Tema 7: Clonación de ácidos nucleicos.

1. METODOS DE CLONACION MOLECULAR.

Clonación molecular: proceso de amplificación in vivo de secuencias de ADN genómico o ADNc basada en la tecnología de
ADN recombinante. Proceso:

- Inserción del fragmento de ADN en un vector.

- Introducción del vector recombinante en una célula viva hospedadora.
- La selección y multiplicación en cultivo de las células que portan el ADN recombinante.
- La recuperación del fragmento amplificado.

Ventajas:

- Permite obtener cantidades ilimitadas de la secuencia de interés.

- Se pueden clonar secuencias de ADN de gran tamaño.
- En un único proceso se puede clonar el genoma entero de un organismo, permitiendo la creación de bibliotecas
genómicas.
- Posibilita la expresión de genes.

Clonación molecular PCR

Técnica in vivo Técnica un vitro
El fragmento de ADN de interés se introduce en una El fragmento de ADN se replica en un tubo de ensayo.
célula viva.
Es manual y dura varios días. Automatizada y dura horas.
Permite obtener cantidades ilimitadas de la secuencia Las cantidades de secuencias de interés están limitadas
de interés. por un número de ciclos.
Permite amplificar secuencias de ADN de incluso Niveles de amplificación menor.
millones de pb.

2. COMPONENTES DE LA CLONACION.
2.1. LOS VECTORES DE CLONACION.

Vectores de clonación: moléculas de ADN que pueden replicarse automáticamente en una célula huésped y que permiten la
inserción de ADN extraño, sin perder esa capacidad de replicación autónoma.

A) CARACTERISTICAS DE LOS VECTORES DE CLONACION.

- Origen de replicación: le permite replicarse en la células huésped.
- Sitio de inserción de ADN extraño: secuencias diana de enzimas de restricción. En algunos vectores las dianas de
restricción se concentran en un segmento corto del vector, denominado sitio múltiple de restricción o sitio múltiple de
clonación o polylinker.
- Marcador de selección: permite distinguir las células que portan el vector de aquella que no lo portan mediante genes de
resistencia a antibióticos (solo crece la bacteria que tiene el gen de resistencia).
- Marcador de identificación: permite distinguir las células que portan un vector recombinante de las que no.
B) TIPOS DE VECTORES.

Se diferencian por el origen, disposición de los elementos y el tamaño del fragmento de ADN.

- Plásmidos: moléculas circulares de ADN bicatenario extracromosómico que se replica independientemente del ADN
bacteriano. Se diferencian según:
o El tamaño del inserto que puede transportar.
o El número de copias del plásmido por células que puede alcanzar tras su replicación en la célula hospedadora.

Los plásmidos más utilizados son:

o pBR322: puede transportar fragmentos de ADN pequeños (3,5-5 kb), el número de copias por células es de 20.
o pUC18: se usa por su capacidad de aceptar insertos de hasta 10 kb y su alta tasa de replicación (500 copias x
célula).
- Bacteriófagos: virus que infectan a bacterias. Cuando introduce su material genético en la bacteria se adueña del control
metabólico. Y desarrolla:
o Ciclo lítico: consiste en la replicación del cromosoma vírico, la síntesis de proteínas víricas, el empaquetamiento
de los nuevos virus y su liberación por la lisis celular.
 o Ciclo lisogénico: en el ciclo lítico algunos fagos insertan temporalmente su material genético en el cromosoma
bacteriano mediante recombinación. Como es el caso del fago lambda (uno de los mas usados) en ellos se
pueden incluir hasta 20kb.
- Cósmidos: son vectores híbridos construidos con parte del cromosoma del fago lambda y parte de un plásmido
bacteriano. Posee las características del fago y el origen de replicación del plásmido, un gen de resistencia a antibióticos
y un polylinker. Insertos de 50 kb.
- Fagémidos: son vectores híbridos compuestos por un plásmido al que se le inserta el origen de replicación de in fago
M13 (puede producir ADN monocatenario). Se infecta la célula hospedadora con M13, las proteínas del virus reconocen
el origen de replicación del fagémido e inicia la replicación. Experimentos de secuenciación y sondas monocatenarias.
- Cromosomas artificiales: son vectores de clonación con capacidad de transportar fragmentos de gran tamaño. Se
denominan vectores de alta capacidad y son idóneos para la construcción de genotecas genómicas. Los mas utilizados
son:
o Cromosomas artificiales bacterianos (BAC): pueden transportar insertos de ADN extraño de hasta 300 kb.
o Cromosomas artificiales de levaduras (YAC): pueden transportar insertos mayores de 1Mb.
- Vectores lanzadera: vectores híbridos que contienen orígenes de replicación de dos hospedadores diferentes,
normalmente uno de plásmido bacteriano y otro de levadura o de virus animal como el SV40.
2.2. CELULAS HOSPEDADORAS.

