CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE

ALTA EFICACIA
(HPLC)

INDICE
 Campo de aplicación
 Componentes básicos de un equipo de HPLC
 Modalidades de la cromatografía de líquidos: características
específicas de los equipos instrumentales
 Aplicaciones

1
 TIPOS DE CROMATOGRAFÍAS

CROMATOGRAFÍA CROMATOGRAFÍA
PLANAR EN COLUMNA

PAPEL CAPA FINA

LIQUIDO GAS FLUIDO
SUPERCRÍTICO

CAMPO DE APLICACIÓN
Permite el análisis de:
– Compuestos termolábiles o no volátiles
– Compuestos muy polares
– Especies iónicas
– Compuestos de alto peso molecular

Técnica más versátil que cromatografía de gases

TIPOS DE CROMATOGRAFÍAS DE LÍQUIDOS

FASE MOVIL: LIQUIDA

FASES CROMATOGRÁFICAS
FASE ESTACIONARIA: LIQUIDA O SÓLIDA

FASE ESTACIONARIA LÍQUIDA

ABSORCIÓN ADSORCIÓN
CROMATOGRAFÍA DE PARTICIÓN O DE REPARTO
- FS: líquido adsorbido sobre un sólido (cromatografía líquido - líquido)
- FS: especie orgánica unida químicamente a una superficie sólida (cromatografía líquido-fase
unida químicamente, líquido-fase enlazada)

FASE ESTACIONARIA SÓLIDA

- CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN O LÍQUIDO-SÓLIDO (FS es un sólido)

- CROMATOGRAFÍA IÓNICA (FS es una resina de intercambio iónico)
- CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN POR TAMAÑOS (FS es un sólido poroso)

2
 Cromatografía de líquidos (CL)
TIPO DE
Fase estacionaria Tipo de equilibrio
CROMATOGRAFÍA
Líquido adsorbido sobre una Distribución entre líquidos Cromatografía líquido-
superficie sólida inmiscibles líquido o de reparto
Especies orgánicas enlazadas Cromatografía líquido-fase
Distribución entre el líquido y
químicamente a una superficie unida químicamente o
la superficie enlazada
sólida enlazada
Cromatografía líquido-
Sólido Adsorción
sólido o adsorción
Cromatografía iónica o de
Resina de intercambio iónico Intercambio iónico
intercambio iónico
Cromatografía de exclusión
Partículas o polímeros porosos Distribución-exclusión
por tamaño

La selección del tipo de

cromatografía de
líquidos depende de las
características del soluto

- Peso molecular
- Solubilidad
- Polaridad
- Carácter
iónico/no iónico

3
 COMPONENTES BÁSICOS DE UN EQUIPO DE HPLC
SISTEMA DE SISTEMA DE COLUMNA
RESERVORIO DETECTOR
BOMBEO INYECCIÓN CROMATOGRÁFICA

Recipientes de Tiempo de elución Introduce cantidades Longitud típica 10-30 cm

FM y sistemas de razonables requieren de muestra pequeñas con partículas de relleno
tratamiento de presiones de FM de hasta (1 a 500 µL) y de 5-10 µm de diámetro
disolventes 6000 psi reproducibles
- Velocidad de FM
habitual: 0,1-10 ml/min

4
 Recipientes de fase móvil:
Eluyente (un disolvente o mezcla de disolventes)

Sistemas para el tratamiento de la fase móvil

RESERVORIO Con el fin de eliminar:
 Los gases disueltos
 Las partículas en suspensión

Cámara de mezcla (elución en gradiente)

Tipos de elución
ELUCIÓN ISOCRÁTICA: La composición de la fase móvil permanece constante
durante la separación cromatográfica (eluyente puede ser un único disolvente o mezcla
de disolventes)

SOLUTOS CON POLARIDADES SEMEJANTES

ELUCIÓN POR GRADIENTE: La composición de la fase móvil varía de acuerdo

con un programa establecido

SOLUTOS CON POLARIDADES MUY DIFERENTES

Programador de
disolventes

10

5
 Ejemplo: SEPARACIÓN DE BENCENOS CLORADOS mediante elución isocrática o
por gradiente

La elución por gradiente mejora la eficacia de la separación

11

REQUISITOS:
1. Capacidad para generar presiones hasta 6000 psi:
SISTEMA - Que permitan separaciones en tiempos razonables
- Velocidades de flujo de 0,1-10 mL/min
DE
2. Capacidad de generar flujos libres de pulsos
BOMBEO
3. Proporcionar caudales constantes y reproducibles
(coeficientes de variación de 0,5% o menores)

4. Componentes resistentes a la corrosión

12

6
 Ej. Bomba recíproca

Motor Válvulas anti

retorno

 Caudal constante
 Permite elución en gradiente
X Flujo pulsado (ruido) Atenuador de pulsos a la salida de la bomba
Se evita Bombas de dos pistones en serie o en paralelo

