Módulo 10.

ORGANELOS TRANSDUCTORES DE ENERGÍA:

CLOROPLASTOS Y FOTOSÍNTESIS
PLÁSTIDOS
Con este nombre se denomina genéricamente a un grupo de que producen y almacenan
productos nutritivos en algas y plantas. Todos los plástidos derivan de proplástidos, que son pequeños
organelos presentes en los tejidos meristemáticos (tejidos en activa división). Los etioplastos son plástidos
de hojas crecidas en ausencia de luz, que cuando se exponen a la luz se desarrollan en cloroplastos. Los
amiloplastos son plástidos especiales que reservan almidón en los tejidos no fotosintéticos.

Etapas de transformación de un etioplasto (a) cuando se expone a la luz. En el centro de la fotografía se observa una
estructura (cuerpo prolamelar) que será el origen de los tilacoides. Luego de tan sólo un minuto de exposición a la luz el
cuerpo prolamelar se organiza en laminillas (b). Al cabo de otro minuto de exposición (c) comienzan a distribuirse las
laminillas. Luego de 24 horas de exposición a la luz (d) se observan los primeros grana (asociación de membranas
tilacoidales). En (e) puede verse un granum totalmente desarrollado.

Los cloroplastos son el tipo más común de plástidos: estos organelos contienen clorofila, un
pigmento de color verde del cual hay varios tipos, que difieren ligeramente entre sí (en las plantas
terrestres las clorofilas más comunes son las clorofilas a y b, pero en las algas hay otros tipos) que
atrapan la energía que provee la luz solar para realizar la fotosíntesis. Los cloroplastos también contienen
una variedad de pigmentos amarillos y naranjas llamados carotenoides que absorben radiaciones
luminosas en zonas del espectro visible donde no absorben las clorofilas y por ello se denominan
pigmentos fotosintéticos accesorios o auxiliares.
Un alga unicelular puede contener sólo un gran cloroplasto, en tanto que la célula de una hoja
puede tener de 20 a 100. Es importante señalar que los cloroplastos no son solamente sitio de síntesis y
almacenamiento de hidratos de carbono, ya que el ATP y el poder reductor que producen es utilizado en
diferentes compartimientos para la síntesis de otros compuestos químicos que requiere la célula para su
funcionamiento.
Los cloroplastos son organelos complejos, en forma típica de disco, delimitados por dos
membranas, una interna y otra externa . El espacio delimitado por la membrana interna llamado estroma
(que es análogo a la matriz mitocondrial) contiene las enzimas encargadas de sintetizar glucosa a partir de
dióxido de carbono, agua y energía obtenida de la luz solar; también posee ADN, ARN y ribosomas.
Dentro del estroma existe un tercer sistema de membranas que delimita compartimientos en forma de
sacos aplanados, de forma discoidal, interconectados unos con otros, llamados tilacoides. El interior de
este compartimiento se denomina espacio intratilacoidal. Los espacios intratilacoidales parecen estar
conectados entre sí y se agrupan formando pilas ( granum, plural grana). Tales membranas, ricas en
clorofila, se asemejan a la membrana interna de la mitocondria por el hecho de que ambas intervienen en
la formación de ATP. La energía captada por las moléculas de clorofila a partir de la luz solar es utilizada
para excitar electrones que se utilizarán en la formación de moléculas de ATP y de poder reductor
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(NADPH, equivalente al NADH). Esta energía química será luego utilizada en el estroma para obtener
glucosa partir de dióxido de carbono y agua.

Transporte de proteínas hacia los cloroplastos

Como ya se ha mencionado en capítulos anteriores, casi todo el ADN de las células eucarióticas
se encuentra en el núcleo, pero los cloroplastos (al igual que las mitocondrias) contienen moléculas de
ADN en sus compartimientos internos, así como ribosomas, lo que les permite producir un pequeño
número de las proteínas que se encuentran en estos organelos. Sin embargo, la mayor parte de las
proteínas de los cloroplastos son fabricadas en los ribosomas libres del citosol, que después son
transportadas al sitio adecuado del organelo.
Son relativamente pocas las proteínas codificadas por el genoma del cloroplasto y usualmente
se ubican en la membrana tilacoidal de los cloroplastos; en muchos casos ser trata de subunidades de
proteínas complejas que tienen que ensamblarse luego con otras subunidades codificadas en el genoma
nuclear.
Al igual que lo que ocurre en las mitocondrias, las proteínas destinadas a los cloroplastos son
orientadas hacia estos organelos por secuencias de señal específicas que tienen que ser reconocidas por
una proteína de la membrana externa del cloroplasto. De acuerdo a su ubicación final, la proteína
atraviesa una o las dos membranas y eventualmente llega al estroma o a los tilacoides de los grana. En el
caso de las células vegetales, ambas organelos (mitocondrias y cloroplastos) están contenidos en la
misma célula, por lo que las proteínas citosólicas destinadas a cada uno de ellos tendrán que contener
diferentes secuencias de señal.
Los cloroplastos plantean un problema adicional, ya que contienen un tercer compartimiento, que
es la membrana tilacoidal y el espacio intratilacoidal. En este caso hay una secuencia de señal que debe
ser eliminada por una peptidasa de señal una vez que la proteína precursora haya entrado al estroma,
desenmascarando así a la segunda peptidasa de señal que indica que el destino de la proteína es
intratilacoidal; dentro del tilacoide una segunda peptidasa de señal liberará la cadena polipeptídica
definitiva, que iniciará entonces su plegamiento.

