Valor D - Esporas de Bacillus Cereus

Universidad Miguel Hernández
Escuela Politécnica Superior de Orihuela
Tesis Doctoral
AISLAMIENTO, CARACTERIZACIÓN,
SUPERVIVENCIA Y CONTROL QUÍMICO DE
BACILLUS CEREUS
Luis Alberto Hernández Herrero

2014
AISLAMIENTO, CARACTERIZACIÓN, SUPERVIVENCIA Y CONTROL
QUÍMICO DE BACILLUS CEREUS
Tesis doctoral realizada por D. Luis Alberto Hernández Herrero, Ingeniero
Agrónomo, en el Departamento de Tecnología Agroalimentaria de la Universidad
Miguel Hernández de Elche, para la obtención del grado de Doctor.
D. Luis Alberto Hernández Herrero.
Orihuela, _____ de ______________ de _______.

D. MANUEL VALERO ROCHE, Profesor Titular de Universidad del Departamento
de Producción Vegetal y Microbiología de la Universidad Miguel Hernández de
Elche
HACE CONSTAR:
Que el presente trabajo ha sido realizado bajo mi dirección, y recoge la
labor realizada por el Ingeniero Agrónomo D. Luis Alberto Hernández Herrero
para optar al grado de Doctor.
Dr. Manuel Valero Roche.
Orihuela, _____ de ______________ de _______.

D. JOSÉ RAMÓN DÍAZ SÁNCHEZ, Dr. Ingeniero Agrónomo, Catedrático de
Escuela Universitaria y Director del Departamento de Tecnología Agroalimentaria
de la Universidad Miguel Hernández de Elche
Certifica:
Que da su conformidad a la lectura de la Tesis Doctoral presentada por D.
Luis Alberto Hernández Herrero, titulada “Aislamiento, caracterización,
supervivencia y control químico de Bacillus cereus” que se ha desarrollado dentro
del programa de doctorado de “Tecnología Agroalimentaria” de este
departamento, bajo la dirección del Dr. Manuel Valero Roche, la cual considera
conforme en cuanto a forma y contenido para que sea presentada para su
correspondiente exposición pública.
Y para que así conste a los efectos oportunos firmo el presente certificado
en Orihuela a______ de ______________ de _______.
Dr. José Ramón Díaz Sánchez.

AGRADECIMIENTOS
En primer lugar quisiera agradecer a mi director de tesis, Manuel Valero
Roche, su dedicación, enseñanzas y apoyo técnico, pues han sido fundamentales
para la elaboración de este trabajo.
También quisiera agradecer a D. Manuel Javier Giner Pastor, técnico de
laboratorio del Departamento, su siempre amable colaboración.
Por último, agradecer a los conserjes y guardias jurados su paciencia y
trato por la necesidad de entrar al laboratorio a deshoras y días festivos.

A mi familia
PRÓLOGO
La presente Tesis Doctoral se ha elaborado siguiendo la normativa de la
Universidad Miguel Hernández de Elche para la “Presentación de Tesis
Doctorales como un conjunto de publicaciones”, y se ha dividido en los siguientes
apartados:
 Resumen.
 Introducción.
 Objetivos.
 Publicaciones, este apartado consta de tres artículos publicados:
Valero, M., Hernández-Herrero, L. A., Fernández, P. S., Salmerón, M. C.

2002. Characterization of Bacillus cereus isolates from fresh vegetables
and refrigerated minimally processed foods by biochemical and
physiological tests. Food Microbiology. 19: 491-499.
Valero, M., Hernández-Herrero, L. A., Giner, M. J. 2007. Survival,

isolation and characterization of a psychrotrophic Bacillus cereus strain
from a mayonnaise-based ready-to-eat vegetable salad. Food Microbiology.
24: 671-677.
Hernández-Herrero, L. A., Giner, M. J., Valero, M. 2008. Effective

cheminal control of psychrotrophic Bacillus cereus EPSO-35AS and INRA
TZ415 spore outgrowth in carrot broth. Food Microbiology. 25: 714-721.
 Resumen de Resultados, Discusión y Conclusiones de las tres
publicaciones.
 Bibliografía, en la que se reseñan todas las referencias que aparecen
citadas en el texto, aunque también lo estén en las publicaciones.
Este documento no incluye el apartado “Materiales y Métodos”, puesto que
éstos se encuentran descritos en las diferentes publicaciones.

ÍNDICE
RESUMEN 14
1.- INTRODUCCIÓN 17
1.1.- Características principales de Bacillus cereus. 20
1.2.- Características de crecimiento. 21
1.3.- Reservorios y contaminación. 22
1.4.- La espora bacteriana. 23
1.5.- Termorresistencia bacteriana y métodos para su determinación. 25
1.5.1.- Método de los tubos TDT (tiempo de destrucción térmica) 26
1.5.2.- Método de los tubos TDT abiertos. 27
1.5.3.- Método de los tubos capilares. 27
1.6.- Aislamiento, cuantificación y caracterización. 28
1.7.- Patogenicidad. 29
1.7.1.- Toxina diarreica. 30
1.7.2.- Toxina emética. 31
1.8.- Mecanismos de control. 34
1.8.1.- La esterilización térmica. 34
1.8.2.- La refrigeración. 34
1.8.3.- Efecto del pH. 35
1.8.4.- Los antimicrobianos. 36
1.9.- Evaluación de la cinética de crecimiento de Bacillus cereus. 37
1.10.- Contextualización. 38
2.- OBJETIVOS 41
3.- PUBLICACIONES 43
3.1.- Valero, M., Hernández-Herrero, L. A., Fernández, P. S., 43
Salmerón, M. C. 2002. Characterization of Bacillus cereus
isolates from fresh vegetables and refrigerated minimally
processed foods by biochemical and physiological tests. Food
Microbiology, 19: 491-499.
3.2.- Valero, M., Hernández-Herrero, L. A., Giner, M. J. 2007. 53
Survival, isolation and characterization of a psychrotrophic
Bacillus cereus strain from a mayonnaise-based ready-to-eat
vegetable salad. Food Microbiology, 24: 671-677.
3.3.- Hernández-Herrero, L. A., Giner, M. J., Valero, M. 2008. 61
Effective chemical control of psychrotrophic Bacillus cereus
EPSO-35AS and INRA TZ415 spore outgrowth in carrot broth.
Food Microbiology, 25: 714-721.
4.- RESULTADOS y DISCUSIÓN 71
4.1.- Aislamiento y caracterización de Bacillus cereus. 71
4.2.- Supervivencia de la cepa psicrótrofa de B. cereus EPSO-35AS. 76
4.3.- Control químico del crecimiento de la cepa psicrótrofa de B. 79
cereus EPSO-35AS.
5.- CONCLUSIONES 87
BIBLIOGRAFÍA 89
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Características de los dos tipos de enfermedades alimentarias 33

causadas por Bacillus cereus. Adaptada por Granum (2007). a Clavel et
al., (2004). b Agata et al., (1994); Agata et al., (1995); Shinagawa et al.,
(1995). c Lund et al., (2000). d Mahler et al., (1997); Dierick et al., (2005).
Tabla 2. Conteos de Bacillus cereus aislados de vegetales frescos 71

comúnmente usados como ingredientes de alimentos mínimamente
procesados (RMPFs). Para una misma columna, los valores seguidos de
una misma letra no son significativamente diferentes (P ≤ 0,05). SD:
desviación estándar.
Tabla 3. Conteos de Bacillus cereus en productos vegetales refrigerados 72