13

SISTEMA
OBJETIVOS
DE - Introducir pequeñas cantidades de muestra (1 a 500 μl)
INYECCIÓN - Introducir cantidades de muestra reproducibles
DE MUESTRA

POSICIÓN DE CARGA POSICIÓN DE INYECCIÓN

DE MUESTRA DE MUESTRA
Conjunto de
bucles de
distintos
https://youtu.be/LJ5UJoN2s0s
volúmenes

14

7
 Inyector automático

 Precisión
 Termostatización
 Programabilidad

15

COLUMNA DE SEPARACIÓN O ANALÍTICA

• Deben trabajar a alta presión

– Normalmente construidas de metales

• Dimensiones habituales
– Longitud: 5-30 cm
– Diámetro interno: 3-10 mm

• Contiene el material de relleno sobre el que se

fija la fase estacionaria
– Existen distintos tipos de material de relleno
(partículas de sílice, alúmina o polímeros
porosos)
– Las partículas de relleno típicas tienen un
diámetro de 5-10 µm

• Platos teóricos (N):

40.000-70.000 platos/metro

16

8
 COLUMNAS DE ALTA EFICACIA

CARACTERÍSTICAS 1 p-xileno 5 ftalato de dipentilo

2 anisol 6 ftalato de dibutilo
Son microcolumnas 3 acetato de bencilo 7 ftalato de dipropilo
Tubo de acero inoxidable 4 ftalato de dioctilo 8 ftalato de dietilo
Longitud: 3-7,5 cm
Diámetro interno: 1-4,6 mm
Tamaño de partícula: 2-5 µm
Platos teóricos:
100.000 platos/metro

VENTAJAS
-Tiempo de análisis más corto
(separaciones más rápidas)
- Mínimo consumo de disolvente

Fase móvil: 4,1 % acetato de etilo en hexano

Cromatografía Características de la columna: longitud 4 cm, diámetro
líquida de ultra alta interno 0,4 cm, tamaño de partícula 3 m

presión (UHPLC)

17

HPLC vs UHPLC

18

9
 PRECOLUMNAS O COLUMNAS PROTECTORAS
Se coloca delante de la columna analítica

OBJETIVO
Aumentar la vida de la columna analítica

• Elimina (retiene):
– materia en suspensión
– contaminantes de los disolventes
– componentes de la muestra que se unen
irreversiblemente a la fase estacionaria
• Satura la fase móvil de fase estacionaria
(cromatografía L-L)
• Semejante a la columna analítica, mayor tamaño
de partícula
• Se vacía y rellena de nuevo o se reemplaza por
otra

19

DETECTORES DE HPLC
Características del detector ideal:
– Sensibilidad adecuada
– Buena estabilidad y reproducibilidad
– Respuesta lineal varios órdenes de magnitud
– Tiempo de respuesta corto, independiente del caudal
– Alta fiabilidad
– Manejo sencillo
– Respuesta semejante para todos los solutos o, por el
contrario, respuesta selectiva para una o más clases de solutos
– No destructor de la muestra
– Con bajo ruido y deriva

20

10
 - Generales: responden a una propiedad de la fase
móvil que varía en presencia de solutos (ej. detector
de índice de refracción)

- Específicos: responden a una propiedad del soluto

TIPOS DE (ej. detector de absorbancia)
DETECTORES

- Universales: versátiles

- No universales: selectivos

Detector de absorbancia
Detector de fluorescencia
Detector de índice de refracción
Detector electroquímico
Detector de espectrometría de masas
Detector de conductividad
Detector evaporativo de dispersión de luz

21

• Es el más común en cromatografía de líquidos

• Se mide la capacidad del analito de absorber REM
de una longitud de onda concreta del UV o visible
• Célula de flujo en Z (pequeña para minimizar el
ensanchamiento de banda):
- 1-10 µL de volumen
- Longitud de trayectoria 2-10 mm

Existen tres tipos:

- De longitud de onda fijo
- De longitud de onda variable
- Detector DAD (diodo array)

Se puede trabajar en elución en gradiente con los tres

Límite de detección 0,1-1 ng

22

11
 Detectores de longitud de onda fijo:
Presentan filtros como detectores
Lámpara de Hg como fuente (se aisla la línea de 254
nm, y también las de 250, 313, 334 y 365 nm usando
diferentes filtros)
- Muchos grupos funcionales orgánicos absorben a
esa longitud de onda

Detectores de longitud de onda

variable:
Se usa un monocromador de red de
difracción como selector
Se puede obtener el cromatograma a una
sola λ o cuando los picos que eluyen están
suficientemente separados, se puede elegir
distinta λ para cada analito

23

Fotodetector diodo array

Se registra de forma simultanea la
absorción a diferentes longitudes de onda
de los analitos
Se obtienen espectros tridimensionales en
un intervalo corto de tiempo

24

12
 Detector de fluorescencia

Los más sencillos emplean una

fuente de excitación de mercurio
y uno o más filtros para aislar la
radiación fluorescente.
Los instrumentos más sofisticados
consisten en una fuente de
radiación de xenón y emplean
un monocromador de red para
aislar la radiación fluorescente.

