Universidad Nacional Del Centro Del Perú

Universidad Nacional del Centro del Perú
Facultad de Ingeniería Química
Evaluación de la concentración y el tiempo de contacto de las

nanopartículas de óxido de silicio para la inactivación de las
bacterias E. Coli en aguas residuales municipales
Cornelio Pucuhuayla, Eileen Solange

Quiñones Coronel, Nicole Ginger
Huancayo
2019
Esta obra está bajo licencia

https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
Repositorio Institucional - UNCP
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CENTRO DEL PERÚ
FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA
EVALUACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN Y EL TIEMPO DE CONTACTO
DE LAS NANOPARTÍCULAS DE ÓXIDO DE SILICIO PARA LA
INACTIVACIÓN DE LAS BACTERIAS E. COLI EN AGUAS RESIDUALES
MUNICIPALES
Tesis
PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL DE INGENIERO QUÍMICO

AMBIENTAL
Presentado por:
CORNELIO PUCUHUAYLA, Eileen Solange
QUIÑONES CORONEL, Nicole Ginger
HUANCAYO, PERÚ
2019
ASESOR:
Ms. EVER F. INGARUCA ALVAREZ
CO-ASESORA:
Mg. ANA MARÍA OSORIO ANAYA
ii
DEDICATORIA
Este trabajo va dedicado de manera
especial a mi madre Doris, siendo ella la
base para la construcción de mi carrera
profesional, siempre le estaré agradecida
por todo.
Eileen Cornelio
Este trabajo va dedicado a Dios, por
concederme la oportunidad de seguir con
vida, por estar conmigo en cada paso que
doy y por haber puesto en mi camino a mis
padres, Rubén y Mery, a mis hermanos,
Ayrton y Patrick que han sido mi apoyo
durante todo el periodo de estudio.
Nicole Quiñones
iii
AGRADECIMIENTO
A Dios, por darnos la vida y guiarnos en las metas propuestas a lo largo de nuestras de
vidas.
A nuestros padres, que son su amor, comprensión y trabajo arduo nos educaron y
apoyaron en toda nuestra formación profesional.
A nuestra alma mater, la Universidad Nacional del Centro del Perú, que gracias al
concurso de Tesis de Pregrado 2018-UNCP, nuestro proyecto de tesis se pudo concretar
con éxito; brindándonos el apoyo económico y la asesoría necesaria para desarrollar la
presente tesis.
A nuestro asesor, Ms. Ever Ingaruca Alvarez, por todo su apoyo brindado en asesorías y
consejos para guiarnos al final de nuestro trabajo.
A nuestra co-asesora, la Dr. Ana María Osorio, por compartir sus conocimientos y
experiencias, así como por recibirnos en la Universidad Nacional Mayor San Marcos,
brindarnos las facilidades para desarrollar la experimentación de nuestro trabajo en el
Laboratorio de Nanotecnología e Innovación Tecnológica de la Facultad de Química e
Ingeniería Química.
Al Dr. Julio Santiago Contreras, docente de la Universidad Nacional Mayor San Marcos,
por permitirnos el uso del equipo espectrofotómetro UV-Vis, para las mediciones de
crecimiento bacteriano.
A nuestros compañeros Hidalgo Eustaquio y Bryan Canal, por la ayuda prestada en toda
nuestra estadía en la Universidad Nacional Mayor San Marcos.
iv
RESUMEN
En el presente trabajo de investigación se evaluó un nuevo método de inactivación de
bacterias E. coli presentes en aguas residuales municipales sintetizadas en un reactor
RAFA utilizando nanopartículas de sílice (NPs-SiO2). La investigación se dividió en 3
etapas. La etapa 1 consistió en la caracterización de las NPs-SiO2, el estudio de la
actividad microbiana de las NPs-SiO2, el arranque del reactor RAFA y las mediciones del
reactor, en la etapa 2 se continuó las mediciones hasta determinar una eficiencia mayor
del 80%, y en la etapa 3 ya con una eficiencia del 81,5% se empezó con la evaluación de
concentración y el tiempo de contacto de las NPs-SiO2 para inactivar las bacterias E. coli
en el efluente del reactor. Las NPs-SiO2 se caracterizaron mediante Difracción Dinámica
de Luz (DLS) obteniendo un diámetro hidrodinámico entre 11 y 11,7 nm, por Microscopia
Electrónica de Barrido (SEM) mostrando nanopartículas aglomeradas formando poros de
menos 100 nm con forma semiesféricas, por Microscopia Electrónica de Transmisión
(TEM) mostrando un diámetro menor a 20 nm y por el método de Espectrofotometría
UV-Vis obteniendo un pico más elevado en 195,5 nm que corresponde al grupo funcional
con el material sintetizado. En el estudio de la actividad microbiana, se realizaron lecturas
de inhibición de crecimiento bacteriano de la bacteria E. coli a concentraciones bajas y
altas, se obtuvieron valores de CMI de 20 ppm en concentraciones bajas y de 120 ppm en
concentraciones altas. El reactor trabajó 168 días y se logró la remoción de DQO de más
del 80 % con un TRH de 12,8 horas y un caudal de 4,8ml/min. Del efluente del reactor
RAFA se inoculó las NPs-SiO2 a concentraciones de 20, 120 y 240 ppm y se tomaron
muestras a diferentes tiempos de 2, 4, 6 horas de contacto, obteniendo un resultado óptimo
de concentración y tiempo de 120 ppm en 2 horas presentando una inactivación de 71,4%,
Se concluye que se logró desarrollar una metodología simple y muestra que el uso de las
NPs-SiO2 pueden inactivar mas no eliminar las bacterias E. coli.
v
INTRODUCCIÓN
Unos de los problemas mayores asociado con la contaminación hídrica es la descarga de
agentes patógenos de las plantas de tratamiento de las aguas residuales municipales lo
que ocasiona el daño de biodiversidad y enfermedades. Para solucionar este problema, es
importante el tratamiento de las aguas residuales con nuevas tecnologías que incluyan
tratamientos avanzados para la disminución del crecimiento bacteriano presente en los
efluentes de las plantas de tratamiento de aguas residuales. Existen diferentes formas de
eliminar los agentes patógenos presentes en el agua. Entre los métodos de desinfección
más empleados se encuentra la cloración, ozonificación, luz ultravioleta, la
nanotecnología entre otros (Unidas, 2016)
Actualmente la rama de la nanotecnología se ha identificado como una solución a la
eliminación o inactivación de las bacterias presentes en las aguas residuales municipales
e industriales. En estudios anteriores se ha identificado que las NPs pueden interactuar
directamente con las células microbianas y provocar la inactivación de las mismas
(Eversdijk J, 2012)
Con base a lo anterior surge la presente investigación que tiene como objetivo el
desarrollo de nuevos métodos para la inactivación de E. coli mediante la aplicación de
NPs-SiO2 se divide en tres capítulos. El primero se basa en la revisión bibliográfica que
contiene los antecedentes internacionales de la investigación. El segundo capítulo se
presenta la parte experimental: Materiales, equipos y procedimiento y en el último
capítulo se presentan el tratamiento de datos y discusión de resultados y por último se
presentan las conclusiones recomendaciones y anexos.
vi
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL:
Evaluar la concentración y el tiempo de contacto de las NPs-SiO2 para la inactivación de
las bacterias E. coli en aguas residuales municipales.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
 Caracterizar una muestra de NPs-SiO2.
 Analizar la actividad antimicrobiana de las NPs-SiO2.
 Determinar la concentración de NPs-SiO2 que inactive las bacterias E. coli presentes a
aguas residuales municipales
 Determinar el tiempo de contacto en que las NPs-SiO2 inactiven a las bacterias E. coli
presentes en las aguas residuales municipales
vii
SIMBOLOGIA UTILIZADA
SÍMBOLO SIGNIFICADO UNIDADES
pH Potencial de Hidrógeno -0 – 14
𝑇𝑅𝐻𝑖 𝑇𝑖𝑒𝑚𝑝𝑜 𝑑𝑒 𝑟𝑒𝑠𝑖𝑑𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎 ℎ𝑖𝑑𝑟𝑎𝑢𝑙𝑖𝑐𝑎 h
mg/L Miligramos por litro mg/L
Ppm Partes por millón mg/L
μS Micro siemens μS
NMP Nivel más probable -------
Q Caudal ml/min
STD Solidos totales disueltos ppm
UFC Unidad formadora de colonias
NTU Unidades nefelométricas de turbidez < 30 NTU
Nanopartículas de óxido de silicio o

NPs-SiO2 silice
NPs-ZnO Nanopartículas de óxido de zinc
DBO Demanda bioquímica de oxigeno mgO2/l
DQO Demanda química de oxigeno mgO2/l
CMI Concentración mínima inhibitoria
UASB Upflow Anaerobic Sludge Blanquet
Reactor Anaerobio de Flujo

RAFA Ascendente
E. coli Escherichia coli
ETEC Enterotoxigénico
viii
EPEC Enteropatógeno
EHEC Enterohemorragico
EIEC Enteroinvasivo
P Población
D.O. Densidad óptica λ/cm
A Absorbancia
T Transmitancia
°C Grados Celsius
Planta de tratamiento de aguas

PTAR residuales
TLF Tratamiento de lagunaje facultativo
SEM Microscopio Electrónico de Barrido
Microscopio Electrónico de
TEM Transmisión
ix
ÍNDICE DE CONTENIDO
DEDICATORIA .............................................................................................................. iii

AGRADECIMIENTO ..................................................................................................... iv
RESUMEN ....................................................................................................................... v
INTRODUCCIÓN ........................................................................................................... vi
OBJETIVOS ................................................................................................................... vii
OBJETIVO GENERAL: ............................................................................................ vii
OBJETIVOS ESPECÍFICOS: .................................................................................... vii
SIMBOLOGIA UTILIZADA ....................................................................................... viii
ÍNDICE DE CONTENIDO .............................................................................................. x
ÍNDICE DE TABLAS .................................................................................................... xii
ÍNDICE DE FIGURAS ................................................................................................. xiii
ÍNDICE DE FOTOGRAFÍAS ....................................................................................... xiv
CAPÍTULO I .................................................................................................................. 15
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA...................................................................................... 15
1.1 ANTECEDENTES DEL PROBLEMA ........................................................... 15
1.2 BASES TEÓRICAS ............................................................................................. 24
1.2.1. Aguas Residuales ......................................................................................... 24
1.2.2. Aguas Residuales Municipales ..................................................................... 24
1.2.3. Elementos y variables Físicas, Químicas y Biológicas de las aguas residuales
Municipales. ........................................................................................................... 24
1.2.4. Escherichia coli. ........................................................................................... 26
1.2.5. Modelo matemático del crecimiento bacteriano.......................................... 32
1.2.6. Cinética del crecimiento poblacional ........................................................... 34
1.2.7. Medición del crecimiento bacteriano ........................................................... 36
1.2.8. Factores que afectan el crecimiento.............................................................. 40
1.2.9. Métodos de eliminación de bacterias ........................................................... 42
1.2.10. Métodos de Inactivación de la bacteria ...................................................... 43
1.2.11. Métodos para la determinación de la actividad antimicrobiana ................. 44
1.2.12. Nanopartículas. ........................................................................................... 48
1.2.13. Nanopartículas de óxido de silicio.............................................................. 51
1.2.14. Síntesis de las NPs-SiO2 ............................................................................. 52
1.2.15. Caracterización de nanopartículas de óxido de silicio (Sílice) ................... 54
x
1.2.16. Reactor Anaerobios U.A.S.B. ..................................................................... 59
1.3. MARCO CONCEPTUAL ................................................................................... 65
CAPITULO II ................................................................................................................. 67
PARTE EXPERIMENTAL ............................................................................................ 67
2.1. Materiales e insumos ........................................................................................... 67
2.2. Equipos e instrumentos........................................................................................ 68
2.3. Procedimiento ...................................................................................................... 69
2.3.1. Caracterización de una muestra de NPs-SiO2........................................... 69
2.3.2. Análisis de la actividad antimicrobiana de las NPs-SiO2 ......................... 71
2.3.3. Concentración de NPs-SiO2 ..................................................................... 80
CAPITULO III ............................................................................................................... 95
TRATAMIENTO DE DATOS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS ........................... 95
3.1. Caracterización de una muestra de nanopartículas de óxido de silicio ............... 95
3.1.1. Dispersión Dinámica de Luz .................................................................... 95
3.1.2. Microscopía Electrónica de Barrido (SEM) ............................................. 96
3.1.3. Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM) ..................................... 97
3.1.4. Espectrofotometría UV-visible ................................................................. 97
3.2. Análisis de Actividad antimicrobiana de las NPs-SiO2 ....................................... 98
1.2.1. Método de difusión de discos ................................................................... 98
1.2.2. Método de microdilución en caldo ......................................................... 100
1.2.3. Método de la curva de inhibición del crecimiento ................................. 102
3.3. Determinación de la concentración y el tiempo de contacto de las NPs-SiO2 para
la inactivación de las bacterias E. coli ...................................................................... 106
3.3.1 Porcentaje de inactivación de E. coli a diferentes concentraciones de NPs-SiO2
.............................................................................................................................. 107
3.3.2 Porcentaje de inactivación de E. coli a diferente tiempo de contacto con NPs-
SiO2 ....................................................................................................................... 109
CONCLUSIONES ........................................................................................................ 111
RECOMENDACIONES .............................................................................................. 113
BIBLIOGRAFÍA .......................................................................................................... 114
ANEXOS ...................................................................................................................... 119
xi
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1: Componentes y variables Físicas, Químicas y Biológicas de las aguas residuales

municipales. .................................................................................................................... 25
Tabla 2: Estándares de calidad de agua para diferentes usos ......................................... 26
Tabla 3: Clasificación taxonómica de Escherichia coli ................................................. 27
Tabla 4: Cepas de E. coli ................................................................................................ 29
Tabla 5: Escala de McFarland ........................................................................................ 39
Tabla 6: Principales tipos de nanopartículas y sus aplicaciones .................................. 50
Tabla 7: Ventajas y desventajas del tratamiento anaerobio............................................ 61
Tabla 8: Reacciones Bioquímicas en la digestión Anaerobia de la materia orgánica .... 64
Tabla 9: Distribución de microdiluciones en placa Elisa ............................................... 78
Tabla 10: Especificaciones del reactor RAFA ............................................................... 80
Tabla 11: Tiempo de retención hidráulica a investigar .................................................. 81
Tabla 12: TRH y Caudal de operación a investigar........................................................ 82
Tabla 13: Composición del sustrato sintético (basado sobre la demanda química de
oxígeno en el influente de 1150 mg/L) ........................................................................... 83
Tabla 14: Demanda Química de Oxigeno (DQO) para una razón C/N de 3 .................. 84
Tabla 15: Periodos del proyecto de investigación .......................................................... 89
Tabla 16: Distribución detallada de las muestras ........................................................... 91
Tabla 17: Resumen de datos para medición de diámetro hidrodinámico NPs SiO 2....... 95
Tabla 18: Resumen de mediciones realizadas en espectroscopia UV-Vis ..................... 98
Tabla 19: Sensibilidad de las cepas control .................................................................... 99
Tabla 20: Antibiótico y diámetros críticos para Enterobacterias ................................... 99
Tabla 21: Resultados de mediciones de halos de inhibicion a diferentes concentraciones
de NPs SiO2.................................................................................................................... 99
Tabla 22: Análisis microbiológico de E. coli ............................................................... 106
Tabla 23: Porcentaje de inactivación de bacterias E. coli con 20 ppm de NPs-SiO2 .. 107
Tabla 24: Porcentaje de inactivación de bacterias E. coli con 120 ppm de NPs-SiO2 107
Tabla 25: Porcentaje de inactivación de bacterias E. coli con 240 ppm de NPs-SiO2 108
Tabla 26: Porcentaje de inactivación de bacterias E. coli con 2 horas de contacto de NPs-
SiO2 .............................................................................................................................. 109
SiO2 .............................................................................................................................. 109
SiO2 .............................................................................................................................. 110
xii
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1: Componentes estructurales de E. coli ............................................................. 27

Figura 2: Clasificación de E. coli ................................................................................... 28
Figura 3: Bacteria que contiene un plásmido que codifica mientras que el otro no. ...... 31
Figura 4: El pilus en conexión citoplasmática temporal entre dos células ..................... 31
Figura 5: Replicación de la célula a través del pilus ...................................................... 31
Figura 6: El pilus se retira, dando como resultado dos células que contienen el mismo
plásmido.......................................................................................................................... 32
Figura 7: Crecimiento bacteriano ................................................................................... 33
Figura 8: Cámara de Neubaver ....................................................................................... 37
Figura 9: Antibiograma de disco de difusión ................................................................. 45
Figura 10: Método de microdilución en caldo de un extracto de planta contra B. subtilis
usando resazurina como indicador de crecimiento ......................................................... 46
Figura 11: Escala de comparación de los órdenes de magnitud hasta llegar a la escala
nanométrica .................................................................................................................... 48
Figura 12: Esquema de un equipo DLS .......................................................................... 55
Figura 13: Resonancia plasmónica (polarización) de una nano partícula metálica ........ 56
Figura 14: Esquema de microscopio electrónico donde se muestra las componentes
principales....................................................................................................................... 57
Figura 15: Partes del microscopio electrónico de transmisión ....................................... 58
Figura 16: Esquema de un reactor UASB con sus principales dispositivos. .................. 60
Figura 17: Etapa de la digestión anaerobia ..................................................................... 62
Figura 18: Diagrama de flujo de agua residual sintetizada en el reactor RAFA piloto .. 85
Figura 19: Histogramas obtenidos por DLS ................................................................... 96
Figura 20: Espectro UV-Vis de NPs SiO2 ...................................................................... 98
xiii
ÍNDICE DE FOTOGRAFÍAS
Fotografía 1: Pesado de agar Mueller Hinton ................................................................. 72

