ANÁLISIS DE TEJIDOS

I. COMPATIBILIDAD DE TEJIDOS

El resultado de un trasplante alogénico depende en gran medida del grado de

compatibilidad entre donante y receptor. Esta compatibilidad se estudia
mediante el análisis de unas proteínas situadas en la superficie de las células del
organismo denominadas antígenos leucocitarios humanos (siglas en inglés, HLA).
Para el estudio de compatibilidad basta con una muestra de sangre del paciente
y del posible donante.

El estudio de estos antígenos permite identificar qué donante tiene células más
parecidas a las del receptor, aumentando con ello las probabilidades de éxito del
trasplante.

Todo individuo hereda la mitad de estos antígenos de su padre y la otra mitad de

su madre. Por ello, la probabilidad de encontrar un donante compatible es mayor
entre hermanos y entre familiares directos.

Se han identificado gran cantidad de antígenos del sistema HLA, siendo los más
importantes los denominados HLA A, B, C, DR, DQ y DP. Para considerar a un
hermano compatible es necesario demostrar la identidad de 6 de estos antígenos
(A, B y DR maternos y A, B y DR paternos). Para considerar compatible a un
donante no emparentado se exige que entre 8 y 12 antígenos sean iguales.

II. PATRONES DE ANTÍGENOS

Las pruebas inmunológicas usan uno de los siguientes:

➢ Antígeno para detectar anticuerpos contra un patógeno en una muestra

del paciente
➢ Anticuerpo para detectar un antígeno del patógeno en una muestra del
paciente
El procesamiento de las muestras varía, pero si es necesario retrasar el análisis,
deben refrigerarse o congelarse para impedir la proliferación de contaminantes
bacterianos.

a. PRUEBAS DE AGLUTINACIÓN

En las pruebas de aglutinación (p. ej., aglutinación con látex, congregación),

partículas muy pequeñas (cuentas de látex, partículas de gelatina, bacterias) se
acoplan con un reactivo antigénico o un anticuerpo. La partícula compleja
formada se mezcla con la muestra (p. ej., líquido cefalorraquídeo o suero); si el
anticuerpo o el antígeno buscados están presentes en la muestra, producirán el
entrecruzamiento de las partículas, lo que se observa como una aglutinación.

Si los resultados son positivos, se realizan diluciones seriadas de la muestra y se

prueban nuevamente. La aglutinación de las soluciones más diluidas indica que
existen mayores concentraciones del anticuerpo o del antígeno en estudio. El
título se informa como la recíproca de la solución más diluida que produce
aglutinación; p. ej., un título de 32 indica que la aglutinación se observa hasta la
dilución 1/32 de la concentración inicial.

Generalmente, las pruebas de aglutinación son rápidas, pero menos sensibles que
muchos otros métodos. También permiten determinar los serotipos de algunas
bacterias.

b. FIJACIÓN DEL COMPLEMENTO

La fijación del complemento mide la cantidad de anticuerpos consumidores de

complemento (o que lo fijan) de una muestra de suero o líquido cefalorraquídeo.
Se usa para el diagnóstico de algunas infecciones virales o micóticas,
especialmente para la coccidioidomicosis.

La muestra se incuba con cantidades conocidas de complemento y del antígeno

que es el blanco del anticuerpo en estudio. El grado de fijación del complemento
indica la cantidad relativa de anticuerpos en la muestra.
La prueba permite medir los títulos de anticuerpos IgM e IgG, o puede modificarse
para detectar determinados antígenos. Es precisa, pero tiene aplicaciones
limitadas, es laboriosa y requiere muchos controles.

c. ENZIMOINMUNOENSAYOS

Los enzimoinmunoensayos utilizan anticuerpos unidos a enzimas para detectar

antígenos, y para detectar y cuantificar anticuerpos. Algunos ejemplos son

➢ Enzimoinmunoensayos (EIA)
➢ Ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA)

Como la sensibilidad de la mayoría de los inmunoensayos es elevada, suele

utilizárselos con fines de rastreo o cribado. Pueden determinarse los títulos
mediante la dilución seriada de las muestras, como en los ensayos de aglutinación.

Las sensibilidades de estas pruebas, aunque suelen ser bastante elevadas, pueden
variar de acuerdo con la edad del paciente, el serotipo del microorganismo o el
estadio clínico de la enfermedad.

d. PRUEBAS DE PRECIPITACIÓN

Las pruebas de precipitación miden la cantidad de antígeno o de anticuerpo en

los líquidos corporales a partir del grado de precipitación visible de complejos de
antígeno-anticuerpo dentro de un gel de agarosa o en solución. Hay muchos tipos
de pruebas de precipitación (p. ej., doble difusión de Ouchterlony, contra
inmunoelectroforesis), pero sus aplicaciones son limitadas.

En general, una muestra de sangre se mezcla con un antígeno de prueba para

detectar los anticuerpos del paciente, en general cuando se sospecha una
infección micótica o una meningitis piógena. Para obtener un resultado positivo,
se requiere una gran cantidad de anticuerpo o de antígeno, y por ello la
sensibilidad es baja.
 e. PRUEBA DE INMUNOTRANSFERENCIA DE WESTERN

La prueba de Western blot detecta anticuerpos contra el microorganismo en una

muestra del paciente (que puede ser suero u otro líquido corporal) mediante su
reacción con antígenos blanco (p. ej., componentes virales) que se hallan
inmovilizados en una membrana mediante electrotransferencia.