Alta sensibilidad: Varios órdenes de magnitud superior a métodos absorciométricos

Alta selectividad
- sustancias fluorescentes
- sustancias no fluorescentes: derivatización
Limite detección 0,001 – 0,01 ng
Se puede usar en elución en gradiente

25

Detector de índice de refracción

La celda consta de 2 compartimentos:
-Siempre pasa fase móvil (n1 fijo)
- Pasa lo que procede de la columna (n variable)
Celda de referencia
Haz
n1 desviado
Haz
incidente
Placa de n2
vidrio
Celda de muestra

Detector universal
No destruye muestra
Menos sensible que UV-VIS
Control estricto de temperatura
Limites de detección elevados (100-1000 ng)
Solo elución isocrática

26

13
 Detector electroquímico
Este tipo de detectores responden a analitos susceptibles de reducirse u oxidarse
Un ejemplo es el detector amperométrico

Se oxida o reduce el analito

(fenoles, aminas,
Electrodo de peróxidos,…)
trabajo

Electrodo
de
referencia

Electrodo Se mide la corriente eléctrica

auxiliar generada cuando el analito es
oxidado o reducido a un
determinado potencial
Desde la columna Célula amperométrica

27

• Se debe trabajar en ausencia de oxígeno para reducir la corriente de fondo

(ruido y deriva)
• La FM debe ser conductora de corriente eléctrica: disolventes polares, que
contengan electrolitos (no fase normal).
• Muy usado en cromatografía de intercambio iónico y de fase inversa
• Límite de detección: 0,01 y 1 ng.
• Se detectan por reducción: aldehidos, cetonas, ésteres, compuestos insaturados
• Se detectan por oxidación: fenoles, aminas aromáticas, mercaptanos (-SH)
• No pueden ser empleados en elución con gradiente
• Dependen de la temperatura y del caudal.

28

14
 Detector de espectrometría de masas
DIAGRAMA DE BLOQUES DE UN SISTEMA
CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS-ESPECTROMETRÍA DE MASAS

ESPECTRÓMETRO DE MASAS

SISTEMA Fuente Analizador Detector

HPLC de iones de masas de iones

Sistema de vacío

Problemas de acoplamiento de ambas técnicas: La espectrometría de masas requiere

una muestra en fase gaseosa

29

MODALIDADES DE CROMATOGRAFÍAS DE LÍQUIDOS

FASE MOVIL: LIQUIDA

FASES CROMATOGRÁFICAS
FASE ESTACIONARIA: LIQUIDA O SÓLIDA

FASE ESTACIONARIA LÍQUIDA

CROMATOGRAFÍA DE PARTICIÓN O DE REPARTO

- FS: líquido adsorbido sobre un sólido (cromatografía líquido - líquido)
- FS: especie orgánica unida químicamente a una superficie sólida (cromatografía líquido-fase
unida químicamente, líquido-fase enlazada)

FASE ESTACIONARIA SÓLIDA

- CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN O LÍQUIDO-SÓLIDO (FS es un sólido)

- CROMATOGRAFÍA IÓNICA (FS es una resina de intercambio iónico)
- CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN POR TAMAÑOS (FS es un sólido poroso)

30

15
 CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN
CROMATOGRAFÍA DE PARTICIÓN

CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN POR

IÓNICO TAMAÑOS

31

CROMATOGRAFÍA DE REPARTO O PARTICIÓN

Dos tipos en función de la forma en que se retiene la

FASE MÓVIL LÍQUIDA
fase estacionaria sobre las partículas del soporte

1. Cromatografía líquido-líquido  Fase estacionaria líquida

FASE ESTACIONARIA LÍQUIDA adsorbida físicamente sobre la superficie del soporte
RETENIDA SOBRE LA
SUPERFICIE DE UN SÓLIDO 2. Cromatografía líquido-fase unida químicamente o
(Partículas de relleno) líquido-fase enlazada  La fase estacionaria es una especie
orgánica unida químicamente a la superficie del soporte

La separación se basa en un equilibrio de reparto del soluto entre FM y FS

los solutos se separan en función de su polaridad

Sirve para separar:

-Compuestos no polares
-Compuestos polares sin carga
-Compuestos con masa molar relativa inferior a 3.000 D