Células hospedadoras: aquellas en las que se introduce el vector de clonación para su amplificación mediante replicación,
dependen del tipo de vector.

A) CELULAS HOSPEDADORAS BACTERIANAS.

Son las más utilizadas como hospedadoras, por la escasa complicación técnica de su manipulación. Gran versatilidad y la
rapidez con la que crecen. La más utilizada es la E. Coli, concretamente la cepa K12; aunque también Bacillus subtilis y
especies del género Streptomyces.

B) CELULAS HOSPEDADORAS EUCARIOTAS.

- Levaduras: se usan como hospedadoras para clonar YAC y plásmidos de levaduras basados en el plásmido 2u. La
levadura más utilizada es S. cerevisiae, otras: Pichia pastoris y Hansenula polymorpha.
- Células vegetales y animales: se utilizan en experimentos de clonación para obtener organismos transgénicos:
o Células animales: vectores víricos (derivados del genoma baculovirus, infecta células de insectos o retrovirus,
células de mamíferos).
o Células vegetales: vectores basados en el plásmido Ti de la bacteria Agrobacterium tumefaciens.
3. FASES DEL PROCESO DE CLONACION.
- Fase I: creación de un vector recombinante.
- Fase II: introducción del vector en la célula hospedadora.
- Fase III: selección e identificación de los clones que portan la secuencia de interés.
3.1. CREACION DEL VECTOR RECOMBINANTE.

Vector recombinante: contiene un inserto de ADN extraño. Para ello es necesario crear extremos romos y cohesivos en los
extremos de las moléculas.

A) PREPARACION DEL ADN QUE SE VA A CLONAR.

Para que un ADN bicatenario tenga extremos cohesivos debe tratarse con enzimas de restricción (endonucleasas de
restricción).

Se somete a una digestión donde se generan múltiples fragmentos de diferentes tamaños. Esta estrategia es útil para generar
librerías génicas pero no cuando se quiere amplificar un gen, pues la identificación del clon específico supone más tiempo y
más gastos de recursos.

Cuando se quiere clonar solo un gen se debe amplificar previamente el ADN mediante PCR. La Taq ADN polimerasa, genera
amplicones con una A extra en los extremos 3´. Los amplicones se pueden insertar en vectores que tienen las T desapareadas
en sus extremos 3´, Vectores T.

B) PREPARACION DEL VECTOR DE CLONACION.

Hay varias situaciones:

- Vector circular, con diana de restricción única (mayoría de los plásmidos). Extremos cohesivos.
- Vector circular con dos dianas de restricción, al cortar con una enzima se forman 2 fragmentos. Extremos cohesivos.
- Vector lineal con una diana de restricción única. Extremos exteriores romos e interiores cohesivos.
- Vector lineal con 2 dianas de restricción (fago lambda). Ambos extremos cohesivos y brazos derecho e izquierdo
extremos exteriores romos e interiores cohesivos.
C) INSERCCION DEL ADN EXTRAÑO EN EL VECTOR.

Mezclándolos o incubándolos en presencia de una ADN ligasa que sella covalentemente las mellas de la doble hélice de
ADN, produciendo el vector recombinante en la ligación. Los productos se introducirán en las células hospedadoras y
deberán eliminarse en fases posteriores de la clonación.

3.2. INTRODUCCION DEL VECTOR EN LA CELULA HOSPEDADORA.

A) TRANSFORMACION BACTERIANA.