La inmunotransferencia de Western suele tener una buena sensibilidad, aunque

menor a la de las pruebas de cribado como el ELISA, y generalmente su
especificidad es elevada. Por ello, suele utilizársela para confirmar un resultado
positivo obtenido con una prueba de cribado.

Las modificaciones técnicas del procedimiento de Western blot son

• El inmunoensayo lineal (LIA)

• Ensayo de inmunotransferencia recombinante (RIBA), que utiliza antígenos
sintéticos o recombinantes

Los ensayos de inmunocromatografía, que pueden evaluar rápidamente las

muestras para detectar los antígenos microbianos específicos o los anticuerpos
del paciente

De los tres, el ensayo inmunocromatográfico es el más fácil de hacer, y el que se

utiliza con mayor frecuencia, p. ej., para detectar los microorganismos productores
de shigatoxina, el antígeno capsular de Cryptococcus neoformans y el virus de la
influenza.

III. RESPUESTA AUTOINMUNE

APROXIMACIÓN DE LABORATORIO EN EL ESTUDIO DE INMUNODEFICIENCIAS

Las inmunodeficiencias corresponden a alteraciones del sistema inmune en las

cuales puede existir un defecto primario de origen genético o bien un defecto
secundario dado por diversos factores ambientales como infecciones virales,
enfermedades metabólicas, situaciones de estrés, etc.
El estudio de laboratorio asociado a estas patologías consiste en la medición
cuantitativa y en algunas ocasiones funcional de distintos componentes del
sistema inmune. A continuación, se describen los de uso más frecuente.

Recuento de inmunoglobulinas séricas (IgG, IgA, IgM)

El estudio de laboratorio de las inmunodeficiencias asociadas a anticuerpos puede

comenzar con el recuento de inmunoglobulinas séricas, siendo posible medir IgA,
IgM e IgG séricas de forma rutinaria en muchos laboratorios.

Actualmente existen varias técnicas que permiten la medición de estas proteínas

plasmáticas, siendo la nefelometría la más recomendada.

La nefelometría mide la dispersión de la luz, a medida que un analito está en

mayor concentración, la dispersión será mayor, permitiendo, a través de un cálculo
de álgebra analítica, determinar la concentración de la sustancia.

Al momento de solicitar el recuento de inmunoglobulinas, es necesario recordar

que los anticuerpos se distribuyen en los líquidos biológicos por todo el cuerpo,
por tanto, las formas secretadas que se encuentran en el plasma sólo
corresponden a una fracción del total, a pesar de esto, diversos estudios han
reflejado que se correlacionan de forma adecuada con la producción total de
inmunoglobulinas del ser humano. Un adulto sano de 70kg produce
aproximadamente 2 a 3 grs. de anticuerpos todos los días, en plasma la IgG se
encuentra en mayor concentración y corresponde a la más importante en la
respuesta a infecciones, le sigue IgA la cual tiene rol crucial en la inmunidad de
mucosas y finalmente IgM con la menor concentración plasmática, pero es la
primera en elevarse en infecciones agudas.

De esta forma, en la evaluación de inmunodeficiencias asociadas a anticuerpos la

evidencia avala la medición de inmunoglobulinas en plasma como el examen más
adecuado al momento de sospechar déficit de anticuerpos, siendo de utilidad
diagnóstica en patologías como agamaglobulinemia ligada a X (De Brutton),
inmunodeficiencia común variable, déficit de IgA, entre otras.
Por otra parte, es posible medir subclases de IgG, anticuerpos específicos en
respuesta a vacunas, tales como los anticuerpos anti-Neumococo, sin embargo,
se solicitan en casos especiales y con una fuerte sospecha diagnóstica por lo que
no están considerados en la evaluación inicial.

Además, es posible medir niveles de IgE total, la cual revisaremos en detalle en

otro acápite de esta revisión, sin embargo, vale la pena mencionar que existen
inmunodeficiencias asociadas a elevación de esta inmunoglobulina, los llamados
síndromes Hiper-IgE asociados a infecciones bacterianas recurrentes y dermatitis.

Existen exámenes de laboratorio que permiten medir IgA secretora en mucosa

oral. Sin embargo, éstos no tienen buen rendimiento ni adecuada correlación con
inmunodeficiencias.

TABLA 1. RANGOS DE NORMALIDAD PARA INMUNOGLOBULINAS SÉRICAS EN

MAYORES DE 18 AÑOS

Inmunoglobulina Rango de normalidad

IgG 580 a 1540 mg/dl
IgA 64 a 297 mg/dl
IgM 75 a 230 mg/dl

Nota: Los rangos de normalidad son aproximados y dependen de varios factores

como edad, sexo y raza.

Inmunofenotipo de poblaciones y subpoblaciones linfocitarias por citometría de

flujo

Para evaluar las inmunodeficiencias asociadas a un déficit de la inmunidad celular

es posible cuantificar las distintas poblaciones de linfocitos, así como las
subpoblaciones de linfocitos T mediante el uso de la citometría de flujo.

La citometría de flujo es una técnica de análisis celular multi-paramétrico en la

que -mediante tamaño celular y complejidad interna de la célula- es posible
distinguir distintos tipos celulares, por ejemplo, linfocitos, polimorfonucleares y
monocitos. Además, mediante anticuerpos marcados con fluorocromos dirigidos
contra distintos clústeres de diferenciación (CD) de la superficie celular es posible
diferenciar distintas subpoblaciones linfocitarias, siendo las más utilizadas en la
evaluación de inmunodeficiencias los linfocitos B (CD19+), linfocitos T citotóxicos
(CD8+), linfocitos T Helper (CD4+) y linfocitos naturales killer (CD16+/CD56+).

