UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BAJA CALIFORNIA

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS E INGENIERÍA

LABORATORIO DE BIOQUIMICA METABOLICA

PRÁCTCA NO. 1

FERMENTACION

OBJETIVO:

Que el alumno logre observar la producción de CO₂ durante el proceso de fermentación in vitro,
comparando con condiciones de ausencia de sustrato y la presencia de un inhibidor de la fermentación.

INTRODUCCIÓN:

Cuando se agrega levaduras a ciertos azucares, se produce una elevación a CO2 y alcohol
etílico. Esta reacción la cual se conoce desde tiempos remotos se denomina fermentación. Una
fermentación es una descomposición de una substancia orgánica, usualmente un carbohidrato producida
por un organismo vivo o por sus enzimas.

La reacción comúnmente se representa por la siguiente ecuación:

La fermentación de la D-glucosa a alcohol etílico y dióxido de carbono es un proceso de

respiración anaeróbico. Las reacciones intermedias involucradas en dicha fermentación se presentarán a
continuación:
La energía de activación para la oxidación de la glucosa, la suplen 2 moléculas de ATP. El
compuesto resultante, se transforma en 2 moléculas de gliceraldehido-3 fosfato (PGAL). Hasta ese paso,
se completan las reacciones de preparación. Las 2 moléculas de gliceraldehido-3 fosfato se oxidan con la
presencia de NAD⁺ para formar 2 moléculas de NADH 2. En esa misma reacción se introducen 2
moléculas de fosfato inorgánico y se adhieren a cada una de las 2 moléculas de 3 carbonos.
Luego, mediante una serie de reacciones, se producen 4 moléculas de ATP con una ganancia de
2 moléculas de ATP (puesto que al principio de la primera reacción, se consumieron 2).

El acido pirúvico así formado, mediante la fermentación anaeróbica puede oxidarse si se

encuentra presente oxigeno (no se muestran las reacciones). En ausencia de suficiente O₂ el ácido
pirúvico acepta hidrógenos del NADH₂ para formar CO₂ + EtOH en ciertos tipos de organismos y ácido
láctico en otros.

MATERIAL Y REACTIVOS:

 3 tubos de ensaye con rosca 16x150 mm

 Regla
 Papel milimétrico
 Solución de levaduras al 10%
 Solución de glucosa 10%
 Solución de Fluoruro de Sodio 10%
 Gradilla
 Cinta adhesiva
 Papel parafilm
  Balanza
 Probeta de 250 ml
 2 vasos de precipitado de 250 ml
 Pipetas transfer
 Espátula
 Parrilla
 Baño de agua
 Termómetro

PROCEDIMIENTO:

1. Marque respectivamente 3 tubos de ensaye con las letras A, B y C.

2. Preparare los tubos como se indica a continuación, utilizando una suspensión de levaduras, la
cual se deberá agitar antes de usar.

TUBO A: llene el tubo hasta una tercera parte de este con la suspensión de levadura. Adicione agua
destilada hasta llenar completamente el tubo.

TUBO B: llene una tercera parte con suspensión de levadura. Agregue la solución de glucosa hasta
llenar completamente el tubo.

TUBO C: llene una tercera parte del tubo con la suspensión de levadura. Agregue hasta las ⅔ partes
del tubo con la solución de glucosa. Adicione la solución de fluoruro de sodio hasta llenar
completamente el tubo.

3. Cierre los tubos sin apretarlos demasiado.

4. Invierta los tubos y colóquelos en una gradilla evitando el movimiento de los mismos.

5. Observe como se forma una pequeña burbuja de aire en la parte superior del tubo.

6. Si la burbuja de aire está presente, mida su longitud. Recuerde que la longitud se mide en
milímetros.

7. Coloque los 3 tubos de incubación en el baño de agua a una temperatura de 370C.

8. Examine los tubos a intervalos de 15 minutos y anote la longitud de todas las burbujas de aire,
conforme se vayan desarrollando y aumentando de tamaño.

9. Grafique los resultados.

CUESTIONARIO:

1.- Describa la influencia de la glucosa con relación al control según cada tubo
2.- Describa la influencia del NaF en el proceso de fermentación

3.- Describa el proceso que se llevo a cabo en la fermentación (principales reacciones)

4.- Mencione las 3 características principales de la glucólisis

5.- La ultima reacción del proceso de fermentación (Acido Piruvico) puede convertirse en acido láctico o
alcohol etílico y CO2. ¿En que casos se presentan dichas reacciones?

6.- Anexe grafica de los resultados.

DISCUSIONES DE RESULTADOS Y CONCLUSION:

REFERENCIAS:
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PRÁCTICA NO. 2
PRODUCCIÓN DE PIRUVATO Y ACETALDEHÍDO DURANTE LA FERMENTACIÓN DE GLUCOSA POR
LEVADURA

OBJETIVO:
Que el alumno haga patente la formación de piruvato y acetaldehído mediante la
fermentación de glucosa por acción de levaduras y determine su presencia, utilizando reacciones
específicas.
INTRODUCCIÓN:
La primera etapa del metabolismo de glucosa en levadura es la producción de piruvato.
Este proceso, que se efectúa mediante una serie de reacciones que involucran un número
considerable de intermediarios, se conoce como fermentación o glucólisis. La reacción total
podría considerarse como la transferencia de dos pares de átomos de hidrógeno de la glucosa al
NAD⁺ (ver figura). Puesto que la enzima se encuentra sólo en cantidades catalíticas, es
necesario reoxidarla para que el proceso no se suspenda y así, el NADH 2 formado es convertido
en NAD⁺ por oxígeno molecular a través de la cadena respiratoria. Esto no es posible en
condiciones anaerobias y en este caso la reoxidación se efectúa cuando el piruvato se convierte
en acetaldehído, y luego en alcohol tal como se muestra en la figura.
H2O Cadena respiratoria aeróbica ½ O2

2 NAD⁺ + C6H12O6 Glucólisis 2 NADH2 + 2 CH3COCOOH

Pirúvico
descarboxilasa
TPP MG++ Anaeróbico
2C2H5OH (deshidrogenasa 2CH 3CHO + CO2
alcohólica)
Oxidación aerobia y anaeróbica de glucosa por levadura.

Demostración de los intermediarios metabólicos

Los metabolitos de piruvato y acetaldehído se encuentran presentes normalmente en
muy bajas concentraciones, por tanto, para demostrar su existencia como intermediario en el
camino metabólico, es necesario impedir que sean transformados en otros compuestos. Este
procedimiento se usa mucho cuando se usan caminos metabólicos y se hace bloqueando la
enzima que cataliza la conversión del compuesto, que se está investigando mediante inhibidores.
También se pueden cambiar las condiciones fisiológicas para que la enzima funcione a una
velocidad muy por debajo de su actividad máxima, o se puede usar un agente que “atrape” el
intermediario y que forme un compuesto que no pueda metabolizarse. Estos dos últimos
métodos se ilustran en el procedimiento siguiente.
La priúvico-descarboxilasa (2-oxoácido carboxi-liasa, 4.1.1.1.) no es activa en soluciones
ligeramente alcalinas, de manera que el piruvato se acumula y su presencia puede demostrarse
por acción con nitroprusiato de sodio o 2,4-dinitrofenil hidrazina.
En el segundo experimento se añade a la mezcla de incubación sulfito de sodio, que
“atrapa” el acetaldehído. La presencia de acetaldehído puede demostrarse por el color azul
producido por la reacción con nitroprusiato de sodio y piperidina.
MATERIAL Y REACTIVOS:
 Fosfato de sodio dibásico (1 M)
 Fosfato de potasio monobásico (1 M)
  Solución de levadura al 10% en fosfato de sodio dibásico
 Solución de levadura al 10% en fosfato de potasio monobásico
 Solución de levadura al 10%en agua
 Solución de glucosa al 10%
 Solución de nitroprusiato de sodio al 5%
 Solución de hidróxido de sodio al 10%
 Solución de 2,4-dinitrofenilhidrazina, saturada en HCl concentrado
 Solución de ácido tricloroacético al 10%
 Baño de agua a 37º C
 Termómetro
 Parrilla eléctrica
 2 pipetas graduadas de 5 ml
 1 pipeta graduada de 1 ml
 Perilla
 10 tubos de ensaye 16x150 mm con rosca
 Balanza
 2 vasos de precipitado de 250 ml
 2 vasos de precipitado de 150 ml
 Probeta de 100 ml
 Probeta de 250 ml
 Pipetas transfer
 Espátula
 Amoniaco concentrado
 Sulfato de amonio
 Sulfito de sodio
 Piperidina acuosa

