UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO

Facultad de Ciencias Biológicas

Escuela Profesional de Ciencias Biológicas
 GUÍA DE PRÁCTICAS

Asignatura: Microbiología del Suelo

Docente: Dra. Carmen Rosa Carreño Farfán
Integrantes: Burga Paz Julisa
Díaz Valdera Alex
Gonzáles Navarro Katia
Huamanchumo Villalobos Edgar
Sánchez Martínez Jesús
Zeña Quesquén Julissa

Lambayeque –Perú- 2020

PRÁCTICA 3

ANÁLISIS DE LA FERTILIDAD MICROBIANA DEL SUELO

I. Introducción

El suelo no es solo el sustrato más utilizado en la producción agrícola,

sino que además es un sustrato vivo y dinámico y representa uno de los

ecosistemas más altamente biodiverso.  Hasta 10.000 millones de células se

pueden encontrar en un gramo de suelo, los microorganismos tales como

bacterias, hongos y virus son los más abundantes. Los microorganismos juegan

un papel esencial en el mantenimiento de la calidad, la salud y fertilidad de

suelo. Influyen en la disponibilidad de nutrientes en el suelo, proveen estructura,

aportan en el control de organismos patógenos, degradan contaminantes

orgánicos y favorecen la huella de carbono (C) en el suelo. 

La vida microbiana tiene un rol esencial en la formación y el

mantenimiento de la fertilidad del suelo. El monitoreo de la abundancia,

actividad y diversidad de los microorganismos edáficos es de suma importancia

en ecosistemas agrícolas a fin de evaluar el impacto de las diferentes prácticas

de manejo productivo. El análisis microbiológico del suelo estudia la presencia,

abundancia y actividad de las poblaciones microbianas y las interacciones entre

los microorganismos y entre ellos y las plantas. Por tal motivo, se debe recurrir

al uso de técnicas de laboratorio que respeten lo más fielmente posible las

condiciones presentes en el ambiente natural.

Las técnicas de análisis más utilizadas para estimar la abundancia

microbiana incluyen: Recuento de células totales (células vivas y muertas) y

recuento de células viables (células que aún presentan capacidad para

reproducirse).

En el recuento de células viables se puede realizar en medio sólido y en

medio líquido. En medio sólido, asumiendo que cada célula origina una colonia,
 se cuentan aquellas desarrolladas sobre o dentro del agar. Generalmente la

muestra se diluye, se siembra 1mL (siembra en profundidad, por inmersión o

embebido) o 0,1mL (siembra en superficie) y los resultados se expresan en

unidades formadoras de colonias: UFC mL-1 o UFC g-1:

UFC mL-1 o UFC g-1 Colonias contadas x 1/factor de dilución x 1/volumen de

inóculo

En medio líquido, se siembran volúmenes secuenciales de base 10

(diluciones de la muestra o 1ml de las diluciones decimales). El método del

número más probable (NMP) es adecuado, especialmente cuando no es factible

contar las células individuales. Se basa en la determinación de la presencia o

ausencia de atributos particulares de los microorganismos presentes en la

muestra, como por ejemplo el consumo de un sustrato o la formación de algún

producto (ácido, gas) y la densidad poblacional se estima con la tabla

probabilística de MC Grady.

II. Objetivo

Diferenciar el recuento de grupos funcionales de microorganismos en el suelo,

considerando la siembra en superficie o inmersión en medio sólido (fijadores de

nitrógeno, solubilizadores de fosfato, amilolíticos, proteolíticos) y número más

probable (amonificadores, celulolíticos, nitrificadores).

III. Metodología
3.1. Suspensión y dilución del suelo

Como en el suelo la cantidad de microorganismos es muy grande se

deben realizar diluciones de la suspensión/dilución para obtener un número

factible de microorganismos que pueda ser contado. Por ejemplo, cuando se

realizan métodos de recuento en medio sólido, el número factible de

microorganismos que puede ser contado en una caja de Petri debe estar en el

rango de 30 a 300 colonias por caja. Asimismo, en el caso del método de

recuento en medio líquido (Número Más Probable), para poder ingresar a la

tabla de Mc. Grady se requiere al menos que exista un tubo negativo.

Pesar 10g de suelo y depositarlos en 90mL de solución salina

esterilizada, homogenizar durante 10-20 minutos y realizar diluciones al décimo:

1mL de la muestra en 9 mL de solución salina esterilizada.

3.2 Recuento de células viables aplicadas a grupos funcionales

a) Recuento en medio líquido

Figura 1

Método del número más probable, 2015.

b) Recuento en medio sólido:

 UFC/mL o UFC/g = colonias contadas x (1/factor de dilución) x (1/volumen

de inóculo).