El estudio de las distintas poblaciones linfocitarias por citometría de flujo, está

recomendado para el estudio de inmunodeficiencias primarias combinadas
severas en recién nacidos y lactantes pequeños, evaluación de linfocitos T CD4+
en el diagnóstico y seguimiento de pacientes VIH+, linfopenia T CD4+ idiopática,
entre otras.

Mención especial requiere la evaluación inmunológica en personas viviendo con

VIH, pues una de las características más relevantes en la patogenia de la infección
es la depleción de los linfocitos T CD4+ durante el avance de la enfermedad y el
aumento de los linfocitos T CD8+ en respuesta a la infección viral.

La medición de subpoblaciones de linfocitos T Helper CD4+ y Linfocitos T

citotóxicos CD8+, permite al momento del diagnóstico clasificar al enfermo en tres
estadios lo que tiene relevancia clínica y pronóstica, pues a medida que
disminuyen los Linfocitos T CD4+, aumenta el riesgo de infecciones oportunistas,
siendo el riesgo mayor con linfocitos T CD4+ menores a 200 cel/ml. Por otra parte,
se produce un aumento en el número de linfocitos T citotóxicos CD8+, lo que
produce una inversión en el índice CD4+/CD8+, que normalmente es 2 a 1. En el
seguimiento también es relevante las subpoblaciones linfocitarias T CD4+ y CD8+
pues con la terapia antirretroviral altamente efectiva los linfocitos T CD4+
comienzan a subir y el número de linfocitos T CD8+ tiende a normalizarse, esto se
traduce en la restauración del sistema inmunológico y en la disminución del
riesgo de infecciones.
 Tabla 2. Clasificación CDC para pacientes VIH

Categorías clínicas
Categoría según CD4
A B C
1 ≥ 500 cel/mm3 A1 B1 C1*
2 200-499 cel/mm3 A2 B2 C2*
3 < 200 cel/mm3 A3* B3* C3*

* SIDA.

APROXIMACIÓN DE LABORATORIO EN EL ESTUDIO DE ENFERMEDADES

AUTOINMUNES

Las enfermedades autoinmunes constituyen un grupo heterogéneo de

patologías, con manifestaciones clínicas diversas. En este contexto el estudio de
laboratorio constituye un complemento importante después de haber realizado
una completa anamnesis y examen físico.

Anticuerpos anti nucleocitoplasmáticos (ANA)

Son autoanticuerpos dirigidos contra componentes nucleares: dsDNA, histonas y

ribonucleoproteínas. Son muy sensibles en la pesquisa de patologías
autoinmunes, pero poco específicos; encontrándose positivos en distintas
enfermedades e incluso, en pacientes sanos.

La técnica de elección para su estudio es la inmunofluorescencia indirecta (IFI) en

células HEP-2, observándose distintos patrones de tinción fluorescente. Estos
patrones orientan a la estructura celular afectada y a distintas patologías
autoinmunes. Del mismo modo, se efectúa una dilución seriada de la muestra
(titulación), con el fin de determinar de forma indirecta la cantidad de auto-
anticuerpo presente. El informe del examen se realiza describiendo el título y
patrón de fluorescencia observado y su ubicación nuclear y/o citoplasmática.
 TABLA 3. PATRONES DE INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA EN ANA

Patrón Patología asociada

LES, Artritis Idiopática Juvenil, Cirrosis
Homogéneo
Biliar Primaria, entre otras.
Moteado Síndrome de Sjögren, LES.
Esclerosis Sistémica Variedad Limitada,
Centrómero
NUCLEAR Cirrosis Biliar Primaria
Nucleolar Esclerosis Sistémica
Baja especificidad
Aparato mitótico Centríolo: Esclerosis sistémica
Puente intercelular: LES, EMTC
Asociado a Anticuerpos anti-
Moteado
mitocondriales de Cirrosis Biliar
Reticular
Primaria
CITOPLASMÁTICO Asociado a anticuerpos anti p-
Moteado
ribosomal, presentes en LES
Granular Fino
neurológico
Fibrilar Asociado a enfermedades hepáticas

En población sana hasta un 33% de las personas puede resultar con un ANA
positivo a una dilución de 1/40, por tanto, es considerada la dilución de trabajo
inicial. Sin embargo, estudios han demostrado que una dilución ≥ 1/160 se observa
sólo en 5% de la población sana, por lo tanto, este título tiene mayor relevancia
clínica en el diagnóstico de una patología autoinmune.

Otra característica importante de los ANA, es que pueden detectarse años antes
de las manifestaciones clínicas de un lupus eritematoso sistémico (1 a 2.5 años).