32

16
 Principios de la separación

Regla general:
Polaridad de los analitos ≈ polaridad de la fase estacionaria ≠
polaridad de la fase móvil

Para conseguir una buena separación, los analitos tienen que

interaccionar con la fase estacionaria, pero la interacción no debe
ser muy fuerte, porque originarían tiempos de retención muy altos

Polaridades de diversos grupos funcionales del analito incrementan en el orden siguiente:

Alcoholes > aminas > amidas > aldehídos > cetonas > ésteres > éteres > hidrocarburos

33

Modalidades de cromatografía de reparto

IMPORTANTE:
POLARIDADES RELATIVAS DE LAS FASES MÓVIL Y
ESTACIONARIA

Cromatografía en fase normal

- Fase estacionaria polar
- Fase móvil relativamente no polar: cloroformo, hexano, etiléter …

Cromatografía en fase inversa (fase reversa)

- Fase estacionaria no polar
-Fase móvil relativamente polar: agua, metanol, acetonitrilo …
-Ideal para la separación de solutios en disoluciones acuosas, como los compuestos
biológicos.

34

17
 CROMATOGRAFÍA EN FASE NORMAL
COMPUESTOS POLARES
FASE ESTACIONARIA: ALTAMENTE POLAR
FASE MÓVIL: RELATIVAMENTE APOLAR

C
B
A
Los primeros solutos que eluyen son los menos
polares, ya que interaccionan menos con la FS
(quedan más retenidos en la columna los Tiempo
analitos polares) POLARIDAD DE COMPUESTOS
A>B>C

 Polaridad FM

C
Si se incrementa la polaridad de FM, los tiempos de
B
retención disminuyen A
(esos compuestos polares interaccionan más con la
FM, permanecen más tiempo en la FM y se eluyen
antes) Tiempo

35

CROMATOGRAFÍA EN FASE RESERVA

COMPUESTOS APOLARES
FASE ESTACIONARIA: APOLAR
FASE MÓVIL: RELATIVAMENTE POLAR

A
B
Los primeros solutos que eluyen son los más C
polares, ya que interaccionan menos con la FS
(se retienen más en la columna los analitos Tiempo
apolares)
POLARIDAD DE COMPUESTOS
A>B>C

 Polaridad FM

Si se incrementa la polaridad de FM, los tiempos de A

retención aumentan B
C
(esos compuestos relativamente apolares interaccionan
aún menos con la FM, permanecen más tiempo en la
FS y se eluyen después) Tiempo

36

18
 Fase estacionaria
 Fase líquida adsorbida físicamente sobre la superficie de un soporte
 Especie orgánica unida químicamente a la superficie del soporte

- Partículas de sílice (resistentes, porosas y uniformes) con

SOPORTES PARA LOS diámetros entre 1,5 a 10 m. Útiles a pH pH < 8.0
RELLENOS DE FASE
ESTACIONARIA - Partículas de poliestireno. Para pH entre 8 y 12

Estructura esquemática de sílice

Superficie de sílice totalmente

hidrolizada por calentamiento con HCl
está constituida por grupos silanol (Si-
OH) químicamente reactivos

37

FASE ESTACIONARIA LÍQUIDA ADSORBIDA

La fase estacionaria es un líquido que se adhiere al soporte por adsorción física

Es significativa sólo en cromatografía en fase normal

- Fase estacionaria: líquidos polares como agua, trietilenglicol
- Fase móvil: líquidos relativamente no polares como hexano, cloroformo…

Desventajas:
- Pérdida de FS por disolución en la fase móvil (recubrimiento periódico de las
partículas del soporte)
- No útil para elución por gradiente

38

19
 FASE ESTACIONARIA LÍQUIDA UNIDA QUÍMICAMENTE

La fase estacionaria es una especie orgánica

unida químicamente a la superficie de las
partículas de relleno

Permite a la fase estacionaria

resistir las altas presiones
aplicadas en HPLC

Revestimiento de la superficie de sílice por silanización

39

Proceso de bloqueo (end-capping o protección terminal)

- El revestimiento de la superficie de sílice por silanización está limitado a causa de
impedimento estérico (grupos SiOH sin reaccionar: aporta carácter polar)
-Desactivación por bloqueo con trimetil clorosilano de pequeño tamaño

(CH3)3SiCl +

Trimetil clorosilano

40

20
 Grupos funcionales comunes para fases unidas químicamente

Siloxano con R variable

Cromatografía en Fase Normal Cromatografía en Fase Inversa

Fase estacionaria polar Fase estacionaria no-polar
(R es un grupo funcional polar) (R es un grupo funcional no-polar)
-Si-OH No -(CH2)7CH3 Octilo (cadena C8)
derivatizada
-Si-(CH2)3NH2 Aminopropil -(CH2)17CH3 Octadecilo (cadena C18)
- C18H37
-Si- Diolpropil -(CH2)29CH3 Triacontilo (cadena C30)
(CH3)3OCH2CH(OH)CH2
OH
-Si-(CH2)3CN Ciano* -(CH2)3C6H5 Fenilpropil

* También puede usarse en fase inversa

41

Cadenas hidrocarbonadas en cromatografía en fase inversa

- FM: polar
- FS: cadena hidrocarbonada (cadena larga C-18, cadena intermedia C-8 o cadena corta C-2)
Dichas cadenas alifáticas se orientan paralelas unas a otras, perpendicularmente a la superficie de las
partículas (a modo de peine).