Factor de dilución: Dilución utilizada

Volumen de inóculo: 1 mL (para siembra por embebido y 0,1 mL para

siembra en superficie).

Existen básicamente dos formas de realizar recuento en medio sólido:

Figura 2

Método de siembra por inmersión o embebido, 2015.

Figura 3

Método de siembra en superficie,2015.

3.2.1 Microorganismos amonificadores

 De las tres diluciones más altas (-9,-8,-7) de la muestra, tomar 1mL y

sembrar por triplicado en el medio selectivo caldo asparagina.

Después de la incubación a 30°C, durante 7 días, agregar dos o tres gotas

del reactivo de Nessler en cado tubo y contar aquellos donde se observe un color

ocre por la presencia de amonio.

Ingresar la cifra de tubos positivos resultante a la tabla de Mc Grady para

obtener el número más probable.

3.2.2 Microorganismos celulolíticos

Utilizar el agar Carboximetilcelulosa (CMC) que contiene (L-1): 1g

K2HP04; 0,5g MgS04.7H20; 0,5gNaCl; 0,01g Fe S04.7H20; 0,01g MnS04.H20;

0,3g NH4N03; 10g carboximetilcelulosa y 17g de agar bacteriológico, con un pH

final de 7,0.

Sembrar de las diluciones -6,-5 y -4 y después de la incubación a 28°C por

7 días contar las colonias que muestran alrededor halos de hidrólisis utilizando

Rojo Congo al 1% y NaCl 1 M como agentes reveladores.

3.2.3 Microorganismos nitrificadores

De las tres diluciones más bajas (-4,-3,-2) de la muestra, tomar 1mL y

sembrar por triplicado en el medio selectivo con sulfato de amonio.

Después de la incubación a 30°C, durante 21 días, agregar 0,1 mL de ácido

sulfúrico concentrado y unas gotas de difenilalanina sulfúrica en cada tubo y

contar como positivos aquellos donde observe el color azul característico.

Ingresar la cifra de tubos positivos resultante a la tabla de Mc Grady para

obtener el número más probable.

3.2.4 Microorganismos fijadores de nitrógeno de vida libre

Utilizar el medio Ashby sin nitrógeno, que contiene (L-1): 0,2g KH2P04;

0,2g MgS04; 0,2g NaCl: 5gCaC03; 0,1g CaS04; 10g manitol y 15 g de agar

bacteriológico, con un pH final de 7,0.

Después de la incubación a 28°C durante 7 días, contar las colonias

desarrolladas, en su mayoría translúcidas y mucoides. Éstas son fijadoras de

nitrógeno porque crecen en un medio carente de ese nutriente.

3.2.5 Microorganismos solubilizadores de fosfato

Utilizar el medio National Botanical Research Institute Phosphate

(NBRIP) que contiene (L-1): 10g glucosa; 01g (NH4) S04; 0,2g KCl; 0,25g

MgS04.7H20; 5g MgCl2.6H20, 14 g de agar bacteriológico y Ca3P04 al 0,5%,

con un pH final de 7,0.

Después de la incubación a 28°C por 14 días, contar las colonias que

muestren halos claros alrededor o halos de solubilización de fosfato.

3.2.6 Microorganismos amilolíticos

Utilizar el agar Almidón que contiene (L-1): 10g triptona; 5g NaCl; 10g

almidón soluble y 17g de agar bacteriológico. Después de la incubación a 30°C

por 72 horas (bacterias) y 7 días (hongos) contar las colonias que muestren

alrededor halos de hidrólisis utilizando como agente revelador lugol al 0,05%.

3.2.7 Microorganismos proteolíticos

 Utilizar el agar Leche que contiene (L-1): 28g de leche descremada en

polvo; 5 g de hidrolizado de caseína; 2,5g de extracto de levadura y 17g de agar

bacteriológico.

Después de la incubación a 30°C por 48 horas contar las colonias que

muestren alrededor halos transparentes o de hidrólisis.

Figura 4

Esquema de Siembra de los Grupos Funcionales, 2015.

IV. RESULTADOS

IV.1 Estimación del número más probable en grupos funcionales:

Tabla 1

Mc. Grady para tres Tubos, 2015

 4.1.1. Microorganismos amonificadores

Tres Diluciones altas: 10-9, 10-8, 10-7

La siembra se realiza por triplicado:

Se coloca 1 mL de las diluciones 10-9,

10-8 y 10-7 en tubos en el medio con

asparagina.