Fotografía 2: Autoclavado de materiales usados para preparación de cepas bacterianas de
E.Coli .............................................................................................................................. 72
Fotografía 3: Cultivo de E.Coli ...................................................................................... 73
Fotografía 4: E.Coli sembrada en agar Müeller Hinton ................................................. 73
Fotografía 5: Medición de pH en el caldo Mueller Hinton ............................................ 74
Fotografía 6: Muestra inoculada en el vortex ................................................................. 74
Fotografía 7: Comparación de Escala Mc Farland y solución bacteriana ...................... 75
Fotografía 8: Nanopartículas de óxido de silicio pesados en balanza analítica .............. 75
Fotografía 9: Inoculación de placas Petri con solución bacteriana ................................ 76
Fotografía 10: Aplicación de discos ............................................................................... 76
Fotografía 11: Medición de pH de rojo de fenol y caldo Mueller Hinton ...................... 77
Fotografía 12: Soluciones seriadas de NPs SiO2 ........................................................... 77
Fotografía 13: Nanopartículas de óxido de silicio pesados en balanza analítica............ 79
Fotografía 14: Espectrofotómetro UV-Vis usado para medir la densidad óptica........... 79
Fotografía 15: Celdas con muestra a analizar ................................................................. 80
Fotografía 16: Laboratorio de la Facultad de Química e Ingeniería Química ................ 81
Fotografía 17: Extracción de las muestras de lodos activos de CITRAR UNI .............. 85
Fotografía 18: Puntos de monitoreo del reactor RAFA .................................................. 86
Fotografía 19: Termometro digital , BOECO ................................................................. 87
Fotografía 20: Multiparámetro, Milwaukee modelo MW801 ........................................ 88
Fotografía 21: Distribución de NPs-SiO2 ....................................................................... 90
Fotografía 22: soluciones de NPs-SiO2 dentro del sonicador ........................................ 90
Fotografía 23: Distribución de las muestras ................................................................... 92
Fotografía 24: llenado de muestra para ser analizadas ................................................... 92
Fotografía 25: Imágenes SEM de NPs SiO2 ................................................................... 96
Fotografía 26: Imágenes TEM de NPs SiO2 ................................................................... 97
Fotografía 27: Halos de inhibición de Nps SiO2 ............................................................ 99
Fotografía 28: Placa Elisa para la determinación de la CMI de las NPs SiO 2 ............. 101
Fotografía 29: Materiales usados en el proyecto de investigación ............................... 123
Fotografía 30: Nanoparticulas de silice a concentraciones de 20,120 y 240 ppm ........ 123
Fotografía 31: Sonicación de las nanoparticulas de silice a diferentes concentraciones
...................................................................................................................................... 124
Fotografía 32: Muestra de agua residual simulada ....................................................... 124
Fotografía 33: Inoculacion de las nanoparticulas en el agua residual simulada ........... 125
Fotografía 34: Muestras en contacto con las nanoparticulas ........................................ 125
Fotografía 35: Envases para las muestras a analizar .................................................... 125
Fotografía 36: Toma de muestras a analizar ................................................................. 125
xiv
CAPÍTULO I
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
1.1 ANTECEDENTES DEL PROBLEMA
En los últimos años se han realizado muchas investigaciones en el campo de la
nanotecnología aplicados a temas de tratamientos de aguas residuales, dentro de ellos uno
de los que tiene muy pocos estudios son los métodos de inactivación de agentes patógenos
con nanopartículas de Sílice.
(Osorio, y otros, 2008) es su investigación “Síntesis y caracterización de materiales
macroporosos modificados de óxido de silicio” usan el método SOL-GEL para la
síntesis de nanopartículas de silicio. Usando silicato sódico como precursor, esta pasa a
una etapa de hidrólisis, para la formación de material macroestructurado aplicándose la
síntesis hidrotermal, para finalmente eliminar la materia orgánica por calcinación.
Mediante este proceso se observó la formación de macroporos con 100 nm de diámetro
determinada por el análisis de TEM.
(Arce, 2010) realizó una investigación denominada “Modificación y caracterización de
nanopartículas de sílice. Reactividad con estados excitados”. La modificación
consistió en esterificar sus grupos silanoles con alcoholes alifáticos y aromáticos para
luego caracterizarlos mediante las técnicas Espectroscopía UV-visible, Microscopía de
transmisión electrónica (TEM), entre otros. Los resultados mostraron que las
nanopartículas funcionalizadas en una suspensión de 0.0025 g/l y 0.6g/l muestran
absorción en la zona de los alcoholes libres usados para la síntesis de estas con ello
determinándose la unión de los alcoholes hacia la superficie del óxido de silicio. Para el
análisis en el equipo TEM, la muestra en suspensión 0,1 g/l de nanopartículas en mezcla
15
acetonitrilo: buffer fosfato, muestra un tamaño menor a 20nm y formación de agregados
en la suspensión.
En el estudio titulado “Nanopartículas de sílice: preparación y aplicaciones en
biomedicina”, (Llinàs & Sánchez-García, 2013) investigan las NPs-SiO2 mesoporosas
para su uso como vehículos de transporte aplicados a la biomedicina. El método usado
para su obtención es una adaptación del método Stöber, a la que se le incorpora un
tensoactivo catiónico. En su caracterización, este estudio determina el tamaño global de
las NPs-SiO2 mediante las técnicas del DLS y de TEM. Obteniéndose un valor promedio
de 200 nm de diámetro hidrodinámico.
(Espinoza, 2015) en su estudio “Síntesis de nanopartículas de SiO2 como potenciales
vehículos para administración de fármacos” sintetiza nanopartículas de dióxido de
silicio mediante el método de Stober modificado para evaluarlos como superficies de
actuación y liberar fármacos. La caracterización fue se realizó por SEM, TEM, DLS entre
otras; las que mostraron nanopartículas esféricas y porosas con un tamaño aproximado de
partículas 70 nm.
(Velazco, Rodríguez, Castillo, Fernández, & Rojas, 2016) realizan un estudio titulado
“Síntesis y caracterización de nanopartículas de SiO 2 por el método de Stöber”, con
la finalidad de estudiar la influencia de la velocidad de agregado de los reactivos en las
características de nanopartículas de SiO2, se ensayaron dos métodos de reacción uno que
denominamos lento que consiste en añadir de 4 ml de Tetraetil ortosilicato en 25 ml de
etanol a razón de 1 gota por segundo a una solución de 2 ml de Hidróxido de Amonio en
25 ml de Etanol, agitándose por 24 horas a 22°C; y uno rápido que mezcla 2 ml de
hidróxido de amonio en 25 ml de etanol con una solución de 4 ml de Tetraetil ortosilicato
en 25 ml de etanol en agitación por 24 horas a 22°C. Con la finalidad de estudiar la
16
estabilidad de los métodos aplicados, las Nps fueron dispersadas en agua/ Carboximetil
celulosa (CMC)/ Polietilenglicol (PEG) y Quitosano y se determinó la distribución de
tamaños empleando dispersión dinámica de luz (DLS). Se logra distinguirse partículas de
forma cuasi-esférica de diámetros inferiores a 100 nm.
(Darryl, Sheryl, & Tracey, 2006), analizaron las nanopartículas de sílice, sílice/óxido de
hierro y oro para conocer sus efectos en la actividad de crecimiento de las E.Coli. Las
mediciones de crecimiento bacteriano mostraron que a concentraciones de 3.3 x 10 -2 g/ml,
2.2 x 10-3 g/ml y 1.1 x 10-4 g/ml, el desarrollo de las bacterias no mostraban signos de
toxicidad.
(Ghaida, Muatez, & Ridha, 2009) realizó una investigación que lleva por título “The
Antimicrobial Activity of Silica Oxide Nanoparticles Against Some Bacteria and
Fungi Isolates “(“La actividad antimicrobiana de las nanopartículas de óxido de
sílice contra algunas bacterias y aislamientos de hongos”) el cual tuvo como objetivo
visualizar el efecto de las nanopartículas de sílice en algunas bacterias y hongos aislados.
Dichas nanopartículas se adquirieron de Sky Spring. Nanomateriales Inc., según
información el tamaño fue de 20 nm con una pureza de 98.7%, se preparó a diferentes
concentraciones de 10, 20, 30, 40 ppm disuelta en agua destilada con 5% de ácido acético,
según los estudios se obtuvo una concentración mínima de inactivación para las NPs SiO 2
de 10 ppm para todas la especies bacterianas analizadas dentro de ella E.coli ,demostrando
que las nanopartículas muestran actividad bacteriana a concentraciones bajas , si estas
sobrepasan los 5000 ppm se convierten en toxicas.
A nivel internacional existen interesantes investigaciones realizada por (Qian Wang,
2016) titulada “ Sequestration of nanoparticles by an EPS matrix reduces the
particlespecific bactericidal activity”(“El secuestro de nanopartículas por una
17
matriz EPS reduce la actividad bactericida específica de partículas”) cuyo objetivo
principal es verificar si las bacterias E. coli cubiertas de una sustancia polimérica
extracelular (EPS) pueden protegerlas de las NPs-ZnO y NPs-SiO2 , la cual reduciría la
actividad bactericida de estas nanopartículas mencionadas . Inicialmente realizaron unas
pruebas de toxicidad a las NPs-ZnO y NPs-SiO2 teniendo como resultado la inexistencia
de toxicidad. Realizaron experimentos de manipulación del EPS en las suspensiones de
E. coli o la eliminación de la EPS unida a las células por sonicación, que sirve para la
reducción de la actividad bactericida. Según resultados observados después de 16 horas,
la tasa de supervivencia de las bacterias E. Coli sin manipulación de EPS alcanzo el 65%
con (NPs-ZnO, 500 ppm) y el 79% con (NPs-SiO2, 500 ppm), mientras que la tasa de
supervivencia después de la eliminación de EPS por sonicación fue del 11 y 63 %
respectivamente. Asimismo, las nanopartículas después de la reacción con E. coli los
diametros disminuyeron de 15 nm a 11 nm para NPs-ZnO y 13 nm para NPs- SiO2. Por
lo tanto, según lo leído y entendido los resultados demuestran que las NPs-ZnO tienen
mayor efecto bactericida que las NPs- SiO2
(Annadurai, 2013) en su investigación “Fluorescent Silica Nanoparticles in the
Detection and Control of the Growth of Pathogen”(“Nanopartículas de sílice
fluorescente en la detección y control del crecimiento de patógenos”) cuyo objetivo
es el control del crecimiento de la bacteria E. coli mediante las nanopartículas de silice
fluorescentes modificadas en la superficie, estas nanopartículas fueron cubiertas o
modificadas con grupos carboxilos con carga positiva, trabajaron a concentraciones de 20
ppm, 50 ppm y 100 ppm se agregaron a un medio autoclavado libre de microorganismos
y luego el cultivo de E. coli se inoculó, se tomaron muestras cada 2 horas dando como
resultado que a concentración de 100 ppm tiene la máxima inhibición de bacterias E. coli
a las 2 primeras horas, también demostraron que las bacterias se dañaron seriamente en
18
su membrana externa y perdieron la confiabilidad celular de las especies bacterianas
cuando se contactaron con las nanopartículas. En conclusión, las nanopartículas
modificadas interactúan con las estructuras de las membranas bacterianas, lo que llevo a
la muerte de las células, lo que conlleva que la actividad antibacteriana de las
nanopartículas fue influenciada por el tamaño de estas.
Una parte fundamental para la investigación y del cual no es ubicó mucha información
es sobre la interacción de las nanopartículas de sílice con las bacterias E. coli , pero en
Turquia un grupo de investigadores realizaron el siguiente trabajo titulado
“Characterization of Silica Nanoparticles in Interaction with E. coli Bacteria”(“
Caracterización de nanopartículas de sílice en interacción con bacterias E. coli”),
(Ibtissem Gammoudi, 2013) tuvieron como objetivo principal la evaluacion de la
morfología de la bacteria E. coli en interacción con las NPs-SiO2. Este estudio se realizó
mediante microscopía de fuerza atómica y microbalanza de cristal de cuarzo utilizando
NPs-SiO2 con diámetros de 10 nm, 50 nm y 100 nm y bacterias inmovilizadas en películas
de múltiples capas de polielectrolito obtenidas mediante recubrimiento por centrifugación
o mediante el método de "capa por capa". Asimismo, mencionan que el tamaño, la forma,
la superficie química, la composición y el estado de agregación de las nanopartículas
serian determinantes en la interacción de la membrana de las bacterias. En sus primeros
experimentos interactuaron con nanopartículas de 100 nm donde se concluyó que su
morfología (forma y tamaño) de las bacterias no cambian, esto quiere decir que las
bacterias están sanas
Según estudios realizados por científicos brasileños (Maiara Emer, 2017) “Nature and
Bactericidal Impact on Surface Modified silica Nanoparticles.”(“ Naturaleza e
impacto bactericida en nanopartículas de sílice de superficie modificada”), lograron
demostrar el efecto bactericida de las nanopartículas de sílice cubiertas con distintos
19
grupos funcionales (NH2, NCO, SH y COOH) en bacterias E. coli y S. aureus , . En la
primera etapa, se obtuvieron nanopartículas de sílice por hidrolisis y condensación, en el
segundo paso, diferentes grupos funcionales se injertaron en la superficie de las
nanopartículas utilizando distintos silanos funcionalizados. Estas nanopartículas
presentan una estructura cuasi esférica con tamaño de aproximadamente 110 nm, el
tamaño de las nanopartículas se determinó mediante mediciones de partículas SEM y
mediante la técnica de DLS da como resultado un tamaño de 20 nm, estos resultados SEM
y DLS están bien correlacionados ya que el análisis de tamaño realizado por SEM se basa
en números mientras que DLS proporciona diámetros hidrodinámicos (Dh) que son
resultados basados en la intensidad. En las pruebas bacterianas trabajaron a
concentraciones de 5,10,15 ppm con los distintos grupos funcionales, y obtuvieron una
reducción del 60 % del crecimiento bacteriano con excepción del SiO2-NCO, y esto se
debió a la agregación de la muestra. Se concluyo que a una mayor concentración de
nanopartículas disminuye el crecimiento bacteriano y el mecanismo de actividad se
especula que estas nanopartículas son atraídas por la superficie de las bacterias y que
interactúan físicamente con su pared. Luego, que las partículas que presentan una
interacción mejorada con la pared bacteriana dan como resultado una alta actividad
bactericida. Pero la explicación más lógica se relaciona con la estabilidad coloidal, así
como con los efectos de carga de la superficie en general, y es razonable considerar que
las nanopartículas con menos estabilidad coloidal en un medio dado tenderán a
desarrollarse y da como resultado una reducción del área expuesta y por lo tanto la
interacción con las bacterias tiende a ser reducido
(Mustafa, 2018) menciona en el artículo titulado “Preparación, caracterización y
propiedades antimicrobianas de nano revestimiento a base de sílice” que se sintetizan
recubrimientos híbridos orgánico-inorgánicos con matriz orgánica (soluble en agua) que
20
contiene NPs-SiO2. El proceso de Stober se utilizó para preparar nanopartículas de sílice
monodispersadas. Las reacciones se llevaron a cabo a altas concentraciones de silicato de
sodio [Na2SiO3] = 0.1-1 M, bajas concentraciones de hidróxido de amonio [NH4OH] =,
acetonitrilo, en mezcla alcohólica (etanol, metanol y polietilenglicol). La composición y
morfología de las formulaciones de recubrimiento se estimaron mediante espectroscopia
infrarroja (FT-IR) y dispersión dinámica de la luz (DLS). Las actividades antimicrobianas
de estas formulaciones de recubrimiento fueron investigadas contra varias bacterias
patógenas (estreptomicina, Burkholderia pseudomallei, Salmonella gallinarum,
neumonía por Klebsiella, Xanthomonas campestris y Pseudomonas fluorescens). Se
reveló que las formulaciones resultantes que contienen NPs-SiO2 persisten su efecto
antimicrobiano durante un tiempo de almacenamiento razonable.
En el artículo, titulado “Antimicrobial propertiesof silica modified nanoparticles”
(“Propiedades antimicrobianas de nanopartículas modificadas con sílice”), (Thibaud
Coradin, 2013) menciona que los antibióticos encapsulados en nanopartículas tienen
muchas ventajas como: la composición química y las modificaciones en la superficie de
las nanopartículas permiten prolongar, localizar, apuntar y tener un medicamento
protegido que logran interactuar con el tejido enfermo. Haciendo un claro ejemplo con
óxido nítrico se analizó la actividad antimicrobiana, la cual se demostró la producción no
es parte de una respuesta eficaz del huésped a la infección por lo tanto no inhiben o
destruyen los microbios cuando se administra directamente in vitro. Es aquí donde se han
utilizado NPs-SiO2 liberadoras de óxido nítrico para controlar con éxito la formación de
biopeliculas mediante microorganismos como Pseudomonas aeruginosa y E. Coli.
En el año 2012 (Alexandros Besinis, 2012) realizo una investigación sobre “Los efectos
antibacterianos de las nanopartículas de plata, dióxido de titanio y óxido de sílice en
comparación con el desinfectante dental clorhexidina en Streptococcus mutans
21
utilizando un conjunto de bioensayos” donde Las NPs-SiO2 y NPs-TiO2 examinadas
en este estudio mostraron un efecto limitado o nulo contra S. mutans y, por lo tanto, no
pueden considerarse sustitutos de la clorhexidina. Este hallazgo está de acuerdo con
estudios previos que demostraron que se requieren concentraciones considerablemente
más altas de sílice o TiO2 (> 1000 mg/l) para comenzar a proporcionar alguna evidencia
de inhibición del crecimiento bacteriano. Sin embargo, el papel de los diferentes tipos de
sílice en la prevención de la adherencia bacteriana en sustratos orgánicos o inorgánicos
debe investigarse más a fondo.
Por otra parte (Y. Liu, 2009) en su investigación “Antibacterial activities of zinc oxide
nanoparticles against E. Coli O 157:H7” (“Actividades antibacterianas de las
nanopartículas de óxido de zinc contra E. Coli O 157: H7”) tiene como objetivo
investigar las actividades antibacterianas de las NP-ZnO y su modo de acción contra un
importante patógeno transmitido por los alimentos, E. Coli O157:H7, la cual el método
que utilizaron fue mostrar un efecto inhibitorio a diferentes concentraciones 0, 3, 6 mmol
con un tamaño de nanopartícula de 70 nm y para caracterizar los cambios de morfología
y estudiar el modo de acción de NP-ZnO contra Escherichia Coli usaron Microscopia
Electronica de barrido (SEM), transmicion Microscopia Electronica (TEM) y
espectroscopia Raman , con este ultimo las células bacterianas aumentaron después de la
exposición a NP-ZnO mientras que no hubo cambios significativos y en el ácido nucleico
se observaron bandas, por lo tanto se llegó a la conclusión de que si existe actividad
antimicrobiana NP-ZnO contra la bacteria E. coli O157:H7 y que los efectos inhibitorios
aumentan a medida que la concentración de NP-ZnO aumentan, la cual pueden
distorsionar y dañar las células bacterianas, el impacto que genera es que puede ser
utilizado para proteger la agricultura y seguridad alimenticia.
22
(Samah, 2017) muestra en su investigación el estudio de la actividad antimicrobiana de
dos nanopartículas, una de óxido de silicio y otra de zinc contra diferentes bacterias gram
positivas y gram negativas. Sus resultados mostraron que la mejor zona de inhibición era
20 mm a una concentración de 10 µg/ml de NP-SiO2 en P. aeruginosa, mientras que la
zona de inhibición más baja era (2 mm) a una concentración de 4 µg / ml en el misma
nanopartícula en S. epidermidis sin zona de inhibición a la concentración de 2 µg / ml
observada en la misma bacteria. Todas las bacterias probadas se inhibieron por completo
a la concentración de 0.625 µg / ml de NP-SiO2 y el (MBC) fue el mismo que (MIC) para
todos aislamientos probados. Por lo tanto, las dos nanopartículas (ZnO y SiO 2) tenían
actividad antibacteriana, pero las NP-ZnO eran mejor que las NP-SiO2 y podía inhibir la
mayoría de las bacterias patógenas importantes a las concentraciones analizadas aisladas
de pacientes hospitalizados.
(Sánchez-Venegas, y otros, 2016) en su investigación titulada “Actividad inhibitoria del
crecimiento bacteriano por cobre nanoestructurado obtenido de minerales de la región
Marañón: comparación con cobre comercial”, estudian la actividad inhibitoria para el
desarrollo bacteriano por NPs CuO cementado y comercial. Usaron dos tipos de
microrganismos: Staphylococcus aureus y Escherichia coli para determinar la
concentración mínima inhibitoria de las nanopartículas diluidas. Las técnicas usadas
fueron dilución en caldo y microdilución em caldo, aplicando una variación al
procedimiento general, ya que fortifican el medio de cultivo con rojo de fenol como
indicador de presencia bacteriana. Sus resultados mostraron una CMI de 20 μg/mL para
el cobre comercial frente a S. aureus. Por otro lado, el cobre cementado no produjo
impacto en la inhibición de desarrollo de ningún microorganismo usado.
23
1.2 BASES TEÓRICAS
1.2.1. Aguas Residuales
Según (OEFA, 2014) define como cualquier agua con cualidades originales que han sido
modificadas por las actividades humanas y/o animales y que por su calidad requieren un
tratamiento, antes de ser reusadas, desembocadas a un cuerpo natural de agua o
desechadas al sistema de alcantarillado.
1.2.2. Aguas Residuales Municipales
Según RJ N° 224-2013-ANA las aguas residuales domesticas las que pueden estar
combinadas con aguas de drenaje pluvial o con aguas residuales de industrias previamente
tratadas, para ser admitidas en los sistemas de alcantarillado de tipo combinado.
1.2.3. Elementos y variables Físicas, Químicas y Biológicas de las aguas residuales
Municipales.
Los elementos y variables físicas, químicas y biológicas que tienen las aguas residuales,
según definido por METCALF & EDDY INC, se indican a continuación:
24
Tabla 1: Elementos y variables Físicas, Químicas y Biológicas de las aguas residuales municipales.
CARACTERÍSTICA VARIABLE PROCEDENCIA
Propiedades Físicas Color Aguas residuales domesticas e industriales,
desintegración de materiales orgánicos.
Olor Aguas residuales de descomposición,
vertimientos industriales.
Sólidos Aguas de suministro, Aguas residuales
domesticas e industriales, erosión del suelo,
infiltración y conexiones incontroladas.
Temperatura Aguas residuales domesticas e industriales.
Orgánicos Carbohidratos Aguas residuales comerciales e industriales.
Grasa animal y Aguas residuales domésticas, comerciales e
aceite industriales.
Pesticidas Residuos Agrícolas.
Fenoles Vertidos industriales
Proteínas Aguas residuales domésticas y comerciales.
Otros Desintegración natural de materiales orgánicos
Inorgánicos Alcalinidad Aguas residuales domésticas agua de suministro,
infiltración de aguas subterráneas.
Cloruros Agua de suministro, Aguas residuales
domésticas, infiltración de aguas subterráneas.
Metales Vertimientos industriales, Aguas Residuales
pesados domésticas y residuos agrícolas.
Nitrógeno Aguas residuales domésticas y residuos
agrícolas.
PH Vertimientos industriales.
Fosforo Aguas residuales domésticas, industriales,
escorrentía residual.
Azufre Aguas de suministro, aguas residuales,
domesticas e industriales.
Compuestos Vertidos industriales.
tóxicos
Propiedades Biológicas Animales Cursos de aguas y plantas de tratamiento.
Plantas Cursos de aguas y plantas de tratamiento.
Protistos Aguas residuales domésticas, plantas de
tratamiento
Virus Aguas residuales domésticas, plantas de
tratamiento
Bacterias Aguas residuales domésticas, plantas de
tratamiento
Fuente: METCALF & EDDY INC, pag 6
Asimismo, cabe mencionar que en el DS. N° 004-2017-MINAM publicado en el diario
(PERUANO, 2017) se aprueban los Estándares de Calidad Ambiental definiendo los
25
límites Máximos Permisibles de las sustancias y o parámetros físicos, químicos y
biológicos presentes en el agua, que no muestran riesgos para la salud ni el ambiente
según categorías, a continuación se detalla solo los parámetros biológicos, para una
posible comparación con los resultados obtenidos en el proyecto.
Tabla 2: Estándares de calidad de agua para diferentes usos
ECA AGUA Categoría 1: Agua superficiales Categoría Categoría 4: Conservación del ambiente
ESTANDARES DE destinadas a la producción de agua 3: Riego Acuático
CALIDAD DE potable
AGUA-PERÚ
A1: Con A2: Con A3: Con Riego de E1: E2: E2: Ecosistemas
simple tratamiento tratamient vegetales Lagunas Ríos marinos costeros
desinfec convenciona o de tallo y lagos Costa,
Parámetro Unidad ción l avanzado alto y tallo Sierra y Estuario Marino
bajo Selva s s
DBO mg/L 3 5 10 15 5 10 15 10
DQO mg/L 10 20 30 40 ** - ** **
E. coli NMP/ 0 ** ** 1000 ** ** ** **

