Diagnóstico Molecular Enfermedades Infecciosas

Facultad de Ciencias Farmacéuticas, Bioquímicas y Biotecnológicas
Escuela Profesional de Ingeniería Biotecnológica
BIOTECNOLOGÍA MÉDICA
DIAGNOSTICO MOLECULAR DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS
Ing. Cinthia Córdova Barrios

Ing. Mónica Yugra Condori
[email protected]
OBJETIVO
Comprender las aplicaciones de las tecnologías en el diagnóstico molecular de

enfermedades infecciosas, conduciendo ensayos y adquiriendo destrezas y
habilidades en la interpretación de pruebas de diagnóstico y casos de estudio,
estableciendo su importancia en el pronóstico y tratamiento del paciente.
1. Introducción
2. Toma de muestra
3. Preparación de la muestra
4.Tecnicas de identificación
5. Control de calidad
6. Organismos detectados por Biología molecular
7. Bibliografía
DIAGNOSTICO MOLECULAR: INTRODUCCION
Análisis de rasgos Recientes

fenotípicos aplicaciones
microbiológicas
Caracterización molecular
Caracterización de microorganismos
macroscópica y
microscópica Identificación de nuevos
microorganismos
Caracterización bioquímica
Epidemiologia molecular
DIAGNOSTICO MOLECULAE: INTRODUCCION
Diagnostico clínico Diagnostico molecular
Microorganismos Genoma (DNA y RNA)

clínicamente Proteína
importante: Parásitos,
hongos, bacterias y
virus.
DIAGNOSTICO MOLECULAR: TOMA DE MUESTRA
Adecuado
procedimiento:
Recolección (tipo de
muestra y el tiempo de
muestreo), transporte y
manipulación (cultivo) Evitar contaminación
Preservar la viabilidad
del organismo en
estudio
Conservar la calidad de
los ácidos nucleicos
PAUTAS
• Colectar un apropiado volumen de muestra.

• Identificar cada muestra con el nombre del paciente, número de identificación
personal, procedencia, tipo de muestra, fecha de colección e iniciales del
funcionario que tomó la muestra.
• Colocar la muestra en un receptáculo adecuado para su transporte con el fin de
asegurar la sobrevivencia del posible agente infeccioso, evitar derrame del
espécimen y mantener las medidas de bioseguridad apropiadas.
• Anotar en el formulario cualquiera información de interés, tales como si el
paciente es inmunosuprimido o si recibe drogas inmunosupresoras, si recibe
antibióticos, diagnóstico presuntivo, interés en algún germen, etc.
La muestra es representativa por un

Cultivo de la muestra numero mínimo de microorganismos.
Concentración inicial tiene Se realiza la detección en bajos niveles
significancia en la interpretación de de significancia clínica (Sensibilidad)
los resultados.
Alta especificidad
Diagnostico clínico microbiológico Diagnostico molecular

DIAGNOSTICO MOLECULAR: PREPARACION DE LA MUESTRA
Remoción de
nucleasas.
Remoción o
inactivación de
inhibidores de
enzimas utilizadas
Concentración de en análisis
la muestra en un molecular. Ej: Hb
volumen en sangre,
apropiado para el polisacáridos
análisis molecular ácidos en esputo,
Elección de un nitratos y
método de lisis gonadotrofina
coriónica humana
en orina.
MICROORGANISMOS
LISIS
Métodos mecánicos
• Lisozima o • SDS, CTAB,Triton
zimoliasa X-100, en
• Agitación vigorosa presencia de
con perlas de NaOH, EDTA y Tris-
vidrio. Base
Métodos
Métodos químicos
enzimáticos
SANGRE
Suero o plasma es
utilizado como
fuente de
Los linfocitos son
microorganismos.
aislados y lisados
para la detección de
Centrifugación en
virus.
gradiente de
densidad:
En solución
isotónica y Ficoll –
Hypaque.
TEJIDO
Células
Fijados
• Es congelado en
Nitrógeno líquido y
posteriormente • Debe ser
homogenizado. desparafinado
rehidratado y
digestión con
proteinasa K.
Fresco
https://www.youtube.com/watch?v=3THA1Ure_nA
DIAGNOSTICO MOLECULAR: TECNICAS DE IDENTIFICACION
ELECTROFORESIS: PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis)
Objetivo
• Diagnóstico y tipificación
de microorganismos en
epidemiología (digestión • El DNA migra hacia
enzimática) adelante y luego hacia
atrás. Orientación del
campo eléctrico es
variable periódicamente
Aplicación
Los microorganismos en estudio deben ser inmovilizadas en agarosa (bloques) antes de la lisis celular, y
debe mantenerse aún en la digestión con enzimas de restricción, purificación del DNA y electroforesis
https://www.youtube.com/watch?v=k_QAXLGuQ5w
ELECTROFORESIS: PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis): Métodos
Método FIGE Método TAFE

