APUNTES SOLEMNE 2 BIOCEL

Biocel
Solemne II

-DNA Recombinante
-Métodos en Biología Celular
-Biomembranas
-Transporte a través de membranas biológicas
-Transporte intracelular parte I
-Compartimientos y transporte intracelular parte II
-Bioenergética I
-Bioenergética II

Edgardo Matus Sáez

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DNA RECOMBINANTE

Las técnicas de ADN recombinante son herramientas de la biología molecular e ingeniería

genética. Permitió producir transgénicos, fármacos y terapias génicas. Fue posible gracias al
descubrimiento de las enzimas de restricción y de la Transcriptasa inversa.

1975 David Baltimore, Howard Temin y Renato Dulbecco, investigaron retrovirus

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

Son producidas por bacterias como método de defensa contra virus al degradar ADN extraño.

El propio genoma bacteriano está protegido contra sus enzimas de restricción mediante
metilaciones en ciertos nucleótidos de secuencia

Las enzimas son específicas para secuencias de ADN

Extremos romos: Se cortaron en el eje de simetría

Extremos cohesivos: Se cortaron lejos del eje de simetría

Cortar 2 moléculas de ADN con la misma enzima de restricción permite recombinar e hibridar
ADN mediante la unión de los extremos cohesivos de los distintos ADN y luego reestablecer
enlaces fosfodiéster con ADN Ligasa

Edgardo Matus Sáez

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PLASMIDIOS RECCOMBINANTES

Genoteca o biblioteca genómica: Conjunto de fragmentos genómicos recombinantes

representa el genoma completo de un individuo: ADN codificante y no codificante.
El genoma cortado en fragmentos por enzimas de restricción puede ser clonado para
posteriormente estudiarlo. Vectores recombinantes, genoteca de expresión (cDNA)

Edgardo Matus Sáez

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Construcción de cDNA a partir de mRNA:

1º Síntesis de ADN complementario

Organismo genéticamente modificado (ogm): Planta, animal, hongo o bacteria a la que se le ha

agregado uno o unos pocos genes con el fin de producir proteínas de interés industrial o
mejorar ciertos rasgos.

TÉCNICA DE AMPLIFICACIÓN DE DNA (PCR)

PCR: Reacción en cadena de la Polimerasa
Se desnatura y separan las cadenas a 94ºC, luego se baja la temperatura a 55ºC para que se
hibridice la molécula con los primer, se elonga la cadena con taq polimerasa a 72ºC y el ciclo
comienza de nuevo.

Edgardo Matus Sáez

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RT-PCR

Retro transcribe una hebra de ARN en ADN complementario usando transcriptasa inversa y el
resultado se amplifica el cDNA mediante una PCR tradicional.

Aplicaciones de PCR:
- Mutagénesis
- RTPCR
- Producción de sondas
- Detección de infecciones bacterianas y virales
- Detección de enfermedades hereditarias
- Evolución molecular
- Medicina forense
- Estudios de filiación

SECUENCIACIÓN DEL ADN

Método de Sanger:
- Polimerización interrumpida de ADN
- Se lleva a cabo en presencia de derivados dideoxi que detienen la polimerización en
diferente momento, obteniéndose fragmentos de diferente tamaño
- Se examinan en electroforesis, “se lee”

MÉTODOS EN BIOLOGÍA CELULAR

Mendel, al igual que muchos científicos, hablaban de la herencia sin saber que molécula era,
cuando se descubrió el ADN ocurrió una explosión de conocimientos y abrió paso a un nuevo tipo
de investigación y descubrimientos.

Permitió el trabajo con células eucariontes, ya que antes solo se trabajaba con Procariontes.

1.- Cultivo celular y separación de células

- Se necesita tener una temperatura controlada, substrato para la adhesión celular y medio de
cultivo apropiado que mantenga pH y osmolaridad (medio isotónico).
- Selección del medio de cultivo es el paso más importante. Uno de los primeros cultivos que
tuvieron éxito, fue un tumor que un médico logró aislar, haciendo que se reprodujera en un
medio en el cual el trabajó.
- Las células animales requieren 9 aa: Histidina, Isoleucina, Leucina, Lisina, Metionina,
Fenilalanina, Treonina, Triptófano, Valina.
- Medio enriquecido: Vitaminas, Sales, Glucosa, Suero.
- Antibióticos. (Estreptomicina, Penicilina, Amfotericina)
- Tampón e indicador de pH

Edgardo Matus Sáez

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-Aditivos específicos: Suplemento de piruvato, suplemento de glucosa, etc.

*Células normales crecen en monocapa. (tienen inhibición de división por contacto con otras
células).
*Células cancerosas crecen en cúmulos. (perdieron la inhibición por contacto y empiezan a crecer
descontroladamente).

Industria farmacéutica y biotecnológica.

Producción de anticuerpos y proteínas que los microorganismos son incapaces de sintetizar.
Screening de toxicidad.
Investigación científica.

Líneas celulares estables:

- Primarias: Se obtienen directamente de los tejidos.

- Secundarias: Se obtiene de tomar una muestra primaria y se realiza nuevo cultivo.
- De líneas establecidas: Derivan de tumores.

Ventajas: Control del entorno, homogeneidad celular, conocimiento del tipo celular.
Desventajas: Falta de diferenciación, Inestabilidad de la línea.