EFECTO DE LA LONGITUD DE LA CADENA DEL GRUPO ALQUILO SOBRE LA EFICACIA

• Cuanto más larga es la cadena del hidrocarburo
- mayor es la retención de los compuestos
- permite mayor cantidad de muestra (mayor capacidad de carga)

42

21
 Fase móvil

• Hay muchos tipos disponibles (al contrario que en cromatografía de gases)

– Cromatografía en fase normal: hexano, cloroformo, etiléter
– Cromatografía en fase inversa: agua, metanol, acetonitrilo

• La fase móvil interacciona con los componentes de la muestra

– Al contrario que en CG (gas inerte)

• Selección de la fase móvil:

– El tiempo de retención de un soluto varía en función del tipo de eluyente
– Valor de factor de capacidad (k) entre 1 y 5, siempre que sea posible

• Mejorar la resolución de una columna cromatográfica (variación de k, , H o N)

- k’ y  se pueden modificar cambiando la fase móvil

43

INDICE DE POLARIDAD (P) Medida numérica de la polaridad relativa de disolventes

Un índice de polaridad determinado se puede conseguir por mezcla de dos disolventes apropiados
PROPIEDADES DE LAS FASES MÓVILES CROMATOGRÁFICAS MÁS COMUNES

44

22
 El índice de polaridad de una mezcla de disolventes A y B se calcula:

En general, se comprueba que un cambio de dos unidades de P’ origina

aproximadamente una variación de 10 veces en la constante de reparto k:

45

Miscibilidad de los disolventes más usados en HPLC

46

23
 Calcular la polaridad de la siguiente fase móvil:
30% en volumen de metanol y 70% de agua
(DATOS: índice de polaridad del metanol 5,1 e índice de polaridad del agua 10,2)

¿Qué proporción de disolventes metanol:agua se necesitará para lograr un índice de

polaridad/fuerza eluyente de 7,6?

x = 49 % ( % de agua en la mezcla)
100-x = 51 (% de metanol en la mezcla)

47

En una columna de reparto de fase normal se encuentra que un analito tiene un tiempo
de retención de 29,1 minutos, mientras que una sustancia no retenida eluye en 1,95
minutos cuando la FM es 50% cloroformo: 50% hexano. Calcula:
a) El factor de capacidad del analito
b) Una composición de disolventes que condujera a un valor del factor de
capacidad por debajo de 10.

DATOS: índice polaridad del cloroformo 4,1 e índie de polaridad del hexano 0,1

a) El factor de capacidad del analito

b) Una composición de disolventes que condujera a un valor del factor de capacidad

por debajo de 10.

48

24
 b) Una composición de disolventes que condujera a un valor del factor de capacidad
por debajo de 10.

10 ¿? P2 = 2,95

26,7

Para obtener una polaridad P2 de 2,95, la composición de la FM debe ser:

49

Mejora de la resolución de una columna cromatográfica

Separación de esteroides
Cromatografía en fase inversa: FS C8
Ajuste del factor de retención (k)

 Variación de la polaridad de la FM
Mezcla acetonitrilo:agua
P acetonitrilo: 5,8
P agua: 10,2

Polaridad FM cromatograma a
P= 0,41x 5,8 + 0,59 x 10,2 = 8,396

Polaridad FM cromatograma b

P=0,3 x 5,8 + 0,7 x 10,2 = 8,88

50

25
 Ajuste del factor de selectividad ()

 Variación de la naturaleza de los disolventes

51

Aplicaciones de la cromatografía de reparto

Campo de Sustancias
aplicación
Farmacéutico Antibióticos, esteroides, analgésicos, ansiolíticos, etc..

Bioquímico Aminoácidos, proteínas, carbohidratos, lípidos

Alimentación Conservantes, antioxidantes, edulcorantes, etc…

Química industrial Tensioactivos, colorantes, etc…

Química forense Drogas, venenos alcohol en sangre, narcóticos, etc

Química clínica Ácidos biliares, metabolitos de drogas, extractos de orina,

estrógenos, etc.