100
mL
** No aplica para esta subcategoría
Fuente: : Modificado de (Minam, 2017)
1.2.4. Escherichia coli.
1.2.4.1. Definición
Escherichia coli es un bacilo gran negativo, anaerobio facultativo de la familia
Enterobacteriaceae, género o tribu Escherichia, no forma esporas, son móviles (flagelos
perítricos), miden 0.5 u de ancho por 3 u de largo, reducen nitratos a nitritos y producen
vitamina B y K, y como partes principales son: Flagelo, fimbrias, ribosomas, cadena de
ADN circular, mesosoma, cápsula (Angeles, 2002)
26
Figura 1: Componentes estructurales de E. coli
Fuente: (Rojas., 2015)
1.2.4.2. Clasificación taxonómica
La Escherichia coli, también conocida como, E. coli, es uno de los organismos más
estudios por la humanidad y su clasificación taxonómica es la siguiente:
Tabla 3: Clasificación taxonómica de Escherichia coli
Escherichia coli
Reino: Bacteria
Filo: Proteobacteria
Clase: Gammaproteobacteria
Orden: Enterobaceriales
Familia: Enterobacteriaceae
Genero: Escherichia
Especie: E. Coli ( E. Freundi)
Nombre binomial
Escherichia Coli
Fuente: Microbiologia General, 2015
Se han demostrado la existencia de colonias de E. Coli. se reconocen 4 grupos
1.2.4.3. Clasificación de Escherichia Coli
27
Enteroinvasivo
(EIEC)
Enteropatogeno Escherichia Enterohemorragico

(EPEC) Coli (EHEC)
Enterotoxigénico
(ETEC)
Figura 2: Clasificación de E. coli
En la investigación realizada por (Ingerson, 2011) menciona que el mayor porcentaje de
bacterias E. coli no generan enfermedad, pero si una persona se enferma de E. coli, se
producirá infección en el tracto gastrointestinal y como consecuencia se producirá náusea,
vómito, diarrea y fiebre. Estas bacterias tienen como habitad natural el tracto
gastrointestinal, si se introducen en lugares erróneos, por ejemplo: los riñones o la sangre
pueden causar infecciones, y esta puede diseminarse en el cuerpo (el sistema nervioso, la
sangre, el hígado, etc.). Las formas más comunes de estar expuesto a las bacterias E. coli
son los alimentos y el agua contaminada.
Hay tipos específicos de E. coli que pueden o no causar enfermedades y se clasifican
como se muestra en la figura 2, la cual estas bacterias pueden ser transmitidos
generalmente a través de alimentos y agua contaminada. La tabla 4 resume los tipos
dañinos de E. coli, el modo de transmisión y evolución de la enfermedad.
28
Tabla 4: Cepas de E. coli
Cepas de E. coli Modo de transmisión Enfermedad
Enterotoxigénico Alimentos o ingestión de agua ETEC ocasiona diarrea sin

(ETEC) fiebre.
Enteropatógeno Los alimentos o agua, el contacto EPEC ocasiona diarrea

(EPEC) humano directo e indirecto acuosa, a veces con sangre.
Enterohemorrágico Alimentos o ingestión, el contacto EHEC ocasionan diarrea

(EHEC) humano directo o indirecto consagre, a veces pueden
dañar los riñones
Enteroinvasivo La ingestión de alimentos o agua EIEC provoca disentería,

(EIEC) como la diarrea. La fiebre
es un síntoma común
Fuente: Microbiologia General, 2015
1.2.4.4. Características de E. coli
 Las bacterias E. coli se caracterizan por tener bacilos Gram negativo, no
producción de acetoína. Ademas, fermenta la glucosa y lactosa con producción de
gas
 Las bacterias E. coli están cubiertas de tres elementos: la membrana
citoplasmática, la membrana externa y péptido glucano. El ultimo elemnto le da a
la bacteria su forma y rigidez, la cual le permite resistir presiones osmóticas
ambientales relativamente elevadas.
 La E. coli es una bacteria mesofílica, esto quiere decir que su optimo desarrollo o
crecimiento se encuentra en un rango de temperatura corporal (35-43°C) y su
temperatura límite de crecimiento se encuentra alrededor de 7°C. sin embargo, E.
coli son muy sensible a temperaturas superiores a 70°C, solo a esa temperatura
pueden ser eliminadas fácilmente.
 El pH y la actividad de agua tienen un papel muy importante ya que pueden influir
en la proliferación de la E. coli. Las condiciones óptimas de crecimiento para estos
parámetros son de 7.2 y 0.99 respectivamente. Para el crecimiento o desarrollo de

29
las bacterias E. coli varia en el rango de pH (3.8 a 9.5) y para la actividad de agua
(aw) superiores a 0.94. Por ello, el grado de acidez de un alimento puede definir
un factor de protección y seguridad.
 La adaptación de la E. coli no son muy comunes, debido a la adquisición de
nuevos genotipos a partir de plásmidos, bacteriófagos y otros elementos que ceden
su material genético. Así mismo, su capacidad de movilización favorece la
aparición de nuevas cepas con capacidades patógenas que no son reconocidas con
facilidad.
1.2.5.5. Reproducción bacteriana
Las bacterias, como células procarióticas, se dividen por medio de la fisión binaria.
(Raven, 2008) nos dice que la fisión binaria es un proceso de reproducción que resulta en
dos copias idénticas de la célula madre original. Una bacteria contiene un solo ADN
circular de doble cadena circular, el proceso comienza del origen de la replicación y
mover ambas direcciones alrededor del cromosoma hasta que se encuentren de nuevo en
el extremo de la replicación, creando dos moléculas del ADN. Durante este tiempo, la
célula se alarga y comienza a separarse una vez se completa la replicación del ADN.
En el caso de las bacterias E. coli la cantidad de tiempo que tarda en dividirse es de 20 a
30 minutos dependiendo de la cepa específica y el ambiente en el que se encuentra,
después de esta división las bacterias aún pueden intercambiar más información genética
y esto ocurre a través de la conjugación, transducción y la transformación. La conjugación
implica la conexión física de las células por medio de un pilus. Un pilus es una conexión
citoplasmática entre dos bacterias, en la cual intercambian segmentos de ADN hasta
inclusive la resistencia de los antibióticos. El proceso se muestra en las siguientes figuras
4,5 y 6 (Raven, 2008)
30
ADN
Plásmido
Figura 3: Bacteria que contiene un plásmido que codifica mientras que

el otro no.
Fuente: (Raven, 2008)
PILUS
Figura 4: El pilus en conexión citoplasmática temporal entre dos células
Figura 5: Replicación de la célula a través del pilus
31
Figura 6: El pilus se retira, dando como resultado dos células
que contienen el mismo plásmido
1.2.4.8. Uso de nutrientes
Las bacterias deben de consumir más de una fuente de energía para lograr sobrevivir, en
el caso de las E. coli prefieren consumir la glucosa sobre cualquier otra forma de azúcar.
Si en caso no existiera glucosa, las bacterias pueden activar un gen que le permite
consumir lactosa en vez de la glucosa. Si el ambiente no tiene la concentración de
nutrientes necesarios para poder alimentar a la población bacteriana, los E. coli, como
muchas otras especies, pueden ingresar a una fase latente, donde se minimizan sus
necesidades metabólicas y el crecimiento de la población se detiene. Las causas de
inactivar las bacterias pueden ser la baja concentración de los nutrientes, el medio
ambiente y otros factores que afectan el metabolismo, como la temperatura. (Aizawa,
1985)
1.2.5. Modelo matemático del crecimiento bacteriano
Según (Garre Perez, 2016) menciona que el crecimiento de una bacteria suele mostrarse
a través de la curva de crecimiento, que se define logarítmicamente el número de
microorganismos con respecto al tiempo. En la Figura 7 se muestra la forma sigmoidal
de la curva de crecimiento a condiciones constantes y favorables.
32
Figura 7: Crecimiento bacteriano
Fuente: (Velandia, 2014), pág. 6

Entonces podemos decir las fases del crecimiento bacteriano son las siguientes:
 Fase de latencia
En esta fase el número de bacterias no varían ya que se están adaptando al medio,
el tiempo de crecimiento puede variar entre horas a días.
 Fase exponencial
En esta fase se caracteriza por su duración, el tiempo necesario para que la
población duplique su tamaño exponencialmente, y esto se expresa como
generaciones por hora.
 Fase estacionaria
En esta fase en un determinado punto el crecimiento disminuye, la población no
aumenta, su actividad metabólica es más lenta y ocurre la fase de esporogénesis
para las especies productoras de esporas.
 Fase de muerte
En esta fase el recuento de células disminuye sensiblemente, el número de células
muertas supera al número de células vivas y disminuye los nutrientes
Este crecimiento eventualmente se convierte en una fase estacionaria, donde la
concentración de nutrientes es limitada y la acumulación de desechos metabólicos hacen
33
que el ambiente sea incapaz de soportar una colonia más grande de bacterias. En la
mayoría de los modelos esto se conoce como: “La capacidad de carga”, se describe la
siguiente formula donde:
P: población
r: tasa de crecimiento de la población
K: capacidad de carga en sí misma
𝒅𝑷 𝑷
= 𝒓𝑷 (𝟏 − ) (𝟏)
𝒅𝒕 𝑲
La solución a la ecuación diferencial 1 es entonces:
𝑲𝑷𝒐 𝒆𝒓𝒕
𝑷(𝒕) = (𝟐)
𝑲 + 𝑷𝒐 (𝒆𝒓𝒕 − 𝟏)
1.2.6. Cinética del crecimiento poblacional
La descripción del crecimiento bacteriano incluye aspectos tanto estequiométricos como
cinéticos. Mientras que la estequiometria se ocupa de los aspectos cuantitativos la cinética
describe el desarrollo dependiente del tiempo de los procesos bacterianos.
Los estudios estequiométricos de (A, 1998)se inician en la década de 1850 por Pasteur,
investigadores ingleses y alemanes informaron las primeras investigaciones cinéticas
justo antes de 1900, explicaban los ciclos de crecimiento de los lotes, los tiempos de
generación informados y las tasas de división celular. En 1912, Slator introdujo la
“constante de tasa de crecimiento” para relacionar la tasa de crecimiento con el numero
de células reales. Para el año 1942 J. Monod realizó el mayor paso en la cinetica del
crecimiento bacteriano, refinó y calibró el método para cuantificar el crecimiento
34
bacteriano a través de la turbidimetría y demostró como el crecimiento puede ser
matemáticamente descrito
1.2.6.1. Tasa de crecimiento basadas en el número de células
La ecuación para el aumento de células binarias dentro de un periodo de tiempo se da en
la ecuación o formula 3:
𝑵 𝒕 = 𝑵 𝒐 ∗ 𝟐𝒏 (𝟑)
Donde:
𝑁𝑡 𝑦 𝑁𝑜 : Numero de células al principio y después de haber transcurrido un determinado
tiempo t
n: Numero de divisiones en este periodo
Ahora para poder saber el número de divisiones, se da en la fórmula 4:
𝒕
𝒏 =𝒌∗𝒕= (𝟒)
𝒈
Donde:
k: constante
g: Tiempo de generación
Sustituyendo la fórmula 4 en la 3, se obtiene:
𝒕
𝑵𝒕 = 𝑵𝟎 ∗ 𝟐𝒌∗𝒕 = 𝑵𝟎 ∗ 𝟐𝒈 (𝟓)
𝟏 𝒍𝒏𝑵𝒕 − 𝒍𝒏𝑵𝟎 𝐥𝐨𝐠𝟐 𝑵𝒕 − 𝐥𝐨𝐠𝟐 𝑵𝟎