2.- Fraccionamiento subcelular. (Como nuestros organelos tienen distinto tamaño y forma, es
posible que por centrifugación podamos seccionarlos, para analizarlos)

- Para estudiar estructura y/o función de un organelo celular determinado, lo primero que hay
que hacer es purificarlo (Separarlo del resto).
- Debemos romper la membrana, ahí se obtiene un homogeneizado celular o extracto crudo.
- Tenemos una “sopa” de organelos, sin organización.
- Por centrifugación podemos purificar organelo, o proteína (Cromatografía/ Electroforesis)

Edgardo Matus Sáez

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Método para romper membranas (Lisis celular):

- Físicos (Congelación- Descongelación sonicación)
- Químicos (detergente)
- Enzimáticos (Pared Celular)
*debemos tener delicadeza para no dañar el interior

Al final tendremos distintos pellets enriquecido de distintas estructuras y organelos celulares.

Edgardo Matus Sáez

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Así separamos los organelos que se encuentran en un mismo pellet.

3.- Aislamiento y caracterización de macromoléculas celulares

A. Anticuerpos:
-Medio de defensa, se producen en forma específica cuando llegan moléculas externas, el cuerpo
las “desconoce” y crea anticuerpos para cada antígeno.
-Anticuerpos policlonales: Pueden ir dirigidos contra diferentes epítopes de un mismo antígeno.
-Anticuerpos monoclonales: Van dirigidos contra un mismo epítope, de un mismo antígeno. (ultra
específico).
-Producción de anticuerpos policlonales: Administración repetida del mismo antígeno a
intervalos (inmunización), Si yo inoculo el antígeno a un conejo, éste puede producir más o
menos anticuerpos que otro conejo inoculado.
-Producción de anticuerpos monoclonales: Inoculamos antígenos a un ratón, obtenemos
Linfocitos, y éstos los fusionamos con células de mielomas (células de cultivos celulares) y células
productoras de anticuerpos, obtenemos “HIBRIDOMAS”, éstas son inmortales, crecen de manera
indefinida, lo purificamos y clonamos, así obtenemos anticuerpos específicos para cada epítope.

*Para identificar o confirmar enfermedades autoinmunes à ELISA

Se cubre una placa con antígeno, luego se incuba con el suero del paciente, luego el anticuerpo
de detección se incuba, y se hace un lavado, si se queda acoplado la enfermedad es “detectada”
si no se queda acoplado no hay ningún problema. Para detectar esto se adiciona enzimas las
cuales cambian de color. Si cambia de color hay enfermedad autoinmune.

Edgardo Matus Sáez

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En la terapia contra el cáncer: Se han encontrados marcadores blancos, “receptor de tirosina-

quinasa tipo 1” asociado a algunas proteínas presentes en algunos tipos de cáncer (gástrico,
ovárico, pulmonar y mamario). 1998 fue aprobada por la FDA.

-Bloquear el crecimiento celular: Anticuerpos monoclonales bloquean la conexión entre una

célula cancerosa y la proteína que fomenta el crecimiento celular.

-Prevenir el crecimiento de vasos sanguíneos: Anticuerpos monoclonales bloquean las

interacciones que permiten la angiogénesis de las células cancerosas.

B. Inmunohistoquímica e Inmunofluorescencia

Inmunohistoquímica: Reconocimiento de antígenos tisulares por anticuerpos específicos,

permite identificar la localización de una sustancia específica a nivel tisular o celular.

Para la detección del anticuerpo primario se realiza utilizando anticuerpos secundarios contra
inmunoglobulinas. Estos anticuerpos secundarios pueden estar conjugados a un fluorocloro.

Método directo: Se marca el anticuerpo específico.

Método indirecto: Es necesario que el anticuerpo reaccione con un segundo anticuerpo marcado.

Así se detecta el VPH

Inmunofluorescencia: El anticuerpo secundario no está unido a una enzima sino a fluorocromo.

Células HeLa, analizamos con microscopio de fluorescencia.

C. Separación de proteínas (Cromatografía y electroforesis)

Purificación de proteínas para aislar un solo tipo de una mezcla compleja

Cromatografía: Análisis en columna, se colocan resinas con distintas propiedades, y así logramos
separar por cargas (Intercambio iónico), por tamaño (exclusión) o composición (afinidad) las
proteínas.

Electroforesis: Las proteínas se colocan en un soporte, se aplica corriente y las proteínas se

separan por tamaño principalmente, todas las proteínas migrarán al polo positivo, las más
pequeñas migrarán más que las más grandes.

Edgardo Matus Sáez

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BIOMEMBRANAS

Las membranas son dinámicas y esenciales para la función celular.

Proteína integral (alfa-hélice): Los aminoácidos polares estarán al interior, y los hidrofílicos hacia
el exterior.

Modelo del mosaico fluido: Describe la membrana como un tapiz de varias moléculas que están
en constante movimiento. Proteínas y lípidos pueden desplazarse lateralmente.