PROCEDIMIENTO:
Formación de piruvato a partir de glucosa
1. Marque dos tubos de ensaye como A y B, y pipetee 5 ml de la solución de glucosa en
cada uno.
2. Al tubo A agregue 5 ml de la suspensión de levadura en solución ligeramente alcalina de
fosfato de sodio dibásico
3. Al tubo B agregue 5 ml de la suspensión de levadura en solución ácida de fosfato de
potasio monobásico.
4. Coloque los tubos en un baño de agua a 37º C durante una hora
5. Luego añada a cada tubo 2 ml de la solución de ácido tricloroacético, mezcle
vigorosamente y centrifugue durante 10 minutos a 2500 g.
6. Separe el sobrenadante y utilícelo para la determinación de piruvato.
Determinación de piruvato mediante nitroprusiato de sodio (Método 1 para determinación de
piruvato)
1. En un tubo de ensaye agregue 2 ml del sobrenadante hervido previamente a un 1 gramo
de sulfato de amonio sólido.
2. Agregue 2 gotas de solución de nitroprusiato de sodio (50g/l) recién preparada, mezcle
vigorosamente y deje deslizar por las paredes del tubo amoníaco concentrado hasta que
se formen 2 capas.
3. Si hay piruvato, se forma un anillo azul o verde en la interface de los dos líquidos. La
formación de un anillo rosado transitorio en la interface indica la presencia de grupos
 tioles y con frecuencia se observa antes de la coloración azul o verdosa característica de
la reacción con piruvato.
Determinación de piruvato con 2, 4- dinitrofenilhidrazina (Método 2 para determinación de
piruvato)
1. Agregue 1 ml de solución saturada de 2,4-dinitrofenil hidrazina a 2 ml de sobrenadante,
mezcle fuertemente.
2. Coloque 2 o 3 gotas de la mezcla en un tubo de ensaye.
3. Agregue 1ml de solución de hidróxido de sodio (100g/L) y diluya con agua hasta 5 ml. La
formación de un color rojo indica la presencia de piruvato.
Formación de acetaldehído a partir de glucosa
1. En dos tubos marcados C y D pipetee 5 ml de la solución de glucosa.
2. Agregue a ambos tubos 5 ml de la suspensión de levadura en agua.
3. Al tubo D añada 0.5 g de sulfito de sodio.
4. Mezcle vigorosamente, incube los 2 tubos durante una hora a 37º C.
5. Centrifugue, separe el sobrenadante, mezcle 2 ml de sobrenadante con 0.5 ml de
solución fresca de nitroprusiato de sodio y 2 ml de piperidina acuosa y agite. Si hay
acetaldehído presente, se observará una coloración azul.
Reporte resultados de lo que observó en cada tubo
Tubo Observaciones
A1

B1

A2

B2

CUESTIONARIO:
1-. ¿Qué es una fermentación?
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2-. Describa con ecuaciones la vía aeróbica y anaeróbica la glucólisis.

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3-. ¿Por qué se empleó suspensión de levaduras en agua para la formación de acetaldehído?
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4-. ¿Qué diferencia observó en la determinación de piruvato con los 2 diferentes reactivos?
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DISCUSIÓN DE RESULTADOS Y CONCLUSIÓN

Referencias
Karlson, P. Introduction to modern biochemestry, 4 th. Edition N.Y. Academic Press, 1975.
Lehninger, A.L. Biochemestry, 2nd.Ed., N.Y. Worth, 1975
Stryer, L., Biochemestry, San Francisco, W.H. Freeman, 1975.
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LABORATORIO DE BIOQUIMICA METABOLICA

PRÁCTCA NO. 3: FOTOSINTESIS (1ª PARTE)

OBJETIVO:
Que el alumno identifique las reacciones bioquímicas que ocurren durante la fotosíntesis.

FOTOSINTESIS (1ª PARTE)

El carácter más importante por el cual las plantas verdes se diferencian de los animales, es la facultad de
elaborar sustancias orgánicas a partir de productos inorgánicos.
Uno de los elementos principales de todas las sustancias orgánicas es el carbono, de manera que para la
elaboración éstas, las plantas verdes necesitan de dicho elemento, el cual toman del aire, por ello
absorben el anhídrido carbónico del medio externo y en el interior de las células lo descomponen,
desprenden el oxígeno y fijan el carbono que se utiliza al combinarse con productos inorgánicos como el
agua y sales minerales, en la síntesis de sustancias orgánicas. Para que se efectúe la fotosíntesis no
solamente es indispensable el gas carbónico sino también el concurso de la clorofila y la presencia de la
luz.
En las plantas superiores la fotosíntesis es función exclusiva de los cloroplastos y tiene lugar en la hoja.
Según lo anterior se puede definir que el fenómeno fundamental de la fotosíntesis es la absorción de la
luz por la clorofila.
El fenómeno de la fotosíntesis supone dos reacciones, la primera necesita de la luz y la segunda no. La
primera reacción comprende fotofosforilación y fotólisis del agua, la segunda transcurre con fijación del
CO2 (dióxido de carbono) y formación de carbohidratos. Luego las reacciones químicas
intracelulares transforman parte de los carbohidratos en otras moléculas.

MATERIAL Y REACTIVOS
1.- 3 tubos de ensayo 16x150 mm con rosca
2.- Ramas de Elodea
3.- Solución de azul de bromotimol
4.- Papel aluminio
5.- Popotes
6.- Tijeras
7.- Pipetas transfer
8.-Lampara de escritorio con un foco de 75 watts

PRODUCCIÓN DEL DIÓXIDO DE CARBONO EN LA FOTOSÍNTESIS

1.- Marque 3 tubos de ensayo como A, B y C.
2.- Llene cada tubo aproximadamente a ⅔ partes con agua desionizada (libre de CO2).
3.- A cada tubo, agregue azul de bromotimol, gota por gota (mezclando con cada adición) hasta que el
agua quede verde o azul (deben requerirse 5 o menos gotas). El colorante azul de bromotimol es un
indicador para condiciones de pH en el agua. El color verde o azul indica condición básica, el color
amarillo indica una condición ácida.
4.- Use un popote para soplar el aliento (conteniendo dióxido de carbono) suavemente en las superficies
de los tubos A y B únicamente. Deje de soplar cuando la solución cambie a un color amarillo definitivo. El
tubo C funcionará como control (sin dióxido de carbono) PRECAUCION: Tener cuidado de no soplar
fuerte ya que esto ocasionará que la solución se les tire. Esta solución mancha la ropa.
5.- Corte 3 pedazos de la planta Elodea (aproximadamente de 1.5 pulgadas c/u) usando unas tijeras.
6.- Coloque los pedazos con la punta recién cortada hacia abajo cada uno en su tubo correspondiente.
7.- Cierre los 3 tubos. El tubo A tápelo complemente con papel aluminio.
8.- Ponga los tres tubos en un estante cerca de una fuente de luz fuerte (mantenga el tubo A cubierto).
9.- Observe los tubos B y C descubiertos, cada 10 min. Hasta que un cambio de color sea permanente.
10.- Descubra el tubo A y compare los 3 tubos por:
 a).- Cambios de color debidos a cambio en las condiciones del pH.
b).- Formación de burbujas de aire.

11.- Anote los resultados en la tabla

CAMBIOS DE COLOR
CONDICION Burbujas de aire
TUBO INICIAL FINAL
A OSCURIDAD

B LUZ

C LUZ
(CONTROL)

1. Usando estos datos determine cualquier cambio de pH que pueda haber ocurrido de acuerdo a
los cambios de color del indicador (paso 3)
Tubo A:

Tubo B:

Tubo C:

2. Su aliento conteniendo CO2, el cual fue soplado dentro del agua desionizada, reacciona para
formar ácido carbónico.

CO2 + H2O H2 CO3 HCO3 ¯ + H+

Si el CO2 fuera removido, ¿qué pasaría con el pH de las soluciones?

3. Usando esta información y las condiciones de pH, determine la presencia o ausencia de dióxido
de carbono en la siguiente Tabla:

Presencia de bióxido de carbono

TUBO CONDICIONES pH

Inicial Final Inicial Final

A OSCURIDAD
       

B LUZ
       
LUZ
C
(CONTROL)
       

4. ¿Qué relación puede establecer entre las plantas verdes (cloroplastos), luz y CO2?
 5. ¿Esta relación debe sugerir que la fuente esencial de dióxido de carbono en las células vivientes
es atmosférica? ¿Por qué?

6. Las burbujas de aire que pueden aparecer durante el experimento contendrán oxígeno gaseoso
(02), ¿cómo puede este fenómeno ser relacionado con la fijación de CO2 por la Elodea o
cualquier otra célula de plantas verdes durante la fotosíntesis?