Transformación bacteriana: captación e internalización de moléculas de ADN desnudas presentes en el medio externo en una
bacteria. Solo se puede realizar en bacterias denominadas bacterias competentes.

La E. coli no es competente por lo que hay q transformarla con cloruro cálcico y un choque térmico (tratamiento químico y
físico), aumenta la permeabilidad de la membrana y la pared, facilitando la incorporación del vector. Finalizado, las bacterias
se siembran en placas con medio de cultivo sólido.
B) TRANSFECCION.

Transfección: introducción de vectores recombinantes en células eucariotas no mediada por virus. Tipos:

- Métodos químicos:
o Fosfato cálcico: el vector precipita sobre las membranas celulares y es introducido en el interior de la célula por
endocitosis.
o Liposomas: se incluye el vector en liposomas que se fusionan con las membranas y liberan su contenido al
interior de la célula (eficacia media, pero mayor que la del fosfato cálcico).
- Métodos físicos:
o Electroporación: consiste en aplicar cortos pulsos eléctricos de alto voltaje en una mezcla de células
hospedadoras en suspensión y vectores al interior de la célula. Gran eficiencia y se puede usar en todo tipo de
células hospedadoras.
- Métodos biológicos:
o Transducción: consiste en la introducción de material genético extraño en una célula por la acción de un virus.
El vector recombinante se empaqueta dentro de la cápside de un virus con el que se infecta un cultivo de células
hospedadoras. Situación habitual: infección de cultivos bacterianos con fagos recombinantes o Cósmidos
empaquetados en fagos. Determinados virus y retrovirus se utilizan también para introducir vectores en células
eucariotas vegetales y animales.
3.3. SELECCIÓN E IDENTIFICACION DE CLONES RECOMBINANTES.

Tras la introducción del vector en la célula hospedadora se obtienen 3 tipos de células:

- Células no transformadas (no captan ADN extraño).

- Células transformadas que portan el vector recombinante específico.
- Células transformadas que portan un vector no recombinante o alguna molécula de ADN no deseada producida en la
ligación.
A) GENES DE RESISTENCIA A ANTIBIOTICOS.

Se emplean vectores con genes de resistencia a antibióticos (ampicilina y tetraciclina). El punto de inserción del ADN extraño
se localiza en la secuencia de un gen de resistencia, de modo que en los vectores recombinantes, ese gen no es funcional.
Cuando se introduce el vector en bacterias sensibles a ampicilina y a tetraciclina se forman 3 tipos de células:

- No transformadas (sensibles a los antibióticos).

- Transformadas resistentes a la ampicilina y sensibles a la tetraciclina.
- Transformadas con el vector no recombinante resistentes a los antibióticos.

Selección: se cultivan las células en una placa Petri con medio de cultivo con ampicilina, solo crecerán las bacterias
transformadas.

Identificación: se pasa la placa de ampicilina a otra con tetraciclina y solo crecerán las bacterias transformadas con el vector
no recombinante.

Los clones recombinantes: colonias que crecen en la placa con ampicilina pero no en tetraciclina.
 B) ESTRATEGIA CROMOGENICA.

Se basa en la identificación, se combinan:

Operón lac
- Bacterias hospedadoras defectivas lactosa
El gen lacZ codifica la B-galactosidasa, forma parte del operón
negativas o lac -: no producen B-galactosidasa.
lac. Responsable del transporte y metabolismo de la lactosa en E.
La bacteria es sensible al antibiótico que porta
Coli. el operón consta de 3 genes que codifican enzimas, un
resistencia al vector.
promotor y un represor. Las cepas con un operón funcional son
- Vectores con un gen re resistencia al antibiótico y
lac +. Las que no tienen funcional el operón son lac -
el gen de lacZalfa con un polylinker en su interior.

La selección e identificación se realizan a la vez, se

obtienen 3 tipos de células:

- Células no transformadas (sensibles antibiótico y

lac-)
- Células transformadas con el vector recombinante, resistentes al antibiótico y lac - .
- Células transformadas con el vector no recombinante, resistentes al antibiótico y a lac+.