Los genomas de los cloroplastos

Como ya se ha dicho, la mayoría de las proteínas presentes en los cloroplastos son codificadas
por el ADN nuclear, pero parte de las mismas son sintetizadas en los propios organelos. Tal como se
mencionó al tratar las mitocondrias, el tráfico de proteínas está dirigido solamente desde el citosol hacia
los cloroplastos; no se conoce que se exporten proteínas desde el cloroplasto hacia el citosol.
Del mismo modo que lo que ocurre con las mitocondrias, los cloroplastos no se originan de novo:
siempre provienen de la división de cloroplastos ya existentes y esta división no necesariamente está en
fase con la división celular. Antes de la división debe dividirse el ADN cloroplástico, de modo que las
células hijas posean una cantidad de cloroplastos equivalentes a los que poseía la célula madre. La
división ocurre por fisión binaria, como en las bacterias.
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El ADN cloroplástico es bastante simple y, salvo en algunas algas, es de tipo circular y no parece
contener histonas asociadas, tal como ocurre en las bacterias. De todos modos es sorprendente que la
maquinaria de síntesis proteica se parezca más a la de las bacterias que a la de células eucariotas. Esto
es particularmente cierto en cloroplastos, donde los ribosomas son similares a los de Escherichia coli,
tanto en su estructura como en la sensibilidad a los antibióticos. Además, la síntesis de péptidos empieza
con N-formilmetionina y no con metionina y el DNA cloroplástico puede ser transcripto por la ARN
polimerasa de la E. coli para producir ARNm cloroplástico y fabricar proteínas cloroplásticas.
Como ya ha sido expresado antes, la existencia de un juego separado de moléculas de ADN en
cloroplastos, junto con otras características semejantes a las de células procarióticas, han sido la causa de
que algunos biólogos supongan que estos organelos evolucionaron a partir de organismos procarióticos
que originalmente vivían en células de mayor tamaño y que se han adaptado poco a poco, de manera que
ya no son organismos autónomos. Esta idea se ha incorporado como un elemento importante de la teoría
(denominada endosimbiótica) acerca de cómo surgieron los organismos eucariontes 1.

Los cloroplastos constituyen el lugar en donde se lleva a cabo la fotosíntesis

Las plantas, las algas y algunas bacterias son productores, es decir los únicos organismos
capaces de transformar la energía solar en energía química mediante el proceso de la fotosíntesis. Cada
año estos destacados organismos producen más de 200 mil millones de toneladas de nutrientes. La
energía química almacenada en éstos sirve de combustible para las reacciones metabólicas que
mantienen la vida en la tierra.
Los productores son organismos autótrofos (que se nutren a sí mismos: del griego autos que
significa "a uno mismo" y trophos que significa "nutrición"), es decir que se trata de organismos que
fabrican sus propios alimentos a partir de materias primas inorgánicas y por lo tanto no dependen para su
nutrición de otros organismos. Algunas bacterias son autótrofos quimiosintéticos: son productores que
fabrican sus compuestos orgánicos mediante la oxidación de sustancias inorgánicas simples como el
azufre y el amoníaco. Los autótrofos quimiosintéticos no requieren de luz como fuente de energía para
realizar estas reacciones. La mayor parte de los productores son autótrofos fotosintéticos: organismos que
utilizan la luz como fuente de energía para la fabricación de compuestos orgánicos a partir de dióxido de
carbono y agua.
Cuando se examina al microscopio una pequeña porción de la hoja de una planta, se puede
comprobar que el color verde debido a la clorofila no está difundido en el citoplasma sino que se encuentra
confinado en los cloroplastos, localizados principalmente en las células del mesófilo, tejido que se ubica en
el interior de la hoja. Si se utiliza el microscopio electrónico puede comprobarse que los cloroplastos, al
igual que las mitocondrias, poseen una membrana interna y otra externa. La membrana interna encierra
una zona llena de líquido, denominada estroma, que contiene la mayor parte de las enzimas necesarias
para aquellas reacciones de la fotosíntesis que no requieren de luz (las reacciones que convierten el
dióxido de carbono en glucosa).
Como ya se ha mencionado, la membrana interna de los cloroplastos también encierra un tercer
sistema de membranas que forman un conjunto de sacos discoidales, aplanados e interconectados entre
sí, llamados tilacoides. Estas membranas tilacoides forman un tercer compartimiento en los cloroplastos,
llamado espacio tilacoideo. En algunas zonas estos sacos se organizan en columnas llamadas grana.
Cana granum se parece a una pila de monedas, en donde cada moneda corresponde a un tilacoide.
Algunas membranas tilacoidales se extienden de un granum a otro, conformando un sistema
interconectado. Los procariotes fotosintéticos como las cianobacterias carecen de cloroplastos, pero
poseen tilacoides que se presentan como extensiones de la membrana celular y se ubican en la periferia
de la célula. La clorofila, los pigmentos fotosintéticos y las enzimas necesarias para las reacciones de la
fotosíntesis que requieren luz se encuentran asociadas a las membranas tilacoidales. Estas membranas,
al igual que la membrana interna de las mitocondrias, intervienen en la síntesis de ATP.

1
Christian de Duve, “The birth of complex cells, Scientific American, 274:(4): 38-45, April 1996
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FOTOSÍNTESIS: CAPTACIÓN DE ENERGÍA LUMINOSA

Los organismos fotosintetizadores atrapan la luz solar
formando ATP y NADPH (un análogo fosforilado del NADH),
que son luego utilizados como fuente de energía para fabricar
glúcidos a partir de CO2 y H2O. Los organismos heterótrofos
aeróbicos usan el O2 para degradar los productos orgánicos
ricos en energía producidos en la fotosíntesis a CO 2 y H2O,
generando ATP para sus propias actividades. El CO 2 formado
regresa a la atmósfera para volver a ser utilizado por los
organismos fotosintetizadores. De este modo la energía solar
proporciona la fuerza motriz para la ciclación continua del CO 2
y O2 atmosféricos.
La ecuación global de la fotosíntesis describe una
reacción de óxido-reducción en la que el H 2O provee el
hidrógeno necesario para la reducción del CO 2 y su
transformación a glúcidos (CH2O), con liberación de oxígeno
molecular:
luz
H2O + CO2  (CH2O) + O2

La fotosíntesis abarca dos procesos: las reacciones luminosas (fotodependientes), que sólo tienen
lugar cuando se iluminan las plantas, y las reacciones de fijación de carbono, mal llamadas reacciones
oscuras, ya que tienen lugar tanto en la luz como en la oscuridad (sería más correcto denominarlas
reacciones fotoindependientes). En las reacciones luminosas se absorbe energía luminosa por parte de la
clorofila y otros pigmentos, conservándola en forma de energía química mediante dos productos ricos en
energía: ATP y NADPH. En las reacciones de fijación de carbono se utilizan el ATP y el NADPH para
reducir el CO2 a glucosa. El ATP y el NADPH producidos durante la fotosíntesis también pueden ser
utilizados para la síntesis de otros compuestos orgánicos.
¿De qué manera transducen (transforman) las moléculas de pigmentos de las membranas
tilacoides la energía luminosa en energía química? La clave la dio un descubrimiento realizado en 1937
por Robert Hill, que demostró que cuando se exponen a la luz extractos de hoja que contienen
cloroplastos en presencia de un aceptor de hidrógeno (A) se desprende oxígeno, al tiempo que tiene lugar
la reducción simultánea del aceptor de hidrógeno, según una ecuación actualmente conocida como
reacción de Hill.