Medio ambiente Pesticidas, herbicidas, fenoles, bifenilos policlorados

52

26
 Aplicaciones de la cromatografía de reparto

Fase estacionaria enlazada polar (ciano) Fase estacionaria enlazada con cadenas C8
Elución isocrática: 6 % AcH/95 % H2O Elución en gradiente:
Velocidad de flujo: 1,0 mL/min 67 % metanol/33 % H2O a 80% metanol/20% H2O
Velocidad de flujo: 2,0 mL/min

53

CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN O LÍQUIDO-SÓLIDO

Es la modalidad clásica de cromatografía de líquidos (Tswett, 1906)

FASE MÓVIL LÍQUIDA

Relativamente no polar

Metileno, isooctano, etc

FASE ESTACIONARIA SÓLIDA

Polar

Dos fases habituales:

- Sílice (la más común porque permite
mayor capacidad de carga)
- Alúmina

La separación se basa en un equilibrio Competencia entre las moléculas de fase móvil

de fuerzas de adsorción-desorción del y moléculas de soluto por los sitios de
soluto en la FS adsorción de la fase estacionaria

54

27
 FUERZA ELUYENTE ()
Medida de la energía de adsorción por unidad de área de adsorbente

CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN: FS muy polar, FM menos polar

Mayor polaridad de solutos  mayor adsorción en la superficie de Fase estacionaria

 mayor tiempo de retención

Variación del factor de retención de los solutos  Variación de la fase móvil

Se cambia el disolvente de FM por otro con mayor fuerza eluyente
Si k´ muy alto Si el soluto se adsorbe mucho a la FS necesitará FM con alta fuerza eluyente para resorber el
soluto de la FS.

Si k´ bajo El disolvente se sustituye por otro con fuerza eluyente menor

Se puede utilizar un disolvente o una mezcla con la fuerza eluyente adecuada para llevar a
cabo una determinada separación.

55

Fuerza eluyente

Propiedades de las fases móviles cromatográficas más comunes

56

28
 Aplicaciones de la cromatografía de adsorción

1. Compuestos no polares de bajo peso molecular con dificultades para disolverse en

disolventes utilizados en cromatografía de fase inversa
- tR Hidrocarburos aromáticos
Haluros, sulfuros
Éteres
Compuestos nitrogenados
Ésteres, aldehídos, cetonas
Alcoholes, aminas
Sulfonas
Sulfóxidos
+ tR Amidas
Ácidos carboxílicos
Enumerados en orden de tiempo de retención, es decir, de menor a mayor interacción
con la fase estacionaria

2. Separación de compuestos isómeros en mezclas

57

FOSFOLÍPIDOS
1. Colesterol Fase estacionaria: partículas de sílice
2. Ácido palmítico - Tamaño de partícula 3 µm.
3. Fosfatidiletanolamina
- Diámetro interno de la columna: 4,6 mm
4. Fosfatidilserina
5. Fosfatidilcolina Fase móvil: 3 disolventes (A: isopropanol; B: hexano; C: agua
6. esfingomielina Gradiente en elución
- Tiempo 0-7 min: 58 % A, 40 % B y 2% C
- Tiempo 7-15 min: 52 % A, 40 % B y 8 % C
Velocidad de flujo: 1,25 mL/min
Detector de luz dispersada tras evaporación

ISÓMEROS
VITAMINAS LIPOSOLUBLES
Separación de cis
Análisis de leche en polvo y transpirazolina
1. Vitamina E
2. Vitamina D
3. Vitamina A

Fase estacionaria: partículas de sílice (tamaño de partícula 5 µm, diámetro

interno de la columna 4,6 mm)
Fase móvil: Isopropanol:Hexano (1:99) Elución isocrática
Velocidad de flujo: 1,5 mL/min
Detector UV (265 nm)

58

29
 CROMATOGRAFÍA IÓNICA

Separar y determinar especies iónicas

FASE MÓVIL LÍQUIDA FASE ESTACIONARIA

Polar e iónica RESINA DE INTERCAMBIO IÓNICO

La separación se basa en un equilibrio de intercambio iónico entre los

iones de la disolución y los iones de carga semejante que se encuentran
en la superficie de un relleno insoluble (FS)

59

Fase estacionaria
RESINAS DE INTERCAMBIO IÓNICO

Según el material del soporte pueden ser de dos tipos:

SOPORTE - Resinas con base polimérica
SÓLIDO - Resinas de gel de sílice

Resinas con base polimérica

Matriz constituida
por un polímero
orgánico:
poliestireno

Matriz
constituida por
un copolímero de
estireno-
divinilbenceno

60

30
 GRUPOS FUNCIONALES DE INTERCAMBIO IÓNICO (SITIOS ACTIVOS)

Intercambiadores catiónicos Intercambiadores aniónicos

Acido sulfónico – SO3 - (H+) – Amina primaria – NH3+(OH-)
Acido carboxílico – COO- (H+)
– Amina terciaria