Además, si bien son criterio diagnóstico de LES, Hepatitis Autoinmune y

enfermedad mixta del tejido conectivo, su título no se asocia a gravedad de la
enfermedad y no se aconseja su uso en el seguimiento.
 TABLA 4. UTILIDAD DE ANA EN DIVERSAS PATOLOGÍAS

Condiciones asociadas a ANA positivo

Muy útil en el diagnóstico de:
- LES
- Esclerosis sistémica
Algo útil en el dignóstico de:
- Síndrome de Sjögren
- Polimiositis-dermatomiositis
Muy útil para el diagnóstico y pronóstico de:
- Artritis idiopática juvenil
- Fenómeno de Raynaud
Parte crítica para el diagnóstico de:
- Lupus asociado a drogas
- Enfermedad mixta del tejido conectivo
- Hepatitis autoinmune
No es útil ni se ha probado su valor para el
diagnóstico, monitorización o pronóstico de:
- Artritis reumatoide
- Esclerosis Múltiple
- Enfermedad tiroidea
- Enfermedades infecciosas
- Púrpura trombocitopénico autoinmune
- Fibromialgia.

Anticuerpos anti-DNA de doble hebra (Anti dsDNA)

La medición de estos autoanticuerpos se utiliza en la evaluación y manejo de

pacientes con lupus eritematoso sistémico (LES). Están dirigidos contra el DNA de
doble hebra (nativo), el cual está presente en el núcleo celular. Su presencia se
puede sospechar al tener ANA positivo patrón nuclear homogéneo y su detección
en forma dirigida se puede realizar por varias técnicas.
Radioinmunoensayo (Farr): estándar de oro, permite detectar anticuerpos de alta
afinidad mediante radioactividad. Tiene una alta sensibilidad y especificidad, pero
es un método caro y potencialmente peligroso para el operador.

En la actualidad las dos técnicas más utilizadas son: Inmunofluorescencia

indirecta (IFI) en Crithidia lucilae y ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay).

La IFI en Crithidia lucilae, hemoflagelado unicelular, muestra tinción del

quinetoplasto que corresponde a una estructura celular que sólo contiene dsDNA.
Esta técnica es comparable en sensibilidad y especificidad al ensayo de Farr.

La medición por ELISA se informa según UI/ml y los valores de corte dependen de
los reactivos utilizados en cada laboratorio. En pacientes con LES se encuentra
positivo en 70 a 80% de los casos y sus niveles se correlacionan muy bien con
enfermedad renal activa y bastante bien con actividad de la enfermedad en forma
general.

En relación con la sensibilidad y especificidad de cada ensayo es importante

mencionar que la IFI en Crithidia lucilae y el ensayo Farr son altamente específicos
(98-99%), en cambio la técnica de ELISA es menos especifica (70%), por lo tanto, se
recomienda que al momento del diagnóstico de LES el resultado de Anti-dsDNA
por ELISA sea confirmado por IFI o Farr. Posteriormente, el seguimiento de la
enfermedad se puede realizar solo con Anti-dsDNA por ELISA.

ANTICUERPOS CONTRA ANTÍGENOS EXTRACTABLES DEL NÚCLEO (ENA)

Son auto-anticuerpos contra proteínas no histonas, asociados a RNA;

generalmente en el núcleo. Debido a la localización de estos antígenos, suelen
relacionarse a distintos patrones de ANA en inmunofluorescencia. El nombre ENA,
deriva de que estos antígenos pueden extraerse con soluciones salinas de baja
fuerza iónica. El examen se divide en dos: screening (tamizaje) y profile (perfil);
ambos se realizan mediante técnica de ELISA.

Otras técnicas disponibles son inmunoblot, blot en línea y citometría de flujo.

En la técnica de tamizaje se realiza una detección general de estos auto-
anticuerpos, el punto de corte depende del laboratorio, y el resultado se informa
en UI/ml, pero sin especificar qué auto-anticuerpo está positivo.

En cambio, en el perfil ENA se detecta la presencia y se mide la concentración de

cada auto-anticuerpo. En el laboratorio clínico, usualmente se examina: Anti-SM,
Anti-RNP, Anti- SSA (Ro), Anti-SSB (La), Anti Scl-70, anti-Jo-1. El punto de corte
depende de los reactivos utilizados. La positividad de cualquiera de estos
anticuerpos orienta a distintas patologías autoinmunes, teniendo valor
diagnóstico y pronóstico.

Anti-SM (sn-RNP, spliceosoma): Este anticuerpo da un patrón nuclear moteado (a

veces homogéneo) en los ANA. Su principal asociación clínica es con LES, pues
está presente en 15 a 30% de los casos, con especificidad cercana a 100%. Se asocia
a mayor actividad y severidad de la afectación renal, pero no desaparece cuando
el paciente entra en remisión. Puede preceder la aparición de los síntomas de LES
6 meses a 1 año. El 80% de las ocasiones, se encuentra asociado al anticuerpo anti
RNP (ribonucleoprotreínas), ya que ambos comparten epítopos.

Anti-RNP o Anti-SM-RNP (Anti-ribonucleoproteína): Este anticuerpo da un patrón

moteado en los ANA y su principal epítopo reconocido es U1. Se encuentra en casi
100% de los pacientes con enfermedad mixta del tejido conectivo. También puede
estar presente en un 25-47% de los pacientes con LES, en un 24% de los pacientes
con polimiositis o esclerodermia, en un 2-4% de los pacientes con esclerosis
sistémica y en un porcentaje menor en aquellos con fenómeno de raynaud.