2 H2O + 2 A  2 AH2 + O2

El aceptor de hidrógeno utilizado por Hill fue el diclorofenolindofenol

(DPIP), que en su forma oxidada es azul y en su forma reducida es incolora.
Cuando se iluminaba el recipiente con la mezcla de reacción, el colorante se
decoloraba y se formaban burbujas de oxígeno. En la oscuridad no había
reacción. Hill también demostró que la presencia de CO 2 no es necesaria
para que la reacción tenga lugar y que si está presente no participa en la
reacción, concluyendo que la producción de oxígeno podía disociarse de la
reducción del CO2. Algunos años más tarde se encontró que el aceptor
universal de hidrógeno en las plantas es el NADP +, un análogo fosforilado
del NAD+:

2 H2O + 2 NADP  2 NADPH + 2 H + O2

En la fotosíntesis, los electrones fluyen desde el agua hacia el NADP , en tanto que en la
fosforilación oxidativa que ocurre en la cadena respiratoria que tiene lugar en las mitocondrias sucede lo
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contrario: los electrones pasan del NADH al O 2, con formación de agua. Puesto que el flujo electrónico
inducido por la luz va “cuesta arriba” no puede transcurrir sin aporte de energía. Esta energía proviene de
la luz.

La absorción de luz excita las moléculas

La luz es una pequeña parte de un gran espectro de radiación, el espectro electromagnético.
Todas las radiaciones de dicho espectro viajan a través de ondas. En un extremo del espectro se
encuentran los rayos gamma, cuya longitud de onda es muy corta (menor de un nanómetro). La longitud
de onda es la distancia que existe entre la cresta de una onda y la de la siguiente. En otro extremo del
espectro se encuentran las ondas de radiación de baja frecuencia, cuya longitud de onda es tan grande
que puede medirse en kilómetros.
Los diferentes colores de la luz (distintas regiones del espectro de luz) se identifican mediante sus
longitudes de onda. Dentro del espectro de la luz visible el color violeta corresponde a la longitud de onda
más corta y el rojo a la longitud de onda más larga. La luz ultravioleta tiene una longitud de onda aún más
pequeña y el infrarrojo una longitud de onda incluso mayor. La luz no sólo se comporta como una onda,
sino también como una partícula. Está constituida por pequeños paquetes de energía llamados fotones. La
luz visible es radiación electromagnética de longitud de onda entre 400 y 700 nm. La energía de un fotón
(cuanto de luz) es mayor cuanto menor sea la longitud de onda y va de 300 kJ (radiación violeta de 400
nm de longitud de onda) a 170 kJ (radiación roja de 700 nm de longitud de onda). En otras palabras, la
energía de un fotón es inversamente proporcional a su longitud de onda .

Color Rango de longitud de onda (nm) Energía (KJ/mol)

Ultravioleta <400 471
Violeta 400-425 292
Azul 425-490 260
Verde 490-560 230
Amarillo 560-585 210
Anaranjado 585-640 193
Rojo 640-740 176
Infrarrojo >740 85

La capacidad de una molécula para absorber luz depende del ordenamiento de sus electrones
alrededor de los núcleos atómicos en su estructura. Cuando se absorbe un fotón se eleva un electrón a un
nivel energético superior, pero el proceso ocurre según un sistema de todo o nada: para ser absorbido el
fotón ha de contener una cantidad de energía (un cuanto) que iguale exactamente la energía de la
transición electrónica. Una molécula que ha absorbido un fotón se encuentra en estado excitado que, en
general, es inestable. Los electrones elevados a orbitales de energía superior usualmente vuelven
rápidamente a sus orbitales normales (estado basal), dejando ir el cuanto de energía en forma de luz
(fluorescencia) y/o calor. La radiación fluorescente es siempre de mayor longitud de onda (menor energía)
que la luz absorbida.

Pigmentos fotosintéticos
Los más importantes son las clorofilas, pigmentos verdes con estructuras policíclicas que se
parecen a la protoporfirina de la hemoglobina, excepto que la posición central está ocupada por el Mg 2+ en
lugar del Fe2+. La molécula está compuesta de cuatro anillos pirrólicos sustituidos y un quinto anillo no
pirrólico. Además contiene una larga cadena hidrofóbica de un alcohol, el fitol, esterificando a un ácido
sustituyente de uno de los pirroles. El sistema de anillos heterocíclicos tiene una estructura extendida con
alternancia de enlaces sencillos y dobles (conjugados) que constituyen el grupo cromóforo 2 responsable
de la absorción de luz. Los cloroplastos de las plantas superiores contienen siempre dos tipos de clorofila.
Una es invariablemente la clorofila a, mientras que la segunda es en muchas especies la clorofila b, que

2
del griego cromos = color, foros = llevar, grupo responsable del color de la molécula
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sólo difiere de la clorofila a en que tiene un grupo

aldehído en lugar de un grupo metilo en el anillo II. La
mayoría de las plantas superiores contienen
aproximadamente el doble de clorofila a que de
clorofila b.
Además de las clorofilas, las membranas
tilacoidales contienen pigmentos secundarios que
también absorben la luz, llamados conjuntamente
pigmentos accesorios. Los carotenoides incluyen a los
carotenos, no oxigenados, y a las xantofilas, de
colores rojo al amarillo. Las ficobilinas son pigmentos
tetrapirrólicos pero no cíclicos, presentes en algas
rojas y en cianobacterias e incluyen a la ficocianina
(azul) y a la ficoeritrina (roja).