61

Fase móvil

• Si se utiliza una resina de intercambio catiónico(-)  FM con carga positiva (ej. grupos – H+)
• Si se utiliza una resina de intercambio aniónico(+)  FM con carga negativa (ej. grupos - OH-)
• pH controlado por una disolución amortiguadora (HCO3-/CO32-)

Resina de intercambio catiónico (Fase móvil con carga positiva)

62

31
 Equilibrio de intercambio iónico

FS: Resina de intercambio catiónico R-SO3- Los iones de la fase móvil compiten por los iones
FM: H+ del analito por los puntos activos del relleno del
Muestra con catión M2+ intercambiados iónico

Sólido disolución sólido disolución

 Se añade fase móvil (disolución ácida): R-SO3- H+

 La muestra con catión M2+ entra en la columna disuelta en la fase móvil
 Se produce el equilibrio de intercambio iónico indicado (los cationes M2+ se unen a la
resina)
 Los iones M2+ se desplazan a lo largo de la columna tras una serie de transferencias
entre la fase móvil y estacionaria

63

El tiempo que permanece cada catión en cada fase depende del valor de la constante
de reacción de intercambio iónico

REORDENANDO

Cuando:
– [H+]aq >> [M+2]aq y [RSO3-H]s >> [(RSO3-)2M2+]s
Es decir, cuando:
– [ácido] > [catión] y los puntos de unión no están saturados

[H+]ac y [RSO3-H]sólido se incluyen en la constante

Principio de aplicación de la cromatografía iónica

coincide con la cromatografía de reparto

64

32
 Características generales

La afinidad de los iones por la resina

IONES DE DISTINTA CARGA

A mayor carga, mayor unión a la resina

(iones polivalentes retenidos con más fuerza que especies con una sola carga)

Al3+ > Ca2+ > Na+

GRUPO DE IONES CON LA MISMA CARGA

A menor radio del ión hidratado, mayor unión a la resina

K+ > Na+ > Li+ (radio hidratado) K+ < Na+ < Li+ (unión a la resina)

65

Los iones de las sustancias de la mezcla desplazan a los contraiones de la columna. A su

vez, ellos compiten con los iones de la FM por los sitios activos

66

33
 Componentes del equipo instrumental

Mismos componentes que cualquier

equipo de HPLC, excepto un
componente específico

Membrana o columna supresora

convierte los iones de la fase móvil en
especies poco ionizadas

67

DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
Sin columna supresora Separación de cationes (Mn+)
FS: resina de intercambio catiónico (columna
analítica)
FM: HCl (H+)

Columna supresora: resina de intercambio

aniónico (resina-OH-)
Resina-OH- + H+ + Cl-  Resina-Cl- + H2O

La conductividad de FM enmascara a la Detector conductimétrico: Llegan iones Mn+

de los analitos
Separación de aniones (An-)
Con columna supresora FS: resina de intercambio aniónico (columna
analítica)
FM: Bicarbonato sódico (HCO3-)

Columna supresora: resina de intercambio

catiónico (resina-H+)
Resina-H+ + Na+ + HCO3-  Resina-Na+ + H2CO3

Detector conductimétrico: Llegan iones An-

68

34
 Aplicaciones

DETERMINACIÓN DE:
- Aniones inorgánicos y orgánicos: Fluoruros, cloruros, nitritos, bromuros,
nitratos, fosfatos, sulfatos, bromatos, cloritos, cloratos, acético, cítrico,
tartárico, láctico, benzoico…
- Cationes: Sodio, amonio, potasio, calcio, magnesio…
- Azúcares y polialcoholes: Monosacáridos, disacáridos, oligosacáridos,
polisacáridos
- Mezclas de vitaminas, de aminoácidos

APLICACIONES AL ANÁLISIS DE: Aguas de consumo, Bebidas, Productos

cárnicos, Productos vegetales, Alimentación infantil, etc

69

SEPARACIÓN DE IONES SEPARACIÓN DE AMINOÁCIDOS

INORGÁNICOS

FS: Resina de intercambio catiónico con tamaño

(a) Separación de aniones de partícula 8 m
FS: Resina de intercambio aniónico
Fase móvil NaHCO2/Na2CO3

(b) Separación de cationes alcalinotérreos

FS: Resina de intercambio catiónico
Fase móvil: HCl/diclorhidrato de fenilenodiamina

70

35
 CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN POR TAMAÑOS

FASE ESTACIONARIA
FASE MÓVIL LÍQUIDA Partículas de sílice o de polímeros porosas
de tamaño de poro uniforme

Aplicación: fundamentalmente a especies

de elevada masa molecular
Fundamento:
- Las moléculas de soluto son atrapadas en
los poros y eliminadas del flujo de la fase
móvil.
- El tiempo de residencia de la molécula en
los poros depende del tamaño de las
moléculas de soluto