Colesterol: Da rigidez a la membrana

Filamentos de actina: Interactúan con proteínas de membrana

Funciones de la membrana:
- Transporte de nutrientes
- Impedir el ingreso de sustancias nocivas
- Detecta señales del ambiente extracelular
- Interactuar con otras células (formar tejidos) o con la matriz extracelular
- Mantener la composición iónica y la presión osmótica adecuada para la célula

- Compartimentalización
- Protección
- Catálisis llevada a cabo por proteínas de membrana (tirosin quinasas)

Edgardo Matus Sáez

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LÍPIDOS DE MEMBRANA

Fosfolípidos: Lípidos más abundantes en las membranas biológicas, zona hidrófila y zona
hidrófoba. Carácter anfipático. Fosfatidietiletanoamina, fosfatidilserina, fosfatidilcolina,
esfingomielina

- Esfingolípidos: Cumplen función en la vaina de mielina, lípidos que derivan del

aminoalcohol insaturado de 18 carbonos (esfingosina)
Las membranas son asimétricas con respecto de la composición de tipos de fosfolípidos.

Glucolípidos: Contienen oligosacáridos y solo se encuentran en la monocapa externa.

Colesterol: En todas las membranas eucariotas, más abundante en animales. Da rigidez a la

membrana.
- Disminuye la permeabilidad de la membrana al agua
- Amortigua la fluidez (menos deformable)
- Mientras más colesterol es más estable a la temperatura

Carácter anfipático confiere propiedades a las membranas:

a) Auto ensamblaje: Los lípidos se juntan para formar una estructura unificada, quedando
las porciones hidrófobas al interior, y las porciones hidrofílicas al exterior.

b) Autosellado: Las bicapas tienden a cerrarse sobre si mismas, formando vesículas sin
bordes libres. Micelas (1 capa), Liposoma (2 capas)

c) Fluidez:
- Disminuye cuanto mayor es el grado de saturación de los ácidos grasos
- Disminuye al aumentar la longitud de las cadenas
- Disminuye a medida que desciende la temperatura
- Disminuye al aumentar la proporción de colesterol
*Viscosidad: Aumenta con el grado de saturación, aumenta con la longitud de las colas HC,
aumenta con la disminución de la temperatura, aumenta con la proporción de colesterol.

d) Impermeabilidad: Barrera de contención evitando el escape al exterior celular del

contenido hidrosoluble.

Edgardo Matus Sáez

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PROTEÍNAS DE MEMBRANA

Glucoproteínas:

Periféricas: Manera parcial en una de las superficies de la membrana, unidas covalentemente a

lípidos

Integrales: Abarcan todo el espesor de la membrana, son anfipáticas. Región hidrofóbica, rica en
aminoácidos apolares. Aminoácidos hidrofóbicos en contacto con las moléculas de fosfolípidos y
los aminoácidos hidrofílicos al interior de la hélice, formando un poro acuoso.
- Transportadores (bomba Na+)
- Conectores (integrinas, unen filamentos de las proteínas con filamentos de actina, o con
proteínas de la matriz extracelular)
- Receptores (Receptor de un factor externo)
- Enzimática (adenilato ciclasa)

Funciones de las proteínas de membrana:

- Adhesión celular: Unen membranas de células vecinas (formación de tejidos)
- Canales protéicos: Paso de moléculas pequeñas
- Proteínas de transporte: Transporte selectivo de moléculas esenciales, puede ser activo
o pasivo.
- Proteínas receptoras: Portadoras de señales externas y luego transfieren el mensaje al
interior.
- Bombas dependientes de ATP: Transportan activamente iones de un compartimiento a
otro.
- Actividad enzimática

Aislar proteínas integrales, se les añade detergente, podemos formar micelas o las podemos
disolver sin formar micelas.

Edgardo Matus Sáez

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Difusión de las proteínas de las membranas.

- Experimento que permitió comprobar el movimiento.
A. Fusión celular: Permite fusionar células de especies diferentes, van a tener un citoplasma
común y una sola membrana plasmática continua. Se realiza con un virus inactivado
(sendai) con polietilenglicol o con un shock eléctrico suave. Frye y Edidin demostraron
que las proteínas de membrana podían difundir después de la fusión.

Edgardo Matus Sáez

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B. Hibridización (FRAP): Recuperación de fluorescencia después de fotoblanqueamiento. Se

marcan los componentes integrales de la membrana de células en cultivo con pigmento
fluorescente. Se montan las células en portaobjetos, se colocan al microscopio y se
irradian con un laser en una pequeña zona, dejando una mancha circular sin
fluorescencia.

Se vuelve a recuperar la
zona blanqueada por efecto
del movimiento de las
proteínas a través de la
membrana, esta técnica
también permitió
comprobar el experimento
anterior, que postulaba que
la membrana tenía
movimiento.

Edgardo Matus Sáez

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GLUCOCÁLIX

Zona de superficie celular rica en carbohidratos, asociados a lípidos y proteínas. Aparece en el

lado externo de la membrana interactuando con la matriz extracelular.

- Antígenos de grupos sanguíneos: A, B, AB Y 0 se determina mediante una cadena corta

de azúcares unidos por enlaces covalentes con lípidos de la membrana del eritrocito.
- Lectina: Cuando se produce una infección las células endoteliales exponen la lectina, que
le indica a los neutrófilos que en esa zona hay una infección

Funciones de la glucocálix:
- Protege la superficie de posibles lesiones
- Se relaciona con la matriz extracelular
- Aporta viscosidad a la superficie celular
- Propiedades inmunitarias
- Reconocimiento celular
- Fija determinadas sustancias que la célula debe incorporar por fago o pinocitosis
- Reconocimiento de parásitos a virus o bacterias

CÓRTEX CELULAR

Reforzamiento interior de la membrana, que determina la forma de la célula y las propiedades

mecánicas, por una red de proteínas fibrosas.