Espectro de acción de la fotosíntesis

El espectrofotómetro es un instrumento para
medir la cantidad de luz que puede absorber una
sustancia, por lo que da idea de la capacidad de los
distintos pigmentos para absorber radiaciones
luminosas de diferentes longitudes de onda. Sin
embargo, un espectro de absorción no indica cuáles
son las longitudes de onda más efectivas para la
fotosíntesis. La efectividad relativa de las diferentes
longitudes de onda en la fotosíntesis está dada por el
espectro de acción de la fotosíntesis, que fue
determinado en un experimento biológico clásico
llevado a cabo en 1833 por el biólogo alemán T.W.
Engelmann, aprovechando la forma del cloroplasto en
la Spirogyra, un alga que se encuentra en forma de
filamentos delgados en estanques de agua fresca.
Cada una de las células de Spirogyra contiene un cloroplasto verde esmeralda en forma de espiral
embebido en el citoplasma. Engelmann supuso que si dichos cloroplastos se expusieran a un espectro
luminoso producido por un prisma, la
fotosíntesis se llevaría a cabo con mayor
rapidez en aquellos puntos en los que el
cloroplasto fuera iluminado por los colores
que la clorofila absorbe más rápidamente, si
la clorofila fuese responsable de la
fotosíntesis.
¿Cómo medir la fotosíntesis en
aquellos días de tecnología tan elemental?
Engelmann sabía que durante la fotosíntesis
se producía oxígeno, y que algunas
bacterias tenían especial atracción por
áreas de alta concentración de oxígeno. Por
tanto, determinó el espectro de acción
observando hacia cuáles células de
Spirogyra nadaban estas bacterias y
encontró que se dirigían a las localizadas en las regiones azul y roja del espectro. El hecho de que las
bacterias no se dirigiesen hacia esas zonas en ausencia de la Spirogyra, demostró que dichas bacterias
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no eran atraídas simplemente por la luz roja o azul, sino por la presencia del oxígeno liberado durante la
fotosíntesis.
Sin embargo, el espectro de acción de la fotosíntesis difiere un poco del espectro de absorción de
la clorofila pura. Esto se explica por dos razones: primero, los cloroplastos contienen pigmentos accesorios
como carotenoides y ficobilinas (pigmentos accesorios de algas rojas y de cianobacterias) en cantidades
importantes y, por tanto, absorben la luz verde que la clorofila reflejaría; en segundo término, y más
específicamente, estos pigmentos accesorios transfieren por resonancia su energía de excitación
provocada por la luz verde a las moléculas de clorofila.
La presencia de estos pigmentos permite a las algas utilizar con mayor eficacia la luz verde del
espectro, en comparación, por ejemplo, con los crisantemos. Esto constituye un importante mecanismo de
adaptación, ya que permite que las algas vivan en hábitats acuáticos profundos, en donde la luz roja tan
efectiva para la fotosíntesis ha sido absorbida durante el paso de la luz a través del agua.

La clorofila canaliza la energía absorbida a centros de reacción fotoquímicos

Los pigmentos de las membranas tilacoidales que absorben luz están ordenados en conjuntos o
dispositivos funcionales denominados fotosistemas. En los cloroplastos de espinaca cada fotosistema
contiene unas 200 moléculas de clorofilas y unas 50 de carotenoides. Todas las moléculas de pigmentos
pueden absorber fotones, pero sólo unas pocas pueden transducir la energía luminosa a energía química.
Un pigmento transductor consiste en varias moléculas de clorofila combinadas con un complejo proteico
que también contiene quinonas fuertemente unidas; este complejo se denomina centro de reacción
fotoquímico. Las otras moléculas del fotosistema se denominan moléculas recolectoras de luz o antenas.
Su función es absorber energía lumínica y transmitirla a velocidad muy elevada al centro de reacción en
donde tienen lugar las reacciones fotoquímicas que se describirán más adelante.
Las moléculas de clorofila en las membranas tilacoidales están ligadas a proteínas integrales de
membrana (fijadoras de clorofila a o b, o proteínas CAB 3) que orientan a la clorofila con respecto al plano
de la membrana y le confieren propiedades para la absorción de la luz ligeramente diferentes de las de la
clorofila libre. Cuando una molécula de clorofila (o un pigmento accesorio) absorbe un fotón se excita y
en lugar de emitir fluorescencia transfiere la energía por resonancia a una molécula de clorofila vecina y
retorna a su estado basal. El proceso se repite varias veces hasta que se excita la clorofila del centro de
reacción, donde se promueve el pasaje de un electrón a un orbital de energía superior, de donde
finalmente es cedido a un aceptor electrónico vecino que forma parte de la cadena de transportadores de
electrones y que darán como resultado final la generación de ATP y de NADPH.
Las membranas tilacoides tienen dos tipos de fotosistemas, cada uno de ellos con su centro de
reacción y su conjunto de moléculas antena. Los dos fotosistemas tienen funciones distintas y
complementarias. El fotosistema I tiene un centro de reacción denominado P700 y una elevada proporción
de clorofila a en relación con la clorofila b. El fotosistema II, con su centro de reacción P680, contiene
cantidades aproximadamente iguales de ambas clorofilas y puede tener también clorofila c. Todas las
plantas superiores, algas y cianobacterias tienen ambos fotosistemas, pero las bacterias fotosintéticas,
que no desprenden oxígeno, sólo tienen el fotosistema I, ya que no utilizan el agua como dador de átomos
de hidrógeno sino al sulfuro de hidrógeno (SH 2) o directamente al hidrógeno molecular.

La absorción de luz por el fotosistema II inicia el proceso

Cuando la energía de excitación llega al centro de reacción del fotosistema II, se genera una
molécula de potencial de reducción muy negativo, el P680*, que finalmente cede su electrón a una serie
de quinonas (plastoquinona y otras), que son capaces de tomar protones del medio. Para poder continuar
con el proceso, el P680 debe adquirir un electrón para volver a su estado basal. Ese electrón podría
provenir de un gran número de compuestos orgánicos o inorgánicos, pero el gran salto evolutivo lo dieron
los antecesores de las cianobacterias, que adaptaron el fotosistema II para aprovechar los electrones de
agua, el producto más abundante que existía. Para ello crearon un complejo de escisión del agua , que
contiene cuatro iones manganeso. La absorción secuencial de cuatro fotones, cada uno de los cuales
produce la pérdida de un electrón del centro de Mn, produce un agente oxidante que está en condiciones
3
CAB = chlorophyll a/b binding proteins
BIOLOGÍA / Módulo 10 / Cloroplastos y Fotosíntesis 8

de tomar cuatro electrones del agua, generando cuatro protones y una molécula de oxígeno, proceso
denominado fotólisis del agua (ruptura de la molécula de agua por efecto de la luz).