𝒌= = = (𝟔)
𝒈 𝒕. 𝒍𝒏𝟐 𝒕
35
1.2.7. Medición del crecimiento bacteriano
El crecimiento bacteriano se determina a través mediciones sucesivas en tiempos
determinados de la población de estudio, estas mediciones pueden ser directas o
indirectas.
MEDICIONES DIRECTAS:
 Determinación del peso húmedo
Para la determinación del peso húmedo se inicia de una muestra en suspensión que es
pesada luego de pasar por filtración y centrifugación, luego que se centrifuga el
cultivo se elimina el sobrenadante se determina el peso del sedimento
Ecuación que determinara el peso húmedo es:
𝑚𝐻 (𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑡𝑢𝑏𝑜+𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 ℎ𝑢𝑚𝑒𝑑𝑎)−(𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙 𝑡𝑢𝑏𝑜)

𝑝𝑒𝑠𝑜 ℎú𝑚𝑒𝑑𝑜 (𝑔 ) = (7)
𝑚𝑙 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎=5 𝑚𝑙
 Determinación del peso seco
Para la determinación del peso seco sucede como el anterior método indirecto, pero
el sedimento se seca antes de ser pesado a una temperatura de 105°C por toda una
noche hasta obtener un peso constante. Los resultados del peso seco suelen mostrar el
10-15% de los valores del peso húmedo. Existen varios inconvenientes ya que
requiere mucho tiempo y con bastantes errores por la dificultad de pesar con exactitud
cantidades menores a 1 mg y dentro del conjunto de bacterias no solo se encuentran
bacterias vivas , si no también muertas, material inerte y material orgánica adsorbida.
Ecuación para determinar el peso seco es:
36
𝑚𝑠 (𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑡𝑢𝑏𝑜+𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑠𝑒𝑐𝑎)−(𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙 𝑡𝑢𝑏𝑜)
𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑠𝑒𝑐𝑜 (𝑔 ) = (8)
𝑚𝑙 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎=5 𝑚𝑙
 Recuento de placas
Para estos recuentos se utilizan principalmente cámaras de recuentos (cámara de
Petroff Hauser, cámara de Neubaver ver figura 8). Una de las mayores ventajas del
recuento microscópico es que nos muestra el tamaño y la forma de los
microorganismos.
La muestra puede utilizarse como se encuentra inicialmente o puede prepararse en
dilución.
Figura 8: Cámara de Neubaver
Cálculo de recuento de placas:
Si se contaron todas las células presentes en los 4 cuadros de 1 mm 2 marcados como A,
B,C y D, la concentración celular seria:
𝑪 = 𝑵 ∗ 𝟏𝟎𝟒 ∗ 𝒅𝒊𝒍 (𝟗)
37
Donde:
C: cél/mL
N: promedio de células presentes en 1 mm2 (0.1ul)
dil: Factor de dilución (cuando se consideró necesario diluir)
Si las celulas se contaron en el cuadro central (25cuadros) considerando solo los 5 cuadros
menores del cuadro central marcado con X, la concentración celular seria:
𝑵
𝑪 = [ 𝟒−𝟔 ] ∗ 𝒅𝒊𝒍 (𝟏𝟎)
𝟏𝟎
Donde:
C: cél/mL
N: promedio de células presentes en los 5 cuadros pequeños del cuadro central
4*10-6: Corresponde al volumen de la muestra expresado en cm 3(ml)
dil: factor de dilución
MEDICIONES INDIRECTAS:
 Métodos turbidimétricos
Lo común de estos métodos consiste en la medición de la cantidad de luz que es
transmitida a través de un cultivo bacteriano. Cabe mencionar que las suspensiones
bacterianas dispersan la luz, al igual que cualquier partícula pequeña suspendida en
agua.
38
a) Escala de MacFarland:
Consiste en una serie de 11 tubos con patrones de turbidez previamente calibrados.
En estos tubos de vidrio herméticamente cerrados contienen cantidades de cloruro de
bario y acido sulfúrico a 0.36 M como se muestra en la tabla 5, por lo tanto generan
precipitados y se puede visualizar la turbidez en cada tubo. Para las cepas bacterianas
hay que definir la equivalencia entre la turbidez de los diferentes tubos. Una de los
inconvenientes es que es un método poco preciso.
Tabla 5: Escala de McFarland
N° BaCl2 0.048M H2SO4 0.36 M Vf N° Células

ml ml ml
0.5 0.05 9.95 10 1.5*108
1 0.1 9.90 10 3*108
2 0.2 9.80 10 6*108
3 0.3 9.70 10 9*108
4 0.4 9.60 10 12*108
5 0.5 9.50 10 15*108
6 0.6 9.40 10 18*108
7 0.7 9.30 10 21*108
8 0.8 9.20 10 24*108
9 0.9 9.10 10 27*108
10 1 9.00 10 30*108
b) Espectrofotómetro
Según antecedentes, medir la densidad óptica es equivalente a la absorbancia, por
ende, para hallar la densidad óptica es que podemos reconocer las fases de crecimiento
de las bacterias, y asi tomar decisiones sobre los tiempos de dilución. Con las
mediciones de densidad óptica podemos definir la curva de crecimiento graficando
los valores de densidad óptica (DO) con el tiempo, recordando que cuando se usa la
transmitancia (T = % de la luz incidente recibida por el fotodetector), es necesario
utilizar la transformación: DO = 100 - T
39
𝒍𝒐𝒈𝑻
𝑫. 𝑶. = 𝑨 = − (𝟏𝟏)
𝟏𝟎𝟎
Donde
D.O.: Densidad óptica
A: Absorbancia
T: Transmitancia
1.2.8. Factores que afectan el crecimiento
Todos los microrganismos necesitan una fuente de micronutrientes para que puedan
crecer y vivir en un medio, por lo cual estos factores son diferentes para cada
microorganismo, por ejemplo, las bacterias requieren de ambientes diferentes que las
levaduras para poder crecer. Los diferentes factores que influyen en el crecimiento
bacteriano son generalmente conocidos como factores intrínsecos y extrínsecos.
Los factores intrínsecos se refiere a las características físico-químicas y los factores
extrínsecos a las condiciones de almacenamiento y las condiciones ambientales. Existen
otros factores las cuales tienen que ver con las características del propio microorganismo
y son llamados factores implícitos
1.2.8.1. Factores intrínsecos
a. Nutrientes
La presencia de vitaminas, aminoácidos, etc de mayor o menor cantidad va a permitir el
crecimiento de algunos microorganismos. En el caso de las bacterias E. coli los nutrientes
que influyen en el crecimiento son: fuente de carbono, oxigeno, nitrógeno, fosforo, azufre,
40
hidrogeno, potasio y magnesio como macronutrientes y elementos traza Cobalto, cobre,
zinc, molibdeno, etc como micronutrientes.
b. pH
Las bacterias E. coli pueden sobrevivir en el ácido estomacal de pH 2, según estudios
realizados por (Spector, 1995) las bacterias E. coli poseen sistemas para sobrevivir a pH
bajo, se han comprobado 3 mecanismos de las cuales 2 son dependientes de la
descarboxilasa de aminoácidos y el restante es con catabolitos de glucosa y por lo tanto
pueden considerarse una bacteria intrínsecamente resistente a los ácidos, pero el pH
óptimo para el crecimiento de las bacterias E. coli es alrededor de pH igual a 7
c. Agua disponible
La disponibilidad de agua es otro determinante clave de la supervivencia y el crecimiento
de E. coli. (Van, 2010) nos dice que la disminución severa del contenido de agua provoca
un aumento del estrés hídrico alrededor de las células, mientras que la saturación de agua
rodeará rápidamente las células con agua e inducirá condiciones anóxicas. Ambos
extremos tienen graves consecuencias para la fisiología y la supervivencia de E. coli en
el sistema, dado que una sequía extrema puede provocar una muerte celular masiva,
mientras que las inundaciones cambiarán el metabolismo celular a procesos
anaeróbicos. Sin embargo, aún no está claro el comportamiento de E. coli en ambientes
abiertos, en particular cómo el organismo se enfrenta a las fluctuaciones en la
disponibilidad de agua.
41
1.2.9.2. Factores extrínsecos
a. Temperatura
La temperatura es otro de los factores importantes que afecta la supervivencia y el
crecimiento de las bacterias E. coli. En un cuerpo animal hospedador, la temperatura suele
ser estable, mientras que puede variar fuertemente en un ambiente no hospedador, como
el suelo o el agua. Estudios realizados por (Semenov, 2007) mostró que la supervivencia
a temperaturas fluctuantes era generalmente más baja que la temperatura constante.
Además, la reducción en la supervivencia del organismo fue más pronunciada cuando la
amplitud en las oscilaciones de temperatura fue mayor (7 ° C) que a amplitudes menores
(4 ° C). Entonces se podría concluir a bajas temperaturas disminuyen, mientras que las
temperaturas superiores a 40°C desnaturalizan las bacterias, se necesita una temperatura
óptima para un crecimiento la cual es de aproximadamente 37 °C.
1.2.9. Métodos de eliminación de bacterias
1.2.9.1. Alquilantes (Óxido de etileno, formaldehido, glutaraldehído)
Estos agentes tienen un mecanismo de acción en la cual modifican de forma irreversible
los grupos funcionales de proteínas, el núcleo de la bacteria y provocan inhibición
enzimática, lo que lleva a la muerte celular.
1.2.9.2. Autoclavado
Es un método de eliminación microbiana más efectivo, y asegura la eliminación al 100
%, este proceso utiliza vapor de agua a 121°C durante 15 min o 20 min. El equipo que se
utiliza es la autoclave, del cual existen distintos tipos, como ser:
 Vertical de manejo manual
 Que opera por gravedad
 De esterilización rápida
42
1.2.9.3. Radiaciones UV
El principal mecanismo es la incidencia de la luz UV sobres las membranas de las
bacterias, al tener contacto daña la membrana y por ello genera la destrucción de la
bacteria.
1.2.9.4. Filtración
Existen filtros de membrana, son inertes y nos dan un buen medio para aglomerar a los
microorganismos, por ejemplo, para el cultivo de bacterias a concentraciones bajas en un
gran volumen del liquido
1.2.9.5. Tratamiento de lagunaje facultativo
El tratamiento de lagunaje facultativo consiste en una planta de tratamiento de aguas
residuales (PTAR) la cual está compuesta por un pre tratamiento, tratamiento primario y
lagunas biológicas. Para evaluar la eficiencia del tratamiento de lagunaje facultativo se
realizaron muestreos de entrada y salida de la PTAR, realizando análisis físicos, químicos
y microbiológicos.
1.2.10. Métodos de Inactivación de la bacteria
Es el proceso en la cual se logra la detención de su crecimiento de las bacterias, pero lo
que se observa son poblaciones de organismos y no individuos y esto resulta en un efecto
cinético en términos de la tasa de crecimiento. (Bravo, 2015), menciona los siguientes
métodos de inactivación:
 Adición de sustancias químicas
 Ozono – luz ultravioleta
 Radiación solar
 Nanotecnología
43
1.2.11. Métodos para la determinación de la actividad antimicrobiana
Se realizan con la finalidad de determinar con pruebas In vitro la susceptibilidad que
tienen las bacterias frente a agentes antimicrobianos, el resultado va a depender del
método seleccionado, el grado de solubilidad de los compuestos a analizar y los
microorganismos estudiados. Las principales técnicas usadas son las siguientes:
1.2.11.1. Método de difusión
a. Método del antibiograma disco-placa
Es el método usado en muchos laboratorios de microbiología clínica para rutinas de
pruebas de susceptibilidad antimicrobiana. En la actualidad el Instituto de Normas
Clínicas y Laboratorio publicó estándares aprobados y normalizados para ciertas
patógeno bacteriano fastidioso como el estreptococo, haemophius influenzae,
haemophilus parainfluenzae. Neisseria gonorrhoeae y neisseria meningitidis, usándose
medios de cultivo específicos, condiciones de incubación y criterios de interpretación
para zonas de inhibición (Clinical and Laboratory Standars Institute, 2012).
Esta técnica está basada en el método de Kirby-Bauer. El método consiste en la
inoculación de placas agar con un medio de cultivo con una agente patógeno identificada,
sobre ella se coloca un disco de papel filtro de 6mm de diámetro aproximado que contiene
una cantidad del compuesto de prueba a concentración conocida. Las placas Petri son
incubados bajo adecuadas condiciones. Generalmente, los agentes antimicrobianos se
difunden en el agar e inhiben el crecimiento del microorganismo estudiado, para que
luego el diámetro de la zona de inhibición de crecimiento sea medido. El método nos
provee de resultados cuantitativos, ya que el resultado caracteriza la bacteria como
susceptible (S), intermedio (I) o resistente (R). Para lograr la interpretación de los
44
resultados es necesario comparar los efectos con un antibiótico de control ya estudiado
(Balouiri, Sadiki, & Koraichi, 2015).
Este método no es apropiado para la determinación de la concentración mínima
inhibitoria, ya que no es posible cuantificar la cantidad agente antimicrobiano difundido
en medio de agar (Stella & Marin, 2009).
La concentración mínima inhibitoria (CMI) es definida como la concentración más baja
del agente estudiado que puede inhibir el crecimiento de un patógeno al ser incubado por
24 horas. Otro término familiarizado a este tema es la concentración mínima bactericida
(CMB), que es básicamente la concentración más baja del compuesto estudiado para
evitar el crecimiento de un organismo.
Figura 9: Antibiograma de disco de difusión

Fuente: (LabMedic, 2019)
45
1.2.11.2. Método de dilución
Este método es apropiado para la determinación de la CMI y CMB ya ofrece la posibilidad
de estimar la concentración del agente antimicrobiano estudiado en el agar o medio de
cultivo.
a) Dilución en caldo
Se prepara soluciones de la sustancia estudiada a concentraciones creciente usando
diferentes tubos o microplacas que son inoculadas con una solución bacteriana ajustada a
0.5 escala de McFarland, luego son incubadas a condiciones adecuadas de acuerdo al
microorganismo a analizar. La CIM es determinada a simple vista ya que se observa la
turbidez en los tubos interpretada como el crecimiento del microorganismo.
La microdilución es una técnica que no requiere de mucha muestra, se usa una placa de
96 pocillos (12mm x 8mm), se puede estudiar 8 antimicrobianos y 11 diluciones con un
mismo microorganismo. Al incubarse se observa la turbidez de los pocillos para
determinar la CIM.
Figura 10: Método de microdilución en caldo de un extracto de planta contra B. subtilis usando resazurina
como indicador de crecimiento
Fuente: (Balouiri, Sadiki, & Koraichi, 2015)
46
b) Dilución en agar
El medio de cultivo, en este caso agar, es fortificado con una determinada concentración
de sustancia analizada. Este nuevo medio es inoculado con el microorganismo que pasa
a incubarse. Finalmente se verifica si el agente patógeno crece o no. El principal
inconveniente de este método consiste la gran cantidad de muestra a usarse.
1.2.11.3. Método de bioautografía
En este método se usa una placa de cromatografía en capa fina, la que absorbe las
muestras a analizar. El primer paso es colocar los analitos a investigar en las placas
mencionadas para que se pueda dar la selección de la fase móvil. Esta muestra en colocada
en una placa petri inoculada con la bacteria por unas 8 a 12 horas en refrigeradora. Paso
seguido se incuba de acuerdo al microorganismo estudiado. Transcurrido el tiempo
adecuado, se forma un halo de inhibición la que será medida (Stella & Marin, 2009).
1.2.11.4. Curva de la letalidad bacteriana o Método de la curva de inhibición del
crecimiento
Es el método más apropiado para la determinación de los efectos bacterianos y fúngicos.
Brinda información sobre la interacción dinámica entre la cepa microbiana y el agente
antimicrobiano. Este método permite conocer el efecto antimicrobiano sobre tiempo y
concentración como variables dependientes (Pfaller, Sheehan, & Rex, 2004).
El análisis consiste en analizar la tasa de muerte de un microorganismo en contacto con
el agente antibacteriano y una muestra de control sin esta sustancia. La solución
bacteriana en caldo es ajustada a 0.5 escala de Mc Farland y es incubada en diferentes
intervalos de tiempo de 0, 4, 6, 8, 12 y 24 horas. El porcentaje de células muertas es
calculado por la determinación del número de células vivas (UFC/ml) de cada tubo por el
método recuento de placas. Para la visualización de las curvas de mortalidad, esta se
47
construye en formato semilogaritmico, en el eje de las ordenadas las Unidades
Formadoras de Colonia (UFC) y en el eje de las abscisas el tiempo (Balouiri, Sadiki, &
Koraichi, 2015).
1.2.12. Nanopartículas.
Según (Ouahid Hessissen, 2016) define la palabra nano procede del latín “nanus” y
significa enano. En la ciencia y tecnología se utiliza el sistema internacional de unidades
(SI) que emplea el término nano para indicar un factor de 10 -9.
Figura 11: Escala de comparación de los órdenes de magnitud hasta llegar a la escala nanométrica
Fuente: (Silva, 2015),Pag21
Las nanopartículas están compuestas por átomos y moléculas cuyas dimensiones son
inferiores a 100 nm, las cual estas se dividen en dos generaciones, primera generación
(entre 10 y 10 nm) y la segunda generación (entre 10 y 1 nm). El objetivo principal de las
nanopartículas se basa en la reducción de tamaño.
 Al reducir el tamaño se permite sintetizar estructuras con mayor relación superficie-
volumen, es decir hay mayor cantidad de átomos o moléculas superficiales por
unidad de volumen.
48
 Aparecen propiedades propias de sistemas de tamaño reducido, efecto del tamaño
cuántico, ya que están constituidos por un pequeño número de átomos o moléculas.
Los efectos cuánticos dominan el comportamiento de la materia a escala
nanométrica, afectando a sus propiedades ópticas, eléctricas y magnéticas.
 La forma en la que se dispersan las moléculas da lugar a diferencias importantes en
cuanto a las propiedades mecánicas.
1.2.12.1. Principales tipos de nanopartículas y sus aplicaciones
49
Tabla 6: Principales tipos de nanopartículas y sus aplicaciones
Utilizadas en aplicaciones médicas. No