No hay interacción ni física ni química entre el analito y la fase estacionaria

La retención no se controla con la fase móvil

71

72

36
 FASE ESTACIONARIA

Partículas porosas de tamaño de poro uniforme

- Partículas de sílice: Rigidez y alta estabilidad. Tienden a retener solutos por
adsorción
- Partículas poliméricas: polímeros hidrofóbicos (copolímeros estireno-
divinilbenceno) y polímeros hidrofílicos (poliacrilamida)

CARACTERÍSTICAS DE DIVERSOS RELLENOS COMERCIALES

73

Límite de exclusión: masa molecular

máxima por encima de la cual las
Límite de moléculas ya no pueden ser
exclusión retenidas por un determinado
Región de relleno
Peso molecular

permeabilidad
selectiva Límite de penetración: masa
molecular por debajo del cual las
moléculas pueden penetrar
completamente en los poros
Límite de
penetración
Pico A: Compuestos con pesos
moleculares mayores que el límite de
exclusión

Picos B y C: Compuestos con pesos

moleculares dentro de la región de
Señal del
detector

permeabilidad selectiva

Pico D: Compuestos con pesos

moleculares inferiores al límite de
penetración

74

37
 Aplicaciones

 Separación y determinación del peso molecular de proteínas

 Estudio de la polidispersidad o distribución de pesos moleculares en
polímeros sintéticos o productos naturales
 Purificación de macromoléculas (purificación de ADN)
 Eliminación de productos, cofactores, inhibidores, etc. de las enzimas

75

Ejemplos

Análisis de una resina epoxi comercial

Separación de ácidos grasos (n =número de unidades poliméricas en el
polímero)

Columna de poliestireno Columna de sílice

• F.M.: tetrahidrofurano • F.M.: tetrahidrofurano
• Detector: índice de refracción • Detector: absorción UV

76

38
 Determinación de sacarosa (S), glucosa (G) y fructosa (F) en zumos

77

Ejercicio
Tres compuestos A, B y C se analizaron mediante cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC)
en una columna de sílice. La fase móvil empleada para la separación estaba compuesta por éter
etílico (30%) y hexano (70%). Un compuesto que no interacciona con la fase estacionaria dio un
tiempo de retención de 1,5 minutos. El cromatograma proporcionó los siguientes datos
Tiempo retención anchura de la base
(min) del pico (min)
A 2,5 0,21
B 7,2 0,31
C 12,3 0,75

Calcular

a) El factor de retención o de capacidad k,.para cada compuesto

k’A = 0,66; k’B = 3,8; k’C = 7,2

b) La selectividad y resolución para cada para de picos a-b, b-c

a-b = 5,75; b-c = 1,89

Ra-b = 18,07; Rb-c = 9,62

78

39
 c) La fuerza de elución de la fase móvil (índice de polaridad) siendo la polaridad (P)
del hexano 0,1 y la del éter-etílico 2,8.
FM: éter etílico (30%) y hexano (70%).

(d) La separación ¿es en fase normal o inversa? ¿Por qué?

FM: apolar Cromatografía en fase normal

FS: polar

(e) Si la fase móvil se cambia por éter etílico (70%) y hexano (30%) ¿Qué cambios cabe
esperar que se produzcan en el cromatograma? ¿Por qué?

La fase móvil se vuelve más polar

COMPUESTOS A SEPARAR POLARES: tiempos de retención disminuirán

79

Ejercicios

Mediante cromatografía se consiguen separar seis hidrocarburos

aromáticos policíclicos, empleando una columna de 25 cm de
longitud. El caudal de la FM acetonitrilo/agua es de 0,8 mL/min,
obteniéndose los siguientes resultados:
Analito Tr (min) W (min)
No retenido 3,4 -
Naftaleno 5,2 0,41
Fluoreno 7,4 0,62
Fenantreno 8,3 0,81
Benzoantraceno 11,5 1,53
Criseno 12,1 1,95

a) Calcular el factor de retención para las especies eluidas

b) Calcular el número de platos teóricos de cada analito en la
columna
c) Calcular la resolución para el primer y último par de compuestos

80

40
 K´=tr-tm/tm

K´(N)= 0,529 N(N)= 2573,7 R (Fl-N)=4,4/1,03=4,27

K´(Fl)= 1,176 N(Fl)= 2279,3 R (C-B)=1,2/3,48=0,34
K´(Fe)= 1,441 N(Fe)= 1680
K´(B)= 2,382 N(B)= 904
K´(C)= 2,559 N(C)=616

FM: relativamente polar COMPUESTOS A SEPARAR

APOLARES

Para que los solutos interaccionen más con FM, ésta se debe
hacer menos polar (más apolar)

81

41