Actúan los filamentos de actina, la tropomiosina, etc.

Anclaje al citoesqueleto.

TRANSPORTE A TRAVÉS DE MEMBRANAS BIOLÓGICAS

*Fosforilados à gasto de ATP

OSMOSIS: Movimiento neto de agua a través de una “membrana semipermeable”, o sea sin
proteínas, desde una zona de baja concentración de solutos hacia otra de mayor concentración.

- Tonicidad: Capacidad de la solución extracelular de mover el agua hacia adentro o hacia

afuera de la célula por osmosis.
- Osmolaridad: Concentración total de todos los solutos en la solución.

• Medio Hipotónico: Menor osmolaridad que el liquido intracelular.

• Medio Isotónico: Igual osmolaridad que el liquido intracelular.
• Medio hipertónico: Mayor osmolaridad que el líquido intracelular.

Edgardo Matus Sáez

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OTROS TIPOS DE TRANSPORTE

Edgardo Matus Sáez

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*Si la bicapa fuera pura (sólo fosfolípidos) seria permeable sólo a gases y agua.

ACUAPORINAS: Canales para el agua.

Proteínas integrales que tienen rol importante en la regulación del contenido acuoso, su
formación es de un tetrámero, también transportan moléculas pequeñas sin carga como el
glicerol.

DIFUSIÓN SIMPLE: O2, Moléculas hidrofóbicas (hormonas esteroidales) y otros tipos de solutos
y solventes, pasan a través de la membrana a favor de un gradiente, SIN NECESIDAD de un
transportador.

TRANSPORTE PASIVO: A favor de un gradiente

- Mediados por canal: A través de proteínas canales.
- Mediados por transportador: El transportador sufre un cambio conformacional.

TRANSPORTE ACTIVO: En contra de un gradiente (con gasto de energía).

- Mediado por un transportador con gasto de ATP.
- Bomba impulsada por luz
- Transporte acoplado

• Uniporte: una molécula transportada

• Simporte: dos moléculas distintas en el mismo sentido, (ambas entran o ambas salen)
• Antiporte: dos moléculas distintas en sentidos contrarios, (una entra y otra sale)

TRANSPORTE A FAVOR DE UN GRADIENTE IÓNICO: Está constantemente funcionando,

corresponde a una distribución asimétrica de iones a uno y otro lado de la membrana, éste
permite que exista un gradiente químico, se crea una diferencia de cargas eléctricas, generando
una diferencia de potencial (voltaje) o potencial de membrana.

El gradiente de Na+ se formó por una bomba Na/K

TRANSPORTE ACTIVO PRIMARIO à Gasto directo de ATP [Bomba Na/K ATPasa]

TRANSPORTE ACTIVO SECUNDARIO à La energía es aportada por el gradiente iónico creado por
el Transporte Activo Primario (gasto indirecto).

Edgardo Matus Sáez

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TIPOS DE PROTEÍNAS TRANSPORTADORAS

- Transportadores: Cambios conformacionales, interacción fuerte con la molécula.

- Canales: Interacción débil con la molécula, TÚNEL.
- Bomba de protones: Proteína integral, cambia el pH de las células. (Omeprazol, inhibe la
enzima H/K-ATPasa de las células parietales de la mucosa gástrica, impidiendo la
acidificación del estómago). En lisosomas, lo acidifican, facilitando el paso de productos
finales de la degradación de sustancias hacia el citoplasma

GLUT 4 (activado por insulina) à Músculo, corazón, adiposo.

Los transportadores están secuestrados por una vesícula, se activan en presencia de insulina en
el receptor de membrana, el cual manda señales por transducción.

TRANSPORTE TRANS-CELULAR: Por ejemplo, transporte desde células gástricas hacia la sangre.

Glucosa à Sin fuente de E. à Importe pasivo (glut)

Bomba Na/Glucosa à Gradiente NA+ à Importe activo Glucosa
Bomba Na/H à Gradiente Na+ à Exporte activo iones H+
Bomba Na/K à Hidrólisis ATP à Exporte activo Na+, importe activo K+
Bomba Ca 2+ à Hidrólisis ATP à Exporte activo Ca 2+
Bomba H+ à Hidrólisis ATP à Exporte activo de H+

Edgardo Matus Sáez

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CANALES IÓNICOS: Transporte pasivo (no se acoplan a energía), son selectivos para cada ion
(Na+, K+, Cl-, Ca+2). Forman poros llenos de agua, los cuales se abren brevemente. Despolarizan
la membrana (iones Na+ hacia adentro de la célula) y Repolarizan la membrana (iones K+ se
mueven hacia afuera de la membrana)
- Regulados por ligandos: Se abren en respuesta a determinados neurotransmisores u otras
moléculas.
- Regulados por voltaje: Se abren dependiendo del potencial de membrana.
- Regulados por impulso mecánico

Gradiente electroquímico:
àEléctrico: Diferencia de cargas.
àQuímico: Diferencia de concentración de iones.