mínimamente procesados (RMPFs). a Sopa refrigerada de vegetales
mediterráneos elaborada con vegetales frescos. b Puré refrigerado de
vegetales que contiene pan y huevos. c Crema refrigerada que contiene
pan, almendras y aceite de oliva como principales ingredientes. d Mezcla
de zumos de zanahoria y naranja. SD: desviación estándar.
Tabla 4. Caracterización de B. cereus aislado de vegetales frescos (PE: 74

pimiento, CU: pepino, CA: TO: tomate, ON: cebolla, ZU: calabacín) y
alimentos vegetales mínimamente procesados (RMPFs) (GA: gazpacho,
SA: salmorejo, AB: ajoblanco, AS: ensalada americana) en función de
sus propiedades fisiológicas y bioquímicas. Para una misma columna,
los valores seguidos de una misma letra no son significativamente
diferentes (P ≤ 0,05).
Tabla 5. Cepas de B. cereus aisladas de vegetales frescos, alimentos 76

vegetales mínimamente procesados (RMPFs) y ensalada americana que
fueron capaces de crecer a temperaturas que oscilaron entre los 8 y 42
ºC. a Cepas aisladas de pimiento (PE), tomate (TO), cebolla (ON),
calabacín (ZU), pepino (CU) y zanahoria (CA). b Cepas aisladas de
RMPFs tales como gazpacho (GZ), salmorejo (SA) y ajoblanco (AB).
Tabla 6. Valor D (min) obtenido por las esporas de B. cereus EPSO- 77

35AS suspendidas en agua destilada y calentadas a diferentes
temperaturas. Los datos expresan el valor medio ± la desviación
estándar de tres repeticiones.
Tabla 7. Parámetros de cinética de crecimiento calculados para la 78

germinación de células procedentes de esporas activadas térmicamente
de B. cereus EPSO-35AS incubadas a diferentes temperaturas en caldo
nutritivo (NB) y caldo de tindalizado (TCB). N0, número inicial de
bacterias (UFC mL-1). LT, fase de latencia (h). SGR, ratio de crecimiento
específico (Log10 UFC mL-1 h-1). GT, tiempo de generación (h). MPD,
densidad máxima de población (UFC mL-1). R2, coeficiente de
determinación para la ecuación de Baranyi et al. (1993) para la media de
valores de los datos de crecimiento obtenidos por los dos ensayos.
Tabla 8. Parámetros de crecimiento estimados usando la ecuación de 80
Baranyi et al. (1993) para cultivos de B. cereus EPSO-35AS procedentes
de esporas activadas térmicamente e incubadas en caldo nutritivo (NB) y
caldo de zanahoria tindalizado (TCB) acidificado con ácido cítrico. N0,
número inicial de bacterias (UFC mL-1). LT, fase de latencia (h). SGR,
ratio de crecimiento específico (Log10 UFC mL-1 h-1). GT, tiempo de
generación (h). MPD, densidad máxima de población (UFC mL-1). R2,
coeficiente de determinación para la ecuación de Baranyi et al. (1993)
para la media de valores de los datos de crecimiento obtenidos por los
dos ensayos. NG, no crecimiento durante 60 días.

caldo de zanahoria tindalizado (TCB) acidificado con zumo de limón. N0,
número inicial de bacterias (UFC mL-1). LT, fase de latencia (h). SGR,
ratio de crecimiento específico (Log10 UFC mL-1 h-1). GT, tiempo de
generación (h). MPD, densidad máxima de población (UFC mL-1). R2,
coeficiente de determinación para la ecuación de Baranyi et al. (1993)
para la media de valores de los datos de crecimiento obtenidos por los
dos ensayos. NG, no crecimiento durante 60 días.

caldo de zanahoria tindalizado (TCB) que contenían antimicrobianos
naturales. N0, número inicial de bacterias (UFC mL-1). LT, fase de
latencia (h). SGR, ratio de crecimiento específico (Log10 UFC mL-1 h-1).
GT, tiempo de generación (h). MPD, densidad máxima de población
(UFC mL-1). R2, coeficiente de determinación para la ecuación de
Baranyi et al. (1993) para la media de valores de los datos de
crecimiento obtenidos por los dos ensayos. NG, no crecimiento durante
60 días.

Baranyi et al. (1993) para cultivos de B. cereus INRA TZ415 procedentes
caldo de zanahoria tindalizado (TCB) que contenían antimicrobianos
naturales. N0, número inicial de bacterias (UFC mL-1). LT, fase de
latencia (h). SGR, ratio de crecimiento específico (Log10 UFC mL-1 h-1).
GT, tiempo de generación (h). MPD, densidad máxima de población
(UFC mL-1). R2, coeficiente de determinación para la ecuación de
Baranyi et al. (1993) para la media de valores de los datos de
crecimiento obtenidos por los dos ensayos. NG, no crecimiento durante
60 días.
RESUMEN
Resumen
RESUMEN
La contaminación por Bacillus cereus ha sido evaluada en un total de 97

muestras de pimientos frescos, pepinos, tomates, zanahorias, calabacines, ajos y
cebollas, comúnmente usados como ingredientes para elaborar alimentos
refrigerados mínimamente procesados y productos tales como gazpacho,
salmorejo, ajoblanco, zanaranja y ensalada americana. Los recuentos medios no
excedieron de 104 CFU/g en ningún caso. Todos los vegetales y productos
procesados, excepto el ajo y la zanaranja, presentaron contaminación por este
patógeno.
Un total de 37 presuntas cepas de B. cereus fueron aisladas,

caracterizadas e identificadas por el sistema fenotípico API 50CH/20E y el
programa informático APILAB Plus, combinado con test adicionales de movilidad,
actividad oxidasa y crecimiento anaerobio. Confirmándose como B. cereus 33
cepas (89,2%), 2 (5,4%) como B. licheniformis, y las 2 (5,4%) cepas restantes
fueron identificadas como B. firmus.
De las 33 cepas de B. cereus encontradas, 27 (81,8%) eran capaces de

hidrolizar el almidón y 24 (72,7%) eran productoras de la enterotoxina diarreica en
cultivos de TSB según el test de aglutinación pasiva invertida en látex para la
enterotoxina de B. cereus (BCET-RPLA).
La resistencia térmica a 90 ºC de las esporas de las 33 cepas de B. cereus

osciló entre 1,4 y 21,2 min. Las cepas incapaces de hidrolizar el almidón
mostraron mayor resistencia térmica, con valores D90 superiores a 10,8 min.
Todas las cepas productoras de enterotoxinas fueron capaces de hidrolizar el
almidón.
Ninguna de las cepas fue capaz de crecer a 5 ºC. Sólo la cepa EPSO-35AS
(el 3%) creció a 8 ºC, mientras que 29 cepas (el 87,9%) crecieron a 10 ºC. A las
temperaturas de 12, 30 y 37 ºC crecieron todas las cepas, mientras que a 42 ºC
sólo crecieron 19 cepas (el 57,6%).
14
Resumen
El estudio de la cinética de crecimiento de la cepa EPSO-35AS a 8 ºC

mostró un crecimiento más rápido y una población final más elevada en TCB
(caldo zanahoria tindalizado) que en NB (caldo nutritivo), siendo la fase de
latencia 66 horas más corta.
Los parámetros cinéticos de crecimiento de la cepa psicrótrofa EPSO-