Nanopartículas obstante, presentan una biodistribución
poliméricas no específica y una baja capacidad de
carga.
Macromoléculas definidas, que
presentan una estructura altamente
ramificada formada por un núcleo y
Dendrimeros
múltiples ramas. Su estructura molecular
NANOPARTÍCULAS
les permite cargar diferentes agentes
ORGÁNICAS
activos.
Nanosistemas esféricos formados por
una bicapa lipídica que permiten la
encapsulación de fármacos hidrofílicos e
Liposomas hidrofóbicos. A pesar de estar
ampliamente estudiados, una de sus
principales desventajas es su rápida
eliminación.
Las nanopartículas de silicio son inertes,
Nanopartículas biodegradables y presentan una buena
de óxido de biodistribución. Son fácilmente
silicio sintetizables y se pueden obtener de
distinta forma y tamaño.
Nanopartículas metálicas que presentan
unas propiedades ópticas y electrónicas
que dependen totalmente de su forma y
Nanopartículas
tamaño. No presentan toxicidad
de oro
intrínseca. Además, son fácilmente
funcionalizables mediante la formación
de puentes Au-SR.
NANOPARTÍCULAS
Nanopartículas de óxido de hierro,
INORGÁNICAS
típicamente de magnetita (Fe3 O4),
biocompatibles y fácilmente
Nanopartículas
biodegradables. Tienen gran potencial
de óxido de
en biomedicina dada su capacidad
hierro
intrínseca de ser monitorizadas in vivo
por técnicas de resonancia magnética
nuclear.
Monocapa de grafeno enrolladas en
forma de cilindros. Presentan una
Nanotubos de
elevada superficie específica que
carbono
permite anclar una amplia variedad de
moléculas terapéuticas.
Fuente: (Maria C. Llinas, 2013)
50
1.2.13. Nanopartículas de óxido de silicio
Estas nanopartículas están constituidas por una matriz de sílice y se caracterizan por la
presencia de poros de un diámetro comprendido entre los 2 y 50 nm (Rosenholm, 2010).
Esta presencia da a las nanopartículas dos dominios diferenciados: una superficie externa
y otra interior en los poros. Estas propiedades las hacen capacez para ser utilizadas en un
amplio campo de aplicaciones que van desde la biotecnología y nanomedicina a la ciencia
de los materiales. Las principales características de las nanopartículas de óxido de silicio
son:
 Elevada área superficial (>1000 m2.g-1) que permite almacenar una gran cantidad
de carga (35%)
 Elevado volumen de poro (>1 cm3 g-1), gran porosidad y elevado orden del poro.
 Tamaño de poro modificable con una estrecha distribución (2-10 nm).
 Buena estabilidad química y térmica.
 No tóxicas y biocompatibles con el organismo humano.
 Dos superficies funcionalizables (interna y externa).
 Fácilmente modificables morfológicamente (control en tamaño, poro y forma).
 Fácilmente sintetizables.
1.2.13.1. Síntesis y caracterización de Nanopartículas
Existen diferentes formas de obtener nanopartículas, y se clasifican en dos grandes
grupos, el método top-down, que es el continuo rompimiento de un material y las de
bottom-up que consiste en la construcción de nanomateriales a partir de sus
constituyentes. Por otro lado, la obtención de nanopartículas se puede clasificar en
métodos de síntesis físicas, químicas o biológicas. Entre éstas se encuentran los siguientes
métodos (Cruzat C, 2010):
51
 Métodos físicos: condensación con un gas inerte, descarga al arco eléctrico, corte
por láser, pirólisis y pirólisis por aerosol.
 Métodos químicos: reducción del metal, síntesis solvotermal, síntesis fotoquímica,
síntesis electroquímica, rutas termolíticas, rutas sonoquímicas, micelas y micro
emulsiones, interfaces líquido-líquido.
 Métodos biológicos: microorganismos son los reactores y realizan la síntesis de las
nanopartículas.
 Métodos híbridos: es una mezcla de los métodos anteriores; como la síntesis láser,
el procesamiento selectivo de tamaño post sintético y la dispersión atómica de
metal solvatados (DAMS).
En la gran mayoría de los métodos y rutas sintéticas, la formación de las nanopartículas
depende de la nucleación que se efectúa al momento de la síntesis de éstas y la estabilidad
que se le otorgue a la partícula nanométrica cuando se forma. Es por esto que los métodos
químicos son los más utilizados debido a su potencial para controlar adecuadamente el
tamaño, la distribución de tamaño y la forma de las nanopartículas. Los métodos químicos
tradicionales utilizan agentes reductores y estabilizadores durante la síntesis que en
alguna medida son tóxicos y contaminantes.
1.2.14. Síntesis de las NPs-SiO2
La síntesis de NPs-SiO2en estos últimos años se ha incrementado debido a su fácil
preparación y a su aplicación en diversas áreas como: catálisis, separación, pigmentos,
farmacia, electrónica, detergentes, cosméticos y sensores, la cual cuenta con una
estructura porosa y características como alta área superficial (>1000 m2.g) y gran
volumen de poro (0.8-15 cm3/g) y distribución uniforme de tamaño de poro (Rosenholm,
2010).
52
Según (Si-Han Wu, 2013) las NPs-SiO2 se han sintetizado por distintos métodos tales
como Sol-gel, Stöber, Stöber modificado y microemulsión, con morfologías esféricas,
esféricas huecas, tubos y fibras de SiO2 estructuralmente amorfo.
El método Sol-gel es uno de los mejores en la síntesis de una amplia variedad de
materiales nanoestructurados, es un método atractivo ya que su proceso se puede realizar
a bajas temperaturas, pero con un tiempo de síntesis prolongado.
El primer trabajo fue realizado en el año 1968 por Stober, en donde propone un método
para la síntesis eficaz de NPs-SiO2 monodispersas usando una mezcla de alcohol – agua
y amoniaco como catalizador para hidrolizar un alcoxilano, con la ventaja de ser
fácilmente escalado para aplicaciones comerciales y obtención de nanopartículas en un
rango de 50 nm - 1 μm con una estrecha distribución de tamaño y menor tiempo de
síntesis.
Siguiendo los estudios Grun propone un cambio al método, la adición de un tensoactivo
de tipo catiónico, que derivo en la obtención de nanopartículas porosas con un diámetro
de poro controlado. Los siguientes cambios fueron realizados por Hartlen y Yokoi , en la
cual adicionan lisina y arginina respectivamente, así como Meng reporta la síntesis de
Nps solidas en una microemulsión acuosa con el uso de un tensoactivo obteniendo
partículas en un rango de 20 a 300 nm y un método de obtención por microemulsión
inversa (A.H. Karim, 2012)
Todos estos estudios llevaron a obtener nanopartículas con diámetros y tamaños de poros
más uniformes, luego de varios años Bogush demostró que el proceso de crecimiento
depende de la reacción de condensación de monómeros hidrolizados y pequeños
oligómeros, mientras que la nucleación de las partículas de la agregación de
subestructuras de siloxano. (Li Tang, 2013)
53
1.2.15. Caracterización de nanopartículas de óxido de silicio (Sílice)
1.2.15.1. Dispersión de Luz Dinámica (DLS)
Es una técnica no invasiva que permite medir el tamaño y distribución de tamaño de
moléculas y partículas generalmente en la región submicrométrica (Malvern Panalytical,
2019). Para determinar el tamaño de las partículas se tiene en cuenta la variación de la
intensidad de dispersión en el tiempo. Al observar las numerosas partículas que hay en
un medio acuoso, la luz láser del equipo se dispersa en todas las direcciones que esta
pueda dirigirse. Cuando se separa en una dirección, se genera una intensidad de dispersión
determinada, debido a que los haces de luz dispersados por distintas partículas interfieren
entre sí. Esto se debe al movimiento Browniano, ya que, las posiciones relativas de las
partículas varían constantemente entre sí. Cuando las partículas se mueven rápidamente,
generalmente las partículas de tamaño pequeño, se acelera la variación de la intensidad
de dispersión. Un caso aparte sucede con las partículas lentas que son más grades, ya que
sus variaciones son más lentas. Al analizar estas fluctuaciones de intensidad se determina
la velocidad del movimiento browniano, así como, el diámetro hidrodinámico de los
materiales, haciendo uso de la relación de Stokes-Einstein. El tamaño hidrodinámico es
el diámetro de una esfera que posee el mismo coeficiente de difusión traslacional que el
del material que se mide, suponiendo una capa de hidratación que rodea la partícula o
molécula, ya que en la realidad las partículas o macromoléculas en solución no son
esféricas, dinámicas (circulantes), y solvatadas por lo tanto el diámetro calculado a partir
de las propiedades difusionales de la partícula indica el tamaño real de la partícula
dinámica hidratada y solvatada .
54
Ilustración 1 Diámetro hidrodinámico de una NP funcionalizada en su superficie
Fuente: (Llinàs & Sánchez-García, 2013)
Figura 12: Esquema de un equipo DLS
Fuente: (LS Instruments, s.f.)
1.2.15.2. Espectroscopía UV-Visible
Es una de las técnicas más ampliamente utilizada para la caracterización primaria de las
NPs sintetizadas. Es una técnica rápida, sencilla y aplicable a diferentes tipos de NPs.
Basada en la absorción de radiación ultravioleta y visible por la muestra, debido a que se
55
origina un estado activado que posteriormente elimina su exceso de energía en forma de
calor.
La característica de los coloides metálicos, es que generan bandas de absorción en el
ultravioleta-visible por la excitación de la resonancia de plasmón de superficie.
Generalmente estos materiales forman distintos picos de absorción en la región visible
(Aquino, 2016).
Figura 13: Resonancia plasmónica (polarización) de una nano partícula metálica
Fuente: (Cornejo, 2015)
1.2.15.3. Microscopio electrónico de barrido (SEM)
De sus siglas en inglés, Scanning Electron Microscopy, el SEM es una técnica que se
utiliza para la obtención de imágenes de la superficie de la muestra, proporcionando
imágenes con una resolución de gran profundidad de toda la zona de la micrografía
enfocada (Sánchez, 2017).
El funcionamiento consiste básicamente en que el dispositivo que actúa como filamento
en el equipo genera un haz de electrones que ilumina el analito y la que es analizada por
la interacción entre ellas y produce en consecuencia variados impactos las que serán
visualizados en el equipo (Universidad Politécnica de Valéncia, 2017).
56
El equipo SEM puede estar equipado con diversos elementos, tales como:
o Un detector de electrones secundarios, para tener fotografías de alta resolución
o Un detector de electrones retrodispersados, con la que se obtiene imágenes de la
morfología de la superficie.
o Un detector de energía dispersiva, que recolecta los Rayos X del analito (Sánchez,
2017).
Figura 14: Esquema de microscopio electrónico donde se muestra las componentes principales
Fuente: (Universidad Andrés Bello, 2016)
1.2.15.4. Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM)
De sus siglas en inglés, Transmission Electron Microscopy, el TEM permite tener una
imagen de la estructura y tamaño de una nanopartícula o un conjunto de ellas, para
57
determinar si su morfología es homogénea, también permite apreciar su porosidad y
periodicidad (Llinàs & Sánchez-García, 2013).
El equipo utiliza un haz de electrones de alta energía (80-300keV) con una longitud de
onda comprendida entre 0.001 y 0.1 nm. Estas son transmitidas a través de una capa muy
delgada del analito, generando transmitidos, por otro lado, también se dispersan y/o
generan interacciones que producen distintos efectos. Para determinar la composición
elemental del analito el equipo usa la transmisión/dispersión de los electrones, con las
que emite la formación de imágenes y la apreciación de rayos X únicos por muestra
analizada (Dudkiewicz, y otros, 2011).
Se pueden obtener dos tipos de imágenes: campo oscuro (emitida por los electrones
difractados), y campo claro (producto de los electrones que se propagan a través del
analito).
Figura 15: Partes del microscopio electrónico de transmisión

Fuente: (Partesdel.com, s.f.)
58
1.2.16. Reactor Anaerobios U.A.S.B.
Las siglas U.A.S.B. se precisa como Upflow Anaerobic Sludge Blanquet o Reactor
Anaerobio de Flujo Ascendente. Este tipo de reactor es aplicada al tratamiento de aguas
residuales y se ha utilizado en industrias de producción de alimentos, plantas azucareras,
cervecerías, fábricas de conservas alimenticias, industrias de celulosa y papel, etc
(LETTINGA, 1980).
1.2.16.1 Diseño del reactor UASB
En la figura 16 se visualiza un diseño del Reactor UASB con sus principales dispositivos,
una principal característica es el separador de gases, sólidos y líquidos (GSL). El
separador es implementado en el reactor para dividir la parte inferior o zona de digestión,
donde existe un manto de lodos que se encarga de la digestión anaerobia de la parte
superior o zona de sedimentación. El agua residual entra por la zona del fondo del reactor
y sigue una trayectoria ascendente, pasando por la zona de digestión, luego por el
separador GSL y finaliza a la zona de sedimentación. La materia orgánica se mezcla con
el lodo anaerobio que se encuentra en la zona de digestión, existiendo la digestión
anaerobia que resulta en la producción de gas y el crecimiento de lodo, y así el efluente
clarificado sale hacia el pos tratamiento.
59
Recolección del biogás
Afluente
Efluente
Colector
Separador para el gas del gas
Fase liquido gas
Manto de lodos
Figura 16: Esquema de un reactor UASB con sus principales dispositivos.

Fuente: (LETTINGA, 1980), pág. 42
1.2.16.2. Características del reactor UASB:
Una de las principales características en un reactor UASB son:
 Mayor espacio para la unión de microorganismos.
 Mayor concentración de bacterias, permitiendo operar con velocidades de carga
orgánica más elevadas.
 Elevada velocidad de transferencia de materia, que facilita el tratamiento de aguas
con un alto contenido de materia orgánica.
 Concentración de lodos volátiles en la fuente moderada.
1.2.16.3. Ventajas y desventajas del reactor UASB
EI reactor UASB muestra un gran avance en el tratamiento anaerobio, debido a que puede
soportar cargas orgánicas altas frente a otros sistemas. (Ruiz, M, P, A, & Blázquez, 1998)
asimismo, como una de sus ventajas es que el lodo floculante, después de un tiempo, se
60
convierte en lodo granular, que demuestra mayor contacto con el agua residual, mayor
estabilidad y acepta mayor velocidad de carga orgánica. Las ventajas y desventajas del
tratamiento anaerobio (Ver tabla 7)
Tabla 7: Ventajas y desventajas del tratamiento anaerobio
Ventajas Desventajas
1. Ahorro económico en la operación ya 1. Las bacterias anaerobias (particularmente