Anti-SSA (Ro): Puede dar un patrón nuclear moteado fino en los ANA, pero en caso
de ausencia de positividad ANA, no se puede descartar su presencia. Este
anticuerpo se dirige contra dos proteínas distintas: Ro52 y Ro60. En un 50% de los
casos se encuentra asociado a Anti-SSB (La). Su importancia radica en la alta
asociación con síndrome de Sjögren, ya que está presente desde un 60 a 97%
según la cohorte estudiada, además puede aparecer cuatro años antes de los
síntomas del sindrome de Sjögren.
Por otro lado, se observa en LES en un 25-30% de los casos; el clínico debe saber
que este auto-anticuerpo se asocia, junto a anti SSB (La) a la aparición del “lupus
neonatal”, que se produce por traspaso de anticuerpos de la madre al feto durante
el embarazo. El principal compromiso observado en estos niños es el cardíaco,
específicamente el bloqueo auriculo- ventricular completo, por un daño directo
de los auto-anticuerpos sobre las vías de conducción cardiaca fetales,
principalmente entre las 18-26 semanas. El riesgo de que el primer hijo de una
madre portadora presente este cuadro es de 2-3%. Pero una vez ocurrido el primer
caso, el riesgo asciende hasta un 16%. Debido a que la mayor parte de las madres
Ro (+) son asintomáticas, en el caso de bloqueo AV neonatal, miocarditis,
alargamiento QT o LES neonatal, se sugiere realizar un perfil ENA a la madre.

Anti-SSB (La): Auto-anticuerpo contra RNA polimerasa III, coexiste con Anti-Ro;
por lo que se considera que La es un epítopo por expansión. Este anticuerpo se
encuentra presente en un 75-90% de los casos de lupus neonatal. Se observa en el
síndrome de Sjögren en un 75-90% y se correlaciona con mayor compromiso
extraglandular, principalmente renal, pulmonar y hepático. Además, está
presente en un 6-35% de los pacientes con LES, asociándose al sindrome de
Sjögren secundario. Precede de 2,5 a 3,2 años a los síntomas de LES y al igual que
anti-Ro, precede cuatro años a los síntomas clínicos del sindrome de Sjögren.

Anti-SCL70: Este auto-anticuerpo está dirigido contra la topoisomerasa I del ADN.

Su importancia radica en su alta asociación (70%) con esclerosis sistémica
variedad difusa y al 36% de los casos de esclerosis sistémica variedad limitada; con
una especificidad cercana al 100%. Se ha observado que, desde la aparición del
fenómeno de Raynaud hasta el diagnóstico de esclerosis sistémica transcurren en
promedio 2,4 años. La presencia de este anticuerpo se asocia a mayor riesgo de
enfermedad pulmonar intersticial, afectación articular y muscular, crisis renal
hipertensiva y proteinuria. Debido a esto, es un marcador de mal pronóstico y
menor supervivencia. Los títulos suelen asociarse a la actividad de la enfermedad,
pero no se recomienda su uso para seguimiento. Generalmente se considera que
es mutuamente excluyente con el anticuerpo anti-centrómero, también presente
en ES; pero en un estudio de 2002, de 5423 pacientes con esclerosis sistémica, 30
tenían ambos anticuerpos (0.52%), lo que asoció a presentación difusa con mayor
afectación cutánea y visceral.

Anti-Jo-1: A diferencia de los otros anticuerpos descritos, éste se encuentra dirigido

contra la histidil-tRNA sintetasa y se asocia a un patrón citoplasmático granular
fino en ANA. Su presencia se observa en un síndrome denominado “Síndrome
anti-sintetasa” en que coexisten: miositis, enfermedad pulmonar intersticial,
artritis/artralgias, fenómeno de raynaud y lesiones cutáneas hiperqueratósicas,
escamosas y fisurada en manos, denominadas “mano de mecánico”. Presente en
un 90% de los pacientes con enfermedad pulmonar intersticial, a un 20% de las
polimiositis/dermatomiosistis; además que es un factor predictor de mala
respuesta al tratamiento y alta mortalidad.

Tabla 5. Relación entre los patrones de ANA en IFI y los auto- anticuerpos ENA
observados en distintas patologías

Patrón ANA
Sospecha Homogén Moteado Nucleolar Centróme Citoplasmáti
clínica eo ro co
LES dsDNA, Sm, SSA, - - Proteínas P
Sm, SSA, SSB ribosomal
histonas
Sd. Sjögren - SSA-SSB - - -
Esclerosis Scl-70 Scl-70, U1- Fibrilarina, CENP-B -
Sistémica RNP, Ku, T0/Th,
RNA- RNA-
polimerasa polimeras
III a I,
PM/SCL
 Miositis - Ku-Mi-2 PM/SCL - Jo-1, PLA-7,
PLA12, SRP
Síndromes dsDNA, U1-RNP, PM; /SCL CENP-B Jo-1
de Sm, SSA, SCL70, Ku,
superposici SCL70 Sm, SSA,
ón SSB,

Anticuerpos Anticitoplasma de Neutrófilo

Corresponden a auto-anticuerpos dirigidos contra antígenos propios que se

encuentran en los gránulos citoplasmáticos de neutrófilos y monocitos.

Se detectan en forma cualitativa por Inmunofluorescencia Indirecta (IFI) en

neutrófilos humanos con fijación de etanol y formalina. De manera cuantitativa
por técnica de enzimoinmunoensayo (ELISA) es posible medir auto-anticuerpos
anti-PR3 (Proteinasa-3) y anti-MPO (Mieloperoxidasa de neutrófilo).