DISCUSION DE RESULTADOS Y CONCLUSION:

Referencias:
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PRÁCTICA NO. 4
PRODUCCIÓN DE ALMIDÓN DURANTE LA FOTOSÍNTESIS

OBJETIVO:

Que el alumno compruebe la formación de almidón durante la segunda fase de la fotosíntesis

(fase obscura) mediante la fijación de dióxido de carbono y haga patente su presencia con solución de
yodo.

FUNDAMENTOS:

La segunda fase de la fotosíntesis no requiere la presencia de luz y por consiguiente se conoce

como reacción de obscuridad. En esta fase hay fijación de dióxido de carbono y se producen
carbohidratos utilizando el NADPH2 y ATP producidos durante la reacción de luz.

Glucosa Almidón

El producto final de la fotosíntesis depende de la especie de la planta, pero la mayoría de las hojas
almacenan los carbohidratos en forma de gránulos de almidón. La luz visible es esencial para que se
produzca la fotosíntesis y en ausencia de radiación no se sintetiza almidón. Esto puede demostrarse en el
experimento siguiente cubriendo la mitad de la hoja con papel aluminio y tiñendo con yodo para
demostrar la presencia de almidón después de que se haya extraído la clorofila.

MATERIALES:

1. Planta de hojas verdes

2. Papel de aluminio
3. Lámparas de mesa con bombillos de 75 watts
4. Solución de yodo (0.1 mol/L en KI, 30 g/L)
5. Solución diluída de yodo (5 mmol/L en KI, 30 g/L)
6. Perforadora
7. Etanol (tipo industrial)
8. Parrillas eléctricas
9. 2 vasos de precipitado de 100mL
10. 2 cajas Petri

PROCEDIMIENTO:

1. Cubra la mitad de la hoja de la planta con papel aluminio y expóngala a la luz solar o a un
bombillo de 75 watts a una distancia de 60-90 cm durante 48 horas.
2. Al día siguiente descubra la hoja y usando una perforadora de corchos corte discos de 1-2 cm de
diámetro de las 2 partes de la hoja.
3. Coloque los discos en agua caliente hasta que se ablanden las paredes celulares y luego
extraiga la clorofila con alcohol caliente sobre la parrilla eléctrica. (Sea cuidadoso, posibilidad de
incendio).
4. Cambie el etanol si es necesario, hasta que se haya extraído toda la clorofila.
 5. Transfiera los discos de las 2 partes de la hoja de su experimento, a 2 cajas Petri
respectivamente, las cuales deben contener solución diluída de yodo.
6. Compare la forma en que se han coloreado los discos tomados de cada una de las 2 partes de la
hoja.

Nota: Otra forma de realizar este experimento consiste en teñir las hojas de una planta jaspeada (tal
como el Coleo) con yodo. En este caso, el almidón debe estar presente sólo en las porciones verdes,
demostrando la necesidad de la clorofila para la fotosíntesis.

CUESTIONARIO:

1. Escriba las reacciones involucradas en la fase obscura de la fotosíntesis

2. ¿Qué diferencia encontró en la coloración de los discos de la hoja en las 2 cajas Petri?

3. ¿Qué características tiene la fotosíntesis en fase obscura?

DISCUSION DE RESULTADOS Y CONCLUSION:

Referencias:

1. Karlson, P., Introduction to modern Biochemistry, 4th Edition., New York., Academy Press. USA
2. Plummer, D.T., Introducción a la bioquímica práctica, 2da. Ed. McGraw-Hill, Latinoamericana,
S.A.
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LABORATORIO DE BIOQUIMICA METABOLICA

PRÁCTCA NO. 5: FOTOSINTESIS (2ª PARTE)

ACCIÓN DE LA LUZ VISIBLE ESPECTRAL EN LAS PLANTAS FOTOSINTÉTICAS

OBJETIVO:
Que el alumno identifique las reacciones bioquímicas que ocurren durante la fotosíntesis.

FOTOSINTESIS (2ª Parte)

El carácter más importante por el cual las plantas verdes se diferencian de los animales, es la facultad de
elaborar sustancias orgánicas a partir de productos inorgánicos.
Uno de los elementos principales de todas las sustancias orgánicas es el carbono, de manera que para la
elaboración éstas, las plantas verdes necesitan de dicho elemento, el cual toman del aire, por ello
absorben el anhídrido carbónico del medio externo y en el interior de las células lo descomponen,
desprenden el oxígeno y fijan el carbono que se utiliza al combinarse con productos inorgánicos como el
agua y sales minerales, en la síntesis de sustancias orgánicas. Para que se efectúe la fotosíntesis no
solamente es indispensable el gas carbónico sino también el concurso de la clorofila y la presencia de la
luz.
En las plantas superiores la fotosíntesis es función exclusiva de los cloroplastos y tiene lugar en la hoja.
Según lo anterior se puede definir que el fenómeno fundamental de la fotosíntesis es la absorción de la
luz por la clorofila.
El fenómeno de la fotosíntesis supone dos reacciones, la primera necesita de la luz y la segunda no. La
primera reacción comprende fotofosforilación y fotólisis del agua, la segunda transcurre con fijación del
CO2 (dióxido de carbono) y formación de carbohidratos. Luego las reacciones químicas
intracelulares transforman parte de los carbohidratos en otras moléculas.

MATERIAL Y REACTIVOS
1.- Hojas verdes recién cortadas de la planta
2.- 5 Tubos para centrífuga con rosca 13x100 mm
3.- Centrífuga
4.- Acetona
5.- Espectrofotómetro o colorímetro
6.- Celdas para espectrofotómetro
7.-Papel parafilm

OBTENCION DEL EXTRACTO DE HOJAS

1.- Pulverice algunas hojas verdes e introduzca el polvo a un tubo de centrífuga (llénelo aproximadamente
a un cm de profundidad).
2.- Llene el tubo con acetona (aproximadamente 1/3 parte del tubo).
3.- Espere por lo menos 10 min. Agite ocasionalmente, la solución debería cambiar (a color verde oscuro,
espere más tiempo si es necesario)
4.- Centrifugue la solución por 1 min.
6.- Pase el líquido verde oscuro a un tubo de ensaye limpio. Tenga cuidado de que no se le pase
cualquier residuo de las hojas pulverizadas (etiquételo como extracto de hojas).
6.- Llene las 2/3 partes de una celda con acetona.
7.- Agregue de 4 a 6 gotas del extracto de hojas
8.- Tape la celda con un dedo pulgar y mezcle el contenido. El color final deberá ser amarillo-verdoso
pálido, tape la celda con papel parafilm.
9.- Ponga la celda en el lugar adecuado del espectrofotómetro. NOTA: La celda del estándar contiene
únicamente acetona, la cual deberá ser usada para estandarizar el aparato.
10.- Para obtener la cantidad de absorción para una longitud de onda dada, use las siguientes
indicaciones.
a.- Ajuste la longitud de onda a 380nm
b.- Inserte la celda del estándar
c.- Ajuste la absorbancia a cero
d.- Retire la celda
e.- Inserte la celda que contiene el extracto de hojas
f.- Tome la lectura de absorbancia
g.- Retire la celda, repita los pasos de a hasta g para cada longitud de onda enlistada en la tabla.

Si la mayor absorbancia leída está por debajo de 0.3, repetir las lecturas usando el extracto más
concentrado. Si la mayor absorbancia leída está por arriba de 1.0, repetir las lecturas usando una muestra
nueva de extracto de hojas.

Longitud de onda (nm) Grados de absorbancia Longitud de onda (nm) Grados de absorbancia

380 560
400 580
420 600
440 620
460 640
480 660
500 680
520 700
540

A) Con los datos obtenidos construya una gráfica (luz absorbida contra longitud de onda)

B) Describa la relación aparente entre fotosíntesis y la luz visible (del espectro)

C) ¿Cuál o cuáles colores pueden ser absorbidos? (longitudes de onda)

DISCUSION DE RESULTADOS Y CONCLUSION:

Referencias:
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PRÁCTCA NO. 6
HIDRÓLISIS ENZIMATICA DE LIPIDOS

OBJETIVO:

Que el alumno observe la acción de la enzima Lipasa Pancreática sobre los lípidos
saponificables de la leche, en presencia y ausencia de sales biliares, como agente precursor de la
reacción de hidrólisis.

INTRODUCCIÓN:

En los últimos años se ha puesto de manifiesto que los lípidos desempeñan un papel importante
en la función normal de la célula.

Los lípidos no sólo sirven como fuente de energía y de reserva altamente concentrada, sino que
también están íntimamente ligados a la estructura de las membranas celulares y de los organelos que se
encuentran en la célula.
Los lípidos participan directa o indirectamente en muchas actividades metabólicas como:

1) Activadores de las enzimas.