(Field inversion (Transverse
gel alternating field
electrophoresis). electrophoresis)
Método CHEF Método RGE

(Contour - (Rotating gel
clamped electroporesis)
homogeneous
electric field)
PCR en tiempo real o PCR cuantitativa (qPCR)
Amplificar y simultáneamente cuantificar de forma absoluta y relativa el

producto, en tiempo real. Mide la velocidad de la amplificación y no la
cantidad de producto formado al final.
Requiere de molde de ADN, cebadores, dNTPs, polimerasa termoestable y

fluoróforo
Se requiere de un termociclador con capacidad de hacer incidir sobre cada

muestra un haz de luz de una longitud de onda determinada y de detectar la
fluorescencia emitida por el fluorocromo excitado y suministrar la información
a un ordenador.
PCR en Tiempo Real PCR convencional
Amplificación y detección de Amplificación y detección de
productos en una misma etapa. productos en 2 etapas separadas.
Rango dinámico de detección Rango dinámico de detección
amplio. estrecho.
Detección durante la fase
Detección durante la fase
exponencial temprana (máxima
exponencial.
eficiencia de reacción).
Mayor sensibilidad. Menor sensibilidad.
Mayor especificidad con el uso
Menor especificidad.
de sondas.
Requerimiento de equipamiento Requerimiento de equipamiento
y reactivos muy costosos. y reactivos de bajo costo.
La PCR a tiempo real se basa en la capacidad del instrumento de detectar aquel ciclo de amplificación en
el cual se ha acumulado suficiente producto de PCR como para generar una señal fluorescente por
encima de la línea de base. El numero de ciclo o ciclo umbral se denomina 𝐶 .
Cuanto mayor es la cantidad de acido nucleico inicial que usa el molde, mayor es la cantidad de producto
que se puede generar y mas temprano puede este ser detectado, es decir el ciclo umbral se alcanza mas
temprano y el valor 𝐶 es mas bajo.
La cuantificación depende de un compuesto que se une al DNA bicatenario producto de la
reacción de amplificación. Habitualmente se utilizan fluorocromos que al unirse al DNA
incrementan de forma notable su fluorescencia. Los métodos mas utilizados son:
Sondas de TaqMan
Fluorocromo
SYBR Green
El Sybr green es un fluorocromo que se une al DNA de doble cadena.
A medida que se copia más DNA bicatenario con cada ciclo de PCR, hay más copias de DNA que
se unen al SYBRgreen, lo que aumenta la cantidad de fluorescencia emitida.
https://www.youtube.com/watch?v=GCzH2Wcvd8E
Sybergreen
Ventajas Desventajas
El mismo colorante puede La presencia de dímeros de
usarse para diferentes blancos primers y amplificaciones
de amplificación. inespecíficas generan falsos
positivos.
Relativamente económico. No agrega especificidad a la
reacción. Necesidad de realizar
una curva de disociación.
Fácil optimización de las No permite realizar PCR
condiciones de reacción. multiplex.
TAQMAN
Son sondas complementarias de regiones especificas del DNA diana. Las sondas
contienen dos componentes:
Reportero (R), localizado en el extremo 5’ y puede emitir luz fluorescente cuando el
rayo láser lo excita.
Inhibidor de la fluorescencia o Quencher (Q), que se une al extremo 3’ de la sonda.
A medida que la Taq polimerasa extiende cada cebador separa el colorante
reportero, liberado del inhibidor, emite luz cuando es excitado.
TAQMAN
Se lleva a cabo mediante la hibridación con una sonda complementaria a una región
interna de la secuencia blanco, previamente a la amplificación. Tm sonda debe ser
10ºC > que el de los cebadores, de modo que hibride antes que los mismos.
A través del fenómeno de transferencia de energía fluorescente mediante resonancia
(FRET), el fluoróforo quencher absorbe la energía fluorescente emitida por el
fluoróforo reporter, cuando ambos están muy próximos entre si. La degradación de
la sonda elimina este fenómeno, con lo que puede medirse la emisión del reporter.
https://youtu.be/tWIk6HsbM_8?t=316