Se incuba 30C-7 días y después.

Incubación 28-30 C - 7 días

Agregar reactivo Nessler

LECTURA

El color ocre detecta

presencia de amonio

Contar los tubos positivos y

se ingresa la cifra de tubos

en la tabla de Mc.Grady.
 Número característico = 3 2 1

Número más probable (NMP)=15

4.1.2. Microorganismos celulolíticos

Diluciones: -6,-5,-4

Sembrar en medio con agar

Carboximetilcelulosa

Incubación a 28°C por 7 días

Contar las colonias que muestran alrededor halos de hidrólisis.

LECTURA

Se cuentan los tubos positivos (colonias sobre el

papel o alteración del mismo).

INDICADOR - + - - - + - + +

Número característico = 1 1 2

Número más probable (NMP)=1.5

Figura 5
Zona de aclaramiento de la bacteria celulolítica en medios selectivos de
CMC-Na
4.1.3. Microorganismos nitrificadores

Tres diluciones más bajas (-4,-3,-2)

Sembrar en el medio selectivo con

sulfato de amonio

Incubación a 30°C- 21 días

Agregar 0,1 mL de ácido sulfúrico

concentrado y unas gotas de di

fenilamina sulfúrica

LECTURA

Se cuentan los tubos positivos

(color azul por presencia de
nitrato).Buscar en la tabla de
Mc.Grady

Número característico

Número más probable

(NMP)=15
IV.2 Estimación de UFC x g de grupos funcionales:

4.2.1. Microorganismos fijadores de nitrógeno de vida libre

Dilución 10-4
a) Siembra 1ml en
placa Petri.

Utilizar el medio Ashby

sin nitrógeno

2) luego incubar a 28C-7

días

3) Contar las colonias desarrolladas, en su mayoría translúcidas

y mucoides

LECTURA

UFC mL-1 o UFC g-1 =

50 x 1/10-4 x 1/1g

=5x105 ufc/g

Figura 6

Colonias de Azotobacter A15M2G

4.2.2. Microorganismos solubilizadores de fosfato

Se realiza las respectivas diluciones y se siembra 1

ml en placa Petri.

Utilizar el medio (NBRIP)

Incubar a 28°C - 14 días

LECTURA

UFC mL-1 o UFC g-1 =

83x 1/10-4 x 1/1g

=8,3x105 ufc/g

Figura 7

Microorganismos solubilizadores de fosfato de una suspensión de suelo

en medio de cultivo NBRIP. Zonas claras alrededor de las colonias

indican solubilización de fosfatos

 4.2.3. Microorganismos aminolíticos

Se realiza las respectivas diluciones 10-1,10-2,10-3 y se

siembra 0,1 ml de las 2 últimas diluciones en placa Petri.

Utilizar el agar Almidón

Incubar a 30°C - 72 horas (bacterias) y 7 días

(hongos), después se adiciona lugol en las zonas

circundantes a las colonias.

Selecciona los 10 primeros cultivos bacterianos que tuvieron

mayor halo neto de hidrolisis.

Contar las colonias que muestren alrededor halos de hidrólisis

utilizando como agente revelador lugol al 0,05%.

LECTURA

UFC mL-1 o UFC g-1 =

43x 1/10-2 x 1/1g

=4,3x103 ufc/g

Figura 8

Observación de los halos de hidrólisis de almidón en placa producidos por

Bacillus sp.
4.4.4. Microorganismos proteolíticos

Se realiza las respectivas diluciones 10-1,10-2,10-3 y se

siembra 0,1 ml de las 2 últimas diluciones en placa Petri.

Utilizar el agar Leche

Después incubar a 30°C - 48 horas

Contar las colonias que muestren alrededor halos

transparentes o de hidrólisis.

LECTURA

UFC mL-1 o UFC g-1 =

39x 1/10-2 x 1/1g

=3,9x103 ufc/g

Figura 9
Halo de hidrólisis (zona clara) alrededor de la colonia evidenciando

la actividad proteolítica
 V. BIBLIOGRAFÍA

Marrone, F.A. (2015). Guía de Actividades Prácticas Microbiología Agrícola.

Universidad Nacional de Córdoba. http://agro.unc.edu.ar/~microbiologia/wp-

content/uploads/2014/04/Guia-de-Trabajos-Practicos.pdf

Martínez, M. (2017). Estudio de la calidad de suelo a través de análisis

microbiológicos y bioquímicos. https://www.redagricola.com/pe/estudio-la-

calidad-suelo-traves-analisis-microbiologicos-bioquimicos/