Emisión:

2002
DETERMINACIÓN DE AMINAS BIOGENAS Versión: 3
(HISTAMINA)
Método HPLC Actualización:
05-05-2014
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Alimentos y Nutrición

1. OBJETIVO
Determinar histamina y otras aminas biógenas por HPLC con detector UV.

2. CAMPO DE APLICACIÓN Y ALCANCE

El método es aplicable a los alimentos sospechosos de contener histaminas y otras aminas
biógenas, principalmente productos hidrobiológicos frescos o procesados, harina de pescado,
quesos y cecinas, recepcionados en la Sección Química de Alimentos.

3. FUNDAMENTO
Extracción de aminas biógenas en ácido tricloroacético, derivatización precolumna mediante
cloruro de dansilo y posterior análisis de los respectivos derivados dansilados por HPLC con
detector UV.

4. DOCUMENTOS DE REFERENCIAS
Norma Chilena NCh 2637.Of 2001 Productos hidrobiológicos “Determinación de histamina y
otras aminas biógenas”- Método HPLC con detector UV.

5. TERMINOLOGÍA
5.1 Aminas biógenas: compuestos alergénicos generados por la degradación de
aminoácidos que están contenidos en pescados y otros alimentos como derivados
lácteos, cecinas, hígado de vacuno y ave, cacao, vinos y cerveza, los que al ser
consumidos pueden causar reacciones alérgicas o cuadros de intoxicación.
5.2 HPLC : Cromatografía líquida de alta resolución

6. REACTIVOS, INSUMOS Y EQUIPOS

6.1 REACTIVOS
6.1.1 Acetona p.a.
6.1.2 Solución de bicarbonato de sodio 0.25 M (PM=84).
6.1.3 Cloruro de dansilo 10 mg/mL. Solución de ácido tricloroacético (TCA) al 5% con
estándar interno de efedrina 250 ppm
6.1.4 Fase móvil: metanol HPLC y agua desionizada y filtrada (se usa gradiente).

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6.1.5 Estándares:
Aminas biógenas: Putrecina
Cadaverina
Tiramina
Histamina
Espermidina

6.2 INSUMOS
6.2.1 Tubos de centrífuga con tapa rosca de 50 mL
6.2.2 Papel filtro Whatman N° 1, 4 o equivalente
6.2.3 Filtros de membrana de 0.22 m
6.2.4 Viales con tapa de 2 a 3 mL
6.2.5 Columna C-18 fase reversa, 125-4 (5 m) o equivalente

6.3 EQUIPOS
6.3.1 Equipo HPLC con detector UV de longitud de onda variable.
6.3.2 Balanza analítica 0.0001 g.
6.3.3 Balanza de precisión 0.01 g
6.3.4 Agitador mecánico de tubos
6.3.5 Baño termorregulado a 60 °C
6.3.6 Centrífuga 2000 a 3000 rpm
6.3.7 Micropipetas de 100 – 1000 L

7. DESCRIPCIÓN DE ACTIVIDADES
Antes de comenzar a trabajar con las muestras, asegurarse de que todo lo mencionado en
punto materiales, insumos y reactivos esté disponible.
A continuación se describe el método analítico, es crucial si no se dispone de práctica
con el método leer completo este procedimiento antes de comenzar a trabajar.
Es necesario utilizar guantes para este trabajo analítico como medida de bioseguridad.

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7.1 MUESTREO / MUESTRA

7.1.1 Chequear que antecedentes de la muestra en guía de ingreso coincidan con los
rotulados en la muestra.
7.1.2 Una vez recibida la muestra en el laboratorio se debe realizar el análisis lo más
pronto posible. En caso de ser necesario postergar el análisis, ésta se debe
mantener a –18 °C si la muestra proviene de producto congelado; entre 0 °C y 4 °C
si la muestra corresponde a un producto fresco refrigerado, no debiendo superar
más de 36 h en esta condición y a temperatura ambiente si la muestra corresponde
a pescado seco, harina de pescado u otro producto con baja humedad.
7.1.3 Al finalizar el trabajo y una vez informada la muestra, si la cantidad restante lo
permite, almacenar aproximadamente 20 g de muestra como contramuestra y
eliminar lo restante en bolsa de eliminación de desechos de laboratorio (Bolsa roja
y/o amarilla). Anotar fecha de eliminación de la muestra en los antecedentes de la
misma en Registro 711.00-074 “Registro de ingreso de muestras al Laboratorio de
Toxinas Marinas y Micotoxinas”