Edgardo Matus Sáez

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IMPULSO NERVIOSO

1. Entra el Na+ y se despolariza la membrana

2. Sale el K+ para que se repolarice la membrana
3. Se Hiperpolariza
4. La concentración se vuelve al reposo gradualmente

Edgardo Matus Sáez

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POTENCIAL DE MEMBRANA
- PMR: -50 a -100 mV

En las células eléctricamente excitables (neuronas), el potencial de reposo se registra por la

distribución asimétrica de los iones, Cuando la membrana está en reposo la célula tiene una carga
negativa con relación al exterior. La causa del potencial de acción es el intercambio de iones, un
estímulo abre los canales Na. La diferencia causada se va revirtiendo por los canales de K+, pero
estos van más allá, logrando una hiperpolarización, gradualmente las concentraciones regresan
a los niveles normales.

Dependiendo del tipo de canal iónico activado en la sinapsis esta puede ser:
- Excitatoria: Despolarizaciones de membrana (Na+) Ligandosà acetilcolina, glutamato o
aspartato.
*Potencial postsináptico excitador
- Inhibitoria: Hiperpolarización de la membrana (Cl- y/o K+) aumenta la negatividad al
interior de la neurona.
*Potencial postsináptico inhibitorio.

Edgardo Matus Sáez

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TRANSPORTE INTRACELULAR PARTE I

Transporte entre compartimientos:

- A través de poros nucleares.
- A través de membranas
- Transporte por vesículas (exocitosis)

*Los péptidos de señal dirigen las proteínas hacia el compartimiento correcto

¿Cómo sabe la proteína que se está sintetizando su destino final?

Post-traduccional: Ribosomas libres à Núcleo, Mitocondria, Cloroplasto, Peroxisoma

Co-traduccional: Ribosomas asociados a retículo endoplásmico

La importancia de los péptidos de señal fue demostrada en 1999 cuando Günter Blobel recibió el
Nobel por su descubrimiento. “Las proteínas tienen señales intrínsecas que gobiernan su
transporte y localización en la célula”

àNúcleo: Señal interna, 1 grupo de 5 aa básicos, o 2 grupos más pequeños de aa básicos,

separados por aprox. 10 residuos. No se elimina

àMitocondria: Señal n-terminal, 3-5 residuos de Arg o Lys no consecutivos, generalmente en

combinación con Ser y Thr; sin residuos ácidos. Sí se elimina

àPeroxisomas: Señal C-terminal, Ser-Lys-Leu en C-terminal, No se elimina

àRE: Señal N-terminal, “núcleo” de 6-12 aa hidrofóbicos, generalmente procedido por 1 o más
aa básicos. Sí se elimina

àSuperficie luminal RE: Señal KDEL C-terminal, Lis-Asp-Glu-Leu en proteínas residentes en el RE

en vesículas COPI.

àLisosoma: Oligosacárido que se agrega en el Golgi. (Manosa-6-P)

Edgardo Matus Sáez

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DESTINACIÓN NUCLEAR: Puede estar en cualquier lugar de la proteína. Receptores de señal

interactúan con la proteína CARGO y con proteínas del complejo del poro nuclear.

A través del poro pasan iones,

moléculas pequeñas y grandes en
ambas direcciones. Iones (pasiva),
Proteínas entran (Mecanismo
selectivo con gasto de E.), Proteínas
destinadas al núcleo contienen un
péptido de señal, llamado NLS, debe
ser reconocido por una proteína
llamada Importina, residente en el
citosol.

Moléculas que salen deben ser

reconocidas por EXPORTINAS, por
ejemplo, los mRNA.

Edgardo Matus Sáez

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DESTINACIÓN A MITOCONDRIAS:

Complejo TOM: Membrana externa

Complejo TIM: Membrana interna

*Las proteínas ingresan en su forma más desplegada, no globular. Ingresan translocados, desde
la membrana externa hasta la interna, en la membrana interna, la peptidasa corta la proteína y
la divide.

DESTINACIÓN A RETICULO ENDOPLÁSMICO:

RER: Síntesis y procesamiento de proteínas. Adición y procesamiento de los grupos

hidrocarbonados de las glicoproteínas. Plegamiento de proteínas. Reconocimiento y eliminación
de polipéptidos mal plegados. Ensamblaje de proteínas multiméricas.

REL: Eliminación de sustancias tóxicas. Metabolismo de hidratos de carbono. Almacenamiento

de Calcio. Biosíntesis de esteroides (Hormonas sexuales y hormonas esteroidales de la corteza
adrenal). Biosíntesis de membranas (fuente primaria de lípidos de membrana).

PÉPTIDO SEÑAL à SRP (Signal recognition particle)

Edgardo Matus Sáez

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DESTINACIÓN AL LUMEN DEL RE:

3 tipos de proteínas:
- Proteínas de Secreción: fosfatasa alcalina, insulina, etc
- Proteínas lisosómicas: hidrolasas ácidas.
- Proteínas integrales de membrana: Lipoproteínas, Receptores de membrana, proteínas
RER, Golgi, etc.