2 H20 4 H+ + 4 e + O2

La absorción de luz por el fotosistema I crea un poderoso agente reductor

Los procesos fotoquímicos que ocurren en el fotosistema I son similares a los que se han indicado
para el fotosistema II. La captura de un fotón por una de las moléculas antena y su traslado hasta el P700
origina una molécula excitada (P700*) que transfiere su electrón a una serie de aceptores entre quienes se
encuentran una proteína hierro-sulfurada (Fe-S), la ferredoxina (Fd) y finalmente la ferredoxina-
NADP+oxidorreductasa, que transfiere los electrones al NADP + para formar NADPH. Como consecuencia
de la cesión de un electrón, la molécula de P700 ha quedado con déficit electrónico (P700 +), el que es
satisfecho porque una proteína soluble que contiene cobre y que pertenece al fotosistema II
(plastocianina) le cede sus electrones.

El complejo de los citocromos une los fotosistemas II y I

Los electrones almacenados en las quinonas del fotosistema II se transportan al P700 del
fotosistema I a través del complejo de los citocromos y de la plastocianina. El complejo de los citocromos
es muy similar al complejo III de la cadena respiratoria: recibe electrones de una quinona y se los cede a
una proteína soluble (la plastocianina, en el cloroplasto, en lugar del citocromo c de las mitocondrias). Al
igual que en la mitocondria, también se bombean protones, pero en este caso desde el estroma hacia el
interior del espacio tilacoidal. Dado que este espacio es pequeño, la entrada de un número reducido de
protones tiene un efecto pronunciado, que alcanza a 3 unidades de pH (pH 8 el estroma, pH 5 el espacio
tilacoidal), con lo que la concentración de protones interna es 3000 veces superior a la del estroma,
generando una importante fuerza motriz para la síntesis de ATP.
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Acoplamiento de la síntesis de ATP al flujo de electrones impulsado por la luz

En 1954 Arnon descubrió que si se añadían ADP y fosfato inorgánico a la reacción de Hill, se
generaba ATP, proceso al que se denominó fosforilación fotosintética, o simplemente fotofosforilación,
para distinguirla de la fosforilación oxidativa que se produce durante la respiración mitocondrial. A
diferencia de lo que ocurre con respiración mitocondrial, no está bien establecida la estequiometría del
proceso, pero se estima que por cada par de electrones transportados se forman una o dos moléculas de
ATP.
La enzima responsable de la síntesis de ATP en los cloroplastos es un complejo muy similar al
que opera en las mitocondrias: una proteína transmembrana homóloga a la mitocondrial que permite el
pasaje de protones y un complejo de proteína periférica también homóloga a la de las mitocondrias,
ubicada hacia el espacio estromático, que permite la síntesis de ATP a expensas de ADP + Pi, con lo que
tanto la orientación de la ATP sintasa como el sentido de paso de los protones son opuestos a los de las
mitocondrias.

Síntesis fotosintética de glúcidos

Las plantas verdes contienen en sus cloroplastos una maquinaria enzimática única para catalizar
la conversión del CO2 en compuestos orgánicos sencillos (reducidos), proceso que se denomina fijación
del CO2 o fijación del carbono. Las reacciones que dan lugar a la fijación y reducción del dióxido de
carbono forman parte de una ruta cíclica elucidada a principios de la década del ‘50 por Melvin Calvin y a
menudo se la denomina ciclo de Calvin 4.
La fijación del CO2 tiene lugar en tres fases:

1. Fijación del CO2 en una unión orgánica, lograda a través de la condensación de seis moléculas de
dióxido de carbono con otras tantas de una pentosa, la ribulosa-difosfato, formando seis moléculas de
un intermediario inestable que se descompone en 12 moléculas de 3-fosfoglicerato

2. Reducción del 3-fosfoglicerato a gliceraldehído-3-fosfato. El poder reductor (NADPH) generado en las

reacciones luminosas se utiliza para reducir las 12 moléculas de 3-fosfoglicerato a gliceraldehído-3-
fosfato. De ellas, dos moléculas se utilizan en la síntesis de una molécula de glucosa-fosfato que se
utilizará luego en la síntesis de almidón.

4
Melvin Calvin (1918-1997) recibió el Premio Nobel en 1961 por su aporte al conocimiento de la fotosíntesis de hidratos de
carbono
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3. Regeneración de la pentosa difosfatada. Diez de las doce moléculas de gliceraldehído-3-fosfato se

utilizan para la regeneración de las 6 moléculas de ribulosa-difosfato. De este modo el proceso cíclico
permite la conversión continua de CO 2 en triosas y hexosas fosfato.

Fase 1. Fijación del CO2 y conversión en 3-fosfoglicerato.

La enzima que cataliza la incorporación del CO 2 en forma orgánica es la ribulosa-1,5-bisfosfato
carboxilasa oxidasa (rubisco). Está constituida por ocho subunidades grandes (56 kDa c/u) y ocho
subunidades pequeñas (14 kDa c/u), lo que hace un total de 560 kDa. Está localizada en el estroma del
cloroplasto, donde constituye alrededor del 50% de la proteína total del cloroplasto. Es la enzima más
abundante de la biosfera. La enzima cataliza la incorporación del CO 2 a la ribulosa-1,5-bisfostato y la
rotura del intermedio inestable de seis carbonos que se forma, generando dos moléculas de 3-
fosfoglicerato.

Fase 2. Conversión de 3-fosfoglicerato en gliceraldehído-3-fosfato

Ocurre en dos pasos que básicamente significa el proceso inverso de la glucólisis. La diferencia
estriba en que el cofactor necesario para la reducción es el NADPH y no el NADH. En el primer paso el 3-
fosfoglicerato es convertido a 1,3-bisfosfoglicerato por la quinasa correspondiente a expensas del ATP; en
el segundo la deshidrogenasa que requiere NADPH reduce al 1,3-bisfosfoglicerato a gliceraldehido-3-
fosfato con producción de fosfato inorgánico. El destino del fosfoglicerato es variado: a) la mayor parte de
él se recicla para regenerar la pentosa fosfato que da inicio al proceso, b) puede convertirse en hexosa
fosfato y dar lugar a la síntesis de almidón, que se conserva en el cloroplasto y c) puede abandonar el
cloroplasto y dar lugar a la formación de sacarosa o degradarse mediante la vía glicolítica con producción
de energía.
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Fase 3. Regeneración de la ribulosa-1,5-bisfosfato a partir de triosas fosfato

