“Año del Bicentenario del Perú: 200 años de Independencia”
Universidad San Ignacio de Loyola
INFORME N°6
EVALUACIÓN DE LAS ACTIVIDADES METABÓLICAS
BACTERIANAS
Curso: Microbiología General
Bloque: FC-PREIAM07B1M
Profesora: Keidy Cancino Chavez
Alumnas: ● Diaz Forero, Heimmy Yeremy
● Napa Sebastián, Selene
● Nash Venegas, Shania Coleen
● Rengifo Delgado, Maria Laura
● Terrones Ojeda, Ana Claudia
● Tovar Oxa, Milene
ÍNDICE
I. INTRODUCCIÓN 3
II. OBJETIVOS 4
III. MARCO TEÓRICO 5
IV. MATERIALES Y MÉTODOS 6
V. RESULTADOS Y DISCUSIONES 9
5.1. Resultados 9
5.2. Discusiones 13
VI. CONCLUSIONES 15
VII. ANEXOS 16
VIII. BIBLIOGRAFÍA 18
I. INTRODUCCIÓN
El metabolismo se produce por secuencias de reacciones catalizadas
enzimáticamente y se divide en anabolismo y catabolismo. El proceso por el cual la
célula bacteriana sintetiza sus propios componentes se conoce como anabolismo y
resulta en la producción de nuevo material celular; también se denomina biosíntesis.
Las bacterias emplean diversas fuentes de carbono y aminoácidos para su
crecimiento y fermentación.
Por ello, usaremos la siembra de las bacterias para evaluar su capacidad de
degradar almidones, lípidos, proteínas como la caseína y colágeno por medio de la
producción de enzimas hidrolíticas en los medios agar almidón, agar grasa, leche y
gelatina respectivamente.
II. OBJETIVOS
Poner en evidencia la capacidad de algunas bacterias de producir enzimas
hidrolíticas para la utilización de almidón, proteínas y lípidos.
Poner en evidencia la capacidad de las bacterias de utilizar azúcares y
aminoácidos y relacionarla con el metabolismo.
III. MARCO TEÓRICO
Las bacterias entéricas gramnegativas pueden ser diferenciadas mediante
caracterización bioquímica, esto se realiza a través de la prueba IMVIC. Esta prueba
se encuentra compuesta por 4 pruebas: producción de indol, rojo de metilo, Voges-
Proskauer y utilización de citrato, sus resultados se presentan como positivos (+) o
negativos (-) (Dubey & Maheshwari, 2002).
● Prueba del indol: El aminoácido triptófano por acción de ciertas bacterias
logra oxidarse para formar tres metabolitos indólicos principales: indol,
escatol (metilindol) y ácido indolacético. Las distintas enzimas intracelulares
que participan en este proceso adoptan el nombre global de triptofanasa, lo
que sugiere un sistema completo de enzimas asociadas con la producción del
indol. Durante la degradación del aminoácido triptófano se forma un
intermediario primordial, el ácido 20 indol pirúvico con el que se forma indol
por desaminación y escatol por descarboxilación del IAA (MacFaddin, 2003).
● Prueba del rojo de metilo: Esta prueba establece si un microorganismo
puede originar productos finales ácidos estables a través del proceso de
fermentación de la glucosa y con esto exceder la capacidad amortiguadora
del buffer en el caldo de cultivo (Forbes, Sahm, & Weissfeld, 2009).
● Voges-Proskauer: Los bacteriólogos alemanes Daniel Wilhelm Otto Voges y
Bernhard Proskauer, formularon esta reacción en el Instituto de
Enfermedades Infecciosas en el año 1898 (Vashisht, Sharma, & Gupta,
2013). La reacción de Voges-Proskauer posee su 22 fundamento en la
detección de acetoína, que se obtiene a partir de la degradación de glucosa
en bacterias. La familia Enterobacteriaceae se divide en dos grupos,
fermentadoras de ácidos mixtos y fermentadores del 2,3-butanodiol
(MacFaddin, 2003).
● Citrato: Esta prueba se usa para distinguir aquellos microorganismos que
poseen la capacidad de emplear citrato como única fuente de carbono y sales
inorgánicas de amonio como única fuente de nitrógeno (Forbes et al., 2009).
Su utilización depende de la existencia de la enzima citrato permeasa
producida por el microorganismo, esta enzima ayuda al transporte del citrato
hacia el interior de la célula.