TAQMAN
TAQMAN
TAQMAN
TAQMAN
Ventajas Desventajas
Incrementa la especificidad Debe diseñarse una sonda
de la reacción. diferente para cada blanco a
estudiar.
Permite la realización de PCR Relativamente más costoso.
multiplex.
Permite realizar
discriminación alélica
mediante el uso de sondas
ASO
Aplicaciones
Genotipificación
Determinación
de organismos
Determinación genéticamente
de la carga viral modificados
Análisis de la (OMG)
expresión
génica
Absoluta: Necesita del uso de patrones,
que deben ser incluidos en cada PCR
Tipos de realizada.
cuantificación
Relativa: Da idea de los cambios
generados en el nivel de un gen de
interés, en comparación con un gen
control que no varía con el tratamiento
realizado.
Sin importar que método de cuantificación se utilice, es
importante que la eficiencia de la reacción de amplificación sea
cercana a 100%.
N° de N° de
N° de ciclos N° total de Dianas/tota
copias copias
realizados copias l
largas dianas
1 2 2 0 0
2 4 4 0 0
3 8 6 2 25%
4 16 8 8 50%
5 32 10 22 69%
10 1024 20 1004 98%
20 ~ 106 40 ~ 106 99.996%
40 ~ 1012 80 ~ 1012 100%
X 2X 2X 2X- 2X
EFICIENCIA:
𝑌 = 𝑋(1 + 𝐸)
log 𝑌 = log 𝑋 + 𝑛𝑙𝑜𝑔(1 + E)
𝑌 = 𝐺𝑟𝑎𝑑𝑜 𝑑𝑒 𝑎𝑚𝑝𝑙𝑖𝑓𝑖𝑐𝑎𝑐𝑖ó𝑛
𝑋 = 𝑀𝑜𝑙𝑑𝑒 𝑑𝑒 𝑝𝑎𝑟𝑡𝑖𝑑𝑎
𝑛 = Numero de ciclos
𝐸 = 𝐸𝑓𝑖𝑐𝑖𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑚𝑒𝑑𝑖𝑎 𝑑𝑒 𝑎𝑚𝑝𝑙𝑖𝑓𝑖𝑐𝑎𝑐𝑖𝑜𝑛
Tm DE LA SECUENCIA DIANA:
𝑆𝐴𝐿 500
𝑇 = 81.5 + 16.6 log + 0.41 %G + C −
1 + 0.7 𝑆𝐴𝐿 𝐿
𝑇 = 𝑇𝑒𝑚𝑝𝑒𝑟𝑎𝑡𝑢𝑟𝑎 𝑑𝑒 𝑓𝑢𝑠𝑖𝑜𝑛 (ºC)
𝐿 = 𝑇𝑎𝑚𝑎𝑛𝑜 𝑑𝑒𝑙 𝑎𝑚𝑝𝑙𝑖𝑐𝑜𝑛 (𝑝𝑏)
𝑆𝐴𝐿 = 𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖𝑜𝑛 𝑑𝑒 𝑠𝑎𝑙𝑒𝑠 (𝑀)
𝑆𝐴𝐿 = 𝐾 + 4 𝑀𝑔 .
Cálculo de la eficiencia de reacción (E)
Se realiza a partir de los datos recolectados de una
curva estándar, aplicándose la siguiente fórmula:
Eficiencia = [10 (-1/pendiente)] – 1
Realizar diluciones seriada
de una muestra o patrones
Se grafica Ct vs log de la
concentración inicial de templado
(o vs concentración de DNA en la
muestra)
Si la eficiencia de reacción fue del 100%, se obtendrá una recta cuya pendiente es de -3,32
PCR en tiempo real o PCR cuantitativa (qPCR): Cuantificación absoluta
• Utiliza diluciones seriadas de estándares de concentraciones conocidas para construir
una curva estándar.
• A partir de la curva se establece una relación lineal entre el Ct y la cantidad inicial de
templado de ADN.
• La cuantificación absoluta asume que todos los estándares y las muestras tienen la
misma eficiencia de amplificación.
PCR en tiempo real o PCR cuantitativa (qPCR): Cuantificación relativa
• Mide cambios en el nivel de un gen de interés, en relación al nivel de un gen control o
de referencia (housekeeping) que no varía con las condiciones ensayadas.
• Los genes control o de referencia son de expresión constitutiva, es decir, que se
expresan de manera constante en tejidos o muestras, son resistentes a variaciones
experimentales y presentan la misma cinética en un ensayo de PCR. Ej: β-actina. rRNA
18S, GAPDH, β2-microglobulina.
• Es el método más comúnmente utilizado. Se basa en un modelo matemático que
calcula cambios en la expresión génica como diferencias relativas entre la muestra
experimental y un calibrador (controles en los que hay expresión segura de los genes).
Para calcular la expresión relativa a un gen de referencia se utilizan dos métodos:

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Análisis de rasgos Recientes

Microorganismos Genoma (DNA y RNA)

• Colectar un apropiado volumen de muestra.

La muestra es representativa por un

Diagnostico clínico microbiológico Diagnostico molecular

Método FIGE Método TAFE

Método CHEF Método RGE

Amplificar y simultáneamente cuantificar de forma absoluta y relativa el

Requiere de molde de ADN, cebadores, dNTPs, polimerasa termoestable y

Se requiere de un termociclador con capacidad de hacer incidir sobre cada

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