que no necesita energía para el proceso las metanogénicas) son muy susceptibles de
2. El proceso soporta altas cargas inhibición por un gran número de compuestos.
hidráulicas y orgánicas. 2. Si no se cuenta con el lodo activo, el
3. Los sistemas pueden ser aplicados en proceso es relativamente lento.
cualquier parte y a cualquier escala. 3. El efluente necesita de un adecuado
4. La producción de lodo en exceso es postratamiento para cumplir los límites de
baja, además el lodo está bien estabilizado y es de vertimiento.
fácil secado. 4. Tecnología establecida en clima tropical,
pero en vías de desarrollo a temperaturas inferiores a
20°C.
Fuente: (Ruiz, M, P, A, & Blázquez, 1998)
1.2.16.4. Etapas de la digestión anaerobia en reactor UASB
Para que el proceso de la digestión anaerobia sea optimo es necesario la intervención de
una cantidad considerable de bacterias, bajo unas condiciones ambientales establecidas,
actúan en una serie de etapas y reacciones muy específicas. Así cada etapa es realizada
por diferentes tipos de bacterias, las cuales se distinguen 4 etapas (Ver figura 17):
61
Figura 17: Etapa de la digestión anaerobia
Según la figura anterior, el proceso comienza con la hidrolisis de polisacáridos, proteínas
y lípidos por la acción de enzimas extracelulares producidas por las bacterias hidrolitica.
Los productos de esta reacción son moléculas de azucares, los aminoácidos, los acidos
grasos y los alcoholes, los cuales serán fermentados por las bacterias acidogenicas a
ácidos grasos con bajo número de carbonos (Ac. Acetico, formico, propiónico y butírico)
así compuestos reducidos como el etanol, ademas de H2 y CO2 y estos serán convertidos
a acetato, H2 y CO2 por las bacterias acetogenicas productoras de hidrogeno. Finalmente,
las bacterias metanogénicas convierten el acetato a metano y CO2, o reducen el CO2 a
metano (Díaz Báez & Espitia, 2002)
Cabe resaltar la existencia de dos puntos importantes, con respecto a los diferentes
procesos que existen durante la digestión anaerobia de la materia orgánica:
 En la figura 17 se visualiza que solamente el 30% de la materia orgánica se
convierte en metano por la vía hidrogenofilica, en conclusión, para obtener una
62
óptima remoción de la materia orgánica, es que la metanogénesis se desarrolle
eficientemente.
 La fermentación ácida tiende a bajar el pH, y esto se debe a la producción de
acidos grasos volátiles (AGVs), mientras que la metanogénesis solo se desarrolla
cuando el pH es cercano a 7. Por lo tanto, si en el proceso de la metanogénesis
existe una alta tasa de producción de AGVs puede ocurrir una baja
significativamente del pH del sistema, produciendo la inhibición de las bacterias
metanogénicas (Lettinga, 1994).
En la siguiente tabla, se mencionan las principales reacciones que se llevan en el proceso
de la digestión anaerobia.
63
Tabla 8: Reacciones Bioquímicas en la digestión Anaerobia de la materia orgánica
TIPO DE REACCIÓN ECUACIÓN
Fermentación de glucosa a acetato Glucosa + 4H2O CH3COO- + 4H+ + 4H2
Fermentación de glucosa a butirato Glucosa + 2H2O C4H7O2 + 2HCO3 + 3H+ + 2H2
Fermentación del butirato a acetato e Butirato + 2H2O  2CH3COO- + H+ + H2
H2
Fermentación del propionato a Propionato + 3H2  CH3COO- + HCO3- + H+ + H2
acetato
Acetogénesis a partir de H2 y CO2 HCO3- + H+ + 4H2  CH3COO- + 2 H2O
Metanogénesis a partir del H2 y CO2 HCO3- + 4H2  CH4 + 3 H2O
Metanogénesis a partir del acetato Acetato + H2O  CH4 + HCO3 + H+
Fuente: Zinder,1984
64
1.3. MARCO CONCEPTUAL
Contaminación del agua: Incorporación al agua de materias extrañas, como
microorganismos, productos químicos, residuos industriales y de otros tipos, o
aguas residuales. Estas materias deterioran la calidad del agua y la hacen inútil para
los usos pretendidos.
Cuerpo de agua: Curso de agua natural o artificial tales como ríos, lagos,
manantiales, reservorios, lechos subterráneos u océanos; en los cuales son vertidas
las aguas residuales con o sin tratamiento.
pH: Es el logaritmo de la reciproca de la concentración de ión hidrogeno en una
sustancia o medio y que puede ser medida en un rango de 1-14, si su valor se
encuentra entre 1-6 el pH es Acido, si se encuentra entre 8-14, su pH es Básico.
E. coli: es un bacilo gramnegativo de la familia de las enterobacterias que se
encuentra en el tracto gastrointestinal de humanos y animales de sangre caliente
Hidrolisis: es una reacción química entre una molécula de agua y otra molécula, en
la cual la molécula de agua se divide y sus átomos pasan a formar unión de otra
especie química. Esta reacción es importante por el gran número de contextos en
los que el agua actúa como disolvente.
Acidogénesis: Es el proceso a través del cual bacterias anaerobias producen acetato
a partir de diversas fuentes de energía (por ejemplo, hidrógeno) y de carbono (por
ejemplo, dióxido de carbono)
Acetogénesis: Es el proceso a través del cual bacterias anaerobias producen acetato
a partir de diversas fuentes de energía (por ejemplo, hidrógeno) y de carbono (por
65
ejemplo, dióxido de carbono). Las diferentes especies bacterianas que son capaces
de realizar la acetogénesis se denominan colectivamente acetógenos.
Metanogénesis: es la formación de metano por parte de los seres vivos. Es una
forma de metabolismo microbiano muy importante y extendida. En la mayoría de
los entornos, es el paso final de la descomposición de la biomasa.
Reactor UASB: También conocido como RAFA (reactor anaerobio de flujo
ascendente) son un tipo de biorreactor tubular que operan en régimen continuo y en
flujo ascendente, es decir, el afluente entra por la parte inferior del reactor, atraviesa
todo el perfil longitudinal, y sale por la parte superior. Son reactores anaerobios en
los que los microorganismos se agrupan formando biogránulos.
Caudal: Es la cantidad de fluido que circula a través de una sección del ducto
(tubería, cañería, oleoducto, río, canal, etc) por unidad de tiempo. Normalmente se
identifica con el flujo volumétrico o volumen que pasa por un área dada en la unidad
de tiempo. Menos frecuentemente, se identifica con el flujo másico o masa que pasa
por un área dada en la unidad de tiempo.
66
CAPITULO II
PARTE EXPERIMENTAL
2.1. Materiales e insumos
 Nanopartículas de óxido de silicio
 Medio de cultivo Agar Mueller Hinton y Caldo Mueller Hinton
 Placas Petri
 Tubos de ensayo
 Matraz Erlenmeyer
 Cepa de E. Coli
 Asa de siembra
 Vasos de precipitación
 Varilla
 Mangueras
 Bolsas negras
 Buretas
 Ganchos
 Soportes
 Cronometro
 Pipeta de pasteur
 Papel aluminio
 Mascara de seguridad
 Tijeras
 Calculadora
67
 Papel tornasol
 Discos de papel filtro de 6 mm
 Pinza
 Mechero Bunzen
2.2. Equipos e instrumentos
 Termómetro digital, de marca BOECO con un rango de medición desde -50°C
hasta 300°C.
 Equipo multiparámetro, de marca Milwaukee modelo MW801 con mediciones
de pH, conductividad y sólidos totales disueltos. Este equipo se usó para medir el
pH de los medios de cultivos usados para análisis de actividad antimicrobiana.
 Espectrofotómetro UV-Vis, de marca Thermo Fisher SCIENTIFIC Helios
Gamma, con un haz único UV-Vis, rango de longitud de onda 190-1100nm, ancho
de banda fijo de 2nm y cambiador de celdas opcional de 7 posiciones, para
mediciones de densidad óptica del crecimiento bacteriano del laboratorio de
Química Orgánica de la UNMSM y para la caracterización de las NP-SiO2 se usó
el espectrofotómetro PG INSTRUMENTS modelo T80+ del Laboratorio de
Nanotecnología e Innovación Tecnológica de la Facultad de Química e Ingeniería
Química de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos.
 Equipo Dispersión de Luz Dinámica (DLS), de marca Nicomp N3000, del
Laboratorio de Nanotecnología e Innovación Tecnológica de la Facultad de
Química e Ingeniería Química de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos.
 Microscopía Electrónica de Barrido (SEM), marca JEOL y modelo JSM7600F
del Centro Nacional de Microscopia Electrónica de la Universidad de
Complutense de Madrid-España.
68
 Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM), marca JEOL y modelo JEM-
2100HT del Centro Nacional de Microscopia Electrónica de la Universidad de
Complutense de Madrid-España.
 Autoclave, modelo YXQ-280MD de 18 litros, con una temperatura de
esterilización de 121°C.
 Placa calefactora y agitador magnético, de marca HANNA INSTRUMENTS
modelo HI 190M con una capacidad máxima de 1L y 1000rpm
 Reactor RAFA ha sido diseñado y construido para operar con un volumen de
3456 mL
 Sonicador, de la marca LAB COMPANION UCS-10 y con una capacidad de
10L.
 Bomba peristáltica, de la marca RUNZE 100-240 modelo SR300-RZ1030-4 con
un flujo máximo de 170ml/min
 Biotanque, de la marca KOMAX con una capacidad de 12L
2.3. Procedimiento
2.3.1. Caracterización de una muestra de NPs-SiO2.
Para la determinación del tamaño de las NPs-SiO2 sintetizadas adquiridas de la empresa
española AVANZARE la que usó como método de síntesis industrial el de Sol-Gel a
partir del tetraetoxisilano el cual a través de dos reacciones: de hidrólisis y de
condensación permiten la formación de nanopartículas de SiO 2; se utilizaron los
siguientes métodos.
2.3.1.1. Dispersión Dinámica de Luz (DLS)
Para la determinación del diámetro hidrodinámico se procedió a sonicar por 10
minutos una muestra de NPs dispersada en agua, para ello se pesó 0.01 g y se aforó en
69
una fiola de 100 ml con agua destilada. Se tomó 1 ml de la solución y se colocó en una
celda para su medición a temperatura de 25°C, en el equipo NICOMP 380 de la marca
Particle Sizing Systems del laboratorio de Nanotecnología e Innovación Tecnológica
de la Facultad de Química e Ingeniería Química de la Universidad Nacional Mayor
San Marcos.
Fotografía 1: Análisis con DLS
2.3.1.2. Espectroscopia UV-visible
El análisis en este método consistió en la identificación del espectro UV-visible de las
NPs-SiO2. Para ello se tomó la solución preparada con anterioridad, tomándose 1 ml
de la solución para ser colocada en una celda de cuarzo y analizarla en el
espectrofotómetro PG INSTRUMENTS modelo T80+ del laboratorio de
Nanotecnología e Innovación Tecnológica de la Facultad de Química e Ingeniería
Química de la Universidad Nacional Mayor San Marcos. Se seleccionó una longitud
de onda en el rango de 190 nm a 400nm para el análisis del espectro.
70
Fotografía 2: Análisis con UV- Visible
2.3.1.3. Microscopía Electrónica de Barrido (SEM)
Para el análisis de la morfología y distribución de las NPSiO2, se analizó en el equipo
SEM del Centro Nacional de Microscopia Electrónica de la Universidad de
Complutense de Madrid-España de marca JEOL y modelo JSM7600F, con 15 kV y
10mA de voltaje de aceleración.
2.3.1.4. Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM)
Para el análisis de la distribución del tamaño de partícula de las NPSiO2, se analizó en
el equipo TEM del Centro Nacional de Microscopia Electrónica de la Universidad de
Complutense de Madrid-España de marca JEOL y modelo JEM-2100HT.
2.3.2. Análisis de la actividad antimicrobiana de las NPs-SiO2
La realización de esta prueba constó de 3 métodos diferentes. Los pasos generales para
estas técnicas consiste en la obtención de colonias de E.Coli para ello se procedió a
realizar lo siguiente:
71
a) Preparación del medio de cultivo
Se preparó Agar Mueller Hinton como indica las instrucciones del producto. Para que la
solución sea homogénea se calentó y se agitó en constante movimiento hasta observar
que la mezcla tenga un color amarillo claro uniforme. Esta pasó a ser autoclavada con los
otros materiales requeridos a ser esterilizados.
Fotografía 3: Pesado de agar Mueller Hinton
Fotografía 4: Autoclavado de materiales usados para preparación de cepas bacterianas de E.Coli
b) Sembrado de la cepa bacteriana

Se colocó aproximadamente 15 ml de agar en 4 placas, una de ellas para control (placa
no inoculada con E.Coli) . Una vez gelificadas los medios se procedió a sembrar la
72
bacteria haciendo uso de un cultiloops (asas de inoculación desechables que contienen
microorganismos viables y estabilizados) y se sembró por agotamiento en las 3 placas
restantes, todos ellos en presencia de un mechero para esterilizar la zona donde se
realizarán las pruebas. Las placas fueron puestas en una estufa por 24 horas a 37ºC.
Fotografía 5: Cultivo de E.Coli
Fotografía 6: E.Coli sembrada en agar Müeller Hinton
c) Preparación del inóculo

Se preparó caldo Mueller Hinton con las indicaciones necesarias. Se realizó la medición
del pH del medio y se procedió a autoclavar. Se tomó 3 colonias uniformes de las placas
antes sembradas para inocularlos en el medio preparado y utilizándose el Vortex por 5
minutos a 1000 Microtires con la presencia de un mechero. Se incubó la solución por 4
horas y se procedió a ajustar la solución bacteriana a 0.5 Escala McFarland con suero
quirúrgico NaCl 0.9%.
73
Fotografía 7: Medición de pH en el caldo Mueller Hinton
Fotografía 8: Muestra inoculada en el vortex
74
Fotografía 9: Comparación de Escala Mc Farland y solución bacteriana
Las técnicas usadas son descritas a continuación:
2.3.2.1. Método de difusión de discos
a) Preparación de solución con NPs-SiO2

Se preparó soluciones con concentraciones de 10, 20 y 40 ppm de nanopartículas de óxido
de silicio, luego se pasó a sonicar las muestras por 30 minutos para una mayor
homogenización. Adicional a ello se preparó una solución de ampicilina como antibiótico
de prueba.
Fotografía 10: Nanopartículas de óxido de silicio pesados en balanza analítica
b) Aplicación de discos de papel filtro
75
Se preparó agar en 2 placas Petri. Luego estas fueron inoculadas con la solución
bacteriana antes preparada. En estas placas fueron colocas 4 discos las que contenían:
Ampicilina y nanopartículas de sílice a las diferentes concentraciones preparadas.
Fotografía 11: Inoculación de placas Petri con solución bacteriana
Fotografía 12: Aplicación de discos
2.3.2.2. Método de microdilución en caldo
a) Preparación de medio de cultivo

Para ello se usó caldo Mueller Hinton. Se pesó 2.2 g del caldo y se diluyó en 100 ml, para
que la solución sea homogénea se calentó en microondas en intervalos de 4 por 10
segundos cada uno y 3 intervalos de 5 segundos cada uno. Una vez visualizado la
homogenización de la muestra se procedió a medir el pH el cual mostraba un valor neutro.
76
Luego se autoclavó conjuntamente con los materiales necesarios en el experimento para
evitar contaminación de la muestra. Terminado este paso para el control visual de la
actividad antimicrobiana de las nanopartículas se procedió a añadir 150 µl de rojo de fenol
0.8% la que tiene un pH de 7.0 (0.08 g en 100 ml de agua destilada) en el caldo preparado,
el que se tiñe de color rojizo si el pH es ácido por la presencia de bacterias y la producción
de la enzima β-lactamasa o amarrillo en pH básico por la poca producción de esta enzima.
Fotografía 13: Medición de pH de rojo de fenol y caldo Mueller Hinton
b) Preparación de solución con antibiótico

Se pesó 0.012 g de NPs de SiO2 para disolverlo en 100 ml para obtenerse 120 ppm. Para
que la solución este más homogénea se llevó a sonicar por 15 minutos. Para preparar las
demás concentraciones se diluyó la solución madre para obtener 20, 30, 40, 50, 60, 70,
80, 90, 100, 110 ppm de NPs SiO2.
Fotografía 14: Soluciones seriadas de NPs SiO2
77
c) Aplicación de la microdilución en placas Elisa
Se diluyó en 1/20 la suspensión bacteriana ajustada a 0.5 escala Mc Farland en las
diferentes concentraciones de NPs SiO2. Se consideró un volumen final de 200 μL de
cada pocillo de la placa Elisa.
La fila A, columna 1 y 12 son de control (no contiene NPs SiO2), y las demás pruebas en
filas intercaladas para evitar su contaminación. La columna 2 tiene una concentración de
20µg/ml hasta llegar a la columna final de 120 µl/ml. Realizado las diluciones
correspondientes, se empaquetó la placa Elisa con microfilm y se llevó a la estufa para su
incubación a 37°C por 24 horas.
Tabla 9: Distribución de microdiluciones en placa Elisa
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A C C C C C C C C C C C C
B
C C NP SiO2 NP SiO2 NP SiO2 NP SiO2 NP SiO2 NP SiO2 NP SiO2 NP SiO2 NP SiO2 NP SiO2 NP SiO2
20µg/ml 30µg/ml 40µg/ml 50µg/ml 60µg/ml 70µg/ml 80µg/ml 90µg/ml 100µg/ml 110µg/ml 120µg/ml
D
E C NP SiO2 NP SiO2 NP SiO2 NP SiO2 NP SiO2 NP SiO2 NP SiO2 NP SiO2 NP SiO2 NP SiO2 NP SiO2
20µg/ml 30µg/ml 40µg/ml 50µg/ml 60µg/ml 70µg/ml 80µg/ml 90µg/ml 100µg/ml 110µg/ml 120µg/ml
F
G C C C C C C C C C C C C
H
Fuente: Propia
2.3.2.3. Método de la curva de inhibición del crecimiento
a) Preparación de solución con NPs-SiO2
Se preparó soluciones con concentraciones de 5, 10, 20, 120, 240, 480 ppm de
nanopartículas de óxido de silicio, luego se pasó a sonicar las muestras por 30 minutos
para una mayor homogenización.
78
Fotografía 15: Nanopartículas de óxido de silicio pesados en balanza analítica
b) Medición de densidad óptica del crecimiento bacteriano
Se realizaron mediciones de densidad óptica del caldo inoculado en contacto con solución
de nanopartículas a diferentes concentraciones en dos días, el primer día concentraciones
bajas de 5, 10 y 20; en segundo día concentraciones altas de 120, 240 y 480 ppm. Las
lecturas se realizaron por 8 horas en intervalos de 1 hora, siendo incubadas en una estufa
a 37°C.
Fotografía 16: Espectrofotómetro UV-Vis usado para medir la densidad óptica
79
Fotografía 17: Celdas con muestra a analizar
2.3.3. Concentración de NPs-SiO2
a) Especificaciones del reactor RAFA
El reactor RAFA se utilizó para el tratamiento de las aguas residuales municipales
sintéticas, La capacidad es 3456 ml. Las especificaciones del reactor se muestran
detalladamente en la tabla 8.
Tabla 10: Especificaciones del reactor RAFA
Parametro Símbolo Unidad Valor
Volumen del Reactor Vr ml = cm^3 3456.00
Area del Reactor Ar cm^2 63.62
Altura Efectiva del

L Cm
Reactor 54.32
Flujo másico F KgDBO/d 0.0035
Diametro del reactor D Cm 9.00

Fuente: Propia
80
b) Ubicación del reactor RAFA o UASB
El reactor RAFA o UASB a escala piloto se encuentra en el laboratorio MATINTEC
de la facultad de Química e Ingeniería Química de la Universidad Nacional Mayor
de San Marcos
Fotografía 18: reactor en el laboratorio de la Facultad de Química e Ingeniería Química
c) Tiempo de Retención
Los tiempos de retención estudiados en esta investigación son los siguientes
Tabla 11: Tiempo de retención hidráulica a investigar
TRH TRH-1 TRH-2 TRH-3 TRH-4
Horas 6 8 10 12
Fuente: Propia
Se trabaja con estos cuatro tiempos de retención hidráulica por estimar que el lodo tendrá
efecto en la optimización del reactor RAFA, no se consideró tiempos de retención
mayores a 20 horas porque normalmente son usados en lugares de temperaturas bajas.
81
d) Caudal de diseño
Teniendo volumen del reactor y los TRH definidos podemos determinar para cada TRH
su respectivo Caudal de operación y programar dichos caudales en la bomba peristáltica
𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑟𝑒𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 (3.456𝐿) 1 ℎ𝑜𝑟𝑎 1000𝑚𝑙