IV. MATERIALES Y MÉTODOS
4.1. MATERIALES
● Cultivos de 24 horas en cuñas de agar: Bacillus, E.coli, Staphylococcus,
Salmonella
● Aguja de Kölle Medios de cultivo en placas: Agar almidón, Agar gelatina,
Agar leche, Agar grasa , Gelatina nutritiva en tubo
● Medios de cultivo en tubo: Agar Kligler (dispuesto en semi cuñas), Agar
citrato de Simmons (en cuñas amplias), Agar fenialanima (en cuñas amplias),
Agua triptonada (triptona 1% NaCl 0.5%), Agar lisina (en cuñas amplias)
● Caldo Voges-Proskauser y rojo de metilo (VPRM)
● Reactivos de revelado: Para fenilpirúvico: solución de Cloruro férrico; para
indol: reactivo de Kovacs; Para Voges-Proskauser: Solución de KOH al 10%;
Para rojo de metilo(acidez): solución de rojo de metilo (disolver 0.1g RM en
300 ml de etanol al 95% y diluir a 500 ml con agua destilada)
4.2. PROCEDIMIENTO
Enzimas Hidrolíticas
1. Dividir la base de cada placa en cuatro secciones con un plumón marcador.
2. Sembrar las cepas en cada cuadrante de las placas con una estría de
aproximadamente 1.5 cm de longitud. Dejar el cuarto cuadrante sin sembrar
para usarlo como control.
3. Sembrar aguja mediante punción profunda los tubos de gelatina nutritiva.
4. Incubar los tubos y las placas a 37°C por 48 horas.
5. Después de la incubación analizar los resultados de acuerdo a lo siguiente.
Hidrólisis de almidón
1. Agregar lugol sobre la superficie del agar almidón.
2. Las zonas no coloreadas de azul alrededor de las colonias indican hidrólisis
de almidón (producción de amilasa)
Hidrólisis de lípidos
1. Agregar una solución de sulfato de cobre (1% en H2Od) sobre la superficie
del agar grasa.
2. La aparición de un color verde azulado sobre y alrededor de las colonias
indica hidrólisis de la grasa (producción de lipasa)
Hidrólisis de caseína
1. Las zonas claras alrededor de las colonias indican hidrólisis de la caseína de
la leche.
Hidrólisis de la gelatina (placas)
1. Agregar una solución de HgCl2 sobre la superficie del agar gelatina, esperar
5 minutos y observar la presencia de zonas claras alrededor de las colonias
que indican la hidrólisis de gelatina. La gelatina no hidrolizada precipita
tornando opaco el medio.
Hidrólisis de gelatina (tubos)
1. Colocar los tubos en un baño de hielo durante 5 minutos. La falta de
solidificación del medio indica hidrólisis de la gelatina.
Utilización de carbohidratos y proteínas
1. Siguiendo los procedimientos de trabajo, inocular los medios con las cepas
proporcionadas.
2. Incubar los tubos inoculados 37°C por 24-48 h.
3. Evaluar los resultados.
● Agar Kligler: Evidencia la fermentación de glucosa (color amarillo en la parte
profunda de la semicuña con o sin formación de gas-rotura del medio), la
actualización de lactosa (color rojo intenso en la cuña) y formación de H2S
(color negro en la parte profunda de la semicuña). En el Agar TSI, se evalúa
la fermentación de tres azúcares glucosa, sacarosa y lactosa, produce H2S y
gas. Si fermenta la sacarosa y la lactosa (color amarillo la cuña), si se
fermenta la glucosa (la base es de color amarillo) y formación de H2S (color
negro en la parte profunda de la semicuña) y gas en el fondo.
● Agar Citrato de Simmons: evidencia de la capacidad de actualizar citrato
como única fuente de carbono (crecimiento y cambio de color del medio a
azul intenso).
● Agar fenilalanina: evidencia la descarboxilación del aminoácido a ácido
fenilpirúvico por la aparición de un color verde-azulado al agregar unas gotas
de solución de cloruro férrico.
● Agua triptonada: evidencia la formación de indol a partir del triptófano
debido a la acción de la triptofanasa al aparecer en la superficie del caldo un
anillo de color rojo grosella cuando se agregan unas gotas del reactivo de
Kovacs.
● Caldo lisina: evidencia la descarboxilación de la lisina a cadaverina por el
cambio del color amarillo producido por la fermentación de glucosa de medio
color púrpura (alcalino).