7.2 PREPARACIÓN DE REACTIVOS

7.2.1 Solución de bicarbonato de sodio 0.25 M (PM=84). Pesar 5.25 g de NaHCO 3 y llevar
a un matraz de 250 mL, aforando con agua desionizada filtrada.
7.2.2 Cloruro de dansilo 10 mg/mL. Pesar 50 mg de cloruro de dansilo y llevar a un matraz
de 5 mL aforando con acetona p.a. Guardar refrigerado en envase ámbar bien
cerrado.
7.2.3 Solución de ácido tricloroacético (TCA) al 5% con estándar interno de efedrina 250
ppm. Pesar 25 g de TCA en un matraz aforado de 500 mL, agregar 0.125 g de
efedrina p.a. y aforar con agua para análisis.
7.2.4 Estándares:
Aminas biógenas: Putrecina
Cadaverina
Tiramina
Histamina
Espermidina
7.2.5 Preparar una solución patrón de 1000 mg/L de cada una de las aminas biógenas:
Pesar 50 mg de cada una y aforar a 50 mL con solución de TCA 5% con estándar
interno.

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7.3 PREPARACIÓN DE CURVA DE CALIBRACIÓN

7.3.1 Preparar a partir de las soluciones patrones, una mezcla que contenga al menos 3
niveles desde 50 a 500 µg/mL para la curva de calibración. Aforar cada vez con TCA
5% con estándar interno.

7.4 PREPARACIÓN DE CONTROLES

7.4.1 Preparar un fortificado al límite de cuantificación del método.

7.5 PREPARACIÓN DE LA MUESTRA O ETAPAS PREVIAS A REALIZAR LA

MEDICIÓN
7.5.1 Conservas: Si el líquido de cobertura es comestible, se recomienda homogeneizar
todo el contenido del envase de lo contrario drenar el producto y homogeneizar en
procesadora de alimentos a alta velocidad durante 60 s.
7.5.2 Congelados: Descongelar dejando a temperatura ambiente por un máximo de 4 h y
drenar.
7.5.3 Productos pesqueros salados: Preparar una solución saturada de cloruro de sodio y
sumergir en ella el producto en salazón algunos segundos para retirar la sal superficial.
Sacar la muestra de la solución y secar con papel absorbente, eliminar las espinas,
trozar y preparar el homogeneizado del producto en procesadora de alimentos a alta
velocidad durante 60 s.
7.5.4 Productos seco-salados, apanados, ahumados, quesos y derivados cárnicos: Preparar
el homogeneizado del producto en procesadora de alimentos a alta velocidad durante
60 s.
7.5.5 Pescado fresco: limpiar, descamar, eviscerar y preparar el homogeneizado durante 60
s como se indica a continuación:
a) Pescados de tamaño pequeño ( 15 cm): en su totalidad.
b) Pescados de tamaño mediano: Sacar y descartar cabeza, cola, aletas y espinas;
cortar en filetes para obtener toda la carne y piel.
c) Pescados de tamaño grande: De cada uno de más de tres pescados cortar tres
rebanadas en sentido transversal de 2.5 cm cada una, detrás de la aleta pectoral,
en el medio y después de la abertura anal. Eliminar las espinas.
7.5.6 Mariscos frescos refrigerados y/o vivos: lavar, drenar y desconchar.
7.5.7 Homogeneizar la muestra en procesadora de alimentos de alta velocidad por un
minuto.
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7.5.8 Pesar 5 g en un tubo de centrífuga de 50 mL y agregar exactamente 10 mL de TCA

5% con estándar interno y tapar.
7.5.9 Agitar por 30 min en agitador mecánico.
7.5.10 Centrifugar a 2000-3000 rpm por 15 min.
7.5.11 Filtrar el sobrenadante a través de un embudo con papel filtro.
7.5.12 Filtrar el extracto a través de filtro 0.22 m.
7.5.13 Realizar reacción de dansilación de la siguiente manera:
En un vial de vidrio con tapa adicionar consecutivamente:
100 L de extracto o soluciones estándares
400 L de bicarbonato de sodio 0.25 M (pH 8 a 9)
200 L de solución de cloruro de dansilo
300 L de acetona p.a.
7.5.14 Cerrar herméticamente el vial e incubar a 60 °C en baño termorregulado por 1 hora.
7.5.15 Enfriar a temperatura ambiente.
7.5.16 Inyectar 20 L de la muestra en HPLC.
7.5.17 Utilizar como blanco solución de TCA 5% con estándar interno y dansilar de igual
forma que los estándares y las muestras

7.6 ANÁLISIS DE LA MUESTRA O REALIZACIÓN DE LA MEDICIÓN. CONDICIONES

INSTRUMENTALES.