2) Componentes del sistema de transporte electrónico.
3) Como sustratos.
4) Sustratos en la Descarboxilación indirecta de la serina y aminoectanol.

De acuerdo a la definición de Bloor, un lípido es un compuesto con las siguientes características:

a) Insoluble en agua.
b) Soluble en solventes orgánicos (éter, cloroformo, benceno, acetona).
c) Compuestos que tengan alguna relación con ácidos grasos como ésteres.
d) Posibilidad de utilización por organismos vivos.

Los lípidos se han clasificado en base a la estructura de sus esqueletos. Los lípidos complejos
que se caracterizan porque tienen ácidos grasos como componentes, comprenden a los acilgliceridos,
fosfoglicérido, esfingolípidos y las ceras.

Los lípidos sencillos son aquellos que no contienen ácidos grasos y no son saponificables. Los
acilglicéridos experimentan hidrólisis cuando hierven con ácidos o con bases, o por la acción de las
lipasas (enzimas que convierten las grasas en ácidos grasos libres y glicerol) que se encuentran
presentes en el jugo pancreático.

Las lipasas y las estearasas catalizan la hidrólisis de los enlaces “éster” que se encuentran en un
gran número de lípidos saponificables.

Lipasa + 3 H2O
pancreática
 Estas enzimas están ampliamente distribuídas en la naturaleza y son especialmente importantes
en el tracto gastrointestinal donde ellas funcionan en la digestión y absorción de grasas.

Debido a que las grasas no son solubles en agua, las enzimas deben actuar en la interfase
lípido-agua.

Consecuentemente los agentes emulsificantes tales como las sales biliares producen a menudo
una estimulación, marcada en la hidrólisis enzimática de los lípidos, debido al incremento de la interfase
lípido-agua.

En la leche homogeneizada, los glóbulos de grasas están en un estado finamente dividido y este
material sirve como un sustrato excelente para las lipasas. En este experimento se emplea como enzima
una lipasa muy potente que se encuentra en el páncreas desecado.

MATERIAL Y REACTIVOS:

1. 7 Matraces Erlenmeyer de 125 ml

2. 7 tubos de ensaye 16 x 150 mm
3. 2 buretas de 25 ml
4. 1 pinza para bureta
5. 1 soporte universal
6. Baño de agua
7. Termómetro
8. 2 pipetas graduadas de 1 ml
9. 2 pipetas graduadas de 5 ml
10. 2 pipetas graduadas de 10 ml
11. Leche homogenizada
12. Pancreatina al 1% en agua
13. Etanol al 95%
14. KOH (0.05N)
15. Fenolftaleína (0.1% en etanol al 95%)
16. Sales biliares

PARTE EXPERIMENTAL

Preparar una serie de 7 matraces de 125 ml de acuerdo a la siguiente tabla:

TUBO
        #      
REACTIVO T 1 2 3 4 5 6
Leche (ml) 5 5 5 5 5 5 5
pancretina al 1%
(ml) 0 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5
Extracto de pancre.
1% a ebull. x 3 min 1.5 0 0 0 0 0 0
(ml)              
sales biliares (ml) 0 0 0 0 1 1 1
tiempo (min) de 45 15 30 45 15 30 45
incubacion a 37°C              
Después de que cada matraz cumplió con el tiempo de incubación, retirarlo del baño, adicionar 12.5 ml
de etanol al 95% y 3 gotas de fenolftaleína (indicador) titular con solución de KOH 0.05N.

Agitar el matraz durante la titulación tan rigurosamente como sea posible, ya que la proteína
precipitada puede enmascarar los ácidos grasos.

Titular cada matraz tan rápido como sea posible contra un fondo blanco, debido a que la
digestión por la lipasa continúa durante la titilación.

REPORTE:

a) Restar al gasto de KOH de cada uno de los matraces el gasto de KOH del testigo (T).

No. de Tubo Gasto de KOH menos gasto de KOH del

Testigo (ml)
1
2
3
4
5
6

b) Construir 2 gráficas usando el tiempo de hidrólisis en las abscisas contra el gasto de KOH
corregido en las ordenadas de los matraces 1, 2 y 3 en una y en la siguiente los matraces 4, 5 y
6.

CUESTIONARIO

1. ¿Cuál es la reacción que se efectúa en la hidrólisis de los triglicéridos de la leche?

2. ¿Qué papel desempeñan las sales biliares en la reacción?

3. ¿Qué observó en las gráficas que elaboró y de qué manera influyó la presencia de las sales
biliares en una grafica y su ausencia en la otra?
 4. ¿Cuáles son los principales lípidos que se encuentran en la leche de vaca?

DISCUSION DE RESULTADOS Y CONCLUSION:

REFERENCIAS:

1. Johnston, R.B. “ Laboratory Manual for Biochemistry”. Burgess Publishing Co. Minesota. pags.
157-159

2. Kleiner, I.S. an Orten, J.M. Biochemistry. The C.V. Mosby Co. St. Louis, USA.
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LABORATORIO DE BIOQUIMICA METABOLICA

PRÁCTICA NO. 7

OBTENCIÓN DE GLUCÓGENO A PARTIR DE HÍGADO Y SU CARACTERIZACIÓN EN

CROMATOGRAFÍA EN PAPEL

OBJETIVO
Que el alumno obtenga glucógeno de hígado y analice la composición química del mismo.

INTRODUCCION
A mediados del siglo XIX, Claude Bernard observó la presencia de azúcar en el torrente sanguíneo de
animales. Al buscar los motivos de éstos, descubre y aísla una sustancia de naturaleza glucosídica, a la
cual denominó “Matiére Glycogene”. Tiempo después, Kekulé, Hering y Musculus, establecen la
identidad química de esta sustancia indicando que tiene gran similitud con el almidón.
Esta substancia se conoce actualmente con el nombre de glucógeno. Posee una estructura ramificada
con cadenas lineales con residuos consecutivos de glucosa, unidos por enlaces alfa 1-4 y en los puntos
de ramificación por enlaces alfa 1-6. El resultado es una estructura con forma de abanico, con muchos
extremos no reductores y un solo extremo reductor.

MATERIAL Y REACTIVOS

 Vaso de precipitado de 100ml

 Tijeras
 Recipientes para hielo
 Balanza
 Mortero mediano
 Probeta de 100 ml
 Probeta de 250 ml
 Tubos cónicos
 Vidrio de reloj
 Baño de agua
 Pipeta graduada de 5ml
 Solución de Ácido tricloroacético al 10% y al 5%
 Arena lavada
 Etanol al 95%

PROCEDIMIENTO:

1RA. SESIÓN: OBTENCIÓN DE GLUCÓGENO

1. Pesar 6 g de hígado en un vidrio de reloj previamente frio y cortarlo en pequeños pedazos.

2. Colocar los pedazos de hígado en un mortero previamente sumergido en hielo; añada: ácido
tricloroacético (TCA) al 10% en proporción de 1ml/g de tejido hepático y 0.5g de arena lavada.
Triturar el hígado hasta formar una pasta homogénea.
3. Centrifugar el homogenizado durante 5 min. a 3700 x G (3700 rpm)
 4. Decantar el líquido sobrenadante resultante en una probeta de 100ml y guardar.
5. Lavar el mortero y su mano con 10 ml de TCA al 5% y en este líquido resuspender el precipitado
de la centrifugación anterior, homogenizando bien.
6. Dejar en reposo 5 min. y centrifugar a 3700 x G durante 5 min
7. Decantar el líquido sobrenadante y reunirlo con el anterior en la probeta (inciso 5).
8. Añadir dos volúmenes de etanol al 96% por cada volumen de sobrenadante. Agitar esta mezcla
hasta que el glucógeno flocule. Si esto no sucede, añada un poco de NaCl y colóquelo en baño
María a 37°C, hasta la formación del flóculo.
9. Centrifugar a 3000 x G durante 5 min.
10. Desechar el sobrenadante y resuspender el precipitado con 5 ml de agua destilada
11. Reprecipitar con 2 volúmenes de etanol al 96%
12. Centrifugar a 3000 x G durante 3 min.
13. Desechar el sobrenadante y resuspender el precipitado con 5 ml de agua
14. Precipitar con 2 volúmenes de etanol absoluto
15. Centrifugar a 3000 x G por 3 min.
16. Decantar y suspender con la menor cantidad de alcohol absoluto (1-2 ml) y pasarlo a un vidrio de
reloj. Secar al vacío a 37°C.