35AS, en NB y en TCB fueron evaluados a diferentes temperaturas (8, 12 y 16 ºC)
en combinación con la acidificación con ácido cítrico o zumo de limón a valores de
pH comprendidos entre 4,7 y 5,5. Bajando el pH desde 7,4 en NB o 6,2 en TCB
hasta 5,2 se inhibe el crecimiento bacteriano en ambos medios testados después
de 60 días a 12 ºC o temperaturas inferiores.
Finalmente, se estudió la actividad antibacteriana de 4 compuestos

naturales (aceite esencial de cinnamon, cinamaldehido, carvacrol y eugenol) en
las cepas de B. cereus EPSO-35AS e INRA TZ415 en ambos medios y el mismo
rango de temperaturas. La adición de aceite esencial de cinnamon o de
cinamaldehido a concentraciones de 5 y 2 µL/100mL respectivamente, causaron
la completa inhibición del crecimiento de ambas cepas psicrótrofas a 12 ºC. Así
pues, la combinación de uno de estos compuestos y la temperatura de
refrigeración, se puede usar para la conservación de los alimentos mínimamente
procesados, en los cuales el principal ingrediente sea la zanahoria. Por el
contrario, el carvacrol y eugenol a concentraciones de 5 y 35 µL/100mL
respectivamente, sólo fueron capaces de prevenir el crecimiento de B. cereus
EPSO-35AS durante el almacenamiento a 8 ºC.
15
1.- INTRODUCCIÓN
Introducción
1.- INTRODUCCIÓN.
El consumo de frutas y hortalizas en la dieta diaria tiene un efecto muy
beneficioso para la salud, no sólo son una excelente fuente de vitaminas,
minerales y fibra, sino que además poseen fotoquímicos que contribuyen a la
salud. Estos componentes que se encuentran en las plantas, aunque no se
consideran nutrientes esenciales, proporcionan una importante protección contra
las toxinas, el cáncer y otros trastornos comunes del organismo. Otro aspecto
importante de las frutas y hortalizas es que generalmente son bajas en calorías, y
por lo tanto se adecuan a la tendencia actual del consumidor por realizar dietas
más equilibradas.
Los hábitos de alimentación humana han cambiado mucho en las dos
últimas décadas. El actual ritmo de vida, con escaso tiempo para preparar
comidas equilibradas, ha provocado la demanda de productos cada vez con
mayor grado de elaboración, dando lugar a distintas clasificaciones o gamas de
acuerdo con el grado de procesamiento:
I Gama: vegetales en estado fresco.
II Gama: vegetales en conserva.
III Gama: vegetales congelados.
IV Gama: vegetales frescos mínimamente procesados (MPF), conservados
bajo cadena de frío, listos para ser consumidos.
V Gama: alimentos cocidos, mantenidos bajo cadena de frío (REPFEDs).
17
Introducción
El propósito de los alimentos mínimanente procesados refrigerados (IV
Gama) es proporcionar al consumidor un producto hortícola muy parecido al
fresco, con una vida útil prolongada y al mismo tiempo garantizar la seguridad de
los mismos, manteniendo una sólida calidad nutritiva y sensorial.
También tienen como ventajas la reducción del espacio durante el
transporte y almacenamiento, el menor tiempo de preparación de las comidas, y
la calidad uniforme y constante de los productos durante todo el año.
Por otro lado, su conservación es crítica debido a los daños físicos
producidos en los tejidos vegetales durante el proceso. Estos daños aceleran el
metabolismo provocando el deterioro de las características sensoriales deseables,
pérdida de nutrientes, así como el desarrollo de microorganismos que llevan a un
rápido decaimiento de la calidad y acortamiento de la vida útil del producto. Este
último efecto se ve aumentado en los alimentos poco ácidos, en los que la vida
útil puede ser inferior a una semana, limitando en gran medida su
comercialización en los mercados (Valero et al., 2000). Además, necesitan una
gran rotación y logística muy especializada y son más caros que el producto a
granel, por lo que requieren consumidores con un poder adquisitivo medio.
Los alimentos mínimamente procesados y refrigerados están
experimentando un fuerte crecimiento en todos los países europeos. El desarrollo
de estos productos puede permitir la diversificación y el fomento de la industria de
productos vegetales procesados, los cuales son muy importantes para la
economía del sureste de España, aportando nuevos productos y desarrollando
18
Introducción
nuevas tecnologías que prolonguen la vida útil del producto, minimizando la
pérdida de calidad sensorial y nutritiva y garantizando la seguridad alimentaria.
No obstante, la presencia de microorganismos esporulados patógenos
capaces de desarrollarse a temperaturas de refrigeración puede limitar el éxito de
estos productos.
Una amplia gama de estos alimentos son sometidos a un tratamiento
térmico moderado (temperaturas inferiores a 100 ºC, normalmente entre 65 y
95ºC), una conservación en refrigeración (a menos de 8 ºC) y bajos niveles de
aditivos. Los alimentos así procesados (V Gama) no se pueden considerar
estériles y pueden presentar una vida útil en torno a los 30 días.
Este moderado tratamiento térmico es suficiente para garantizar la
inactivación de las bacterias en forma vegetativa, pero no de las esporas
bacterianas (Graham et al., 1996).
Cuando estos alimentos se envasan en anaerobiosis, el principal riesgo
consiste en la presencia de Clostridium botulinum, capaz de desarrollarse y
producir la toxina botulínica. Pero si son envasados en una atmósfera aerobia o
en una atmósfera modificada que contenga oxígeno, el principal riesgo es la
presencia de cepas psicrótrofas de Bacillus cereus, que son incluso más
resistentes al calor que algunas cepas de C. botulinum (Harmon y Kautter, 1991).
19
Introducción
1.1.- Características principales de Bacillus cereus.
Debido a la similitud entre las diferentes especies pertenecientes al género
Bacillus se han realizado varias clasificaciones.
La clasificación más tradicional se realizó de acuerdo a sus características
morfológicas, diámetro del bacilo, forma de las esporas, dimensión del esporangio
debido a la espora y apariencia del protoplasma. B. cereus y las especies más
relacionadas con él, se ubican en el Grupo I de esta clasificación (Gordon et al.,
1973).
Actualmente B. cereus y estas especies estrechamente relacionadas se
han clasificado de acuerdo a sus características fenotípicas y genómicas dentro
del Grupo B. cereus, estando integrado este por B. cereus, B.
weihenstephanensis, B. mycoides, B. thuringiensis y B. anthracis (Tourasse et al.,
2006). A su vez, este grupo se ha subdividido de acuerdo con mayores grados de
similitud entre especies apareciendo el subgrupo B. cereus sensu lato, dentro del
cual se ubica B. cereus, B. thuringiensis y B. anthracis (Rasko et al., 2005).
Estas especies muestran un alto grado de similitud en sus propiedades
fenotípicas y su ADN dificultando su identificación bioquímica (Martínez et al.,
2011).
B. cereus se caracteriza por ser un bacilo voluminoso de 1-1,2 µm de largo
y un diámetro que puede sobrepasar las 0,9 µm, formador de esporas elipsoidales
20
Introducción
centrales o pericentrales, que raramente deforman el esporangio y
termorresistentes. Es Gram positivo, catalasa positivo, oxidasa negativo,
anaerobio facultativo, aunque requiere oxígeno para la producción de la toxina
emética, y normalmente móvil, por flagelos peritricos, aunque existen variantes
inmóviles (Pascual, 1992; Mcelroy et al., 2000; Gordon et al., 1973).
1.2.- Características de crecimiento.
Su temperatura óptima de crecimiento se encuentra entre 30 y 37 ºC. Su
temperatura mínima de crecimiento se encuentra entorno a 5 ºC y su máxima a 55
ºC (Bourgeois et al., 1991).
El abanico para la producción de toxinas esta entre 15 y 40 ºC, pues las
cepas productoras de toxina emética no germinan a temperaturas inferiores a
15ºC (Finlay et al., 2002).
Las cepas productoras de toxina emética son mesófilas, mientras que las
cepas productoras de toxina diarreica son más heterogéneas abarcando cepas
mesófilas y psicrótrofas. La mayoría de las cepas diarreicas tienen como
