Revisión de Métodos Espectroscópicos y Elaboración de Curvas Estándar de Proteína

Revisión de métodos espectroscópicos y elaboración de curvas estándar
de proteína
En esta práctica se determinó la concentración de una muestra problema, realizando una

curva patrón con distintas concentraciones de albúmina de suero bovino (BSA) contra la
absorbancia leída a 750 nm. Determinar la concentración de la muestra fue posible
mediante el uso del método colorimétrico Lowry el cual se basa en dos reacciones
químicas.
La primera reacción es la reducción de los iones de cobre en condiciones alcalinas, lo que
forma
un complejo con los enlaces peptídicos. La segunda, es la reducción del reactivo de
Folin-Ciocalteu por el complejo cobre-enlace peptídico, la cual causa un cambio de color a
azulado en la solución, con una absorción en el rango de 650 a 750 nm. Una vez realizada
la
curva patrón fue posible transpolar la absorbancia obtenida en la muestra problema y
determinar su concentración mediante la gráfica, o sustituyendo en la ecuación de la recta
y=mx+b despejando x
) es una proteína globular

aislada del suero bovino que se utiliza en numerosas aplicaciones bioquímicas debido a su
estabilidad y falta de interferencia en las reacciones biológicas.El proceso de obtención es
por shock térmico y el producto se presenta en su forma liofilizada o en solución. (1)
https://www.dsflab.com.ar/albumina-bovina
tirosina, triptófano y cisteína reaccionan en un medio alcalino con ácido fosfotungsténico y
ácido molíbdico del reactivo de Folin (color amarillo) para dar un complejo incoloro que se
puede reducir mediante una reacción lenta con fenol en un complejo de coloración azul
detectable por espectrofotometría entre 600 y 900 nm (con una absorbancia máxima a 740
nm).
concentración de una sustancia (analito) en una muestra desconocida, sobre todo en
disoluciones. El método se basa en la relación proporcional entre la concentración y una
determinada señal analítica (propiedad).
cuanta luz absorbe una sustancia química, midiendo la intensidad de la luz cuando un haz
luminoso pasa a través de la solución muestra, basándose en la ley de Beer-Lambert. Esta
medición también puede usarse para medir la cantidad de un producto químico conocido en
una sustancia.
https://elespectrofotometro.com/espectrofotometria/
A partir de la construcción de una curva de calibración es posible obtener la concentración
de una muestra problema, una curva de calibración es una representación gráfica de una
señal que se mide en función de la concentración de un analito. Esta técnica se lleva a cabo
comparando una propiedad conocida del analito, contra los estándares de concentración
conocida.
Existen una gran variedad de métodos para determinar la cantidad de proteína en una
muestra de tejidos o fluidos. El método de Lowry es un método colorimétrico de valoración
cuantitativa de las proteínas en donde a la muestra se añade un reactivo que forma un
complejo coloreado con las proteínas, esto ocasiona un cambio de color a azulado en la
solución, con absorción en el rango de 650 a 750 nm, siendo la intensidad de color
proporcional a la concentración de proteínas, según la ley de Lambert-Beer: A=εlC. La
cantidad de proteína en la muestra puede ser estimada utilizando una curva de calibración
con una solución de una proteína estándar seleccionada, tal como la BSA.
Esta práctica tiene como objetivo aplicar un método espectrofotométrico para medir la
concentración de una proteína, construyendo una curva de calibración en donde se
establece que a mayor color, mayor concentración de proteína
La construcción de una curva de calibración para obtener la concentración de una muestra
problema es un estudio analítico, en el cual a partir de una muestra stock de concentración
conocida se realizan diluciones para poder obtener una regresión lineal, de la cual se puede
extrapolar para obtener la concentración de muestras problema.
Se proporcionaron 10 microtubos, de los cuales a 8 microtubos se añadieron los siguientes
reactivos,H O, albúmina de suero bovino (BSA) a una concentración de 1 mg/mL,
2
reactivo A
y Reactivo B, posteriormente se mezcló todo en el vortex y se incubó por 30 minutos a
temperatura ambiente.
A los 2 microtubos restantes se les añadió: H O, Reactivo A, Reactivo B y muestra
2
problema, el paso siguiente fue mezclar y dejar incubando por 30 minutos a temperatura
ambiente. Una vez transcurrido este tiempo se midieron sus absorbancias en un
espectrofotómetro previamente configurado a 750 nanómetros, colocando primero el
control, ajustando con este la medición de los demás celdas. Se colocó cada una celda en
el espectrofotómetro en orden creciente de concentración, se anotó la absorbancia y
posteriormente se realizo una grafica (no tomando en cuenta los valores de nuestras
muestras 9,10) y se obtuvo la regresión lineal del modelo obtenido
Se realizó una curva de calibración mediante el método de Lowry es un método

