

una medida más precisa del tiempo; y el gen 16S rRNA (1.500 pb) es lo suficientemente

grande para fines informático. En 1980 en las listas aprobadas, se reconocieron 1.791

nombres válidos en el rango de especies. Hoy, este número se ha disparado a 8,168 especies,

un aumento del 456%. La explosión en el número de taxones reconocidos es directamente

atribuible a la facilidad en el rendimiento de los estudios de secuenciación del gen 16S rRNA

en comparación con las manipulaciones más engorrosas que implican las investigaciones de

hibridación ADN-ADN. La hibridación ADN-ADN es inequívocamente el "estándar de oro"

para las nuevas especies propuestas y para la asignación definitiva de una cepa con

propiedades ambiguas a la unidad taxonómica correcta. Los ensayos de hibridación de ADN

no están exentos de sus defectos, sin embargo, requieren mucho tiempo, trabajo intensivo y

costosos. Hoy en día, cada vez menos laboratorios en todo el mundo realizan tales ensayos, y

muchos estudios que describen nuevas especies se basan únicamente en secuencias de

subunidades pequeñas (SSU) u otros datos polifásicos.

A principios de la década de 1990, la disponibilidad de secuenciadores de ADN en

términos de costo, metodologías y tecnología mejoró dramáticamente, de modo que muchos

centros ahora pueden permitirse tal instrumentación. En 1994, Stackebrandt y Goebel

resumieron el surgimiento de la tecnología de secuencia SSU y su posible utilidad en la

definición de una especie. Aunque se ha demostrado que los datos de secuencia del gen 16S
rRNA en una cepa individual con un vecino más cercano que exhibe una puntuación de

similitud de <97% representa una nueva especie, el significado de los puntajes de similitud

de> 97% no es tan claro. Este último valor puede representar una nueva especie o,

alternativamente, indicar el agrupamiento dentro de un taxón previamente definido.

Tradicionalmente, se han requerido estudios de hibridación ADN-ADN para proporcionar

respuestas definitivas a tales preguntas. Mientras que los datos de secuencia del gen 16S

rRNA pueden usarse para una multiplicidad de propósitos, a diferencia de la hibridación de

ADN (reasociación > 70%) no existen "valores umbral" definidos (p. Ej. 98.5% de similitud)

por encima de los cuales existe acuerdo universal. identificación concluyente al rango de

especie.

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se realiza en un termociclador, es una

técnica científica en biología molecular para amplificar una o varias copias de un fragmento

de ADN en varios órdenes de magnitud, generando miles a millones de copias de una

secuencia de ADN particular. PCR ahora es una técnica común e indispensable, utilizada en

laboratorios de investigación médica y biológica para una variedad de aplicaciones. Hay tres

pasos principales involucrados en la técnica de PCR: desnaturalización, recocido y extensión.

OBJETIVOS

● Conocer los fundamentos y los procedimientos de una PCR

● Conocer cómo se realiza el secuenciamiento del gen 16S

ACTIVIDADES

Esquematizar el proceso de la PCR, diferenciando sus etapas.

Figura 17: Polimerasa, Agua, Pimer

Fuente: Elaboración propia

Figura 18: Extracción del ADN

Fuente: Elaboración propia

 Figura 20: Extracción del Primer

Fuente: Elaboración propia

Figura 21: Extracción del Supermix

Fuente: Elaboración propia

Figura 22: Agregado del agua

Fuente: Elaboración propia

 Figura 23: Perfil térmico típico de una PCR. Los tiempos de cada fase son orientativos. La
temperatura de hibridación puede variar en función de la especificidad de la reacción.

Fuente: Pérez de Castro, Ana María. Reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase

Chain Reaction, PCR)
Figura 23: Etapas de la técnica

Fuente: Aguilera P., Ruiz Tachiquí M., Rocha Munive M. G., Pineda Olvera B. Chánez

Cárdenas, M . E. PCR en tiempo real

DISCUSIÓN

El tiempo para la aplicación de la PCR es considerablemente largo sobre todo para la

obtención de los resultados del termociclador, unidad capaz de detectar señales fluorescentes

(fluorómetro).