temperatura mínima de crecimiento 7 ºC (Pielaat, 2005).
Sobrevive entre valores de pH comprendidos entre 4,5 y 9,3 (Bourgeois et
al., 1991) y su pH óptimo está entre 6-7 (Finlay et al., 2002; Lake et al., 2004). La
aW está en torno a 0,92-0,95 para células vegetativas (Lake et al., 2004).
21
Introducción
1.3.- Reservorios y contaminación.
B. cereus está muy extendido en la naturaleza, encontrándose en aire,
agua y suelo, siendo este último el hábitat mayoritario de formación de la espora
bacteriana (Vilain et al., 2006) y la fuente directa de la contaminación en alimentos
(Guinebretiere et al., 2003; Guinebretiere y Nguyen-The, 2003). Las
concentraciones de B. cereus en suelo pueden alcanzar valores de 105-106
esporas/gramo de suelo (te Giffel et al., 1995). De este ambiente natural pasa a
los alimentos, especialmente a aquellos de origen vegetal. A través de la
contaminación cruzada puede entonces difundirse a otros alimentos. Crece muy
bien en la mayoría de los productos alimenticios: maíz, hortalizas, carne picada,
embutidos de hígado, fiambre de carne, leche, carne cocida, y especialmente en
arroz, y sobre todo si éste lleva proteínas animales, como podría ser el caso de un
caldo de carne.
La espora de B. cereus es la más hidrófoba del género Bacillus,
adhiriéndose a diferentes tipos de superficies (Husmark y Rönner, 1992;
Husmark, 1993; Klavenes et al., 2002), incluso acero inoxidable (Jullien et al.,
2002). Además, las esporas de B. cereus disponen de pelos y/o apéndices
(Husmark y Rönner, 1992; Andersson et al., 1995) que favorecen la adherencia
(Husmark y Rönner, 1992).
Estas propiedades de adherencia permiten a la espora resistir los procesos
de desinfección normales de la industria alimentaria, contaminando los alimentos
durante su tratamiento, apareciendo incluso en los materiales de embalaje
22
Introducción
(Pielaat et al, 2005), además de adherirse a las células epiteliales intestinales
donde germina y produce las enterotoxinas (Granum, 1994a; Granum, 1994b).
La capacidad de B. cereus para sobrevivir en diversos ambientes,
condiciones de estrés y su capacidad de adherirse a las superficies dificulta
enormemente su eliminación en la industria alimentaria (Anderson et al., 1995).
Además, parece haber una asociación por “nicho térmico” en la industria de
alimentos, es decir las cepas psicrótrofas viven en ambientes fríos, mientras que
las cepas más termorresistentes viven en industrias donde se realizan procesos
térmicos (Carlin et al., 2010).
1.4.- La espora bacteriana.
La espora (del griego, semilla) o endospora bacteriana (llamada de esta
manera debido a que la espora se forma dentro de la célula) es única por su
capacidad para resistir temperaturas muy elevadas. Hay esporas bacterianas
capaces de sobrevivir a temperaturas superiores a 121ºC e incluso cepas
extraordinariamente resistentes que pueden sobrevivir a 135 ºC durante 4 horas.
La endoespora es una forma de resistencia que presentan algunos géneros de
bacterias (Bacillus y Clostridium son los más relevantes en alimentos) frente a
condiciones ambientes desfavorables (desecación, falta de nutrientes,
acumulación de sustancias tóxicas, etc.) (Brock y Madigan, 1991).
Las esporas se forman por invaginación de una doble capa de membrana
celular, que se pliega sobre sí misma encerrando en su interior un genoma y una
23
Introducción
pequeña porción de citoplasma. Entre ambas capas se sintetiza la fina pared de la
espora y una corteza más gruesa (Davis et al., 1996).
La esporulación es el proceso de formación de la espora a consecuencia
de la expresión de unos genes específicos. Para que se produzca la esporulación
se han de cumplir unos requerimientos nutricionales que varían según las
especies e incluso entre cepas. En general, es necesario un medio con un aporte
limitado de hidratos de carbono, nitrógeno o fósforo. Esto indica que es un
proceso que se ve favorecido en un medio con carencias nutricionales (Keynan y
Sandler, 1983).
Las esporas son capaces de permanecer en dormancia por muchos años,
pero pueden convertirse de nuevo en una célula vegetativa, proceso denominado
germinación, en cuestión de minutos (Prescott et al., 1999).
Algunas esporas germinan espontáneamente en un medio favorable, pero
otras permanecen durmientes hasta que algún agente traumático como el calor,
pH bajo o algún compuesto con grupos sulfhídricos (-SH) o el envejecimiento las
activa. Una vez dañada la cubierta, el agua y algún agente germinador
(dipicolinato-Ca, Mn2+, etc.) activan la hidrólisis de la corteza y el crecimiento de la
célula vegetativa (Valero, 2000).
24
Introducción
1.5.- Termorresistencia bacteriana y métodos para su determinación.
La resistencia térmica de la espora se atribuye en gran parte al dipicolinato-
Ca, que puede constituir hasta el 15% de su peso. La mayoría de enzimas de la
espora no son termoestables, por lo que la resistencia térmica de las esporas
debe ser debida a la deshidratación del entorno intracelular (Valero, 2000).
Los equipos que se usan para determinar la termorresistencia de esporas
son muy diversos, y pueden agruparse en métodos de calentamiento directo e
indirecto (Brown, 1993).
En los métodos de calentamiento indirecto, la muestra no entra en contacto
con el medio de calentamiento, recibiendo el calor a través de una barrera física
que actúa como superficie intercambiadora (paredes de tubos de vidrio o metal,
latas, intercambiadores de calor). La temperatura se eleva de forma exponencial,
lo que implica que durante el tiempo que tarda la muestra en alcanzar la
temperatura prevista, está expuesta a temperaturas que van ejerciendo una
acción letal. Éste es quizás el principal factor limitante en este tipo de sistemas,
porque las esporas pueden morir al alcanzar la temperatura del proceso.
En los métodos de calentamiento directo, la muestra está en íntimo
contacto con el medio de calentamiento, siendo la forma más común el empleo de
vapor de agua sobrecalentado. Tiene la ventaja de que el calor latente del vapor
es capaz de producir un calentamiento extremadamente rápido. Otra forma de
25
Introducción
calentamiento directo es el empleo de resistencias eléctricas introducidas dentro
de la muestra.
A continuación describimos los métodos de calentamiento indirecto, ya que
son los más utilizados en laboratorio:
1.5.1.- Método de los tubos TDT (tiempo de destrucción térmica).
Consiste en tubos de ensayo de vidrio de pequeño diámetro (7 a 10 mm)
que se inoculan con volúmenes de 1 y 4 µL de tampón, medio de cultivo o
alimento.
Es un método simple, disponible en cualquier laboratorio, y barato. En
medios transparentes el desarrollo bacteriano o cualquier cambio en el alimento
puede observarse sin necesidad de abrir los tubos, y en caso de ser necesario
abrirlos se hace con facilidad. Su incubación no requiere un gran espacio, pero
poseen el inconveniente de que llenar, cerrar y, en su caso, subcultivar los tubos
es una tarea tediosa.
Al transferir el contenido de los tubos al medio de recuperación, siempre
existe la posibilidad de perder supervivientes que queden adheridos a las paredes
del tubo. Solo pueden usarse productos líquidos u homogeneizados y los
períodos de inercia (tiempo que transcurre hasta que la muestra del tubo alcanza
la temperatura de tratamiento o se enfría por completo en el baño de hielo) son
importantes y difíciles de calcular (Stumbo, 1953; Odlaug y Pflug, 1977).
26
Introducción
Odlaug y Pflug (1977) propusieron una variante de esta técnica,
consistente en emplear tubos de aluminio cerrados con roscas de nylon, y con
capacidad para 1 mL de muestra. Sin embargo, y a pesar del alto coeficiente de
transmisión del calor del aluminio, persiste el problema de un alto periodo de
inercia, lo cual limita su empleo a altas temperaturas.
1.5.2.- Método de los tubos TDT abiertos.