colorimétrico,el cual se basa en dos reacciones químicas. La primera reacción es la
reducción de los iones de cobre en condiciones alcalinas, lo que forma un complejo con los
enlaces peptídicos (reacción de Biuret). La segunda, es la reducción del reactivo de
Folin-Ciocalteu por el complejo cobre-enlace peptídico, la cual causa un cambio de color a
azulado en la solución, con una absorción en el rango de 650 a 750 nm,se realizó la curva
de calibración de soluciones de concentración conocida, obteniendo la siguiente regresión

2
lineal y= A= 0.0203x + 0.0909 con una r =0.96, siendo un valor muy confiable debido
a que
no se presenta una gran dispersión de datos, a partir de la ecuación de la recta se
determinó la cantidad de proteína en las muestras 9 y 10, obteniendo un valor de 5.45μg
para muestra 9 y 18.7μg para muestra 10, finalmente se obtuvo la concentración en estas
dos muestras problema, obteniendo los siguientes valores, para el tubo 9 la concentración
obtenida fue de 0.218 μg / μL y para el tubo 10 0.374 μg / μL ambos valores entran en el
intervalo de detección de Lowry 10-1000 μg/ μL
En la sección de resultados se presenta de manera concisa y descriptiva los hechos sin

analizarlos, generalmente contiene figuras, como diagramas, tablas, gráficas, cuadros o
mapas que pueden ser muy útiles para mostrar o enfatizar la información en un reporte. En
la discusión se explican los resultados del estudio con base en la literatura científica
existente y se evalúa si lo encontrado en el estudio tiene un significado práctico, biológico,
y/o está relacionado con otro fenómeno.
Según las Normas de Vancouver:
Autor/es. Título. Volumen. Edición. Lugar de publicaciónt: Editorial; año.
Autores del artículo (6 autores máx et. al.). Título del artículo. Abreviatura del a revista.
Año;
Volumen (número):páginas.
Autores del artículo (6 autores máx et. al.). Título del artículo. Abreviatura del a revista
[internet]. Año [fecha de consulta]; Volumen (número): páginas. Disponible en: URL del
artículo.
Sede Web [internet]. Lugar de publicación: Editor; Fecha de comienzo [Fecha de última
actualización; fecha de nuestra consulta]. Disponible en: URL de la web.
La proporcionalidad entre la absorbancia y la concentración únicamente se cumple para
disoluciones muy diluidas, observándose desviaciones más o menos acusadas al aumentar
la concentración.
Las desviaciones a la Ley de Beer pueden ser instrumentales: Radiación no
monocromática, radiación parásita y errores en la lectura. Pueden ser químicas, tal es el
caso de: Influencia del disolvente,influencia de la temperatura, impurezas en los
reactivos,interacción entre especies absorbentes e influencia del equilibrio ya sea ácido
base, complejos o dimerizaciones.
Ácido bicinconínico (562 nm), Bradford o azul brillante de Coomassie(470nm) y Método

de
Lowry (750 nm)
Detergentes y agentes reductores.

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En esta práctica se determinó la concentración de una muestra problema, realizando una

) es una proteína globular

Se realizó una curva de calibración mediante el método de Lowry es un método

de calibración de soluciones de concentración conocida, obteniendo la siguiente regresión

En la sección de resultados se presenta de manera concisa y descriptiva los hechos sin

Ácido bicinconínico (562 nm), Bradford o azul brillante de Coomassie(470nm) y Método

Detergentes y agentes reductores.

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