Dado que la primera reacción de fijación del carbono consiste en la unión del dióxido de carbono a
una pentosa difosfatada (la ribulosa-difosfato), se debe regenerar ésta constantemente para que el flujo de
CO2 a glúcidos sea continuo. Para ello se forman intermedios de 3, 4, 5, 6 y 7 carbonos en un proceso que
convierte triosas (10 moléculas de gliceraldehído fosfato) en pentosas (6 moléculas de ribulosa 1,5-
difosfato). Las 10 moléculas de gliceraldehído fosfato recorren el siguiente camino, hasta llegar a
regenerar las 6 moléculas de ribulosa-difosfato:
a) 4 gliceraldehído fosfato (C3) 2 fructosa-fosfato (C6)
b) 2 gliceraldehído fosfato (C3) + 2 fructosa-fosfato (C6) 2 eritrosa-fosfato (C4) y 2 xilulosa-fosfato (C5)
c) 2 gliceraldehído fosfato (C3) + 2 eritrosa-fosfato (C4) 2 sedoheptulosa-fosfato (C7)
d) 2 gliceraldehído fosfato (C3) + 2 sedoheptulosa-fosfato (C7) 2 xilulosa-fosfato (C5)+ 2 ribosa-fosfato (C5)
De este modo se utilizaron las 10 moléculas de gliceraldehído-fosfato para generar las 6
moléculas de pentosa requeridas (las 4 xilusosas fosfato y las 2 ribosas fosfato son llevadas a 6 ribulosa
fosfato por isomerasas específicas)

Cada glucosa fosfato sintetizada a partir de CO 2 y H2O cuesta 12 NADPH y 18 ATP

El resultado neto del ciclo de Calvin es la conversión de seis moléculas de dióxido de carbono y
una de fosfato en una de glucosa-6-fosfato. Para ello será necesario que se condensen 6 de ribulosa-1,5-
difosfato con otras tantas de CO 2 para dar un intermedio inestable (18 carbonos) que se descompone
dando lugar a 12 moléculas de 3-fosfoglicerato. Estas 12 moléculas de 3-fosfoglicerato se reducen a 12
moléculas de 1,3-difosfoglicerato con el consumo de 12 ATP y luego se utilizan 12 NADPH para obtener
finalmente 12 moléculas de gliceraldehído-3-fosfato.
Dos de las doce moléculas de gliceraldehído-3-fosfato son el resultado neto del proceso; las otras
diez se reordenan para formar 6 moléculas de ribulosa-5-fosfato. Falta ahora regenerar las seis moléculas
iniciales, por lo que se consumen 6 ATP adicionales para pasar la ribulosa-5-fosfato a ribulosa-1,5-
difosfato. La fuente de ATP y NADPH son las reacciones luminosas ocurridas en el tilacoide.
En la oscuridad cesa la producción de ATP y NADPH, por lo que también cesa la fijación del CO 2
(de allí el error de denominar “reacciones oscuras” a las reacciones de fijación del CO 2). La glucosa-6-
fosfato producida es convertida por la fosfoglucomutasa en glucosa-1-fosfato, material de partida para la
síntesis del almidón por las fosforilasas.

Fotorrespiración
La rubisco no es específica para el CO 2, ya
que el O2 compite con éste por el sitio activo de la
enzima. Aparentemente la evolución de la rubisco
produjo un sitio activo incapaz de discriminar bien
entre ambos sustratos, quizás debido a que gran
parte de la evolución tuvo lugar antes de que el
oxígeno fuese un componente importante de la
atmósfera. El problema es que la condensación de
la ribulosa--difosfato con el oxígeno no permite la
fijación de carbono, sino que se forma un
intermediario inestable oxigenado que se
descompone en una molécula de 3-fosfoglicerato y
otra de fosfoglicolato (de dos carbonos).
A través de un proceso en el que
intervienen tres organelos (el cloroplasto, el
peroxisoma y la mitocondria, dos moléculas de
glicolato (en total 4 carbonos) son reconvertidas en
3-fosfoglicerato y dióxido de carbono. En el proceso
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total se consume oxígeno en los tres compartimientos subcelulares (cloroplasto, peroxisoma y

mitocondria) y se produce dióxido de carbono, como en la respiración (de ahí el nombre de
fotorrespiración), pero el proceso es energéticamente menos favorable.
Si bien la fijación del CO 2 es predominante en relación a la fijación del O 2 (alrededor de tres
veces), la fotorrespiración es un derroche de energía y puede llegar a inhibir la producción de biomasa
hasta en un 50%. Esto ha llevado a que muchas plantas, especialmente de climas cálidos, hayan
desarrollado adaptaciones como las que se indican a continuación.

Algunas plantas tienen un mecanismo que impide la fotorrespiración. Plantas C 3 y C4

Se dice que la mayor parte de las plantas son plantas C 3, porque el principal producto de la fijación
del dióxido de carbono es un compuesto de tres carbonos, el 3-fosfoglicerato. Algunas plantas, llamadas
plantas C4, son capaces de fijar dióxido de carbono muy eficientemente mediante la formación intermedia
de un compuesto de cuatro carbonos, el oxaloacetato. De todos modos estas plantas utilizan el ciclo de
Calvin para producir carbohidratos, pero primero incorporan el dióxido de carbono en el oxaloacetato.
Las plantas C4, que típicamente crecen en condiciones de altas intensidades luminosas y
temperatura, tienen alta velocidad fotosintética, alta velocidad de crecimiento, baja o nula velocidad de
fotorrespiración y baja velocidad de pérdida de agua. De hecho, una de las principales diferencias entre
las plantas C3 y C4 es que estas últimas no se saturan, ni siquiera en presencia de las intensidades de luz
más elevadas de la naturaleza. Para ello han modificado su estructura anatómica, en la que el mesófilo
(tejido fotosintético) adopta una disposición “en corona” (de allí el nombre de estructura Kranz, “corona”,
en alemán) que rodea a las células de la vaina del haz, que a diferencia de lo que ocurre en las plantas C 3
son muy ricas en cloroplastos. El ciclo de Calvin se realiza en las células de estas vainas y las reacciones
de la vía C4 se llevan a cabo en las células del
mesófilo, dando un claro significado funcional a la
diferencia anatómica antes mencionada.
La característica esencial de la ruta C 4 es
que concentra el dióxido de carbono en la célula.
El dióxido de carbono entra en la hoja a través de
pequeños poros llamados estomas, los cuales se
abren y cierran en respuesta a factores como el
contenido de agua y la intensidad de la luz.
Cuando los estomas se cierran, el
abastecimiento de dióxido de carbono disminuye
y en las plantas C3 la fotosíntesis disminuye de
modo considerable. Las reacciones de la vía C 4
incrementan la fijación de dióxido de carbono, de
manera que aún en circunstancias adversas, la
fotosíntesis, y por ende el crecimiento de la
planta, se lleva a cabo con gran eficiencia. Entre
las plantas agresivas y de crecimiento rápido que
utilizan la vía C4 se encuentran la caña de
azúcar, el maíz, el sorgo y la gramilla. El
rendimiento de los cultivos de plantas C 4 es dos o
tres veces más alto que el de plantas C 3. Si este
mecanismo pudiera incorporarse por medios
genéticos a otras especies vegetales, se podría
incrementar de modo importante la producción de
alimento en algunas regiones del mundo.
El cometido del ciclo C4 es simplemente
incrementar la concentración de dióxido de carbono dentro de las células de la vaina, de modo que el ciclo
C3 se verifique ahí. La operación del ciclo C 4 sirve para incrementar la concentración de dióxido de
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carbono dentro de las células de la vaina vascular unas 10 a 60 veces en comparación con la de las
células de las plantas que sólo tienen la vía C 3.
BIBLIOGRAFIA