● Caldo VP-RM: evidencia la producción del ácido y de acetil metil-carbinol a
partir de la glucosa. Para determinar ambas características, separe con
cuidado aséptica 5 ml del cultivo y colócalos en otro tubo: Agregue a un tubo
5 gotas del reactivo de rojo de metilo, agite suavemente y si el color se torna
rojo la prueba es positiva (presencia de ácido).
V. RESULTADOS Y DISCUSIONES
5.1. Resultados
➔ BACILLUS:
1. Agar de almidón: se observan los halos de hidrólisis del almidón alrededor de las
colonias de bacterias sobre las placas con Agar Almidón, sembradas por puntura,
que permitió reconocer y hacer la selección primaria de los cultivos bacterianos con
mayor capacidad hidrolítica sobre el almidón por el método del yodo(Lugol).
2. Agar de leche: Se puede observar un halo transparente alrededor de la colonia lo
que indica la hidrolización de la caseína al desaparecer el color blanco.
3. Agar TSI: Presenta fondo ácido y pico alcalino lo que indica que fermentan solo
glucosa.
➔ ESCHERICHIA COLI:
1. Agar de almidón: No se pudo observar zonas claras por lo tanto entendemos que
no se hidroliza el almidón.
2. Agar Citrato de Simmons: En esta evaluación es negativa porque se mantiene de
color verde y no se utiliza ningún reactivo.
3. Agar Kliger: Se puede obervar que se mantiene del mismo color(amarillo), no se
agrega ningún reactivo, tiene signo positivos en glucos, lactosa y gas, en signo
negativo H2S.
4. Agar de gelatina: El resultado es sólido, pues no hubo acción de la proteína de la
gelatina por lo tanto no hubo hidrólisis.
5. Agua triptonada: para la prueba del indol. Se añade 0,5 ml de Reactivo de Kovacs.
Se puede observar una inmediata aparición de un halo color rosado en parte de la
superficie, entonces se puede decir que la prueba es positiva al Indol e indica
Producción de triptofanasa para degradar el triptófano.
➔ SALMONELLA:
1. Agar TSI: Se puede obervar que presenta un color negro la base y rojizo el pico.
Si la base es negro entonces presenta formación de H2S, fermentación de glucosa y
nopresenta producción de gas ni fermentación lactosa.
2. Agar Citrato de Simmons: En esta evaluación es negativa porque se mantiene de
color verde y no se utiliza ningún reactivo.
➔ STAPHYLOCOCCUS: Es un organismo oportunista que puede colonizar los objetos
con los que comúnmente tenemos contacto, además de los alimentos que
consumimos ocasionando graves estragos en la salud del afectado.
1. Agar Baird-Parker: Tiene presencia de un aspecto negro con un halo
transparente que revela la actividad lipolítica sobre la yema de huevo, sin
embargo las colonias no pueden confirmarse si no es por un teñido de
coloración de Gram.
2. Agar Salado Manitol: Presenta colonias de color amarillo y también un
medio circundante de color amarillo.
Para la evaluación de actividad bacterianas puede ser muy variable para este
microorganismo, por eso, se presenta un cuadro comparativo de acuerdo a cada tipo
de agar-agar.
5.2. Discusiones
Según Romero, Canales, Meneses, Herbozo (2017) nos indica
que “La bacteria Bacillus puede ser capaz de hidrolizar el almidón”; lo
cual coincide con lo observado en los resultados, donde se obtuvo que
efectivamente hidroliza el almidón debido a que se observó la
presencia de un halo transparente alrededor de las colonias de
bacterias.
Según Tapia y Moreno (2012), nos indica que “Bacillus posee
proteasas capaces de degradar proteínas de leche”, lo cual coincide
con los resultados obtenidos debido a que se observó un halo
transparente alrededor de la colonia.
Según Pérez, Campos, Domínguez, Sosa (2006), nos indica
que “La bacteria Escherichia Coli inhibe su crecimiento en el Citrato de
Simmons”, tambien nos indica que “el resultado es positivo cuando
cambia la coloración del medio a azul”; lo cual coincide con los
resultados obtendios debido a que se mantiene de color verde y no se
utiliza ningún reactivo, siendo esta evaluación negativa.