Consiste en utilizar tubos de 13 mm de diámetro y 100 mm de altura
tapados con algodón, que se calientan en un baño de agua o aceite para
temperaturas de hasta 100 ºC o con vapor bajo presión, si se trabaja a
temperaturas superiores a 100 ºC. Son esos mismos tubos los que sirven para
recuperar los microorganismos al añadirles el medio de cultivo, evitándose la
posibilidad de perderlos.
La desventaja es que los periodos de tiempo requeridos para alcanzar las
temperaturas de calentamiento y enfriamiento son altos, lo que limita su uso a
altas temperaturas (Rodrigo y Martínez, 1988).
1.5.3.- Método de los tubos capilares.
Fue diseñado por Stem y Proctor (1954). Se emplean tubos capilares
calibrados que se llenan con el medio inoculado, usando un auxiliar de
micropipeteado. Se cierran a la llama y se calientan en baños de aceite
27
Introducción
termostatado durante periodos predeterminados, enfriándose a continuación en
un baño de agua y hielo.
Esta técnica posee como ventaja que es fácil de usar y el equipo necesario
es muy simple, se requiere un bajo número de esporas y se pueden emplear
tiempos de exposición cortos, del orden de segundos (Perkin et al., 1980).
El uso de capilares de paredes finas (0,15 mm) disminuye
considerablemente los tiempos requeridos para el calentamiento y el enfriamiento
o fases de inercia (Perkin et al., 1980). Sin embargo, el cierre, la apertura y el
vaciado de los tubos es una tarea laboriosa, especialmente cuando se trabaja con
productos viscosos.
Este método fue el elegido para nuestros ensayos de termorresistencia,
utilizando tubos capilares de 10 µL y un baño de aceite de vaselina.
1.6.- Aislamiento, cuantificación y caracterización.
Para cuantificar la contaminación por B. cereus en los vegetales frescos, se
utilizó la técnica de recuento en placa descrita por AFNOR (1996).
Para la detección y cuantificación de B. cereus en productos refrigerados
mínimamente procesados y productos vegetales listos para comer, se utilizó el
procedimiento de estimación estadística del “número más probable” (NMP).
28
Introducción
Los aislados de B. cereus de cada muestra fueron confirmados con los
tests bioquímicos API 50CH y API 20E, por comparación con perfiles tipo de la
base de datos APILAB Plus V3.2.2 Versión B 01.93. También fueron realizadas la
actividad oxidasa, la movilidad en un medio semi-sólido y el crecimiento
anaerobio. Actualmente existen métodos más fiables para la confirmación de
microorganismos como pueden ser las técnicas utilizadas en genética molecular e
ingeniería genética, polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricción-
reacción en cadena de la polimerasa RFLP-PCR y huella genética (genetic
fingerprinting), pero estos métodos no son útiles para controles rutinarios.
Además, el método utilizado es totalmente válido, ya que aunque a veces no
permite la diferenciación entre especies estrechamente relacionadas, nos
proporciona mucha información sobre las propiedades del microorganismo, que
pueden ser útiles a la hora de combatirlo.
1.7.- Patogenicidad.
Este microorganismo causa dos tipos de intoxicación alimentaria, la
diarreica y la emética. Ambas son generalmente leves, aunque también se
producen intoxicaciones serias, e incluso en algunos casos letales (Dierick et al.,
2005).
El tipo diarreico, fue reconocido después de un brote en un hospital de
Oslo (Noruega), causado por una salsa de vainilla contaminada en 1948, y el tipo
emético fue descrito hace 20 años, después de varios brotes en Londres
(Granum, 1997; Montville, 1997).
29
Introducción
El tipo de intoxicación diarreica está causado por una enterotoxina
producida durante el crecimiento vegetativo de B. cereus en el intestino delgado
(Granum, 1994b; Clavel et al., 2004). El síndrome emético esta causado por la
toxina emética, llamada cereulide, producida en los alimentos antes de ser
ingeridos (Kramer y Gilbert, 1989). Ambos tipos de enfermedades son
normalmente causados por alimentos tratados térmicamente, donde las esporas
supervivientes son el origen de la enfermedad (Granum, 1997). Bacillus cereus no
es un microorganismo competitivo, pero crece bien después de un tratamiento
térmico seguido de un enfriamiento. El tratamiento térmico causará la germinación
de la espora, y en ausencia de flora competitiva se desarrolla sin ningún
problema.
1.7.1.- Toxina diarreica.
La toxina diarreica o enterotoxina se produce durante la fase de
crecimiento exponencial, pero la cantidad máxima de toxina se encuentra al
principio de la fase estacionaria. La lisis de la célula no es necesaria para la
producción de la toxina. Es termolábil (se inactiva a 60 ºC), y sensible a la
pronasa y a la tripsina. Actúa rompiendo la integridad de la membrana plasmática
de las células epiteliales, pues estimula el sistema AMP cíclico-adenilato ciclasa,
lo que provoca la acumulación de líquido en el intestino delgado (Bourgenois et
al., 1991; Stenfors Arnesen et al., 2008).
30
Introducción
B. cereus produce un gran número de citotoxinas y enzimas que pueden
contribuir a la enfermedad diarreica, entre las cuales destacan tres: Hbl
(Hemolisina), Nhe (Enterotoxina no hemolítica) y CytK (Citotoxina K), estando sus
masas moleculares entre los 39 y 105 KDa (Lund y Granum., 1996; Lund et al.,
2000). Las cepas productoras de la toxina diarreica son capaces de hidrolizar el
almidón.
El síndrome diarreico es similar al producido por Clostridium perfringens, y
se caracteriza por diarrea líquida, dolores abdominales y ocasionalmente náuseas
(Tabla 1). El tiempo de incubación es superior a 6 horas, normalmente de 8-16
horas, siendo la media de 12 horas, aunque en raros casos se han dado tiempos
de incubación superiores. La duración de la enfermedad normalmente es de 12-
24 horas, aunque se han descrito casos de varios días (Kramer y Gilbert, 1989).
El número de microorganismos necesario para producir la intoxicación diarreica
es de 105-108 células (Granum, 2007).
Esta intoxicación está asociada a alimentos proteicos, salsas, aderezos y
vegetales (Kramer y Gilbert, 1989), productos cárnicos, potajes, pudín y productos
lácteos (Granum, 2007).
1.7.2.- Toxina emética.
Cereulide, la toxina emética, es un péptido cíclico de masa molecular 1,2
KDa, resiste las condiciones ácidas (no es destruido por el ácido gástrico), la
proteolisis (tripsina y pepsina) y un amplio rango de temperaturas, manteniéndose
31
Introducción
estable a 126 ºC durante 90 minutos (termoestable) y a 4 ºC durante dos meses
(Agata et al., 1994; Agata et al., 2002; Ehling-Shulz et al., 2004).
Los síntomas, náuseas y vómitos, son parecidos a los producidos por
Staphylococcus aureus. El tiempo de incubación es de 1 a 6 horas después de la
ingestión, pero también se han observado tiempos inferiores (0,5 h) y superiores a
estos (Tabla 1). La duración de la enfermedad suele esta comprendida entre 6-24
horas (Ehling-Shulz et al., 2004). La intoxicación producida por esta toxina es más
grave y más aguda que la producida por la toxina diarreica, inhibiendo la
oxidación de ácidos grasos de las células del duodeno, y por lo tanto, paralizando
la actividad mitocondrial de estas células (Mikkola et al., 1999).
Esta intoxicación está asociada a alimentos farináceos, tales como el arroz
cocido (Gilbert y Kramer, 1984; Kramer y Gilbert, 1989) y la pasta (Granum,
2007).
32
Introducción
Tabla 1. Características de los dos tipos de enfermedades alimentarias causadas
por Bacillus cereus. Adaptada por Granum (2007). a Clavel et al., (2004). b Agata
et al., (1994); Agata et al., (1995); Shinagawa et al., (1995). c Lund et al., (2000).
d
Mahler et al., (1997); Dierick et al., (2005).
Características Enfermedad diarreica Enfermedad emética
Tipo de toxina: Proteína; enterotoxinas: Hbl, Nhe, Péptido cíclico; toxina emética
CytK (cereulide)
Lugar donde se En el intestino delgado del huésped En los alimentos