ALBERTS, B., D. BRAY, A. JOHNSON, J. LEWIS, M. RAFF, K. ROBERTS Y P. WALTER (1998)

“Essential Cell Biology. An Introduction to the Molecular Biology of the Cell”. Garland Publishing, Inc.,
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edición (traducido de la segunda edición inglesa. 1993).

LODISH, H., A. BERK, S.L. ZIPURSKY, P. MATSUDAIRA, D. BALTIMORE & J. DARNELL. Biología Celular y
Molecular, Editorial Médica Panamericana, 2002.

PURVES, K.W., D. SADAVA, G.H. ORIANS & H.C. HELLER (2003) “Vida. La Ciencia de la Biología”, 6ª. Edición.
Editorial Médica Panameicana (traducido de la 6ª edición inglesa, 2001).

COOPER, G.M. (2002). La Célula. 2ª edición. Marbán Libros, S.L., España. (traducido de la 2ª edición
inglesa, 2000).

CUESTIONARIO
1. Las cianobacterias son procariotes y, en consecuencia, carecen de cloroplastos. ¿cómo es posible
que se los considere organismos fotosintéticos?
2. ¿El ADN que se encuentra dentro de los cloroplastos es realmente funcional o se trata de un resabio
evolutivo?
3. ¿El hecho de contar con un ADN circular y ribosomas del tipo procariote proporciona algún indicio
sobre el origen de los cloroplastos?
4. Cuando una célula fotosintética se divide ¿los cloroplastos existentes se reparten entre las células
hijas? ¿se reduce el número de cloroplastos en cada división celular?
5. ¿Cuál es la importancia de los pigmentos fotosintéticos? ¿Podría tener lugar la fotosíntesis sin ellos?
6. ¿Qué es lo que se pretende indicar cuando se habla de “espectro de acción de la fotosíntesis”?
7. Engelmann realizó una experiencia iluminando los filamentos del alga filamentosa Spirogyra con las
diferentes radiaciones que componen el espectro visible, en presencia de bacterias aerobias. ¿Cuál
fue el objetivo de la experiencia y cómo interpretó los resultados obtenidos?
8. ¿Qué es lo que demuestra la experiencia de Hill?
9. ¿Cuál es el resultado de las reacciones luminosas y en qué se utilizan los productos obtenidos?
10. ¿Por qué se dice que es incorrecta la denominación “reacciones oscuras” para referirse a las
reacciones de fijación del dióxido de carbono?
11. ¿Qué analogía puede encontrar entre la cadena de transporte electrónico de la cadena respiratoria
mitocondrial y los fotosistemas de los tilacoides cloroplásticos?
12. ¿La fotorrespiración fue simultánea con la fotosíntesis o apareció posteriormente durante el curso de
la evolución? Fundamente su respuesta
13. ¿Cuál es la razón para considerar que las plantas “C4” son más eficientes que las plantas “C3”?
14. ¿Existe alguna relación entre la fotorrespiración y la especificidad de sustrato de la rubisco (ribulosa-
bis- fosfato carboxilasa oxidasa, enzima responsable de la fijación del dióxido de carbono)?
15. ¿Existe alguna relación entre la estructura de las hojas de las plantas “C4” y el tipo de fotosíntesis que
realizan?
16. ¿Qué ocurre cuando se expone a la luz una suspensión de cloroplastos activos en presencia de
diclorofenolindofenol (DPIP)? ¿Qué ocurre si en el mismo tubo se ha adicionado un inhibidor de la
reacción de Hill?
17. ¿Qué tipo de pigmentos se extrajeron en el trabajo práctico y mediante qué técnica se logra
separarlos?
18. ¿Qué sustancias acumulan los amiloplastos?
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Módulo 10. TRABAJO EXPERIMENTAL

OBJETIVOS GENERALES

Que el alumno:
 Verifique la existencia de reacciones fotodependientes (luminosas) en los cloroplastos.
 Observe la morfología de cloroplastos y amiloplastos en células vegetales.
 Efectúe la extracción y separación de pigmentos fotosintéticos de hojas.

I. OBSERVACIONES MICROSCOPICAS

OBJETIVO
Las observaciones indicadas tienen como objetivo poder constatar diferencias en la morfología y
distribución de los plástidos según el material que se analice.

1. Cloroplastos en forma de cinta en el alga verde filamentosa Spirogyra

2. Cloroplastos en células del mesófilo adheridas a la epidermis foliar, observados en desgarrado de hojas
de hiedra.
3. Cloroplastos en corte transversal de hoja de pera.
3. Amiloplastos de tubérculos de papa observados con y sin agregado de solución diluida de Lugol.