TRÁFICO EN EL SISTEMA DE ENDOMEMBRANAS:

Algunas quedan en el RER y otras deben

transformarse para pasar al Complejo de
Golgi a través de vesículas. Una vez en el
Complejo de Golgi, se transforman y se
empaquetan en un sistema de vesículas
para luego ser exocitadas hacia afuera de
la célula (movimiento anterógrado,
COP2). En el caso de la endocitosis, el
paso sería al revés (movimiento
retrógrado, COP1).

TRANSPORTE ENTRE VESÍCULAS:

-Marcadores de membrana SNARE.

- v-Snare (VESÍCULA TRANSPORTADORA)
- t-Snare (VESÍCULA BLANCO)
- Actúan junto con GTPasas llamadas Rab

Edgardo Matus Sáez

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Un experimento de “pulso y caza” se usó para ver que es lo que sucede con una molécula a
través del tiempo. Esto permitió, entre otras cosas, identificar que el ARN era el intermediario
entre el ADN y las proteínas durante la expresión de genes.

Comienza con la “fase de pulso”, se le añade una dosis alta de un aminoácido radiactivo, (si el aa
está radiactivo entonces la proteína que se sintetizará quedará radiactiva por un corto período
de tiempo). Luego viene la “fase de caza” se añade una cantidad alta de aminoácido NO
RADIACTIVO, ya no se sintetizan más proteínas radiactivas. Se rastrea las posiciones, fijando una
muestra de células en diferentes momentos. Hacemos una autoradiografía para poder ver en
que lugar se ubica la proteína en distintos momentos, analizándola con una emulsión fotográfica.

1955 George Palade y su equipo, usaron células pancreáticas.

SEÑAL KDEL:

K (lisina)
D (ácido aspártico)
E (ácido glutámico)
L (Leucina)

Las proteínas que se quedan en el RER tienen la señal KDEL, si se encuentran fuera del RER
moléculas con esta señal, son enviadas de vuelta mediante vesículas.

Edgardo Matus Sáez

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COMPARTIMIENTOS Y TRANSPORTE INTRACELULAR PARTE II

Vesículas están cubiertas por complejos proteicos, y dependiendo de esta cubierta sabemos cual
es su destino:
- Clatrina: Vienen por endocitosis, cuando se junta con otra vesícula se elimina la Clatrina.,
cuando salen del Golgi para ir a la endosoma temprano igual están cubiertas por Clatrina.
- Cop1: Las que salen del Golgi y van al Rer.
- Cop2 Las que van del Rer al Golgi.

Las Vesículas se mueven gracias al citoesqueleto.

Aparato de Golgi: Conjunto de 4-6 cisternas (compartimientos encerrados por membrana).

Principal sitio de síntesis de carbohidratos. Lugar de “clasificación y reparto” de proteínas. Rol en
la modificación química, clasificación y empaquetamiento de las proteínas que recibe, vía
vesículas de transición desde el RE. Está rodeado de vesículas de transporte.

Edgardo Matus Sáez

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GLICOSILACIÓN (RER y Golgi)

Proceso bioquímico en el que se adicionan oligosacáridos. Se transfieren oligosacáridos a la

asparagina (Asn). “n-glicosilación”. Señal (Asn- X – Ser/Thr). Sea x cualquier aa menos prolina.
Principalmente RER.

O-Glicosilación, adición de oligosacáridos al grupo hidroxilo (adición a Serina o Treonina).

Principalmente Golgi.

Edgardo Matus Sáez

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Las proteínas solubles y de membrana sintetizadas en ribosomas asociados a retículo

endoplásmico deben dirigirse a:
- RER
- Golgi
- Endosomas
- Lisosomas
- Liberados al medio extracelular
- Incorporadas a la membrana plasmática

Edgardo Matus Sáez

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EXOCITOSIS

Libera proteínas sintetizadas en ribosomas asociadas al RER. Se dirigen hacia el medio

extracelular.

- Enzimas digestivas.
- Insulina.
- Glucagón.
- Proteasas
- Amilasas
- Lipasa pancreática

Vía secretora:

- Constitutiva: No necesita una señal, se

produce en todas las células, lleva moléculas que
van a formar parte de la matriz extracelular o en la
propia membrana de la vesícula.

- Regulada: Debe llegar una señal para que la

vesícula llegue a la membrana. Se producen solo en
aquellas células especializadas en la secreción.
Productoras de hormonas, neuronas, epitelio
digestivo, glándulas, etc. Se liberan moléculas que
realizan funciones en el organismo.

Ejemplo, Biosíntesis de la Insulina: Se sintetiza en el RER, pre-proinsulina, se forman enlaces

disulfuro y la molécula se envuelve, el péptido C se separa por Enzimas Convertidores

ENDOCITOSIS

Fagocitosis:
Pinocitosis:
Endocitosis mediada por receptores: “LDL” hay receptores de membrana para LDL, en la
membrana interna hay una capa protectora de Clatrina, se invagina y se forma la vesícula, luego
se elimina el revestimiento y se liberan las LDL asociadas a receptor, los LDL terminan en los
lisosomas y los receptores se reciclan y vuelven a la membrana. Si estos no pueden ser
endocitadas, entonces se quedan fuera de la célula, en este caso en la sangre.