CONCLUSIÓN

La reacción en cadena de la polimerasa o PCR es una técnica fundamental para la

mayor parte de las aplicaciones de la biología molecular. y son innumerables las aplicaciones

que se derivan de ella, pero a pesar de que permite generar millones de copias de la región de

interés a partir de una o muy pocas copias del ADN molde, la principal desventaja es la

necesidad de estandarizar la técnica para el organismo o la técnica de interés, lo cual puede

ser tardado y costoso.

CUESTIONARIO

1. Aparte de la PCR convencional que otro tipo de PCR existen? De una breve

descripción de cada uno.

● PCR anidada: Variante de la PCR convencional que comprende dos rondas de

amplificación con distintos pares de cebadores en cada una, con el fin de incrementar

la sensibilidad y la especificidad de la detección. Primero se realiza una reacción con

los cebadores externos para amplificar una región de ADN más extensa, que contiene

el segmento diana. Después, este producto de amplificación se utiliza como molde de

una segunda PCR con los cebadores internos para amplificar la región específica.

● PCR in situ: Se marca una hebra sencilla de ARN o ADN denominada sonda y se

permite que se empareje con su secuencia complementaria en el ARN o el ADN

presente en una muestra de tejido o de cromosomas. La sonda está marcada con una

sustancia trazadora química o radiactiva por lo que su unión puede ser visualizada.
● PCR múltiple: lo que se persigue es amplificar simultáneamente en un único tubo

distintas secuencias específicas, lo cual necesariamente implica que los reactivos

mezclados y el programa utilizado sean suficientes y adecuados para permitir la

detección de cada diana y no inhibir la de las demás. Es necesario tener en cuenta:

○ Escoger o diseñar oligonucleótidos que no interaccionen entre sí, es decir, que

no forman oligómeros.

○ Que tengan temperaturas de anillamiento similares.

○ Que cada pareja amplifique una única secuencia diana.

○ Que generen amplicones de tamaño suficientemente diferente como para

poder ser separados y diferenciados tras la amplificación.

● RT-PCR: Dos procesos: transcripción inversa a partir de ácido ribonucleico (ARN)

sintetiza ADN complementario (ADNc), con el cual se realiza posteriormente la(s)

PCR(s) correspondiente(s). De esta forma se pueden amplificar genes que estaban

expresados en el momento del estudio.

● PCR en tiempo real o cuantitativa: El principio de la técnica se basa en la PCR punto

final, sólo que la forma en cómo se detectan y analizan los productos de la

amplificación es diferente. El término en tiempo real se refiere a que la detección de

los productos amplificados sucede en cada ciclo de la reacción. Por su parte, el

término cuantitativo hace referencia a que es posible cuantificar la cantidad de ADN

en la muestra. El producto de amplificación es monitoreado conforme transcurre la

reacción. El sistema garantiza de PCR en tiempo real garantiza una alta sensibilidad,

especificidad y eficiencia. Los ingredientes químicos en la PCR en tiempo real, son

los mismos utilizados en la PCR punto final, sólo que generalmente la enzima,
 dNTP’s, Mg +, el buffer y el sistema reportero de fluorescencia para detectar los

productos amplificados se venden juntos en una solución conocida como «Master

mix», el agua es proporcionada por separado y también es libre de nucleasas. Los

primers deben ser diseñados especialmente para garantizar una alta especificidad y

para que generen amplicones de un tamaño que oscile entre 100-150 pb; si éstos son

más grandes, la eficiencia de la reacción disminuye considerablemente.8

● PRC de células viables: Como paso previo a la amplificación del fragmento de ADN

diana, la muestra se somete a una neutralización del material genético “libre” en la

suspensión, o el procedente de células dañadas o muertas. Con este paso inicial, los

resultados de la PRC evidenciaron solamente la presencia de células vivas presentes

en nuestra muestra.