produce la
toxina:
Dosis para la 105-108 UFC (total), en caso de Normalmente se encuentra en los

infección: tratarse de esporas se requiere un alimentos implicados 105-108
menor número a células/g, pero la existencia de
células vivas no es requisito para
la intoxicación
Cereulide: 8-10 µg/kg de peso

corporal (ensayos en animales) b
Tiempo de 8-16 h (ocasionalmente más de 24 h) 0,5-6 h

incubación:
Duración de los 12-24 h (ocasionalmente varios días) 6-24 h

síntomas:
Síntomas: Dolor abdominal, diarrea líquida y Náuseas y vómitos. Rara vez

ocasionalmente náuseas y rara vez la puede ser letal (posiblemente
muerte c debido a daños en el hígado) d
Alimentos Alimentos proteicos: productos Alimentos ricos en almidón: arroz

frecuentemente cárnicos, potajes, vegetales, pudín, frito o cocido, pasta, productos de
implicados: salsas, aderezos, leche y productos pastelería
lácteos
Se han encontrado diferencias en la distribución de las dos enfermedades
entre países, debido posiblemente a las costumbres alimenticias de cada país.
Mientras que en Japón y Reino Unido predomina la enfermedad emética
(Shinagawa et al., 1995), en Norteamerica y norte de Europa predomina la
enfermedad diarreica (Kotiranta et al., 2000).
33
Introducción
1.8.- Mecanismos de control.
La técnica de “carrera de obstáculos” se basa en las interacciones entre los
diferentes sistemas de conservación tradicionales, tales como los tratamientos
térmicos, las bajas temperaturas, la acidificación, el potencial de oxidación-
reducción, la actividad de agua y la adición de conservantes. El efecto
antimicrobiano puede ser mejorado por la combinación de varios sistemas
formando una estrategia global de conservación. De acuerdo con este concepto,
la combinación de dos o más tratamientos de conservación a bajas intensidades
individuales minimiza su impacto sobre las propiedades sensoriales y nutritivas
del alimento (Leistner, 1999; Leistner, 2000).
1.8.1.- La esterilización térmica.
La destrucción de los microorganismos es el objetivo fundamental en los
procesos de esterilización de alimentos, con el fin de conservar dicho alimento
durante el mayor periodo posible de tiempo. Para ello, se utilizan técnicas tan
variadas como: presión hidrostática, agentes químicos, radiaciones ultravioleta,
radiaciones ionizantes, etc. Entre todos, la aplicación de calor húmedo es la más
usada, por ser muy eficaz, económica y fácil de controlar (Valero, 2000).
1.8.2.- La refrigeración.
La temperatura es uno de los factores que más afectan al crecimiento y
supervivencia microbiana. A medida que aumenta la temperatura, aumentan las
34
Introducción
reacciones enzimáticas y el crecimiento es más rápido, hasta llegar a un valor en
el cual las proteínas, ácidos nucleicos y otros componentes se dañan de manera
irreversible, deteniéndose las funciones celulares. Por tanto, para cada
microorganismo existe una temperatura máxima, a partir de la cual no existe
crecimiento, una temperatura óptima en la cual el crecimiento es rápido y una
temperatura mínima, por debajo de la cual tampoco existe crecimiento (Madigan
et al., 1999).
Se comprobó la capacidad de crecimiento de 33 cepas de B. cereus en
tubos con TSB a 2, 8, 10, 12, 30, 37 y 42 ºC. De estas cepas, 32 pertenecen a la
colección de aislados de vegetales frescos y REPFEDs (Valero et al., 2002). La
cepa restante fue aislada durante el segundo estudio en ensalada americana.
De las 33 cepas, sólo la aislada de ensalada americana fue capaz de
crecer a baja temperatura (8 ºC), por lo cual en teoría es la cepa más peligrosa.
Debido a esto, los últimos dos trabajos se centran en esta cepa psicrótrofa de B.
cereus aislada en ensalada americana.
1.8.3.- Efecto del pH.
El pH interno de muchos microorganismos se acerca a la neutralidad. Una
variación drástica del pH medioambiental afecta al crecimiento microbiano
originando cambios estresantes en el pH citoplasmático. Aunque los
microorganismos frecuentemente crecen en amplios rangos de pH, cada especie
tiene definido un rango de pH para el crecimiento y un pH de crecimiento optimo.
35
Introducción
Sin embargo, el pH mínimo para su crecimiento varía entre cepas y
también depende de los acidulantes, pues los ácidos orgánicos atraviesan mejor
la membrana celular que los inorgánicos. A pesar de su tolerancia a la acidez, la
muerte bacteriana se produce por inhibición de la actividad de las enzimas y de
las proteínas transportadoras de la membrana si el pH interno de la célula
vegetativa disminuye por debajo de 5,0-5,5.
1.8.4.- Los antimicrobianos.
En los últimos años ha aumentado el interés de la industria alimentaria por
sustituir los conservantes sintéticos por naturales. Los compuestos
antimicrobianos naturales incluyen enzimas, compuestos producidos por cultivos
iniciadores y compuestos de origen vegetal tales como especias, extractos,
aceites esenciales y sus compuestos aislados (Davidson, 1997). Es conocido que
algunas especias y sus aceites esenciales poseen diferentes grados de actividad
antimicrobiana (Shelef, 1983; Zaika, 1988; Beuchat y Golden, 1989; Ting y Deibel,
1992; Juven et al., 1994; Tassou et al., 1995; Chang, 1995; Sivropoulou et al.,
1996; Chaibi et al., 1997; Wan et al., 1998; Lachowicz et al., 1998). El
inconveniente de los antimicrobianos naturales radica en que su elevado flavor
limita su uso en determinados alimentos (Ultee et al., 2000; Frutos y Hernández-
Herrero, 2004).
Se estudiaron las actividades antimicrobianas de 4 compuestos naturales.
Uno de ellos es un aceite esencial, aceite esencial de cinnamon; los otros tres,
36
Introducción
son compuestos químicos aislados de aceites esenciales, eugenol, carvacrol y
cinamaldehído, este último componente mayoritario del aceite esencial de
cinnamon.
Se eligieron estos compuestos naturales para proporcionar información
sobre su uso potencial en alimentos mínimamente procesados y convertirse así
en una alternativa a los conservantes tradicionales de alimentos. Además, con
estos compuestos naturales se evita la aparición de resistencias a antibióticos,
problemas de alergias y toxicidad a los consumidores.
1.9.- Evaluación de la cinética de crecimiento de Bacillus cereus.
Para evaluar el crecimiento de B. cereus se ha utilizado un medio sintético,
caldo nutritivo (NB), de pH 7,4 y un medio natural, caldo de zanahoria tindalizado
(TCB), de pH 6,2, tal como se describe en Valero y Giner (2006). Este último, ha
sido escogido por ser la zanahoria un vegetal poco ácido ampliamente utilizado
como ingrediente en los alimentos mínimamente procesados (Valero y Salmerón,
2003). Por ello el TCB ha sido utilizado a modo de sistema modelo de este tipo
de alimentos. Además, en el TCB no ha sido detectado ningún factor inhibidor que
afecte al crecimiento de B. cereus, por lo que se asegura una buena proliferación
microbiana.
Aunque en general los medios de cultivo naturales son más estresantes
para los microorganismos que los medios sintéticos, nuestros resultados previos
indicaron que el medio natural podía tener un efecto estimulante sobre el
37
Introducción
crecimiento de cepas psicrótrofas de B. cereus, por lo que era interesante
comparar estos dos medios de cultivo.
La acidificación de los productos mínimamente procesados es una forma
de aumentar la vida útil de estos alimentos, por ello se acidifico con zumo de
limón y ácido cítrico hasta valores de pH comprendidos entre 4,7 y 5,5. Acidificar
con zumo de limón responde al interés de potenciar el uso de aditivos naturales,
en este caso un acidulante, frente a los aditivos sintéticos.
Para el ajuste de las curvas de crecimiento y el cálculo de sus parámetros
se ha utilizado el programa D-model, el cual utiliza la ecuación de Baranyi et al.
(1993).
1.10.- Contextualización.
El desarrollo de la presente tesis se ha llevado a cabo en tres fases:
En un primer estudio se investigó con la finalidad de detectar, cuantificar,
aislar, identificar bioquímicamente y confirmar la presencia de B. cereus en un
amplio rango de muestras de vegetales frescos y productos mínimamente
procesados. Como resultado de estos ensayos se obtuvo una colección de cepas
de B. cereus aisladas a partir de vegetales y productos mínimamente procesados
y refrigerados, a las cuales se le realizaron ensayos de termorresistencia.
38
Introducción
En un segundo estudio se realizaron ensayos de crecimiento a diferentes
temperaturas sobre la colección de cepas de B. cereus, especialmente sobre la
cepa psicrótrofa EPSO-35AS aislada a partir de ensalada americana,
realizándose sobre ésta un nuevo estudio de temorresistencia. Resulta de gran
interés conocer la resistencia térmica de una amplia representación de cepas de
B. cereus, tanto mesófilas como psicrótrofas, aisladas a partir de distintos
alimentos. Estos resultados contribuirán a disponer de valores de
termorresistencia más precisos, que ayudarán a establecer tratamientos térmicos
más efectivos y adecuados para garantizar la ausencia de riesgos microbiológicos
en estos productos.
Por último, se estudió la capacidad de las esporas de la cepa EPSO-35AS
activadas térmicamente para crecer en un rango de temperatura de 8 a 16 ºC en
caldo nutritivo (NB) y caldo de zanahoria tindalizado (TCB), tanto a pH natural
como acidificado. El estudio también fue dirigido a determinar la actividad
antimicrobiana de 4 compuestos naturales (aceite esencial de cinnamon,
cinamaldehído, carvacrol y eugenol) sobre la cinética de crecimiento de células
germinadas de esporas. Finalmente, los resultados encontrados fueron
comparados con los de la cepa psicrótrofa de B. cereus INRA TZ415, aislada de
alimentos vegetales mínimamente procesados en la Estación Tecnológica de
Productos Vegetales (Institut Nacional de la Recherche Agronomique, Avignon,
Francia).
39
2.- OBJETIVOS
Objetivos
2.- OBJETIVOS.
Los objetivos de la presente tesis doctoral son los siguientes:
1.- Realizar el aislamiento, cuantificación e identificación bioquímica de B. cereus