Se cultivan las bacterias en un medio de cultivo con el antibiótico y un inductor del operón lac (IPTG) y el sustrato
cromogénico X-gal. Solo crecerán las bacterias transformadas. Las bacterias con el vector recombinante (lac-), producen
colonias blancas y las que portan el vector no recombinante (lac +) producen colonias azules.

C) PROTEINAS FLUORESCENTES.

Se emplean vectores con un gen de resistencia para la selección y un gen que codifica la proteína fluorescente para la
identificación. El polylinker se incluye en el gen fluorescente, los insertos inactivan el gen. La proteína más usada es la GFP
(proteína verde fluorescente).

Selección: crecimiento bacterias en un medio con antibiótico.

Identificación: iluminando las placas con luz ultravioleta. Las bacterias transformadas con plásmidos no recombinantes
emiten fluorescencia, las colonias transformadas con plásmidos recombinantes no.

D) GENES LETALES.

Se emplean vectores con un gen de resistencia a antibióticos y un gen que codifica par la proteína letal, con un polylinker en
su interior. En vectores recombinantes la proteína letal no es funcional al ser interrumpida por el inserto de ADN extraño.

Se basa en la selección: cultivando las bacterias en un medio con el antibiótico. Únicamente proliferan las bacterias con el
vector recombinante. Las bacterias no transformadas no crecen al ser sensibles al antibiótico y las transformadas con el vector
no recombinante mueren por la proteína letal.

3.4. TASA DE TRANSFORMACION.

Mide la eficiencia de la introducción del vector en la célula hospedadora.

4. BIBLIOTECAS DE ADN.

Biblioteca de ADN: colección de vectores recombinantes clonados cuyas secuencias de ADN extraño se obtienen de un
único organismo. Tipos:

- Bibliotecas genómicas (de ADN genómico): incluyen el genoma completo. Por la complejidad del genoma de
organismos superiores, se usan vectores para intentar mantener el genoma completo en el menor número de clones. Se
suelen realizar en fagos.
En la biblioteca se representan todos los genes de un organismo. Y se debe tener una copia de cualquier secuencia que
presente el genoma. El número mínimo de clones se puede calcular en base al tamaño del genoma y tamaño de los
insertos clonados, dependerá del vector clonado.
- Bibliotecas cromosómicas: a partir de un cromosoma o fracción.
- Bibliotecas de ARNc: a partir del ARNm mediante la retrotranscipción. Representan el subconjunto de genes de un
organismo que se expresan en un tipo celular y un estado metabólico concretos.
5. APLICACIONES DE LA CLONACION MOLECULAR.
A) INVESTIGACION BASICA.

Para descifrar secuencias génicas completadas de cualquier organismo, para estudios filogenéticos, de diversidad génica y de
expresión génica.

B) INVESTIGACION APLICADA.
- Clonación de vectores de expresión: posibilitan la producción a nivel industrial de proteínas recombinantes. Por
ejemplo: insulina, factores de coagulación, enzimas…
- Clonación mediante inserción de genes en el genoma de células vegetales o animales: se han producido avances en
agricultura acelerando la mejora genética, produciendo individuos más resistentes, más fértiles…
GMO: organismos en los que se insertan genes nuevos o modificadores, están sometidos a una legislación y regulación.

En medicina hay dos aplicaciones de clonación molecular:

Ratones Knockout y knockin
- Ratones transgénicos: se les modifica su ADN por Depende el tipo de gen insertado:
introducción de un gen nuevo o eliminación de uno
propio, para estudio de enfermedades genéticas tanto a -Knockout: se inactiva un gen determinado, por delección o
nivel de comprensión como de tratamiento. inserción de otro gen distinto, se interrumpe la secuencia
- Terapia génica: se transfieren genes normales a células codificante del que que se quiere inactivar.
somáticas para corregir una enfermedad genética. Se - Knockin: un gen normal se sustituye por otro mutado. Es
pretende conseguir que las células sinteticen el producto una mutagénesis dirigida, permite estudiar pequeñas
génico normal, evitando un tratamiento farmacológico de mutaciones o mutaciones de gran envergadura.
por vida. Está sometida a un riguroso control legislativo y
La obtención de estos ratones supone meses de trabajo y
ético.
múltiples pasos.