𝐶𝑎𝑢𝑑𝑎𝑙 = ∗ ∗
𝑇𝑅𝐻 60 𝑚𝑖𝑛 1𝐿
Tabla 12: TRH y Caudal de operación a investigar
TRH(h) Caudal(ml/min) Caudal(L/dia)
6 9.6 13.82
8 7.2 10.08
10 5.8 8.12
12 4.8 6.72
Fuente: Propia
e) Preparación del agua municipal sintetizada
Para caracterizar el agua municipal sintetizada que es el afluente del reactor RAFA,
se mezcló las concentraciones exactas de macronutrientes y micronutrientes (Ver
tabla 13)
82
Tabla 13: Composición del sustrato sintético (basado sobre la demanda química de oxígeno en el influente de
1150 mg/L)
Macronutrientes Micronutrientes
Component Concentració Unidade Component Concentració Unidade
es n s es n s
C6H12O6 0.592 g/L MgSO4.7H20 0.250 mg/L
C2H4O2 0.159 ml/L CaCl2.2 H20 0.010 mg/L
C3H6O2 0.097 ml/L FeSO4.7 H20 0.185 mg/L
C4H8O2 0.110 ml/L MnCl2.2 H20 0.044 mg/L
KNO3 0.979 g/L ZnSO4.2 H20 0.200 mg/L
KH2PO4 0.250 g/L CuSO4.2 H20 0.500 mg/L
Na2HPO4 0.135 g/L NiCl2.6 H20 0.500 mg/L
K2Cr2O7 0.500 mg/L
Fuente: Propia
Según la tabla 13, se preparó para una cantidad de 10L diariamente, a continuación, se
muestra la tabla 14 con la determinación del DQO del afluente que fue un sustrato
sintético
83
Tabla 14: Demanda Química de Oxigeno (DQO) para una razón C/N de 3
Compuesto Cantidad DQO C(mg/L) N- P-PO4
(mg/L) NO3(mg/L)
C6H12O6 0.592 g 631.467 236.800
C2H4O2 0.159ml 169.493 63.560
C3H6O2 0.097 ml 146.054 46.946
C4H8O2 0.110 ml 199.818 59.945
KNO3 0.979 g 135.750
KH2PO4 0.250 g 56.985
Na2HPO4 0.135 g 29.472
TOTAL 1146.85 135.750 86.457
Fuente: Propia
Para que las bacterias metanogénicas trabajen en forma óptima, se requiere mantener el
pH lo más constante posible cercano a 7, es por ello que se realizó constantes mediciones
de relación entre la alcalinidad debida a los AGV y la alcalinidad(IB) según bibliografía
(Andrea Pérez, 2008) recomienda que esta relación debe estar entre 0.2<IB< 0.35.
f) Descripción del sistema
El reactor RAFA funcionó como tratamiento primario para el afluente que fue un sustrato
sintético preparado en el laboratorio con sustancias químicamente puras, asimilando las
características de un agua residual municipal. Los lodos activos fueron extraídos del
reactor RAFA de CITRAR UNI (Ver fotografía
84
Fotografía 19: Extracción de las muestras de lodos activos de CITRAR UNI
El reactor RAFA a escala piloto consiste en un biotanque de almacenamiento de 12 L,
una bomba peristáltica que impulsa caudal constante al reactor RAFA, finalmente el
efluente tratado es recolectado en un recipiente de 15 L
Agua residual sintetizada
Biotanque de almacenamiento
tratamiento primario reactor

RAFA
Efluente tratado
Figura 18: Diagrama de flujo de agua residual sintetizada en el reactor RAFA piloto
Una vez puesto en marcha el sistema de tratamiento, se tomó muestras diarias de entrada
y salida
85
g) Determinación puntos de monitoreo
Para controlar la eficiencia del reactor RAFA se tomaron en cuenta los siguientes puntos
de monitoreo. (Ver fotografía 20)
PUNTO A
PUNTO C
PUNTO B
Fotografía 20: Puntos de monitoreo del reactor RAFA
Donde:
Punto A: Punto de monitoreo al ingreso del reactor RAFA
Punto B: Punto de salida del reactor RAFA
Punto C: Punto de muestreo del lodo activado
h) Parámetros de medición
Los parámetros medidos en esta investigación son los siguientes:
A) PARAMETROS FISICOQUIMICOS
 Temperatura de ingreso al reactor RAFA
86
 Temperatura de salida del reactor RAFA
 pH
 Demanda química de oxígeno total (DQO)
B) PARAMETROS MICROBIOLOGICOS
 Bacterias E. coli
h.1) Temperatura en reactor RAFA
Para determinar la temperatura se utilizó un termómetro digital de marca BOECO, se
utiliza para medir la temperatura de entrada y salida del reactor RAFA, todo esto fue
monitoreado in situ, la muestra se extrajo en vasos de 200 ml y se introdujo el termómetro
digital para ver la medición. (Ver fotografía)
Fotografía 21: Termometro digital , BOECO
h.2) pH
Para determinar el pH se utilizó un multiparámetro de marca Milwaukee modelo MW801
(Ver fotografía 22), el procedimiento de medición se inicia con la calibración del equipo,
luego se introduce el electrodo en la muestra a analizar para dar lectura, finalmente el
electrodo se lava con agua destilada para realizar otra medición
87
Fotografía 22: Multiparámetro, Milwaukee modelo MW801
h.3) DQO
Para el análisis de la demanda química de oxígeno se tomó una muestra del efluente de
acuerdo a las normas de muestreo (Anexo 1), se procedió a enviar al laboratorio SGS del
Perú S.A.C. para su posterior análisis.
h.4) Bacterias E. coli
Para el análisis de las bacterias E. coli se tomó una muestra hade acuerdo a las normas de
muestreo (Anexo 1), se procedió a enviar al laboratorio SGS del Perú S.A.C. para su
posterior análisis.
i) Periodos del proyecto de investigación
En la Etapa 1 se empezó con el estudio de la actividad microbiana y el arranque del reactor
RAFA, el 10 de diciembre del 2018, se empieza con los monitoreos de pH, temperatura,
SDT y DQO el 8 de enero del 2019, hasta el 15 de abril del 2019, la etapa 2 empezó 16
88
de abril hasta el 28 de mayo del 2019, la etapa 3 las tres primeras semanas de junio (Ver
tabla 13), en total el estudio duró 178 días
Tabla 15: Periodos del proyecto de investigación
Periodo Fecha de inicio Fecha final Dias parciales
Etapa 1 10/12/2018 15/04/2019 106
Etapa 2 16/04/2019 28/05/2019 44
Etapa 3 01/06/2019 25/06/2019 24
Fuente: Propia
j) Tiempo de arranque del reactor RAFA
El sistema estuvo aprueba aproximadamente 29 días, comenzó a operar el día 10/12/2018
luego hasta el día 08/01/2019 que comenzó con los monitoreos de pH, T°, SDT y DQO ,
se obtuvo una eficiencia de 60%, siguiendo con los monitoreos desde el 09/01/2019 hasta
el 28/05/2019 se obtuvo una eficiencia de 80.9%, lo cual indica que el lodo se había
estabilizado y el reactor tiene un trabajo óptimo.
k) Distribución del efluente del reactor RAFA
Sabiendo la eficiencia y el trabajo optimo del reactor, se extrajo 6 L del efluente del
reactor RAFA y se distribuyó en 3 vasos de 2 L
l) Preparación de las NPs-SiO2 a las concentraciones definidas
Se preparó soluciones con concentraciones de 20, 120, 240 ppm de NPs-SiO2, luego se
pasó a sonicar las muestras por 30 minutos para una mayor homogenización.
89
Fotografía 23: Distribución de NPs-SiO2
Fotografía 24: soluciones de NPs-SiO2 dentro del sonicador
m) Tiempo de contacto de las NPs-SiO2
m.1) Inoculación de las NPs-SiO2 en el efluente del reactor RAFA
Se mezcló las soluciones de las NPs-SiO2 en cada vaso con el efluente del reactor, y se
distribuyó en 9 vasos de 500 ml para ponerlo en agitación, Ver tabla.16
90
Tabla 16: Distribución detallada de las muestras
Inicial Distribución Tiempo (H)
2L - NPs-SiO2(20 500 ml 2
ppm)
500ml 4
500ml 6
2L - NPs-SiO2(120 500ml 2
ppm)
500ml 4
500ml 6
2L - NPs-SiO2(240 500ml 2
ppm)
500ml 4
500ml 6
Fuente: Propia
n) Toma de muestras a analizar
Para saber la cantidad de bacterias inicialmente, se tomó 250 ml para ser analizadas en el
laboratorio, después de transcurrir 2 horas, se tomó 250 ml de 3 vasos con diferentes
concentraciones y así progresivamente hasta culminar las 6 horas. Cada muestra fue
etiquetada con sus respectivas concentraciones y tiempo
91
Fotografía 25: Distribución de las muestras
Fotografía 26: llenado de muestra para ser analizadas
92
2.4) DISEÑO EXPERIMENTAL
2.4.1) VARIABLE DEPENDIENTE
● Inactivación de las bacterias E. coli
2.4.2.) VARIABLES INDEPENDIENTES
● Concentración de las NPs-SiO2
o 20 ppm
o 120 ppm
o 240 ppm
● tiempo, h
o 2
o 4
o 6
2.4.3.) DISEÑO DE INVESTIGACIÓN
Para hallar los parámetros adecuados de la inactivación de las bacterias E. coli se utilizó
el diseño experimental factorial: N° pruebas = 3k
Donde:
3: representa el número de niveles
k: representa el número de variables independientes
En el proyecto se utilizó 2 variables independientes con 3 niveles como se muestra en la
tabla 17:
93
Tabla 17: Diseño experimental factorial
Concentración Tiempo de contacto % de inactivación
de NPs-SiO2 de NPs-SiO2 de las E. coli
ppm horas
20 2 X1
20 4 X2
20 6 X3
120 2 X4
120 4 X5
120 6 X6
240 2 X7
240 4 X8
240 6 X9
Fuente: Propia
94
CAPITULO III
TRATAMIENTO DE DATOS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
3.1. Caracterización de una muestra de nanopartículas de óxido de silicio
3.1.1. Dispersión Dinámica de Luz
Esta técnica fue usada para determinar el tamaño hidrodinámico de las NPs de SiO 2. A
continuación se muestran los histogramas de distribución de acuerdo a la intensidad,
número y volumen (Figura 19). En la tabla 18 se resumen los datos obtenidos en la lectura
realizada, donde se muestran los diámetros que predominan de acuerdo a la intensidad,
número y volumen de la muestra, realizando un promedio el tamaño promedio del
diámetro hidrodinámico es de 11.3667 ± 0.7367 nm.
Tabla 18: Resumen de datos para medición de diámetro hidrodinámico NPs SiO2
Medida de diámetro Desviación %Volumen

(nm) estándar
Intensidad 11 0.7 100
Pico 1
Volumen 11.6 0.8 100
Pico 1
Número 11.7 0.8 100
Pico 1
Promedio 11.3667 0.7367 100
Fuente: Propia
95
a b
Figura 19: Histogramas obtenidos por DLS
a) Distribución de intensidad b) Distribución de número y c) Distribución de volumen
3.1.2. Microscopía Electrónica de Barrido (SEM)
Las imágenes muestran nanopartículas aglomeradas con diámetro menor a 100 nm. Se
puede observar que las nanopartículas tienen una morfología semiesférica. El espectro de
estas muestras una fuerte intensidad máxima de Silicio a 15.0 keV.
Fotografía 27: Imágenes SEM de NPs SiO2
96
3.1.3. Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM)
Como se puede observar en las micrografías de las NPs SiO2 (fotografía 28), la morfología
muestra que la mayoría de las nanopartículas son semi esféricas y se aglomeran formando
poros de acuerdo a la interpretación de la fotografía. El rango del diámetro de ellas
muestra una tendencia menor a 20nm
Formación de poro
Fotografía 28: Imágenes TEM de NPs SiO2
3.1.4. Espectrofotometría UV-visible
Se realizó una medición para analizar el espectro de las NPs SiO 2. Se realizó la medición
en un rango de 190 a 400 nm (ver tabla 19). La medición mostró un pico más elevado en
195.5 nm (ver figura 20), según (Arce, 2010) la sílice coloidal por tener un área específica
superficial elevada, es ópticamente transparente y fácilmente funcionalizable, es por ello
que no se muestra un pico definido en la banda UV-Vis. El mayor pico encontrado
corresponde al grupo funcional del alcohol libre usado en la síntesis.
97
Tabla 19: Resumen de mediciones realizadas en espectroscopia UV-Vis
Longitud de Absorbancia
onda (nm)
400 0.046
350 0.05
300 0.052
250 0.059
200 0.106
190 0.095
Espectro UV-Vis de NPs SIO2

0.12
0.1
Absorbancia
0.08
0.06
0.04
0.02
0
190 240 290 340 390
Longitud de onda (nm)
Figura 20: Espectro UV-Vis de NPs SiO2
3.2. Análisis de Actividad antimicrobiana de las NPs-SiO2
1.2.1. Método de difusión de discos
En la tabla 21 y se muestra las zonas de inhibición que se obtuvieron al realizar el método
de difusión de discos, a diferentes niveles de concentración de NPs SiO 2. El control
positivo que fue ampicilina, obtuvo como halo de inhibición un promedio de 15.1 mm lo
que corrobora lo descrito en la técnica de Kirby-Bauer (ver Tabla 20). El resultado
muestra que la cepa de E.Coli es sensible al antibiótico como se muestra en la Tabla 21,
donde se muestran los rangos de clasificación en 3 categorías: Resistente, Intermedio y
Sensible.
98
Tabla 20: Sensibilidad de las cepas control
Zona de inhibición en mm
Antimicrobiano E.Coli ATCC 25923
Ampicilina 15 -20
Fuente: Adaptado de (Bernal & Guzman, 1984)
Tabla 21: Antibiótico y diámetros críticos para Enterobacterias
ANTIMICROBIANO CONTENIDO DIÁMETRO EN mm

DEL DISCO R I S
Ampicilina 10ug <13 14-16 <17
Fuente: Adaptado de (Ministerio de Salud de Perú, 2002)
Tabla 22: Resultados de mediciones de halos de inhibicion a diferentes concentraciones de NPs SiO2
Concentración de NPs SiO2 Zona de inhibición

10 ppm 0 mm
20 ppm 0 mm
40 ppm 0 mm
Fuente: Propia
Fotografía 29: Halos de inhibición de Nps SiO2

Fuente: Propia
99
Los resultados de los halos de inhibición de las NPs SiO 2 en comparación con el control
positivo resulta que las bacterias E.Coli son resistentes a las NPs independientemente de
su concentración. Esto contradice los resultados hallados en el estudio de (Ghaida,
Muatez, & Ridha, 2009) ya que a concentración 10, 20, 30 y 40 ppm de NPs SiO2 de 30
nm de diámetro, los halos de inhibición resultaron ser de 38, 34, 36 y 37 mm
respectivamente. Una de las posibles causas radica en la preservación de los discos
fortificados con las NPs SiO2 ya que, según recomendaciones de la OMS, esta debe ser
almacenados a 4°C, para evitar el deterioro del antibiótico. Otra de las fallas posibles
pudo haber sido la cantidad de inóculo por unidad de volumen no es la correcta.
1.2.2. Método de microdilución en caldo
Para esta técnica se aplicó el método modificado por (Sánchez-Venegas, y otros, 2016)
la que consistió en usar como medio de cultivo caldo nutritivo, al cual se incorporó el
indicador rojo de fenol. El test consistió en la identifican del cambio de color, puesto que
se tiñe de color rojizo si el pH es ácido por la presencia de bacterias y la producción de la
enzima β-lactamasa o amarrillo en pH básico por la poca producción de esta enzima. En
la fotografía 28 se puede observar que las filas A, columna 1 y 12 de control positivo
mostraron un color violeta lo que corresponde a la presencia de la bacteria analizada. Con
respecto a la fila C que contenía NPs SiO2 mostraron un color violeta claro en C2, C7
hasta C12, lo que indica la presencia de bacterias. Los demás pocillos mostraron un color
que tiende a amarillo por lo se asume que no hubo una completa eliminación de ellas. La
fila E con NP SiO2 mostró un color que tiende a amarillo en los pocillos de E4 a E6 las
demás mostraron una tendencia violeta claro.
100
Como se puede observar las filas C y E, no presentan repetibilidad, por lo que la CMI no
sé pudo determinar ya que este criterio se puede definir como la menor concentración de
antimicrobiano que a simple vista inhibe completamente el crecimiento del
microorganismo estudiado (Picazo, 2000).
La principal causa probable puede atribuirse a la composición del medio de cultivo que
según (Sánchez-Venegas, y otros, 2016) consta de sacarosa 10; peptona de caseína 5.0;
peptona de carne 5.0; cloruro de sodio 5.0 y rojo de fenol 0.018; pero para este estudio se
usó caldo Mueller Hinton ( 2.0 g de extracto de carne, 17.5 g de hidrolizado de caseína,
1.5 g de almidón, 17.0 g de agar) y la adición de rojo de fenol.
En el estudio mencionado antes para la inoculación de cada pocillo se utilizó una
micropipeta automática multicanal la cuál evita la contaminación de los pocillos
contiguos.
Fotografía 30: Placa Elisa para la determinación de la CMI de las NPs SiO2
101
1.2.3. Método de la curva de inhibición del crecimiento
El método fue modificado, haciéndose mediciones de densidad óptica como método
indirecto del crecimiento bacteriano, este procedimiento también fue desarrollado por
(Lu, Rong, Li, Yang, & Chen, 2013) en su trabajo “Actividades antibacterianas
dependientes del tamaño de nanopartículas de plata contra bacterias patógenas anaerobias
orales”.
Se realizaron lecturas de inhibición de crecimiento bacteriano con concentraciones de
NPs-SiO2 bajas (5, 10, 20 ppm) y altas (120, 240 y 480 ppm) en distintos días, esto se
realizó debido a que según experimentos realizados por (Darryl, Sheryl, & Tracey, 2006)
se demostró que la interacción entre E.Coli y NPs-SiO2 no muestra signos de inhibición
en el crecimiento de la bacteria a concentración 3.3 × 104 ppm de nanopartículas de óxido
de silicio. Por otro lado, en el estudio realizado por (Samah, 2017) en la que evalúa el
efecto de nanopartículas en el crecimiento bacteriano, las concentraciones usadas en su
estudio fueron 2, 4, 6, 8,10 ppm, las que mostraron tener capacidad inhibitoria.
A continuación, se detallan los resultados obtenidos en la lectura de densidad óptica como
método indirecto de medición de crecimiento bacteriano.
102
Concentraciones bajas:
Eliminación Eliminación Eliminación