2. Que otras secuencias de genes aparte del 16S se utilizan para determinar la

taxonomía de microorganismos

ARNr 16S-23S y ARNr 23S. Aunque en muchos casos se considera que la

secuenciación de la fracción 23S puede ser una buena alternativa en los casos en los que la

fracción 16s no proporciona resultados concluyentes, presenta una serie de inconvenientes

que han sido evaluados por algunos autores. Además de incrementarse el coste, existen

dificultades para la amplificación de fragmentos más grandes de forma rutinaria con

propósitos taxonómicos. Un problema añadido es la existencia de abundantes secuencias de

inserción (IS), que sin embargo pueden ser fácilmente localizadas y eliminadas mediante

análisis comparativo, por lo que puede ser utilizado en la actualidad como un método auxiliar

útil con fines taxonómicos y filogenéticos.

rpoB (subunidad β de la ARN polimerasa). El gen rpoB constituye uno de los pocos

genes candidatos útiles en la identificación bacteriana en los análisis taxonómicos y

filogenéticos de cepas de origen humano, animal y ambiental. El gen rpoB permite la

identificación a nivel de género, especie y en ocasiones a nivel de subespecie.

gyrB (subunidad β de la ADN girasa). Es un buen cronómetro molecular para realizar

estudios filogenéticos en numerosos géneros, permitiendo establecer diferencias inter e

intraespecie. Actualmente, constituye un marcador molecular relevante en la investigación de

especies relacionadas.

3. ¿Cómo se denomina a los productos de la PCR?

Los ingredientes clave para una reacción de PCR son Taq polimerasa, cebadores,

ADN molde y nucleótidos (los bloques básicos del ADN). Los ingredientes se colocan en un

tubo, junto con los cofactores que necesite la enzima, y se someten a ciclos repetidos de

calentamiento y enfriamiento que permiten la síntesis del ADN.

BIBLIOGRAFÍA

Aguilera P., Ruiz Tachiquí M., Rocha Munive M. G., Pineda Olvera B. Chánez Cárdenas, M.

E. (S.F.) PCR en tiempo real.

http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones2/libros/710/pcrtiempo.pdf

Khan Academy. (s.f.). Reacción en cadenas de la polimerasa (PCR).

https://es.khanacademy.org/science/ap-biology/gene-expression-and-regulation/biotech

nology/a/polymerase-chain-reaction-pcr#:~:text=Los%20ingredientes%20clave%20par

a%20una,permiten%20la%20s%C3%ADntesis%20del%20ADN.

Jiménez Moraleda. B., Fuentes Martín M. D., Sabanza Belloso M., López Gómez M., Miguel

Molinos A. C., Ciprian Negru. G.(22021). Diagnóstico y tipos de PCR. Revisión

bibliográfica.
 https://revistasanitariadeinvestigacion.com/diagnostico-y-tipos-de-pcr-revision-bibliogr

afica/

Fernández Olmos A., García de la Fuente C., Saéz Nieto J. A., Valdezate Ramos S. (2010).

Metodos de identificación bacteriana en el laboratorio de microbiología.

https://www.seimc.org/contenidos/documentoscientificos/procedimientosmicrobiologia

/seimc-procedimientomicrobiologia37.pdf
 PRÁCTICA XIV: IDENTIFICACIÓN MOLECULAR BACTERIAS

INTRODUCCIÓN

Tras los avances en la secuenciación de ADN y proteínas, la aplicación de enfoques

computacionales, en el análisis de datos biológicos se ha convertido en un aspecto muy

importante de la biología. La evaluación de las similitudes entre los datos biológicos se ha

convertido en un aspecto muy importante de la biología. La evaluación de las similitudes

entre las secuencias biológicas es crucial para nuestra comprensión de la biología evolutiva, y

esto puede lograrse mediante la herramienta de búsqueda de alineación local básica (BLAST)

y la alineación rápida (FASTA). BLAST y FASTA se han convertido en herramientas

fundamentales de la biología y es esencial saber cómo operan, la tarea que pueden realizar y

cómo interpretar con precisión su resultado. Este documento proporciona un análisis de

BLAST y FASTA en el análisis de secuencias. Ambos algoritmos BLAST y FASTA son

apropiados para determinar secuencias muy similares. Sin embargo, BLAST parece ser más

rápido y también secuencias más precisas altamente divergentes en algunos casos.