2ª. SESIÓN

1.- Pesar el glucógeno seco para evaluar el rendimiento

2.- Pesar 40 mg de este glucógeno y disolverlo (suspenderlo) en 1 ml de agua
3.- Coloque 0.5 ml de esta suspensión en otro tubo y adicione 0.5 ml de HCl 1, 2 o 4 N (de acuerdo a lo
que le indique su instructor)
4.- Colocar ambos tubos en baño a ebullición (92°C) durante 30 min.

PREPARACIÓN DEL CROMATOGRAMA

Cortar una tira de papel Whatman No. 1 de 23 x 56 cm. Trazar a lo ancho una línea con lápiz a 7cm de
los extremos (línea de aplicación) más atrás dos líneas adecuadas a las cubetas de cromatografía que se
utilicen, haciendo los dobleces de acuerdo a las instrucciones del profesor.

Sobre la línea de aplicación marque 6 puntos equidistantes con lápiz. En el primer punto colocar 30 mcl
de las soluciones de Glucosa, en el segundo punto, Fructuosa, en el tercero Galactosa y en el cuarto
Maltosa en aplicaciones de 5 en 5 mcl.

En los dos puntos restantes colocar 50 mcl de la muestra de glucógeno sin hidrolizar y en la otra 50 mcl
de la muestra hidrolizada.

Doblar los cromatogramas y ponerlos a saturar en la cámara por dos horas mínimo (previamente saturada
con propanol-agua). Después desarrollarlos durante 18 hrs. Aproximadamente 80:20 (v:v). Sacarlos,
marcar el frente del solvente, dejarlos secar en la estufa para cromatografía a 70°C de 10-15 min.

NOTA: Prender el horno antes de aspersar los cromatogramas, para que tenga la temperatura adecuada
(70°C). Revelar los cromatogramas por aspersión con una solución ácida de floroglucinol en
alcohol o con una solución ácida de naftilamina en alcohol (caliente) y colocarlos después en el
horno de cromatografía por 15 min. Terminado el revelado, medir las distancias recorridas de las
muestras y calcular los Rf.
CUESTIONARIO

1. Defina el fenómeno de floculación

2. ¿Cuál es el objetivo de añadir etanol al extracto de hígado?

3. ¿Cuál es la función del glucógeno en los animales y cuál es su composición química?

4. Incluya parte de la molécula del glucógeno indicando los enlaces alfa 1-4 y alfa 1-6.

5. ¿En qué tejidos se almacena glucógeno en el cuerpo humano?

DISCUSION DE RESULTADOS Y CONCLUSION

Referencias:
1. Clark J.M. “Bioquimica experimental”. Ed. Acribia, Zaragoza. (1966) Borders C.L. Jr. “Descending
Paper Chromatography of Oligosaccharides”. J. Chem. Education.
2. Dawson R.M. Elliott, W.N K.N Jones “Data for Biochemical Research”. Oxford University Press,
London. (1969)
3. Litwack G.”Experimental Biochemistry”, John Wiley and Sons, Inc. N.Y. (1967)
4. West, E.S. and W.R. Todd “Textbook of Biochemistry”. 2da ed. MacMillan Co. N.Y. pags. 215-
220 (1967)
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PRÁCTICA 8 REACCIONES ENZIMÁTICAS DE OXIDO-REDUCCIÓN
PRÁCTICA 9 EFECTO DE COFACTORES E INHIBIDORES EN LA RESPIRACIÓN

OBJETIVO
Que el alumno compruebe la actividad enzimática de la deshidrogenasa láctica y
deshidrogenasa succínica sobre un fragmento de músculo, así como la acción de cofactores e
inhibidores.
INTRODUCCION
Todas las manifestaciones vitales requieren energía, la cual se obtiene por la oxidación gradual
de los alimentos ya que los procesos de oxido-reducción hay transferencia de energía debido a
las diferencias de potencial eléctrico. Un sistema de potencial elevado oxida al de más bajo
potencial con la consiguiente liberación de energía para las necesidades vitales.
En todas las reacciones de oxido-reducción hay transferencia de electrones. La oxidación se
define como la pérdida de electrones, mientras que la reducción es la ganancia de electrones.
Por tanto, la oxidación y reducción son fenómenos que se realizan simultáneamente.
La oxidación biológica implica transferencia de hidrógenos a través de una serie de sistemas
enzimáticos que actúan como intermediarios para llegar al aceptor final de electrones que es el
oxígeno. El proceso oxidativo se inicia por la acción de una deshidrogenasa específica, que no
reacciona directamente con el oxígeno sino que requiere de intermediarios como NAD ⁺,
flavoproteínas y citocromos.
En la presente práctica se realizará el estudio de 2 deshidrogenasas y de dos oxidasas que
actúan como intermediarios en el transporte de electrones, el efecto inhibidor de cianuro y
malonato, así como los cofactores de dichas enzimas.
MATERIAL Y REACTIVOS:
 Tubos de ensaye de 16 x 150 mm
 Pipetas graduada 1, 5 y de 10 ml
 Bureta de 25ml
 Vasos de precipitados
 Mortero
 Tijeras
 Matraz Erlenmeyer de 250 ml
 Vaso de precipitado de 100 ml
 Baño de agua
 Termómetro
 Arena lavada
 Solución d NaCl al 0.9%
 Solución de KCN al 0.5 % y al 0.01%
 Solución de Lactato de sodio al 1%
 Solución de Azul de metileno al 2 mM
 Nujol
 Solución de Na2HPO4 al 0.06M
 Solución de Ácido succínico 0.1 M
  Solucion de Malonato de sodio 0.1 M
 Solución p-fenilendiamina al 1% (recién preparada)
 Solución alfa-naftol al 0.15% en alcohol
 Musculo de patas traseras de carnero
 Bisturí
 Parilla Eléctrica
 Hielera
 Hielo
 Balanza
 Espátulas

TÉCNICA
A) Preparación del sistema deshidrogenasa láctica-NAD+
a) Preparación de la enzima
1-. Pesar de 2 a 3 g de músculo de las patas traseras.
2-. Cortar el músculo en fragmentos más pequeños y ponerlos en agua a ebullición por 5
minutos en un vaso de precipitado de 100 ml (en proporción de 8 ml de H 2O por gr de
músculo).
3-. Pasar la preparación a un mortero con un poco de arena (aproximadamente 1 gr)
y macerar bien el músculo.
4-. Centrifugar a 3000 rpm por 15 minutos. Recuperar el sobrenadante y etiquetarlo
como coenzima (NAD⁺). El precipitado se desecha.
b) Preparación de la enzima (LDH)
1-. Colocar de 2 a 3 gr de músculo de las patas traseras en un mortero previamente
sumergido en hielo y adicionar solución de NaCl al 0.9% (en proporción de 10 ml por
gramo de músculo). Agregar un poco de arena (aproximadamente 1 gr) y macerar
perfectamente.
2-. Dejar reposar la mezcla en el mortero por 30 minutos (mantener en frio).
3-.Centrifugar a 3000 rpm por 15 minutos. Recuperar el sobrenadante y etiquetarlo como
“Deshidrogenasa Láctica” (LDH) y mantener en frio. El precipitado se desecha.
B) Preparación de la deshidrogenasa succínica y citocromos
1-. Pesar 3 g de corazón y cortarlo en fragmentos pequeños y ponerlo en un mortero
previamente sumergido en hielo, adicionando un poco de arena (aproximadamente 1
gr) y de solución fría de Na2HPO4 0.06 M en una proporción de 8 ml por gramo de
corazón y macerar perfectamente.
2-. Diluir la mezcla agregando 16 ml de Na 2HPO4 0.06 M por gramo de corazón.
3-. Dejar reposar la mezcla por 30 minutos con agitación ocasional, en frio.
4-. Centrifugar a 3000 rpm por 15 minutos. Recuperar el sobrenadante y etiquetarlo
como “Deshidrogenasa SuccínicaCitocromos DSC”, mantener en frio. El precipitado
se desecha.
C) Determinación de actividad enzimática
Mientras se obtienen los sistemas enzimáticos, preparar las 3 series siguientes en tubos
de ensaye etiquetados, como se indica a continuación:
ATENCION: TRABAJAR LAS SOLUCIONES DE KCN CON MUCHA PRECAUCION, YA
QUE ES UNA SUSTANCIA ALTAMENTE PELIGROSA. NO SE DEBE UTILIZAR
PIPETA; MANIPULAR DICHA SUSTANCIA CON BURETA Y LAVARSE LAS MANOS.
 1-. DESHIDROGENASA LACTICA
Tubo # 1 2 3 4
KCN 0.5% (ml) 1 1 1 1
Lactato 1% (ml) 1 1 0 1

Azul de metileno 2 mM (ml) 0.3 0.3 0.3 0.3

Agua (ml) 1 0 1 1
Sobrenadante coenzima (ml) 0 1 1 1
Sobrenadante LDH (ml) 1 1 1 0
Lecturas:
Inicial, 15 minutos,
30 minutos,
45 minutos, etc.