Según Weng, Álvarez, Díaz, Rodríguez (2003), nos indica que
la bacteria Salmonella sp. da como resultado negativo al citrato de
Simmons; lo cual coincide con los resultados obtenidos debido a que
se mantiene de color verde y no se utiliza ningún reactivo dando así
como resultado negativo.
Según Sejas, Zurita, Rodriguez, Espinoza (2016), nos indica
que “La especie Staphylococcus aureus, por su capacidad de
fermentar el manitol, característica que ha sido considerada como un
índice de patogenicidad”. Esto coincide con los resultados obtenidos
ya que se observó colonias de color amarillo y también un medio
circundante de color amarillo.
VI. CONCLUSIONES
● Se realizó la siembra de las bacterias para evaluar su capacidad de degradar
almidones, lípidos, proteínas como la caseína y colágeno por medio de la
producción de enzimas hidrolíticas en los medios agar almidón, agar grasa,
leche y gelatina respectivamente.
● Las bacterias emplean diversas fuentes de carbono y aminoácidos para su
crecimiento y fermentación. En el medio Kliger fermentan la lactosa y la
glucosa, en el medio Citrato de Simmons emplean citrato como fuente de
carbono. Emplean los aminoácidos por la degradación del triptófano y la
fenilalanina.
VII. ANEXOS
1. Mencione que enzimas microbianas serían útiles en la elaboración de lácteos.
Las principales fuentes de enzimas usadas en la industria de
alimentos son de diferente origen: la renina, pepsina, tripsina, catalasa y
lipasa pancreática son de origen animal. Algunas de ellas se utilizan en la
industria láctea y son indispensables para determinar las características
fundamentales que distinguen a los diferentes tipos de quesos entre sí.
2. Mencione cómo funcionan las enzimas proteolíticas, ¿tiene alguna utilidad
industrial?
Las enzimas proteolíticas catalizan la hidrólisis de los enlaces
peptídicos de proteínas y participan en variados procesos fisiológicos, al
estar involucradas en todo el ciclo de vida de las proteínas desde su
biosíntesis, control de destino y activación, hasta su degradación
Son aplicadas principalmente en la industria láctea, específicamente
en la elaboración de queso, por su capacidad de hidrolizar las proteínas de la
leche; y en la industria de las bebidas.
3. Menciona el uso de lipasas microbianas en la industria farmacéutica.
Este tipo de enzimas revisten de gran importancia en la industria por
sus múltiples aplicaciones debido a que llevan a cabo la degradación de
sustratos con alto contenido graso así como en reacciones de esterificación
en la industria alimenticia, farmacéutica y cosmética. Las lipasas han sido
encontradas en muchas especies de animales, plantas y microorganismos.
El uso de lipasas en la industria farmacéutica se ha incrementado en
los últimos años. La mayoría de las lipasas microbianas encuentran
aplicación como catalizadores en la síntesis de fármacos. También tienen
importancia en la industria cosmética y pueden utilizarse como herramientas
de diagnóstico y biosensores.
4. Explique detalladamente las lecturas bioquímicas de Agar Kligler, Agar Lia y Agar
Citrato de Simmons.
Agar Kligler: evidencia la fermentación de glucosa (color
amarillo en la parte profunda de la semicuña con o sin formación de gas-
rotura del medio), la actualización de lactosa (color rojo intenso en la cuña) y
formación de H2S (color negro en la parte
profunda de la semicuña).
El Agar Lisina- Hierro (L.I.A.): es un medio de cultivo diferencial, por
lo que su uso está recomendado para la taxonomía bacteriana basada en
pruebas bioquímicas.
Agar Citrato de Simmons: evidencia de la capacidad de
actualizar citrato como única fuente de carbono (crecimiento y cambio de
color del medio a azul intenso).
5. De acuerdo a la literatura, ¿cuáles serían las reacciones de Salmonella
typhi en todos los medios usados en la práctica?
El género Salmonella pertenece a la familia de las
Enterobacteriaceae, está integrada por bacilos Gram negativos, anaerobios
facultativos, no esporulados, generalmente móviles por flagelos perítricos
que utilizan citrato como única fuente de carbono y poseen metabolismo de
tipo oxidativo y fermentativo.
Características bioquímicas diferenciales de especies de Salmonella y
Subespecies
Diferentes reacciones por serovars distintos. +,90% o más cepas
positivas. -,90% o menos cepas negativas.
VIII. BIBLIOGRAFÍA
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