Tabla 6. Patrones ANCA y patologías asociadas

Prevalencia según
Patrón ANCA Patología
enfermedad
c-ANCA (Anti- Granulomatosis de Wegener 70-95%
PR3+) Síndrome de Churg Strauss 30%
Poliangeítis microscópica 20-30%
Glomerulonefritis rápidamente 8%
progresiva
p-ANCA (Anti- Glomeruonefritis con semiluna 65%
MPO+) idiopática
Poliangeitis con granulomatosis 30-60%
eosinofílica
Poliangeitis microscópica 45-60%
Poliangeitis con granulomatosis 10-24%

En la IFI en neutrófilos humanos, se observan distintos patrones de fluorescencia

que determinan tres tipos de ANCA:
 ➢ c-ANCA: patrón citoplasmático
➢ p-ANCA: patrón perinuclear
➢ a-ANCA: patrón atípico

C-ANCA:

Fijados en etanol y formalina se observa una tinción citoplasmática de los

neutrófilos. En un 90% de los casos se asocia a anticuerpos anti-PR3, determinados
por ELISA. Otros antígenos pueden ser la elastasa, catepsina G y lactoferrina. Es
importante señalar que hasta un 2% de los casos puede presentar anti-MPO (+).

P-ANCA

En etanol se observa tinción perinuclear de los neutrófilos, cuando se realiza en

formalina, se observa fluorescencia citoplasmática, lo cual confirma el patrón p-
ANCA. En un 89-90% de los casos se asocia a anticuerpos anti-MPO medidos por
ELISA. Otros antígenos que se pueden observar son PR3, elastasa, lactoferrina,
catepsina G.

A-ANCA

Se observa un patrón atípico, que no tiene relación específica con anti-MPO o anti-
PR3. Se puede observar en vasculitis, pero también en infecciones crónicas,
enfermedad inflamatoria intestinal, neoplasias, drogas entre otras. En estos casos
se sugiere descartar sobre-posición con ANA.

Factor Reumatoide (FR) y Anticuerpos Anti-Péptido Citrulinado Cíclico (Anti-CCP)

Factor Reumatoide corresponden a auto-anticuerpos dirigidos contra el

fragmento Fc de una IgG, la más frecuente es de tipo IgM, pero se han descrito
también del tipo IgG e IgA.

Las técnicas más frecuentes para su medición son enzimoinmunoensayos,

nefelometría o aglutinación por látex. En esta última, se recubren partículas de
látex con anticuerpos IgG humanos que luego son enfrentados al suero del
paciente, si este suero tiene anticuerpos que reconocen los fragmentos Fc, habrá
aglutinación de las partículas de látex visible a simple vista. Se informa en títulos o
en UI/ml dependiendo la técnica utilizada.

La medición de FR clásicamente se asocia al diagnóstico de artritis reumatoide

(AR), donde 75% a 90% presenta un FR positivo para IgM en títulos generalmente
mayores a 20 UI/ml. Sin embargo, puede estar presente en otras enfermedades
reumatológicas como síndrome de Sjögren, enfermedad mixta del tejido
conectivo, LES, entre otras; además en infecciones crónicas como tuberculosis,
endocarditis bacteriana, sarcoidosis, lepra, etc. Por último, es posible encontrarlo
en población joven sana hasta en un 5% a títulos bajos, elevándose a 20% en
mayores de 60 años.

Lo anterior refleja lo poco específico del factor reumatoide en el diagnóstico de

AR, por eso en la actualidad existe otro auto- anticuerpo llamado anti-péptido
citrulinado cíclico mucho más específico para el diagnóstico de artritis
reumatoide en forma precoz.

Los anti-CCP se miden a través de técnica de ELISA, se presentan en forma precoz

en artritis erosiva y son altamente específicos (>90%) de AR, pudiendo estar
presente incluso en AR seronegativas, además corresponden a un marcador
pronóstico y de agresividad. Sin embargo, no son exclusivos de AR, están
presentes en baja concentración en síndrome de Sjögren (10%), tuberculosis (7-
30%), artritis psoriática (8-16%), entre otras.

APROXIMACIÓN BÁSICA DE LABORATORIO EN EL ESTUDIO DE

ENFERMEDADES ALÉRGICAS

Las enfermedades alérgicas han mostrado un aumento importante en las últimas

décadas, el estudio de estas enfermedades tiene varias aristas dependiendo el tipo
de manifestación clínica del paciente.
Para optimizar los exámenes complementarios es necesario distinguir entre
reacciones de hipersensibilidad inmediata, es decir IgE mediadas y las reacciones
por hipersensibilidad retardada mediada por inmunidad celular.

Además, dado las características inmunopatológicas de estas enfermedades,

existe la posibilidad de realizar estudio alergológico in vivo (prick test, test de
parche, entre otros) e in vitro. A continuación, se describen los exámenes de
laboratorio de inmunología in vitro de uso frecuente en el estudio de patologías
alérgicas.

Cuantificación de Inmunoglobulina E (IgE) total

La IgE total sérica se puede medir por diversas técnicas: turbidimetría,

nefelometría, ELISA. Y su reporte se puede hacer en Unidades Internacionales (UI)
o nanogramos (ng) por ml (1 IU/mL=2.44ng/mL).

Su concentración va aumentada con la edad, siendo el valor normal en adultos

menor a 100 ng/ml, sin embargo, es importante destacar que cada técnica
utilizada entrega valores propios de normalidad.

Su elevación nos refiere que el paciente puede tener una condición atópica, sin
embargo, no es específico porque es posible encontrarla elevada en otras
condiciones tales como desórdenes linfoproliferativos, parasitosis, infecciones
como VIH, inmunodeficiencias primarias entre otras. Además, si está en rangos de
normalidad no excluye el diagnóstico de alergia.