7.6.1 CONDICIONES CROMATOGRÁFICAS

Flujo de la fase móvil: 1 mL/min
Longitud de onda: 254 nm
Volumen de inyección: 20 µL
Temperatura del horno de columna: 25°C

Programa de gradiente de fase móvil

Tiempo (min) Metanol (%) Agua (%)
0 70 30
20.0 75 25
20.1 100 0
22.0 100 0
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22.1 70 30
30 70 30

7.6.1 Estabilizar por 15 minutos.

7.6.2 Todas las soluciones deben sonicarse si el equipo HPLC no cuenta con desgasificador
on line.
7.6.3 Limpiar la jeringa y el inyector con agua después de cada inyección.
7.6.4 Al final del trabajo lavar la columna con: 70% metanol y 30% agua por 15 a 30 min.
7.6.5 Los tiempos de retención aproximados son:

Amina biógena Tiempo de retención (min)

Efedrina 4a6
Putrecina 6a7
Cadaverina 7a9
Histamina 12 a 14
Tiramina 19 a 21
Espermidina 22 a 25

7.7 CÁLCULO DE RESULTADOS

7.7.1 Calcular el nivel de histamina en µg/mL entregado por el HPLC utilizando estándar
interno usando la siguiente fórmula:

Cm = {(Am/Asi)-b} / m

Cm = Concentración de la amina biógena en el HPLC µg/mL

Am = Área de la amina biógena de la muestra
m = Pendiente de la curva de calibración
b = Intercepto de curva de calibración
Asi = Área del estándar interno

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7.7.2 La concentración total de aminas biógenas se realiza sumando las concentraciones

de cada amina biógena.
7.7.3 Para determinar la concentración de cada amina biógena en la muestra, usar la
siguiente fórmula:

C = Cm x 10
g
Donde:
C = concentración de amina biogénica en mg/kg, de la muestra
Cm = concentración de amina biogénica de la muestra en µg/mL obtenida de la
curva de calibración
g = peso de la muestra en gramos

7.8 ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD DEL ENSAYO

Se efectuarán controles sistemáticos y periódicos para comprobar la validez de los

ensayos realizados con el método de ensayo recogido en este procedimiento. Los
controles de calidad quedan agrupados en tres niveles de control:
a. Nivel I: Ensayos de intercomparación, según disponibilidad.
b. Nivel II: Materiales de referencia sin certificación externa y muestras fortificadas
por el analista.

7.9 EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS

La forma como se expresan los resultados en el informe de ensayo es en mg/100g

de Histamina.

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8. REGISTRO

ALMACENAMIENTO
LUGAR
MEDIO
IDENTIFICACION RESPONSABLE TIEMPO RESPONSABLE/ DISPOSICION
SOPORTE
RECUPERACION
RGG-700.00-034 Técnico y 5 años Papel
Picado en
Registro profesional del Laboratorio de Toxinas
trozos, basura
preparación de laboratorio marinas y micotoxinas/
normal
soluciones Carpeta de estándares
estándares puros

Técnico y 5 años Papel

RG-711.00-080 Picado en
profesional del Laboratorio de Toxinas
Registro de trozos, basura
laboratorio marinas y micotoxinas/
análisis de Toxinas normal
Cuaderno foliado
marinas y
micotoxinas

9. TABLA DE MODIFICACIONES

PRINCIPALES
PUNTOS
VERSION FECHA MODIFICADOS RESUMEN DE MODIFICACIONES
2 05-05-2014 --- Se modifica documento a nuevo formato institucional,
pasa de PRT a ME
2 05-05-2014 7.6 Se agregan condiciones cromatográficas

10. CUADRO DE RESPONSABILIDADES

Ejecuta el método Elabora el informe de Aprueba el informe de resultados

resultados
Técnico o Encargado Encargado de Jefe de Sección Química de Alimentos y Jefe
de Laboratorio Laboratorio de Subdepartamento Alimentos y Nutrición

11. ANEXOS
No Aplica
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