Crecimiento
bacteriana bacteriana bacteriana
bacteriano
120 ppm 240 ppm 480 ppm
Densidad Densidad Densidad Densidad

Tiempo Tiempo Tiempo Tiempo
óptica óptica óptica óptica
H OD - abs H OD - abs H OD - abs h OD – abs
0 0.027 0 0.013 0 0.014 0 0.02
1 0.09 1 0.02 1 0.032 1 0.024
2 0.31 2 0.031 2 0.044 2 0.076
3 0.668 3 0.069 3 0.185 3 0.267
4 0.754 4 0.185 4 0.304 4 0.413
5 0.778 5 0.301 5 0.349 5 0.531
6 0.781 6 0.376 6 0.399 6 0.601
7 0.815 7 0.409 7 0.415 7 0.642
8 0.829 8 0.41 8 0.447 8 0.684
103
Concentraciones máximas de NP SiO2
0.9
0.8
0.7
Densidad óptica (abs)
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Tiempo (h)
120 ppm 240 ppm 480 ppm Crecimiento bacteriano
Concentraciones altas:
Eliminación Eliminación Eliminación

Crecimiento
bacteriana bacteriana bacteriana
bacteriano
5 ppm 10 ppm 20 ppm
Densidad Densidad Densidad Densidad

Tiempo Tiempo Tiempo Tiempo
óptica óptica óptica óptica
h h h h
OD - abs OD - abs OD - abs OD - abs
0 0.027 0 0.006 0 0.001 0 0.004
1 0.09 1 0.007 1 0.003 1 0.012
2 0.31 2 0.036 2 0.013 2 0.014
3 0.668 3 0.113 3 0.07 3 0.054
4 0.754 4 0.289 4 0.229 4 0.143
5 0.778 5 0.534 5 0.497 5 0.295
6 0.781 6 0.563 6 0.55 6 0.372
7 0.815 7 0.586 7 0.56 7 0.394
8 0.829 8 0.603 8 0.574 8 0.401
104
Concentraciones míninas de NP SiO2
0.9
0.8
0.7
Densidad óptica (abs)
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Tiempo (h)
5 ppm 10 ppm 20 ppm Crecimiento bacteriano
Las pruebas corroboran la bibliografía revisada, ya que para concentraciones bajas el
comportamiento de las NPs-SiO2 tiene una tendencia que mientras más concentrado este
la solución con nanopartículas más capacidad inhibitoria tiene. Lo contrario sucede con
las soluciones de concentración alta, ya que mientras más altas sean su capacidad
antimicrobiana se reduce. Esto se puede explicar debido a que elevadas dosis de
nanopartículas de óxido de silicio estas tienen un mayor volumen poroso y su área de
actuación superficial es alto por lo que se indica un posible nivel de adsorción bacteriana,
siendo estas propiedades relativamente no tóxicas y biocompatibles (Vallet-Regí, Balas,
& Arcos, 2007)
105
3.3. Determinación de la concentración y el tiempo de contacto de las NPs-SiO2 para
la inactivación de las bacterias E. coli
De acuerdo con el resultado de las pruebas in vitro se determinó trabajar a
concentraciones bajas y altas (20, 120 y 240 ppm). En la tabla 23 se presentan los
resultados de los análisis después de la inoculación de las NPs-SiO2 en el efluente del
reactor RAFA a distintos tiempos (2, 4, 6 horas).
Tabla 23: Análisis microbiológico de E. coli
Concentración Tiempo de contacto %

de NPs-SiO2 de NPs-SiO2
ppm horas Inactivación crecimiento
20 2 6.12
20 4 65.31
20 6 65.31
120 2 71.43
120 4 6.12
120 6 61.22
240 2 55.1
240 4 32.65
240 6 246.94 146.94
Fuente: Elaboración propia
106
3.3.1 Porcentaje de inactivación de E. coli a diferentes concentraciones de NPs-SiO2
3.3.1.1. 20 ppm
Tabla 24: Porcentaje de inactivación de bacterias E. coli con 20 ppm de NPs-SiO2
Tiempo de contacto %
de las NPs-SiO2 Inactivación Crecimiento
2 6.12
4 65.31
6 65.31
De acuerdo con la tabla podemos decir que, si existe actividad antibacteriana a 20 ppm,
y esto también lo demuestra (Ghaida, Muatez, & Ridha, 2009)donde trabajaron con NPs-
SiO2 a concentraciones bajas donde obtuvieron que la concentración mínima de
inactivación fue de 10 ppm, pero transcurrido un tiempo se puede especular que estas
nanopartículas actúan como soporte para el crecimiento de las bacterias E:coli.
3.3.1.2. 120 ppm
2 71.43
4 6.12
6 61.22
De acuerdo con la tabla, podemos visualizar que se obtuvo el mayor porcentaje de
inactivación de las bacterias E. coli 71.43%, y esto se corrobora con la investigación
realizada por (Annadurai, 2013), donde obtuvieron como resultado que a concentración
107
de 100 ppm tiene la máxima inactivación de bacterias E. coli , la cual se asemeja a nuestro
resultados, también demostraron que las bacterias se dañaron seriamente en su membrana
externa y perdieron la confiabilidad celular de las especies bacterianas cuando se
contactaron con las nanopartículas, pero también mientras exista mas tiempo de contacto
de las nanopartículas con las bacterias, estas tienden a reproducirse significativamente.
3.3.1.3. 240 ppm
2 55.10
4 32.65
6 146.94
De acuerdo con la tabla podemos visualizar la existencia de actividad antibacteriana, estos
resultados podemos comparar con los estudios realizados por (Qian Wang, 2016) donde
ellos trabajaron a concentraciones altas y obtuvieron el 37% de inactivación a 500 ppm y
que después del contacto prolongado con las bacterias, estas tendieron a crecer
significativamente.
108
3.3.2 Porcentaje de inactivación de E. coli a diferente tiempo de contacto con NPs-
SiO2
3.3.2.1. 2 horas
Tabla 27: Porcentaje de inactivación de bacterias E. coli con 2 horas de contacto de NPs-SiO2
Concentración de %
NPs-SiO2 Inactivación Crecimiento
20 6.12
120 71.43
240 55.10
De acuerdo con la tabla podemos visualizar que en 2 horas existe el mayor porcentaje de
inactivación de las bacterias E. coli , y esto se puede comparar con estudios realizados
por (Annadurai, 2013), donde muestran tener la máxima inactivación en las 2 primeras
horas para las concentraciones altas de 120 y 240, y también la inexistencia de
crecimiento bacteriano por tener menor tiempo de contacto.
3.3.2.2. 4 horas
Concentración de %
20 65.31
120 6.12
240 32.65
109
De acuerdo con la tabla podemos visualizar que en 4 horas las bacterias crecieron
significativamente en las concentraciones mencionadas y esto se debe a su estabilidad
coloidal, y esto lo demuestra (Maiara Emer, 2017) , que las nanopartículas con menos
estabilidad coloidal en un medio dado tienden a desarrollarse y en consecuencia da como
resultado una reducción del área expuesta, asimismo actuando como soporte de
crecimiento para las bacterias..
3.3.2.3. 6 horas
Concentración de %
20 65.31
120 61.22
240 146.94
De acuerdo con la tabla podemos visualizar que en 6 horas el número de bacterias
aumentaron significativamente en las concentraciones mencionadas y esto se debe a su
estabilidad coloidal y al mayor tiempo de contacto, y esto lo demuestra (Maiara Emer,
2017) , que las nanopartículas con menos estabilidad coloidal en un medio dado tienden
a desarrollarse y en consecuencia da como resultado una reducción del área expuesta,
asimismo actuando como soporte de crecimiento para las bacterias mientras sigue
transcurriendo el tiempo..
110
CONCLUSIONES
- Se caracterizó las NPs de SiO2 por las técnicas las DLS, UV-Vis, SEM y TEM. El
resultado mostró un tamaño promedio hidrodinámico de las NPs de SiO 2 de
11.3667 ± 0.7367 nm. Con una morfología semiesférica, las nanopartículas
aglomeradas formando poros de menos 100 nm. El espectro UV-Vis muestra un
pico más elevado en 195.5 nm, la que representa al grupo funcional con el material
sintetizado, debido a que las nanopartículas de sílice son transparentes en
solución.
- Se analizó la actividad antibacteriana de las NPs SiO2 por los métodos de difusión
de discos, microdilución en caldo e inhibición del crecimiento bacteriano. En el
primer método no se identificó un halo de inhibición para las diferentes
concentraciones de NPs SiO2 (10, 20, 40 ppm) en comparación con los 15.1 mm
de diámetro de inhibición de la ampicilina como control positivo, mostrando a las
bacterias E.Coli resistentes al material nuevo . En el método de microdilución, la
CMI para las NPs SiO2, mostraron poca reproducibilidad por lo que no se idéntica
la mínima concentración a la cual se inhibe el crecimiento de las bacterias en
estudio. Con respecto a la medición indirecta de la inhibición del crecimiento
bacteriano con concentraciones de NPs-SiO2 bajas (5, 10, 20 ppm), mientras más
concentrado este la solución con nanopartículas más capacidad inhibitoria tiene.
Lo contrario sucede con las concentraciones altas con las soluciones de
concentración alta, ya que mientras más altas sean su capacidad antimicrobiana
se reduce. Podemos concluir que las NPs-SiO2 presentan una poca capacidad
inhibitoria al crecimiento de las bacterias E.Coli.
111
- En el tratamiento del efluente del reactor RAFA a escala piloto para la
inactivación de las bacterias E. coli, la concentración optima de las NPs-SiO2 es
de 120 ppm, obteniendo un mayor porcentaje de inactivación de 71.43 %.
- El tiempo de contacto óptimo de las NPs-SiO2 para la inactivación de las bacterias
E. coli es de 2 horas, pero mientras exista más tiempo de contacto el porcentaje
de inactivación disminuirá, y estas nanopartículas actuarán como soporte para el
crecimiento de dichas bacterias.
112
RECOMENDACIONES
- Analizar las nanopartículas en DRX para el análisis de compuestos mayores,
menores en la muestra.
- Hacer uso adecuado de materiales para la realización de la parte experimental,
como se describe en los métodos a consulta.
- Para el trabajo con agentes biológicos en importante la esterilización de materiales
y del medio, ya que son muy susceptibles a ser contaminados
- Utilizar otras nanopartículas para un estudio similar al presente
- Controlar constantemente la relación de ácido vs base del reactor RAFA
- Realizar el mismo estudio, pero utilizando el efluente real de una PTAR
113
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118
ANEXOS
119
ANEXO A: Requerimientos de toma de muestra por la empresa acreditada S.G.S.
120
ANEXO B: Metodo de medición de Relación AI/AP
METODO DE MEDICIÓN DE RELACION AI/AP
Para realizar estas mediciones, se siguieron los siguientes pasos:
 Tomar 60 ml de muestra de lodo
 Separarlo en 4 tubos de plástico y centrifugar por un tiempo de 10 min a 4000
rpm
 Retirar solo el líquido de los tubos y acumular 50 ml en un vaso de precipitación
 En una bureta llenar 50 ml de HCl a 0.1 N
 Poner el vaso en el agitador magnético y titular a pH 5.7 y anotar el volumen 1
(V1: alcalinidad bicarbonatica), titular a pH 4.3 y anotar el volumen 2 (V2:
alcalinidad debida a los AGV)
 Para hallar el índice de buffer es igual a:
𝑉2
𝐼𝐵 =
𝑉1 + 𝑉2
 Si el resultado sale entre 0.2<IB< 0.35, quiere decir que el reactor está
trabajando óptimamente.
En la tabla 12, se resume las mediciones realizadas periódicamente.
121
Tabla 12: Resumen de variación de IB
Mediciones pH Inicial V1(ml)-pH V2(ml)-pH IB
5.7 4.3
1 6.8 12 18 0.40
2 6.7 11 21 0.34
3 6.9 10 24 0.29
4 7 13 24 0.35
5 6.8 11 20 0.35
6 6.8 10 22 0.31
7 6.9 10 22 0.31
8 7.1 12 23 0.34
9 6.9 11 21 0.34
10 6.9 10 21 0.32
11 7 11 20 0.35
12 6.9 10 21 0.32
122
ANEXO C: Fotografías
Fotografía 31: Materiales usados en el proyecto de investigación
Fotografía 32: Nanoparticulas de silice a concentraciones de 20,120 y 240 ppm
123
Fotografía 33: Sonicación de las nanoparticulas de silice a diferentes concentraciones
Fotografía 34: Muestra de agua residual simulada
124
Fotografía 35: Inoculacion de las nanoparticulas en el agua
residual simulada
Fotografía 36: Muestras en contacto con las nanoparticulas
125
Fotografía 37: Envases para las muestras a analizar
Fotografía 38: Toma de muestras a analizar
126
ANEXO D: Resultados
127
128
129

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Facultad de Ingeniería Química

Evaluación de la concentración y el tiempo de contacto de las

Cornelio Pucuhuayla, Eileen Solange

Esta obra está bajo licencia

FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA

EVALUACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN Y EL TIEMPO DE CONTACTO

DE LAS NANOPARTÍCULAS DE ÓXIDO DE SILICIO PARA LA

INACTIVACIÓN DE LAS BACTERIAS E. COLI EN AGUAS RESIDUALES

PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL DE INGENIERO QUÍMICO

CORNELIO PUCUHUAYLA, Eileen Solange

QUIÑONES CORONEL, Nicole Ginger

Ms. EVER F. INGARUCA ALVAREZ

Mg. ANA MARÍA OSORIO ANAYA

Este trabajo va dedicado de manera

especial a mi madre Doris, siendo ella la

base para la construcción de mi carrera

profesional, siempre le estaré agradecida

Este trabajo va dedicado a Dios, por

concederme la oportunidad de seguir con

vida, por estar conmigo en cada paso que

doy y por haber puesto en mi camino a mis

padres, Rubén y Mery, a mis hermanos,

Ayrton y Patrick que han sido mi apoyo

durante todo el periodo de estudio.

apoyaron en toda nuestra formación profesional.

concurso de Tesis de Pregrado 2018-UNCP, nuestro proyecto de tesis se pudo concretar

con éxito; brindándonos el apoyo económico y la asesoría necesaria para desarrollar la

consejos para guiarnos al final de nuestro trabajo.

brindarnos las facilidades para desarrollar la experimentación de nuestro trabajo en el

Laboratorio de Nanotecnología e Innovación Tecnológica de la Facultad de Química e

nuestra estadía en la Universidad Nacional Mayor San Marcos.

En el presente trabajo de investigación se evaluó un nuevo método de inactivación de

bacterias E. coli presentes en aguas residuales municipales sintetizadas en un reactor

RAFA utilizando nanopartículas de sílice (NPs-SiO2). La investigación se dividió en 3

etapas. La etapa 1 consistió en la caracterización de las NPs-SiO2, el estudio de la

en el efluente del reactor. Las NPs-SiO2 se caracterizaron mediante Difracción Dinámica

Electrónica de Barrido (SEM) mostrando nanopartículas aglomeradas formando poros de

menos 100 nm con forma semiesféricas, por Microscopia Electrónica de Transmisión

(TEM) mostrando un diámetro menor a 20 nm y por el método de Espectrofotometría

con el material sintetizado. En el estudio de la actividad microbiana, se realizaron lecturas

de inhibición de crecimiento bacteriano de la bacteria E. coli a concentraciones bajas y

altas, se obtuvieron valores de CMI de 20 ppm en concentraciones bajas y de 120 ppm en

muestras a diferentes tiempos de 2, 4, 6 horas de contacto, obteniendo un resultado óptimo

de concentración y tiempo de 120 ppm en 2 horas presentando una inactivación de 71,4%,

NPs-SiO2 pueden inactivar mas no eliminar las bacterias E. coli.

Unos de los problemas mayores asociado con la contaminación hídrica es la descarga de

agentes patógenos de las plantas de tratamiento de las aguas residuales municipales lo

que ocasiona el daño de biodiversidad y enfermedades. Para solucionar este problema, es

tratamientos avanzados para la disminución del crecimiento bacteriano presente en los

efluentes de las plantas de tratamiento de aguas residuales. Existen diferentes formas de

más empleados se encuentra la cloración, ozonificación, luz ultravioleta, la

nanotecnología entre otros (Unidas, 2016)

Actualmente la rama de la nanotecnología se ha identificado como una solución a la

eliminación o inactivación de las bacterias presentes en las aguas residuales municipales

e industriales. En estudios anteriores se ha identificado que las NPs pueden interactuar

directamente con las células microbianas y provocar la inactivación de las mismas

desarrollo de nuevos métodos para la inactivación de E. coli mediante la aplicación de

NPs-SiO2 se divide en tres capítulos. El primero se basa en la revisión bibliográfica que