Edgardo Matus Sáez

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LISOSOMAS: Son organelos que contienen enzimas digestivas capaces de degradar

macromoléculas biológicas, son parte de la red RER-Golgi, pueden degradar material endocitado
(heterofagia) o estructuras intracelulares o macromoléculas dañadas o innecesarias (autofagia),
aíslan a las enzimas digestivas del resto de la célula. Regulan su pH ácido con bomba de H+.

Lisosomas Primarios: recién formados

que todavía no están degradando
células, son organelos derivados del RER
y Golgi. Hidrolasas son sintetizadas en el
RER, luego sufren glicosilaciones
(manosa-6-p), las enzimas lisosomales
son reconocidas y marcadas.

Lisosomas Secundarios: Morfología

variable que están implicados en
procesos de digestión celular. Son
resultado de la fusión de un lisosoma
primario y una endosoma.
- Fagolisosomas: Proceden de un
lisosoma primario que se fusiona con
una partícula del exterior.
- Endosomas tardías: Lisosoma
primario + vesícula grande procedente
de la endocitosis.
- Autofagolisosomas: proceden de la fusión de un lisosoma primario con organelos
dañados de la célula.

PEROXISOMAS: Organelos rodeados de membrana sencilla, no derivan del Retículo

endoplásmico. Presentan catalasas, una enzima esencial para la degradación del peróxido de
hidrógeno (H2O2).

Metabolismo del H2O2: Detoxifican H2O2 que se producen por la coexistencia en el mismo
organelo de la catalasa y la oxidasa.

Degradación de compuestos nocivos: Donantes de electrones al metanol, etanol, ácido fórmico,

formaldehído, nitritos y fenoles.

Oxidación de ácidos grasos: Beta oxidación.

Metabolismo de compuestos nitrogenados: Aminotransferasas, biosíntesis y degradación de

aminoácidos.

Edgardo Matus Sáez

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CATALASA-PEROXIDASAS

Enzimas que se encuentran en animales y vegetales. Es necesaria porque durante el metabolismo

se genera una molécula tóxica, el peróxido de hidrógeno. Entonces esta enzima descompone el
peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno.

Donante + H2O2 à Donante oxidado + H2O

Esta enzima utiliza como cofactor el grupo hemo.

Edgardo Matus Sáez

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BIOENERGÉTICA

Si no hay oxígeno disponible, se detiene el ciclo

de Krebs y la mitocondria queda en estado
estacionario, no produce ATP, ya que el oxígeno
es el aceptor final.

La energía que comemos:

- 50% se pierde como calor
- 5-10% se consume durante la digestión y absorción (termogénesis postpandrial)
- 25-40% se convierte en ATP à eficiencia energética
- 50% de nuestro ATP total se renueva cada hora en reposo.

Una persona sedentaria que consume más de lo que gasta, almacenará esa energía como lípidos.

Metabolismo: todas las reacciones que se realizan dentro del organismo, ya sea degradación
(catabolismo) o síntesis (anabolismo).

- Endergónicas: variación de energía libre de Gibbs es positiva. Desfavorable/ No

espontánea.
- Exergónicas: variación de energía libre de Gibbs es negativa. Favorable / Espontánea.

Catabolismo à Exergónicas (se aprovecha en la síntesis de ATP), Redox

Anabolismo à Endergónicas (Necesitan ATP)

Oxidación y Reducción:
- Agente reductor (A) es aquel que cede electrones a un agente oxidante (B). El agente
reductor se oxida.
- Agente oxidante (B) es aquel que oxida a un agente reductor (A). El agente oxidante se
reduce.

Edgardo Matus Sáez

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Destino del FAD reducido es volver a ser oxidado en la cadena transportadora de electrones.
Destino del NADPH es ser poder reductor para los compuestos en las vías anabólicas.

Metabolismo:
- Catabolismo: Glicolisis, Beta-Oxidación, Ciclo de Krebs, C. respiratoria, Fosforilación
oxidativa. (Produce ATP)
- Anabolismo: Sintesis de aminoácidos, Síntesis de glúcidos, síntesis de lípidos, síntesis de
nucleótidos, gluconeogénesis. (Requiere ATP)
- Anfibolismo: Ciclo de Krebs (algunos intermediarios pueden ser oxidados y otros ir al
anabolismo.

Edgardo Matus Sáez

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Respiración celular: Nutrientes absorbidos son OXIDADOS para obtener energía.

Participación de la Mitocondria (funcionan sólo en presencia de O2)

Metabolismo de la glucosa:
1. Glucosa
2. Fructosa 1,6 bifosfato
3. 2 moléculas de Gliceraldehido 3-fosfato (1 Gliceraldehido 3-fosfato y un Dihidroxiacetol
fosfato que se transforma por una isomerasa a Gliceraldehido 3-fosfato)
4. 2 moléculas de piruvato
Ganancia Neta à 2 ATP

Mecanismos para obtención de ATP:

1. Fosforilación a nivel de sustrato: No se ocupa la cadena transportadora de electrones.

Delta G muy negativo. Transferencia directa

de un fosfato al ADP.

- Se transfiere un grupo acilfosfato al

ADP para formar ATP, catalizada por
fosfoglicerato quinasa.
- Se transfiere el grupo fosforilo del
fosfoenolpiruvato al ADP para formar ATP
catalizada por el piruvato quinasa.