en un amplio rango de muestras de vegetales frescos y productos
refrigerados mínimamente procesados.
2.- Determinar la resistencia térmica a 90 ºC de esporas bacterianas

pertenecientes a cada una de las cepas aisladas.
3.- Poner de relieve la presencia de cepas psicrótrofas de B. cereus entre los

diferentes aislados obtenidos.
4.- Comprobar la capacidad de crecimiento a bajas temperaturas de dichas cepas

en medio sintético y substrato vegetal a base de zanahoria.
5.- Determinar los efectos inhibitorios de la acidificación, adición de

antimicrobianos naturales y la temperatura de incubación sobre el crecimiento
de B. cereus, con la finalidad de obtener datos que sean de utilidad a la hora
de establecer obstáculos que garanticen la seguridad de los productos
vegetales refrigerados mínimamente procesados (RMPFs).
41
3.- PUBLICACIONES
Publicaciones
3.- PUBLICACIONES.
3.1.- Valero, M., Hernández-Herrero, L. A., Fernández, P. S., Salmerón, M. C.

2002. Characterization of Bacillus cereus isolates from fresh vegetables and
refrigerated minimally processed foods by biochemical and physiological
tests. Food Microbiology, 19: 491-499.
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Publicaciones
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Publicaciones
3.2.- Valero, M., Hernández-Herrero, L. A., Giner, M. J. 2007. Survival, isolation

and characterization of a psychrotrophic Bacillus cereus strain from a
mayonnaise-based ready-to-eat vegetable salad. Food Microbiology, 24:
671-677.
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Publicaciones
3.3.- Hernández-Herrero, L. A., Giner, M. J., Valero, M. 2008. Effective chemical

control of psychrotrophic Bacillus cereus EPSO-35AS and INRA TZ415
spore outgrowth in carrot broth. Food Microbiology, 25: 714-721.
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4.- RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Resultados y discusión
4.- RESULTADOS y DISCUSIÓN.
4.1.- Aislamiento y caracterización de Bacillus cereus.
4.1.1.- Recuentos de B. cereus en vegetales frescos.
La media del número de B. cereus en pepino, zanahoria y pimiento osciló
desde 102 hasta 7,8 x 103 UFC/g (Tabla 2). En ajo no se detectó B. cereus,
mientras que en cebolla el recuento también fue casi nulo, ello podría ser debido a
los compuestos naturales sulfurados con propiedades antimicrobianas (allicin
(dialil tiosulfinato, tio-2-propanol-1-sulfínico ácido-S-alil éster) y tiopropanol-S-
óxido) que contienen estos materiales vegetales. Estos agentes antimicrobianos
además inhiben el crecimiento y producción de toxinas de B. cereus y otros
microorganismos.
Tabla 2. Conteos de Bacillus cereus aislados de vegetales frescos comúnmente
usados como ingredientes de alimentos mínimamente procesados (RMPFs). Para
una misma columna, los valores seguidos de una misma letra no son
significativamente diferentes (P ≤ 0,05). SD: desviación estándar.
Vegetales Nº de Conteos medios Nº de muestras que % de muestras que