OBJETIVOS

● Conocer y aprender a manejar el programa BLAST

MATERIAL

● Computadoras

● Secuencias de ADN

PROCEDIMIENTO

Buscar en la plataforma de búsqueda Google la página BLAST.

1. Seleccionar la primera página, se abrirá la siguiente pantalla.

2. Una vez tenga aparezca esta ventana en su pantalla dar click en la opción Nucleotide

BLAST. Se abrirá la siguiente ventana, en el primer cuadro señalado de rojo se

colocará la secuencia de interés.

3. Y luego dar en el icono que dice BLAST

Inmediatamente aparecerán los resultados y aparecerá el Query, en donde se verá la similitud

de esta primera secuencia con algunas otras.

4. Más abajo encontrará la descripción, el query que sea de mayor porcentaje % y con

Max score y Total score mayor, corresponderá a nuestra secuencia de interés.

ACTIVIDADES

Realizar los procedimientos descritos anteriormente pero con su secuencia de interés y

documentar todos los pasos que siguió, usando capturas de pantalla.

1. Ingresar a la página web

2. Una vez tenga aparezca esta ventana en su pantalla dar click en la opción Nucleotide

BLAST. Se abrirá la siguiente ventana, en el primer cuadro señalado se colocará la

secuencia de interés.

3. Inmediatamente aparecerán los resultados y aparecerá el Query, en donde se verá la

similitud de esta primera secuencia con algunas otras.

Pegar la secuencia rRNA16S de su bacteria

GCAGTCGAGCGGTAACACAGGGAGCTTGCTCCTGGGTGACGAGCGGCGGACGGG

TGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAG

CTAATACCGCATAATGTCGCAAGACCAAAGA

DISCUSIÓN

La bacteria analizada de acuerdo a los resultados de la base de datos tiene similitud del 100%

con El Enterobacter sp.

CONCLUSIÓN

La secuencia genética consultada en BLAST corresponde al Enterobacter sp

CUESTIONARIO

1. ¿Cuál es el % de similitud y score?

En primer lugar BLAST usa una matriz de sustitución de aminoácidos o nucleótidos

para calificar sus alineamientos. Dicha matriz contiene la puntuación (también llamada score)

que se le da al alinear un nucleótido o un aminoácido X de la secuencia A con otro

aminoácido Y de la secuencia B y la similitud indica el grado de coincidencia entre dos pares

de secuencias (suele expresarse en porcentajes). Identidad: indica la coincidencia total entre

los pares de secuencias.

BIBLIOGRAFÍA

NCBI. “BLAST: Basic Local Alignment Search Tool.” NCBI, https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.

Accedido 12 Julio 2022.

UPV. “Búsqueda de secuencias en bases de datos — Bioinformatics at COMAV 0.1 documentation.”

Bioinformatics at COMAV, https://bioinf.comav.upv.es/courses/intro_bioinf/blast.html.

Accessed 12 Julio 2022.

 PRÁCTICA XV: CRIOPRESERVACIÓN DE BACTERIAS

INTRODUCCIÓN

El congelamiento instantáneo, o congelación instantánea, es el proceso mediante el

cual las muestras se bajan a temperaturas por debajo de -70 ° C muy rápidamente usando

hielo seco o nitrógeno líquido. La congelación instantánea logra el mismo punto final que la

congelación controlada a baja velocidad, pero a una tasa aproximada de -10-1000 ° C / min,

en comparación con -1 ° C / min. La congelación instantánea con un módulo CoolRack®

proporcionará estabilidad del recipiente de muestra, organización y parámetros de

congelación consistentes, procesamiento rápido de muestras manos libres y evitando la

pérdida o contaminación de muestras. La congelación a presión se realiza en un CoolRack

preenfriado, que asegura una transferencia de calor rápida. Este método puede proporcionar

una excelente integridad de la muestra y una amplia gama de opciones para el análisis,

incluida la extracción de proteínas, ADN y ARN para su uso en investigación y diagnóstico.