Delta G 1 mol de ATP en ADP y Pi es -7,3

kcal/mol (-30,5 kJ/mol).

2. Fosforilación oxidativa: Mitocondrial

Glicolisis: citoplasma
Glucosa à 2 piruvato + 2 NADPH reducido + 2 ATP Neto

Fermentación láctica: tejido muscular, glóbulos rojos, bacterias lácticas.

2 Piruvato à 2 Lactato *Permite regenerar el NAD

Fermentación alcohólica: levaduras

2 Piruvato à 2 Acetaldehído + 2 CO2 (Residuo) // 2 Acetaldehído à 2 Etanol

Edgardo Matus Sáez

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Mitocondrias: Organelos, presentes en prácticamente todas las células eucariotas, encargados

de suministrar la mayor parte de la energía necesaria para la actividad celular. Sintetizan ATP por
medio de Fosforilación oxidativa.

- Matriz mitocondrial: iones metabolitos, ADN circular bicatenario, Ribosomas 70s,

proteínas y ARN mitocondriales. Aquí ocurre el ciclo de Krebs, Beta-oxidación de los
ácidos grasos, se oxidan los aminoácidos y se localizan reacciones de síntesis de urea y
grupos hemo.

Una vuelta al ciclo de Krebs (1 acetil-CoA) produce:

- 3 NADH
- 1 GTP (ATP)
- 1 FADH2
- 2 CO2

Catabolismo de ácidos grasos:

Lipólisis, en el adipocito se catabolizan los trigliceridos

BIOENERGÉTICA II

Síntesis y degradación de triglicéridos en Tejido Adiposo

Edgardo Matus Sáez

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Lipólisis: En los adipocitos por acción de glucagón, epinefrina y norepinefrina, la Lipasa

transforma los Triglicéridos a Ácidos grasos y a Glicerol. Los ácidos grasos se unen a la albumina
y pasan a la sangre, el glicerol pasa directamente a la sangre al ser soluble, y luego pueden ser
utilizados por el hígado para formar glucosa. Gluconeogénesis.

Edgardo Matus Sáez

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BETA OXIDACIÓN

1. Oxidación: FADH2
2. Hidratacion
3. Oxidacion: NADH
4. Tiolisis: Se forma un acil-CoA con 2 carbonos menos que el de partida y se produce un
acetil CoA.

Ejemplo:

- Palmitil CoA (16 C):

- 7 Beta oxidaciones y se generan 7NADH, 7 FADH2 y 8 acetil CoA

Edgardo Matus Sáez

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Membrana Interna Mitocondrial: Contiene más proteínas, carece de poros y es altamente

selectiva; contiene muchos sistemas de transporte transmembrana. Posee invaginaciones
llamadas crestas mitocondriales.

- Cadena transportadora de electrones: O2 + NADH + FADH2 à (Gradiente de H+) + H2O.

Complejo I (NADH à NAD+), Complejo II (FADH2 à Fumarato), Complejo III (Aceptor de
electrones de CI y CII y pasa como intermediario por la Q), Complejo IV (Moviliza protones
desde Cyt c y también ½ O2 + 2H+ à H2O)

- Fosforilación oxidativa: ADP + (Gradiente de H+) àATP

Teoría Quimiosmótica: El gradiente electroquímico de protones a través de la membrana interna

mitocondrial (fuerza proto-motriz) es crucial para la sintesis de ATP desde el ADP + Pi

Fosforilación a nivel de sustrato

FOTOSÍNTESIS

6 CO2 + 6 H2O à C6H12O6 + 6 O2

Clorofila: Absorbe 400-450nm (azul) y 650-700nm (rojo). Refleja color verde

- Clorofila a: R Metil
- Clorofila b: R Aldehído

Fase dependiente de la luz: H2O + ADP + NADP+ àO2 + ATP + NADPH

- Por cada fotón que llegue se libera un electrón.

- Complejo antena “embudo”, colectan los fotones.

PSII (Fotólisis del agua) à Aceptor e- àCadena transportadora de e- à PSI (Producción de

NADPH)

Fase luminosa acíclica, PSII y PSI, excita su pigmento diana P680, pierde tantos electrones como
fotones absorbe. Pero para reponer los electrones que perdió el pigmento P680 se produce la
hidrólisis de agua, desprendiendo oxígeno. Este proceso se realiza en la cara interna de la
membrana de los tilacoides. Los H+ son introducidos en el interior del tilacoide por el citocromo
b-f y crean una diferencia de potencial electroquímico. Esto hace salir protones a través de las
ATP sintetasa (Fosforilación del ADP).

Fase luminosa cíclica, PSI, flujo de electrones que en cada vuelta da lugar a ATP, no hay fotólisis
de Agua y tampoco se genera NADPH, ni se desprende oxígeno. Su finalidad es generar más ATP
imprescindible para realizar la fase oscura posterior.

Edgardo Matus Sáez

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Fase independiente de la luz: ATP + NADPH + CO2 à Glucosa + aa+ ácidos grasos

- Se realiza en el estroma de los cloroplastos

- Se fija el CO2 atmosférico
- Ciclo de Calvin

Edgardo Matus Sáez

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Author: MATUS SÁEZ EDGARDO J
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