Mezclar bien el contenido de cada tubo y agregar a todos 1.0 ml de nujol. Incubar a baño maría a
37º C y hacer observaciones a los tiempos indicados anotando en los cuadros los grados de
“decoloración” con signos “+”y con “0”la falta de la misma.

2-. DESHIDROGENASA SUCCINICA

Tubo # 1 2 3 4 5 6 7
Succinato de sodio 0.1M (ml) 0.5 0 0.5 0.5 0.5 0.5 1
Azul de metileno 2 mM (ml) 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3

Malonato de sodio 0.1 M (ml) 0 0 0 1 0.5 0.25 0.25

Agua (ml) 1 1.5 3 0 0.5 0.75 0.25
Sobrenadante "DSC "(ml) 2 2 0 2 2 2 2
Lecturas:
Inicial, 15 minutos,
30 minutos, 60 minutos,
90 minutos, etc.

Mezclar bien el contenido de cada tubo y añadir a todos 1.0 ml de nujol. Incubar en baño maría a
37º C y hacer lecturas a los tiempos señalados anotando en el cuadro los grados de
“decoloración”con signos “+”y con “0” la falta de la misma.

3-. CITOCROMOS Y CITOCROMO OXIDASA

Tubo # 1 2 3 4 5
KCN 0.01 % 0 1 0 0 1
p-fenilendiamina 1.0% (ml) 1 1 1 1 1

Alfa-naftol 0.15% (ml) 0 0 0 0.1 0.1

Agua (ml) 1.1 0.1 2.1 1 1
Sobrenadante "DSC"(ml) 1 1 0 1 1
Lecturas:
Inicial, 15 minutos,
30 minutos, 60 minutos
90 minutos, etc.
Mezclar bien el contenido de todos los tubos e incubar a 37º C en baño de agua con agitación
ocasional. Hacer lecturas a los tiempos señalados anotando en el cuadro los cambios de “color”
de las soluciones.
PREPARACION DE SOLUCIONES Y REACTIVOS
1.-NaCl al 0.9 %. Pesar 0.9 gr y aforar a 100 ml con agua destilada.
2.- KCN al 0.5 %. Pesar 0.5 gr de cianuro de potasio y aforar a 100 ml con agua destilada.
3.- KCN al 0.01 %. Pesar 0.01 gr de KCN y aforar a 100 ml con agua destilada.
4.- Lactato de sodio al 1%. Pesar 1 grde lactato de sodio y aforar a 100 ml con agua destilada.
En ausencia de lactato se puede preparar a partir de ácido láctico y neutralizar la solución con
bicarbonato de sodio sólido.
5.- Azul de metileno 0.002M. Pesar .747 gr de azul de metileno y aforar a un litro con agua
destilada.
6.- Na2HPO4 (12H2O) 0.06 M. Pesar 21.36 gr de fosfato disódico y aforar a 1 litro con agua
destilada.
7.- Succinato de sodio 0.1M. Pesar 11.8 gr de ácido succínico y aforar a 1 litro con agua
destilada. Neutralizar la solución con bicarbonato de sodio sólido.
8.- Malonato de sodio 0.1M. Pesar 10.4 gr de ácido malónico y aforar a 1 litro con agua destilada.
Neutralizar la solución con bicarbonato de sodio sólido.
9.- p-fenilendiamina (base) al 1%. Pesar 1gr de p-fenilendiamina y llevar a 100ml con agua
destilada. Esta solución debe prepararse en el momento de usarse.
10.- Alfa-naftol al 0.15%. Pesar 0.15 gr de alfa-naftol y llevar a 100ml con alcohol etílico de 96%.
CUESTIONARIO:
1-. Escriba las reacciones que se efectuaron en esta práctica.
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
____________________
2-. Interprete cada tubo, haciéndolo también de una manera global en cada serie.
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
____________________

3-. Escriba el mecanismode reducción del NAD+.

4-. Concluya el objetivo de la práctica.

_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
____________________

5-. Incluya bibliografía consultada.

BIBLIOGRAFÍA
1.-Lehninger, A. L. Biochemistry. Worth Publishers, Inc. 1997.
2.-De Robertis, E.D.P. Cell Biology. W.B. Saunders Company. 1990.
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PRÁCTICA NO. 10
PRODUCCIÓN DE EQUIVALENTES REDUCTORES POR CLOROPLASTOS

OBJETIVO:

Que el alumno efectúe la reacción de Hill (fotólisis del agua) en cloroplastos aislados de hojas de
espinaca, empleando un aceptor artificial de hidrógeno (2,6-diclorofenolindofenol).

INTRODUCCIÓN:

La síntesis de carbohidratos a partir de agua y dióxido de carbono ocurre en 2 etapas, conocidas

como la reacción de luz y oscuridad. La reacción de luz que se demuestra en este experimento se efectúa
solamente en presencia de radiación visible, que es absorbida por el pigmento verde presente en
cloroplastos. Los electrones presentes en la clorofila son promovidos a niveles más altos de energía y
retornan al estado inicial mediante una serie de reacciones semejantes a las que ocurren en la cadena
respiratoria de la mitocondria. Durante este proceso de transporte de electrones se produce ATP. Al
mismo tiempo, se producen equivalentes reductores en forma de NADPH2 y se libera O2.

Ferredoxina Citocromo b3

e- ADP+Pi plastoquinona
Flavoproteína
ATP
H2O
e-

NADPH2 Citocromo f
OH-
e- H+
e-

Plastocianina Clorofila b+
Fotosistema II ½ O2
Clorofila a +

Fotosistema I

Luz Luz

Figura 12.1- Formación de ATP y NADPH2 durante la fotosíntesis

La fotólisis del agua en cloroplastos aislados fue demostrada inicialmente por Hill y se conoce como la
reacción de Hill. En este experimento se pretende demostrar la producción de equivalentes reductores al
iluminar cloroplastos aislados de hojas de espinaca. Esto se hace incluyendo en la mezcla reaccionante
un aceptor artificial de hidrógeno (2,6-diclorofenolindofenol). La reacción del colorante no se efectúa en la
obscuridad.
MATERIALES:

1. Hojas frescas de espinaca.

2. Bolsas de plástico para las hojas
3. Medio de separación (sacarosa 0.4 mol/l que contiene amortiguador de fosfato de potasio 0.06
mol/l, a ph=6.5)
4. Mezcla de reacción (amortiguador de fosfato de potasio 0.03mol/l, ph=6.5 que contiene cloruro
de potasio 0.01 mol/l)
5. Licuadoras
6. Muselina
7. Acetona (80% v/v en agua)
8. 2,6-diclorofenolindofenol (0.1 mol/l en el medio de reacción)
9. Ditionita de sodio
10. Lámparas de mesa con bombillo de 100 watts
11. Centrífuga refrigerada (puede usarse centrífuga de mesa en cuarto frío)
12. Matraces volumétricos de 25 ml

PROCEDIMIENTO:

A) AISLAMIENTO DE CLOROPLASTOS
Lave la hojas varias veces con agua, déjelas escurrir y colóquelas en una bolsa plástica en el cuarto frío
durante unas horas hasta que las hojas se hinchen. Los pasos subsiguientes se llevan a cabo con
materiales helados y en el cuarto frío con el fin de mantener la integridad de los cloroplastos. Separe las
nervaduras de las hojas, pese las hojas y en una licuadora homogenice 100 g con 100 ml de medio de
sacarosa, durante aproximadamente 2 minutos. Filtre la solución verde a través de varias capas de
muselina y centrifugue el sobrenadante a 200 g por 2 minutos en una centrífuga refrigerada para
sedimentar las células que no se han lisado, los núcleos y pedazos de hojas. Separe el sobrenadante y
centrifúguelo en frío durante 10 minutos a 1000 g.
Lave los cloroplastos suspendiendo el sedimento en el medio de separación, centrifugue una vez más
bajo las mismas condiciones. Finalmente, suspenda el precipitado de cloroplastos en 20 ml de medio de
reacción helado, agitándolo suavemente con una varilla de vidrio y almacénelo sobre hielo hasta que se
requiera.

B) DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE CLOROFILA

Agregue 1 ml de la suspensión de cloroplastos a 10 ml de una solución de acetona en agua 80% v/v,
mezcle fuertemente, y usando papel Whatman No. 1 filtre y recoja en un matraza volumétrico de 25 ml.
Enjuague los tubos con 5 ml de solución acuosa de acetona usándola luego para lavar el papel filtro.
Repita el lavado una vez más y complete hasta la marca de 25 ml con acetona 80% v/v. mida la extinción
de la solución verde a 652 nm contra un blanco del solvente.