Tiene utilidad específica en la sospecha y seguimiento de aspergilosis

broncopulmonar alérgica y para evaluar a los candidatos a terapia con anticuerpo
monoclonal anti IgE (Omalizumab).

Además, es importante solicitarla al momento de evaluar IgE específica, pues

valores muy elevados pueden arrojar resultados falsos positivos.

IgE alérgeno específica

Es el marcador serológico de elección para confirmar sensibilización alérgica en
pacientes con historia sugerente y en los cuales no es posible el estudio in
vivo con prick tests, tales como enfermedad generalizada de la piel, riesgo elevado
de anafilaxia o cuando los pacientes están recibiendo tratamientos que no es
posible suspender y que suprimen o interfieren la respuesta cutánea
(antihistamínicos, antidepresivos tricíclicos, entre otros).

La primera técnica utilizada en su medición fue RAST (radioallergosorbent test),

sin embargo, actualmente existen múltiples ensayos basados en el concepto de
inmunoadsorción. Esto significa que la IgE específica de interés se une al alérgeno
en cuestión que se encuentra unido a una fase sólida o bien libre y luego de que
se une la IgE específica se acopla a una fase sólida, de esta manera por lavado se
elimina el resto de las proteínas e IgE que no se unió en forma específica al
alérgeno pegado a la fase sólida. Luego la IgE unida al alérgeno se cuantifica
utilizando una anti-IgE humana monoclonal marcada con alguna sustancia que
permita su medición (fluorocromo, enzima-ligando, radioisótopo).

Actualmente los ensayos de elección son los de tercera generación cuantitativos

como ImmunoCAP e Immulite 2000.

La sensibilidad promedio de este test es de 70 a 75%, comparado con las pruebas

cutáneas in vivo (prick test) y con los test de provocación alérgeno específicos que
corresponden al estándar de oro. En este contexto su interpretación requiere una
adecuada correlación temporal y clínica con el alérgeno sospechoso.

Triptasa sérica

Su principal utilidad está dada para evaluar las reacciones anafilácticas y en el

estudio de mastocitosis.

La triptasa es producida por mastocitos y basófilos, sin embargo, los mastocitos

contienen 500 veces más que los basófilos. Cuando los mastocitos se degranulan
se libera en forma inmediata triptasa e histamina al medio extracelular. La
medición de histamina es compleja pues se degrada rápidamente en cambio la
triptasa es posible medirla entre 15 minutos hasta cuatro horas después de los
síntomas de anafilaxia.

Existe dos formas: α-triptasa y β-triptasa, la primera es secretada en forma

espontánea por mastocitos y se encuentra elevada en mastocitosis, la segunda es
liberada cuando el mastocito se degranula y se detecta en forma predominante
entre los 15 minutos a dos horas de la reacción anafiláctica.

Comercialmente existe un ensayo de “ImmunoCAP triptasa” que mide ambas

formas en combinación, es decir triptasa total.

En la mayoría de los individuos el valor normal es menor a 5ug/L, sin embargo, el

límite superior normal es 11,4 ug/L, niveles superiores han sido reportados por
varios autores en casos de muerte por anafilaxia.

APROXIMACIÓN DE LABORATORIO EN EL ESTUDIO DE ENFERMEDADES QUE

AFECTAN AL SISTEMA HEMATOPOYÉTICO Y A LOS TEJIDOS LINFOIDES

Las enfermedades que afectan al sistema hematopoyético y a los tejidos linfoides

incluyen linfomas, leucemias, discrasias de células plasmáticas, síndromes
mieloproliferativos entre otros. En este sentido el laboratorio de inmunología
ofrece algunas herramientas que colaboran en la pesquisa, diagnóstico y
seguimiento de algunas de estas patologías. A continuación, se ilustran de
manera general los exámenes más relevantes.

Electroforesis de proteínas e inmunofijación

Corresponde a un estudio cualitativo y semi-cuantitativo de proteínas en distintos

líquidos biológicos tales como suero, orina y líquido cefalorraquídeo (LCR).

El principio básico de la electroforesis consiste en la migración de las moléculas a

través de un gel o matriz de naturaleza porosa, en el cual, por acción de un campo
eléctrico serán separadas de acuerdo a su carga eléctrica y peso molecular. Para
observar el avance y la separación de las moléculas en la matriz y establecer un
patrón de fragmentos, las moléculas son teñidas con diferentes colorantes. Estos
pasos facilitan la visualización de las moléculas a manera de simples bandas, luego
es posible realizar una medición semi-cuantitativa a través de un scanner
densitómetro que mide el grosor de la banda electroforética y gracias a
un software en donde se ingresa el valor de las proteínas totales en el suero
analizado (rango normal entre 6,5 a 8g/dl) se realiza un cálculo matemático que
entrega un valor aproximado de cada banda electroforética.

Figura 1. Representación esquemática del proceso de electroforesis.

La electroforesis de proteínas en suero en gel de agarosa clásicamente muestra 5

bandas proteicas: albúmina, fracción α1-globulinas, fracción α2-globulinas,
fracción β-globulinas y fracción g-globulinas.

Albumina: es la fracción más homogénea y la principal proteína del suero, es

sintetizada en el hígado y en la electroforesis se puede observar disminuida
(≤3,5g/dl) en diversos trastornos, tales como inflamación aguda, desnutrición
proteica, nefropatías y enteropatías perdedoras de proteínas, entre otras.