El siguiente protocolo describe un procedimiento general para criopreservar bacterias para el

almacenamiento a largo plazo.

OBJETIVOS

Conservar cepas bacterianas por tiempos largos de tiempo

MATERIAL

Cultivo puro de bacterias

Caldo Nutritivo con Glicerol al 30%

PROCEDIMIENTO

● Colocar una asada de colonia bacteriana a partir de un cultivo puro

● En un tubo Eppendorf, resuspender las bacterias en 200 ul de caldo de cultivo (LB)

● Transferir 100 ul de suspensión bacteriana a un tubo eppendorf que contenga 500 ul

de caldo nutritivo con glicerol al 30%

● Almacenar en un congelador -20 °C, hasta por 5 años.

ACTIVIDADES

A partir de un cultivo puro, preparar las bacterias para su conservación.

Se ha utilizado el cultivo anterior del 3cer repique para criopreservar las bacterias.
Dibuje el procedimiento:

RESULTADO
CUESTIONARIO

1. ¿Qué otros medios de criopreservación conoce?

El nitrógeno líquido como medio de criopreservación reduciendo el metabolismo

celular hasta el punto de prácticamente anularlo a temperaturas menores a -190°C

2. Explique cómo funcionan el medio de criopreservación

La técnica de criopreservación consiste en congelar células o tejidos a temperaturas

generalmente entre -80 °Cy -190°C, reduciendo el riesgo de contaminación y permitiendo la

mantención de los microorganismos a largo plazo.

BIBLIOGRAFÍA

Ocaceres Y, & Castro J. (2016). Preservación de microorganismos por congelación. INIA-

Ministerio de Agricultura - Chile. Obtenido de:

https://biblioteca.inia.cl/bitstream/handle/20.500.14001/67167/NR42413.pdf?sequence=1.

.
 PRÁCTICA XVI: SECUENCIACIÓN DE ADN

En la presente práctica se extrae el DNA de bacterias mediante protocolos básicos en

donde se usan los reactivos necesarios para recuperar de ácidos nucleicos de un cultivo puro

de bacterias. Esta técnica utiliza un rápido proceso para remover macromoléculas

contaminantes,. El ácido nucleico purificado puede ser usado subsecuentemente en muchas

aplicaciones incluyendo hibridización, digestión con enzimas de restricción, amplificación

por la PCR. Para información sobre las bases de los protocolos utilizados, sugerimos revisar

la bibliografía adjunta.

OBJETIVOS:

● Aislar ADN a partir de un cultivo puro

● Aplicar conocimientos teóricos sobre purificación de ácidos nucleicos y precipitación

de ADN Total.

Material y reactivos

● Cultivo de bacterias

● Solución de Lisis

● Mezcla Fenol- cloroformo- alcohol isoamilico 25:24;1

● Alcohol Isopropanol

● Etanol 75 %

● TE buffer

● RNase A 5 ug/ml

● Proteinasa K 50 ug/ul
 PROCEDIMIENTO

PARTE I: PASOS.

1. Repique.

2. Purificar el ADN

3. Amplifica una región de interés del ADN gen16S.

PARTE II: PRECIPITACIÓN DE DNA TOTAL (para todas las muestras biológicas)

1. Colocar 500 ul de la mezcla Fenol-cloroformo-alcohol isoamilico a 300 ul de muestra

lisada y mezclar por vortex por 60 seg.

2. Centrifugar por 10 minutos a 12000 RPM

3. Transferir la fase acuosa (300 ul) a un nuevo tubo eppendorf, use tip nuevo para cada

muestra. Descarte el tubo con las fases orgánica e intermedia.

4. Adicionar 2 volúmenes de Isopropanol absoluto, mezclar (Invertir) el tubo varias

(30-40) veces. Y dejar en reposo por 10 min a 0°C

5. Centrifugar los tubos por 5 minutos a temperatura ambiente, en una microcentrífuga.

6. Descarte el sobrenadante

7. Enjuague en pellet con 0.5 ml etanol frío al 70%, el etanol de debe añadir muy

despacio sin destruir o disolver el pellet.