II. FOTOSINTESIS. REACCION DE HILL

OBJETIVO
El objetivo de la experiencia es comprobar la generación de poder reductor durante la etapa
lumínica de la fotosíntesis. Como aceptor final de los electrones de la fotólisis del agua se empleará un
oxidante artificial (2,6-diclorofenolindofenol, DPIP). Se evaluará el efecto de diferentes factores (oscuridad,
inhibidor de la fotosíntesis y calor) sobre la reacción.

FUNDAMENTO
Se conoce como reacción de Hill a la reacción fotoquímica en la que los electrones provenientes
de la fotólisis del agua producen la reducción de un oxidante natural (NADP +) o artificial (2,6-
diclorofenolindofenol, sales férricas, etc.).
En el trabajo práctico se pondrá de manifiesto la reacción de Hill que tiene lugar en los
cloroplastos. Para ello se utilizará DPIP como oxidante artificial, el que en su forma oxidada es azul y en
su forma reducida es incolora. Podrá observarse además la formación de burbujas como consecuencia del
oxígeno liberado en la reacción.
luz, cloroplastos
2 DPIP + 2H2O 2 DPIPH2 + O2

METODOLOGÍA DEL ENSAYO

Aislamiento de cloroplastos:
 Utilizar 8 hojas medianas de espinaca (deben estar bien verdes y turgentes), eliminar los pecíolos y
la nervadura central y cortarlas en pequeños trozos. Este procedimiento, así como todos los demás
pasos en los que se utilice la suspensión de cloroplastos, deben realizarse en baño de hielo y con
soluciones frías para conservar la estructura de los organoides de interés.
 En un mortero colocado en baño de hielo poner las hojas cortadas junto con una cucharadita de
arena (previamente lavada) y 50 ml de solución fría de sacarosa 0,5 M. Triturar durante 2 a 3
minutos hasta lograr un extractivo de color verde oscuro.
 Filtrar el triturado a través de gasa para eliminar restos vegetales groseros.
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 Centrifugar el filtrado en 4 tubos durante 5 minutos a 2000 rpm para eliminar el material celulósico.
La mayor parte de los cloroplastos quedarán en suspensión en el sobrenadante.
 Colectar los sobrenadantes y centrifugarlos durante 10 minutos a 3000 rpm. Descartar los
sobrenadantes y resuspender suavemente los sedimentos que contienen los cloroplastos en 3 ml de
buffer fosfatos 0,1 M de pH 7 frío, usando una pipeta Pasteur. Reunir las suspensiones de
cloroplastos en un único tubo (suspensión A) mantenido en frío hasta el momento de usar.

Experiencias a realizar:
a) Colocar una gota de la suspensión A entre porta y cubreobjetos y observar al microscopio.
b) Tomar 3 ml de suspensión A y calentar hasta ebullición durante 2 minutos (suspensión B)
c) Rotular cinco tubos (números 1 a 5), para ser utilizados de acuerdo al protocolo siguiente:

Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 (*) Tubo 4 Tubo 5

Buffer fosfatos 0,1 M de pH 7 7ml 7ml 7ml 7ml 7ml
Inhibidor - - - + -
Suspensión A 1ml - 1ml 1ml 1ml
Suspensión B - 1ml - - -
DPIP 6 gotas 6 gotas 6 gotas 6 gotas -
Luz + + - + +

(*) El Tubo 3 debe estar recubierto con papel de aluminio antes de colocar los reactivos

d) Colocar cada uno de los reactivos en el orden listado, manteniendo los tubos en baño de hielo.
e) Mezclar bien el contenido de los tubos por inversión de los mismos 2 veces. Para tapar se
puede emplear un trocito de polietileno.
f) Para exponer los tubos a la luz colocar la gradilla frente a una lámpara de 75 w durante 10
minutos.
g) Observar si se produjeron cambios de coloración.

III. EXTRACCION DE PIGMENTOS FOLIARES

OBJETIVO
Se trata de extraer, separar cromatográficamente y diferenciar distintos pigmentos fotosintéticos
liposolubles presentes en células vegetales.

FUNDAMENTO
La acetona permite la extracción de la totalidad de los pigmentos vegetales, tanto hidrosolubles
como liposolubles. El agregado de hexano y luego agua al extractivo nos permite separar por partición los
pigmentos liposolubles en la capa superior de hexano. Por cromatografía de adsorción en capa fina se
logra la separación de las clorofilas (a y b) y los distintos tipos de pigmentos carotenoides (carotenos y
xantofilas), dado que cada una de estas sustancias presenta diferente polaridad.

METODOLOGÍA DEL ENSAYO

a) Extracción de pigmentos liposolubles

 Colocar en un mortero 20 ml de acetona. Cortar en tiras finas una hoja mediana de espinaca,
colocando las tiras en acetona a medida que son cortadas.
 Incorporar al mortero una cucharadita de arena lavada. Triturar y macerar con ayuda del pilón el
material vegetal durante 5 minutos, reponiendo la acetona en caso en que se evapore en exceso.
 Filtrar por papel el extracto resultante a un tubo de ensayo grande o probeta.
 Agregar al extractivo acetónico obtenido 1 ml de hexano y mezclar bien.
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 Adicionar 40 ml de agua a la mezcla hexano-acetona, mezclar con suavidad para no emulsionar y

dejar separar las dos fases que se han formado.
 Empleando una pipeta Pasteur con tetina separar la fase superior, la que se recibe en un tubo de
Kahn, que constituye la muestra para las cromatografías. Esta muestra debe estar totalmente
exenta de agua (no opalescente).

b) Cromatografía en capa fina

Solventes
hexano
hexano-acetona (80:20)
acetona

Siembra y desarrollo de la cromatografía

 Colocar 2 ml de solvente de desarrollo en el frasco tipo Borrel que servirá de pequeña cuba
cromatográfica.
 Colocar 3 gotas del extractivo en el punto de siembra, el que estará situado cerca del borde inferior
de la placa, pero a una altura tal que no quede sumergido al introducirlo en la cuba. El solvente
debe evaporarse luego del agregado de cada gota.
 Introducir la placa sembrada dentro de la cuba cromatográfica, taparla y dejar ascender el solvente
hasta que el frente del mismo esté a 0,3 cm del borde superior.
 Comparar los cromatogramas obtenidos con los distintos solventes de desarrollo a los efectos de
seleccionar el que permita obtener una mejor resolución
 Analizar los resultados obtenidos.

Nota: las placas deben activarse en estufa durante 1 hora a 110 oC y luego mantenerse en desecador
antes de ser utilizadas.