Concentración de clorofila (mg/L)= extinción a 652 nm X 5.8

C) REACCIÓN DE HILL
Diluya la suspensión de cloroplastos con la mezcla de reacción hasta obtener una concentración de
clorofila de aproximadamente 5mg/L y agregue 1 ml de la suspensión verdosa a 9 ml de la solución de
2,6-diclorofenolindofenol. Prepare 3 tubos en la forma que se indicó anteriormente, coloque uno en la
obscuridad durante el transcurso del experimento e inmediatamente lea la extinción del segundo tubo a
520 nm contra el tercer tubo, al cual se han agregado varios cristales de ditonita de sodio para decolorar
completamente el colorante. Prepare un cuarto tubo que contenga el doble de las cantidades de la
solución y expóngalo a la luz de un bombillo de 100 watts. Coloque un matraz lleno de agua entre el
bombillo y la muestra para que sirva como un filtro de calor y también como lente para enfocar el haz de
luz sobre la muestra. Siga este tratamiento hasta un tiempo de 30 min. Al final del experimento lea la
extinción del tuvo que se ha guardado en la obscuridad.

CUESTIONARIO:

1. ¿Qué es la fotosíntesis?

2. ¿Cuáles son las reacciones involucradas en presencia de luz?

3. ¿Qué es la reacción de Hill?, escríbala y explíquela

4. ¿Qué papel juegan los cloroplastos en la fotosíntesis?

5. Concluya y discuta el fundamento de la práctica

6. Reporte los resultados en forma de tabla

BIBLIOGRAFÍA:
A. Karlson, P., Introduction to Modern Biochemistry, 4th Edition., New York., Academy Press.
B. Lehninger, A.L., Biochemistry, 2nd Edition, New York, Worth.
C. Stryer, L., Biochemistry, San Francisco, W.H. Freeman.
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PRÁCTICA # 11

DETERMINACIÓN DEL GRADO DE RAMIFICACIÓN DEL GLUCÓGENO

MEDIANTE OXIDACIÓN CON ÁCIDO PERYÓDICO

OBJETIVO:
Que el alumno determine el grado de ramificación del glucógeno previamente
purificado por medio de la oxidación con ácido peryódico.

GENERALIDADES:
La oxidación ácida peryódica se limita a los compuestos que tienen los siguientes
grupos sobre los carbonos adyacentes: OH y OH, OH y NH2, C=0 y OH, CO y CO; CO y CHO.
Ejemplo:

Glicerol + HIO4  Formaldehído y Aldehídos mixtos + agua + HIO3

Compuestos hidroxiaminados + HIO4  Formaldehído y Aldehídos mixtos + NH3 + HIO3

Compuestos hidroxicarbonilos + HIO4  Formaldehído de un alcohol primario + Hidroxiácido +

HIO3

Compuestos carbonilhidroxilos + HIO4  Ácido y Aldehído + HIO3

Compuestos α-di cetonas + HIO4 + H2O  R’-COOH y R-COOH + HIO3

Aldehído α-cetónico + HIO4 + H2O  Ácido Acético + Ácido Fórmico + HIO3

El producto final siempre es HIO3 y mezclas de ácidos o aldehídos. Los aldehídos, en

especial formaldehído, pueden determinarse gravimétricamente con dimedón:

CH2O + 2  + H2O

El HIO3 puede determinarse por titulación por varios métodos. El más adecuado es el
de la determinación de la diferencia de la cantidad de yodo liberado. El yodo se libera del IO4-
y del IO3- de acuerdo a la siguiente ecuación y se determina por titulación con solución
estándar de Tiosulfato de sodio. Una diferencia de 1mol de I 2 se obtiene por cada mol de IO4-
reducido y 2 equivalentes de Na2S2O3 se necesitan para titular el mol de I2

IO4- + 8 H+ + 7 I-  4 I2 + 4 H20
____IO3- + 6 H+ + 5 I-  3 I2 + 3 H20____
IO4- + IO3- = I2; 1 mol liberado/mol de IO4- reducido y

I2 + 2 S2O3-2  2 I- + S4O6-2

Esto significa que 1 mol de IO4 reducido es igual a 2 equivalentes de Na2S2O3.

-
 Cuando el Ácido Fórmico es el producto final, se puede determinar por titulación de una
alícuota de la mezcla de la reacción después de descomponerse el exceso de IO4-. La
descomposición del IO
-
4 usualmente se logra al añadir un exceso de etilenglicol.

Los azúcares simples como la glucosa, galactosa y manosa reaccionan con HIO 4 para
producir 1 mol de formaldehído y 5 de ácido fórmico.

Glucosa + 5 HIO4  5 HCOOH + HCHO + 5 H20

La aplicación de este método para azúcares sustituídos, como los glucósidos, es muy
útil en la determinación de estructuras químicas.

D-Metilglucopiranosa + 2 HIO4  Dialdehído + Ácido Fórmico + H20 + HIO3

FUNDAMENTO:
La estructura del glucógeno y polisacáridos similares puede describirse como un
arreglo ramificado de residuos glucopiranósidos con enlaces 1-4 a lo largo de la cadena
principal y enlaces 1-6 en los puntos de ramificación. Como resultado de esta estructura, solo la
punta de la cadena principal terminal reductora y todos los extremos no reductores, producirán
ácido fórmico con la oxidación de peryodato. Debido a esta estructura única, la cantidad de
HCOOH formado del único extremo reductor es insignificante comparado con los formados con
los extremos no reductores. En este procedimiento se presume que el número de extremos no
reductores del glucógeno es aproximadamente igual al número de moléculas de ácido fórmico
formado. El procedimiento clásico de metilación para el análisis de los grupos extremos es
sumamente tedioso, pero el método del peryodato hace posible esta determinación, con un
grado de error aceptable.

Los 4 tipos de enlaces de los residuos de glucosa encontrados en una molécula de

glucógeno se ilustran en:
 En los extremos no reductores hay 2 pares de grupos OH vecinales. Dos moléculas de
peryodato se consumen con la liberación del C-3 como HCOOH.
 En el extremo reductor, el rompimiento tiene lugar entre los carbonos C-3 y C-2 y
también en C-2 y C-1. El C-2 se libera como HCOOH; el C-1 el cual está unido al anillo
del oxígeno formando un éster fórmico, eventualmente se hidroliza para originar otra
molécula de HCOOH y un grupo OH sobre el C-5. Después sigue un rompimiento entre
el C-5 y el C-6 liberando C-6 como formaldehido. El punto de ramificación de los
residuos de glucosa y los residuos α,1-4 se rompen solamente en los C-2 y C-3 para
producir dialdehídos y ningún fragmento de carbono.

El consumo total de peryodato para el extremo reductor es de 3 moles, lo cual forma 2 moles
de HCOOH. Esto hace una pequeña contribución y puede ignorarse en una molécula que
tenga un peso molecular de aproximadamente 1 x 106 con más de 1 o 2 extremos reductores
por molécula completa. Los residuos de la parte interna de la cadena consumen 1 mol de
peryodato. Los grupos extremos no reductores consumen 2 moles de peryodato con la
liberación de ácido fórmico.

Por lo tanto, para fines prácticos, el número de extremos no reductores es igual al

número de moles de HCOOH liberado y este factor se usa para determinar el grado de
ramificación.

Parte Experimental:

Análisis del glucógeno.

Determinación de pureza del glucógeno por medio de la reacción con Antrona.
 Para determinar correctamente, es necesario controlar cuidadosamente la reacción; la
concentración de antrona y ácido en el reactivo, tiempo y temperatura, así como la presencia
de sustancias que interfieran (pelusa, grasa de la piel, fibras o papel).

Procedimiento
1. Pesar cuantitativamente 2 muestras de glucógeno de 9.0 mg, transferir a matraces
volumétricos de 100ml, disolver en agua, mezclar y aforar.
2. Preparar una solución de glucosa (estándar) de 9.0 mg % (0.5 μmol/ml).
3. Separar 5 alícuotas de 1ml en tubos de ensaye. Dos de la solución de glucógeno, dos
de la solución estándar de glucosa y una de agua destilada y etiquetar todo.
4. Agregar 4.0 ml de la solución de antrona muy despacio y por las paredes.
5. Enfriar en baño de hielo a 0°C.
6. Calentar los tubos en baño maría por 10 min hasta ebullición.
7. Enfriar de nuevo en baño de hielo para detener la reacción. Una vez fríos, sacarlos del
baño y dejar que alcancen la temperatura ambiente.
8. Secar los tubos y transferir 3.0 ml a celdas de vidrio y leer la absorbancia a 620 nm y
anotar.