8. Centrifugar los tubos por 5 minutos a temperatura ambiente, en una microcentrífuga.

9. Remover el sobrenadante, deje los tubos abiertos e invertidos para secar los pellet.

10. Resuspender el pellet en 50 ul de agua desionizada o TE.

PROCEDIMIENTO

Describir el Procedimiento

1. Se debe colocar la asa en las llamas para esterilizarlas, se abre el frasco de muestra y se

eligen las colonias que se utilizarán para el aislamiento, todo esto cerca del fuego. Usando

la asa colocamos 2-3 colonias de bacterias en el tubo y agitamos la asa dentro del tubo.

2. Después añadimos 100 ul de microperlas a caa tubo.

3. Luego colocamos los tubos Eppendorf en el vortex por 3 minutos, se debe presionar para

que este empiece a moverse, así mismo no debe presionar fuertemente o podrían romperse.

4. Se coloca 500 ul de mezcla de F:Cl:OH 15 dentro de cada tubo y se agita vigorosamente

por 5 minutos. Se volverá lechoso el líquido.

5. Se colocan en la centrífuga por 10 minutos a 1500 RPM, se deben colocar de dos en dos

para no desequilibrar el aparato, ambos con características de peso parecidas.

6. Se formarán tres estados: acuosos, blanquecino y orgánico. Recuperar la fase acuosa en un

tubo nuevo.

7. Añadir 600 ul de isopropanol.

8. Guardar las muestras en el refrigerador.

RESULTADOS

https://drive.google.com/file/d/1XBFNi_szNRHEbgRihoxaOTZ0zuzweE2G/view?userstoinv

ite=none

DISCUSIÓN

La extracción consiste en el aislamiento y purificación de moléculas de ADN y se basa en las

características fisicoquímicas de la molécula. El ADN está constituido por dos cadenas de

nucleótidos unidas entre sí formando una doble hélice. Los nucleótidos están integrados por

un azúcar (desoxirribosa), un grupo fosfato y una base nitrogenada (adenina, guanina, timina

o citosina). La unión de los nucleótidos ocurre entre el grupo fosfato y el azúcar, mediante
enlaces fosfodiéster, dando lugar al esqueleto de la molécula. Las bases de cadenas opuestas

se unen mediante puentes de hidrógeno y mantienen estable la estructura helicoidal. Los

grupos fosfato están cargados negativamente y son polares, lo que le confiere al ADN una

carga neta negativa y lo hace altamente polar, características que son aprovechadas para su

extracción (Ramos, 2018). Tienen una fuerte tendencia a repelerse, debido a su carga

negativa, lo que permite disolver al ADN en soluciones acuosas y formar una capa hidratante

alrededor de la molécula. Pero, en presencia de etanol, se rompe la capa hidratante y quedan

expuestos los grupos fosfato. Bajo estas condiciones se favorece la unión con cationes como

Na+ que reducen las fuerzas repulsivas entre las cadenas de nucleótidos y permiten que el

ADN precipite. Por otro lado, la carga neta negativa del ADN le permite unirse a moléculas y

matrices inorgánicas cargadas positivamente (Ramos , 2018).

CONCLUSIÓN

● Mediante la utilización de vortex, centrifugadora y materiales de laboratorio se logró

aislar ADN a partir de un cultivo puro, en este caso de dos muestras las cuáles fueron

tomadas de una acequia.

● Se aplicaron los conocimientos teóricos sobre purificación de ácidos nucleicos y

precipitación de ADN Total, después de la realización de tres repiques.

BIBLIOGRAFÍA

- Ramos, S. (15 de agosto de 2018). Extracción Y Purificación De ADN; Introducción

E Importancia De La Extracción Del ADN. Blog Analitek.

https://blog.analitek.com/extraccion-y-purificacion-de-adn-introduccion-e-importanci

a-de-la-extracciondel-adn-0-0-1
ANEXO N° 1: COMPARACIÓN DE LA SECUENCIA