Las fracciones α1, α2, β y g-globulinas son un grupo de diversas proteínas con
funciones biológicas variables que proveen información importante sobre varias
enfermedades órgano-específicas.

Fracción α1: encontramos antitripsina que se puede encontrar disminuida por una
alteración genética que se manifiesta como EPOC de inicio precoz o bien puede
estar aumentada en reacciones de fase aguda (inflamación aguda).

Fracción α2: destaca α2-macroglobulina que aumenta en síndrome nefrótico y

haptoglobina que disminuye en hemólisis, déficit de B12 y déficit de folatos.

Región β: destaca transferrina que aumenta en anemia ferropénica.

Región g: clásicamente encontramos a las inmunoglobulinas (IgG, IgA, IgM, IgD e
IgE), sin embargo, en algunas ocasiones pueden migrar a la región β (sobre todo
IgA). Se pueden observar disminuidas globalmente en inmunodeficiencias
humorales o aumentadas en forma policlonal en inflamación crónica tal como
ocurre en enfermedades autoinmunes, VIH entre otras.

Actualmente la observación de un único peak estrecho en la región gamma de la

electroforesis en suero permite sospechar un aumento monoclonal de
gammaglobulinas (paraproteina). Este hallazgo corresponde a proteínas
electroforética y antigénicamente homogéneas, producidas por un único clon de
linfocito B/célula plasmática; que ha proliferado más allá de los mecanismos de
control.

Tabla 7. Descripción de patologías y otros hallazgos asociados a producción de

proteínas monoclonales

Células
Desorden de
Proteína plasmáticas
células Daño tisular Otros
Monoclonal clonales en
plasmáticas
medula ósea
Gammapatia
Sin evidencia de
monoclonal
otros
de <30 g/L <10% No
desórdenes
significado
linfoproliferativos
incierto
Mieloma
Múltiple ≥30 gr/L ≥10% No --
Silente
Si: Hiperviscosidad,
≥90% por
hipercalcemia, amiloidosis,
Mieloma En suero y citometría de
insuficiencia infecciones
Múltiple orina flujo o
renal, anemia, bacterianas
plasmocitoma
lesiones óseas recurrentes
La sospecha de un peak monoclonal en la región gamma es de gran utilidad pues
constituye una herramienta en el diagnóstico y monitorización del tratamiento de
gammapatías monoclonales malignas. Además, permite el seguimiento de la
evolución de componentes monoclonales de significado indeterminado. Por todo
lo anterior es considerado un examen de primera línea en el estudio de las
discrasias de células plasmáticas. Sin embargo, este examen debe solicitarse en
combinación con inmunofijación, el cual permite confirmar la monoclonalidad y
caracterizar el tipo de cadena pesada y liviana que compone la paraproteína.

Inmunofijación

Permite identificar la paraproteína específica de un patrón monoclonal. La técnica

consiste en realizar una electroforesis tradicional en suero seguido de un marcaje
con un antisuero específico contra las cadenas pesadas de IgG, IgA, IgM, IgE, IgD
más las dos cadenas livianas kappa y lamba; luego una tinción específica para
revelar las bandas reconocidas.

Generalmente como tamizaje (99%) se realiza marcaje solo para: IgG, IgA, IgM,
kappa y lambda. En casos específicos (<1%) el laboratorio y/o médico tratante
solicita marcaje de IgE e IgD.

El informe es de carácter cualitativo describiendo el tipo de banda monoclonal

encontrada.

Tanto la electroforesis como la inmunofijación se pueden realizar en orina si la

sospecha de neoplasia de células plasmáticas es alta, de esta manera se mejora el
rendimiento de estos exámenes.

Cadenas livianas libres

La mayoría de los desórdenes proliferativos de células plasmáticas presentan

exceso de producción de cadenas livianas libres de inmunoglobulinas.
Tradicionalmente la electroforesis e inmunofijación en suero y orina han sido el
estándar de oro para la pesquisa de estos desordenes, además clásicamente las
cadenas livianas se pueden detectar como cadenas libres excretadas en orina lo
que es ampliamente conocido como “Proteinuria de Bence Jones”, pero este
método se encuentra limitado por la función renal, además que requiere la
recolección de orina de 24 horas. Por otra parte, un 15-20% de los pacientes con
mieloma múltiple, sólo producen cadenas livianas libres monoclonales, las cuales
pueden no ser detectadas por la electroforesis.

En la actualidad se han desarrollado sistemas que permiten detectar estas

cadenas livianas libres en suero mediante nefelometría o turbidimetría.

Esta técnica permite detectar cadenas livianas con mayor sensibilidad (hasta
1mg/L), cuantificarlas y calcular la razón kappa/lamba (k/ℓ). Para poder realizar una
diferenciación con las gammapatías monoclonales, se utiliza la relación k/ℓ, cuyo
valor normal fluctúa entre 0,26 a 1,65. Un índice k/ℓ alterado orienta a producción
clonal de cadenas livianas, así proporciones mayores de 1,65 orientan a un exceso
de cadena liviana k y un índice menor que 0,26 refleja un exceso de cadena liviana
libre lamda.

Actualmente las cadenas livianas libres en suero forman parte del tamizaje
diagnóstico de las gammapatías monoclonales además permiten identificar
factores de riesgo para progresión y realizar seguimiento de la remisión temprana
de la enfermedad.