Los micromoles de glucosa en 9.0 mg % de glucosa será igual a la absorbancia equivalente

para la solución de glucosa de 9.0 mg % corregida por la pérdida de agua en el glucógeno, el
cual es un polímero de glucosas. El PM de un residuo de glucosa en glucógeno es de 180-18 o
162, y 180/162 = 1.11

Por lo tanto:

Micromoles de glucosa/ml muestra glucógeno = _Abs620 de glucógeno (AU)_ X Conc. del estándar de
glucosa (Cs)
Abs620 de glucosa (As)

En realidad, ambas soluciones deben de exhibir la misma absorbancia, puesto que ambas son
glucosa; el glucógeno tiene un PM efectivo de 162, por lo tanto:

_abs620 de glucógeno) X 1.11 X 100  PUREZA

Abs620 de glucosa
Lo que es lo mismo:

μmol totales de glucosa en glucógeno__ X 1.11  PUREZA

μmol totales de glucosa en sol, estándar

Determinación del grado de ramificación y número de unidades de glucosa por

segmento en la muestra de glucógeno.

1. Transferir 20.0 mg de glucógeno a un matraz volumétrico de 50 ml. Agregar 20 ml de

NaCl al 3% y calentar en baño de vapor para facilitar la disolución. Agregar 10 ml de
NaIO4 0.35 M y aforar a 50 ml con agua destilada.
2. Elaborar un blanco de la misma manera pero omitir el glucógeno. Colocar ambas
soluciones en la obscuridad, manteniéndolas en baño de hielo por media hora.
3. Tomar 3 alícuotas de 5.0 ml de la mezcla anterior de glucógeno-peryodato y
transferirlas a matraces volumétricos de 50 ml. Agregar 3 gotas de etilenglicol a cada
una y colocarlas en la oscuridad 15 min. Titular las alícuotas hasta el punto final de
fenolftaleína con NaOH 0.01 N, empleando un tubo de ascarita en el tope de la bureta
para impedir el paso de CO2. Sacar un promedio de las 3 titulaciones.

Cálculos:

Si nos fijamos en la estructura del glucógeno, veremos que comienza con un residuo
de glucosa unido por un enlace alfa 1-4 a un segundo residuo de glucosa y así sucesivamente.
En cada punto de ramificación existe un enlace alfa 1-6. El primer residuo de glucosa es un
azúcar reductor debido a que el C-1 está libre. Para este punto de ramificación, sin embargo,
existen 2 residuos de glucosa no reductores, ¿Por qué? El número total de ramificaciones de
enlaces alfa 1-6 en la molécula de la figura adjunta, es una menos que el número de los
extremos no reductores (N) del glucógeno.

De acuerdo al diagrama existen 7 puntos en la representación de una molécula de

glucógeno y consecuentemente, existen 8 grupos terminales no reductores y el número de
cadenas es 8. Sin embargo, en una muestra de glucógeno auténtica con un PM del orden de
más de 1 X10 6, N podría tener un número mayor, y para todos los propósitos prácticos, el
número de enlaces alfa 1-6 es igual al número de extremos no reductores, por lo tanto, el % de
ramificación o % de residuos de glucosa alfa1-6 en una muestra de glucógeno se determina de
la siguiente manera:

% ramificación = enlaces alfa 1-6 en muestra glucógeno X 100

Residuos totales de glucosa en muestra de glucógeno

Puesto que hemos establecido que el número de residuos de glucosa no reductores = número
de moléculas de HCOOH liberadas, entonces:

% ramificación = Moles totales de HCOOH formados de muestra de glucógeno X 100

Moles totales de residuos de glucosa en muestra de glucógeno

Puesto que hay N cadenas presentes:

Longitud promedio de la cadena de glucógeno = Moles de glucosa en la muestra
Número de cadenas

Moles de glucosa en la muestra = Moles de Glucosa en muestra de Glucógeno tarado

Número de cadenas Moles de HCOOH formado del glucógeno tarado

Para cada cálculo usar los datos obtenidos del análisis de glucógeno y corregir con el estado
de pureza.

% pureza X Gramos de glucógeno en 50 ml = moles totales de glucosa en muestra tarada de

gulcógeno

Y:
Moles totales de acido fórmico formados de la muestra de glucógeno
tarado (el factor 3.33 se usa para corregir el hecho de que en realidad
15 ml de los 50 fueron titulados)
Vol X NNaOH X 3.33 =
1000

N= Número de residuos no reductores = número de cadenas presentes.

Si observamos la representación grafica del glucógeno, encontramos que N, el número

de residuos no reductores, es igual a 8 y que el número de segmentos (porción entre los puntos
de ramificación) es igual a 15 o 2N-1, puesto que 2N también es un número relativamente
grande, es posible calcular el número promedio de residuos de glucosa en un segmento de
glucógeno por la relación:

Unidades promedio de Glucosa en un segmento = Mol totales de glucosa en mtra glucógeno

No. Segmentos en mtra. de glucógeno.

Ahora, es posible concluir que si en una molécula de glucógeno, el número de

segmentos es igual a 2N-1 o aproximadamente igual a 2N y N es igual al No. total de
ramificaciones alfa 1-6, las cuales en turno son igual al número total de extremos no reductores
y finalmente equivalentes al número total de moles de HCOOH formados, entonces, esto
significa que:

Número promedio de unidades de glucosa/ segmento = Mol totales de glucosa en mtra

glucógeno
2 X moles de HCOOH formados

Asumiendo al glucógeno con el cual estamos trabajando, un peso molecular de 1.62 X

10 6, usar los datos para calcular, en un gramo molecular de glucógeno, el número total de
residuos de glucosa, número total de extremos no reductores N, el número total de segmentos
2N-1 y por último el número de hileras en el glucógeno, donde 2N-1 = 2T-1; donde T es el
número de hileras.

Sin embargo, para obtener un número real de N y T, tiene que saberse el PM del
glucógeno en la muestra.

Hasta este punto se ha obtenido el número de moles de glucosas en la muestra de

glucógeno, pero no es posible saber cuántas glucosas hay en el glucógeno. Asumiendo un PM
de 1.62 X 106, podemos calcular fácilmente que existen 10, 000 unidades de glucosa por mol
de glucógeno ya que:

1.62 X 106 = 1 X 104

162
Pero debido a que hemos determinado el porcentaje de ramificación, podemos decir
que existe un 8.35%, lo cual significa que un 8.35 % de los residuos de glucosa son los puntos
de ramificación, entonces, 10, 000 X 0.0835, u 835 menos de 10,000 son los residuos de
glucosa ramificados.

Este número también es aproximadamente igual al número residuos no reductores (N),

ya que previamente hemos establecido que N que es 1 más que el número de puntos de
ramificación, N ahora también representa el número de cadenas en la muestra.

N puede derivarse de los datos de la titulación directamente. Suponga en este ejemplo

que encontramos 1.17 x 10-4 moles de grupos terminales de HCOOH en la titulación y que la
muestra de glucógeno pesado es de 0.25 gr y con una pureza de 91%. Los moles de
glucógeno en la muestra serian de:

.91 X .25 = 1.4 x 10 -7 moles en la muestra

1.62 x 10-6
Puesto que:
 N= número de grupos terminales en la muestra = 1.17 x10-4 = 835
Moles de glucógeno en la muestra 1.4 x 10-7

El número total de segmentos iguales

(2 X 835) – 1 = 1669

Con este dato, ahora podemos calcular el número promedio de residuos de glucosa en
un segmento porque sabemos que existen un total de 10, 000 residuos de glucosa en un mol
de glucógeno, por lo tanto.

10,000 = 6
1669
Reporte
 Presentar todos los cálculos de los parámetros obtenidos en la práctica.
 ¿Qué información adicional, si la hay, podría proporcionar para efectuar una titulación
con peryodato, con el fin de obtener una cantidad neta de IO4- a IO3-?
 Asumiendo que una muestra de glucógeno tuviera 5 residuos de glucosa, muestre que
la cantidad de HCOOH formado por los grupos reductores de una molécula de
glucógeno simétrica con 10 hileras por oxidación de IO4- es muy pequeña en
comparación con la cantidad producida por los extremos no reductores.

Bibliografía:

1. Rendina, J.L. “ Experimental Biochemistry” . Chapter 13 pgs. 156-165

2. Clark, J.M. and Switzer R. L. “Experimental Biochemistry”. 2nd edition, W.H Freeman
and Company, San Francisco, USA.