frescos muestras (ufc g-1)  SD contienen B. cereus contienen B. cereus
Pimiento 11 98  25 c 11 100
Pepino 9 7867  1315 a 3 33,3
Ajo 6 0 0 0
Tomate 10 8  10 c 9 90
Cebolla 7 1 1 14,2
Zanahoria 7 2009  903 b 3 42,8
Calabacín 6 78c 2 33,3
71
4.1.2.- B. cereus en productos vegetales refrigerados mínimamente procesados
(RMPFs).
Las muestras de zanaranja fueron las únicas en mostrar ausencia de
contaminación (Tabla 3). La muestra de ensalada americana mostró la mayor
contaminación por B. cereus, mayor 2400 microorganismos/g, de acuerdo con las
tablas de probabilidad (Pascual, 1992). Estos resultados son similares a los
encontrados en los posteriores conteos en cultivo agar fenol rojo de polimixina-
manitol-yema de huevo (PMYPA) que oscilaron entre 2,2 y 4,5 x 103 UFC/g.
Tabla 3. Conteos de Bacillus cereus en productos vegetales refrigerados

a
mínimamente procesados (RMPFs). Sopa refrigerada de vegetales
b
mediterráneos elaborada con vegetales frescos. Puré refrigerado de vegetales
c
que contiene pan y huevos. Crema refrigerada que contiene pan, almendras y
aceite de oliva como principales ingredientes. d Mezcla de zumos de zanahoria y
naranja. e E: ensalada, col blanca, remolacha, cebolla, mayonesa y mostaza. SD:
desviación estándar.
RMPFs Nº de NMP (g-1) Nº de muestras que % de muestras que

muestras  SD contienen B. cereus contienen B. cereus
Gazpachoa 9 3,5  0,5 2 22,2
Salmorejob 9 8,0  1,0 4 44,4
Ajoblancoc 4 3,5  0,5 1 25,0
Zanaranjad 7  3,0 0 0
E. Americanae 12 > 2400 1 8,3
72
4.1.3.- Identificación bioquímica y confirmación de Bacillus cereus.
La identificación bioquímica de los microorganismos aislados se realizó
mediante el sistema APILAB. En los casos donde el sistema APILAB propuso más
de una especie, se realizaron pruebas adicionales (actividad oxidasa, movilidad y
crecimiento anaeróbico) para determinar los resultados. En cuanto al sistema
APILAB, se consideró que una buena identificación era obtenida cuando una
especie era propuesta con un porcentaje de identificación (Id %) superior al 80%,
el cual fue el caso de las siguientes cepas de la EPSO (Escuela Politécnica
Superior de Orihuela): 1PE, 2PE, 3PE, 4PE, 5PE, 6PE, 7PE, 8PE, 9PE, 10PE,
11CU, 12CU, 13CA, 16GZ, 17SA, 18SA, 19SA, 20TO, 21TO, 22TO, 24TO, 25TO,
26TO, 27TO, 28PE, 30CU, 35AS y 37SA. Los resultados finales mostraron que la
mayoría de las cepas aisladas fueron claramente confirmadas como B. cereus,
mientras que la cepa EPSO-13CA fue identificada como B. firmus, y las cepas
EPSO-28PE y EPSO-30CU como B. licheniformis (Tabla 4).
73
Tabla 4. Caracterización de B. cereus aislado de vegetales frescos (PE: pimiento,
CU: pepino, CA: TO: tomate, ON: cebolla, ZU: calabacín) y alimentos vegetales
mínimamente procesados (RMPFs) (GA: gazpacho, SA: salmorejo, AB: ajoblanco,
AS: ensalada americana) en función de sus propiedades fisiológicas y
bioquímicas. Para una misma columna, los valores seguidos de una misma letra
no son significativamente diferentes (P ≤ 0,05).
Cepas % Id Nombre API Movili- Creci-miento Nombre Test Hidrólisis Valor D90
aisladas de: dad anaeróbico BCET- de almidón
RPLA
Vegetales
EPSO-1PE 99,7 B. cereus + + 4,3  0,1 jkl
2PE 99,7 B. cereus - - 15,7  0,6 b
3PE 95,0 B. cereus - - 13,2  0,6 c
4PE 99,7 B. cereus - - 12,3  0,6 c
5PE 99,8 B. cereus - - 21,2  2,1 a
6PE 99,7 B. cereus + + 3,6  0,1 klmn
7PE 99,4 B. cereus + + 6,9  0,2 f
8PE 99,4 B. cereus + + 4,5  0,2 ijk
9PE 99,4 B. cereus + + 2,9  0,1 mno
10PE 99,4 B. cereus + + 4,4  0,1 ijk
11CU 99,4 B. cereus + + 4,3  0,2 jkl
12CU 99,3 B. cereus + + 5,4  0,3 hij
13CA 96,5 B. firmus
14CA 95,0/2,4 B. firmus / B. cereus + B. cereus - - 10,8  0,3 d
15CA 95,0/2,4 B. firmus / B. cereus + B. cereus - - 12,3  0,4 c
20TO 99,1 B. cereus + + 3,8  0,1 klm
21TO 93,7 B. cereus + + 5,6  0,2 ghi
22TO 98,9 B. cereus + + 2,9  0,3 mno
23TO 99,8 B. cereus / B. mycoides + B. cereus + + 3,2  0,1 lmno
24TO 99,1 B. cereus + + 2,5  0,1 nop
25TO 99,1 B. cereus + + 1,5  0,1 p
26TO 99,8 B. cereus + + 2,8  0,1 mno
27TO 99,1 B. cereus + + 2,1  0,1 op
28PE 99,8 B. licheniformis
29ON 99,8 B. cereus / B. mycoides + B. cereus + + 6,6  0,1 fg
30CU 99,8 B. licheniformis
31ZU 98,0 B. cereus / B. mycoides + B. cereus - + 3,5  0,1 klmn
32TO 99,7 B. anthracis / B. cereus + B. cereus - + 9,0  0,9 e
34ZU 99,8 B. mycoides / B. cereus + B. cereus + + 5,1  0,3 ij
RMPFs
EPSO-16GA 91,9 B. cereus + + 1,4  0,1 p
17SA 99,8 B. cereus + + 2,8  0,3 mno
18SA 95,7 B. cereus + + 5,2  0,3 ij
19SA 98,3 B. cereus + + 6,4  0,7 fgh
33AB 99,8 B. cereus / B. mycoides + B. cereus - + 5,1  0,2 ij
35AS 98,7 B. cereus / B. mycoides + + B. cereus + +
36GA 94,7/3,6 B. anthracis / B. firmus - B. firmus
37SA 93,4 B. cereus + + 5,5  0,2 ghij
74
4.1.4.- Resistencia térmica de las esporas de B. cereus.
Los valores D90 de los 33 aislados caracterizados como B. cereus oscilaron
entre 1,4 y 21,2 min (Tabla 4). Los valores D90 mayoritarios (14 de las 33 cepas)
oscilaron ente 3 y 6 min de resistencia térmica. Ocho cepas tuvieron valores D90
inferiores a 3 min, 3 cepas mostraron valores entre 6 y 9 min, y 7 cepas mostraron
resistencias térmicas superiores a 9 min.
4.1.5.- Producción de enterotoxinas e hidrólisis de almidón.
A los 33 aislados caracterizados como B. cereus se les realizó el test
BCET-RPLA de producción de enterotoxina diarreica, resultando 24 cepas
(72,7%) positivas y 9 cepas (27,3%) negativas (Tabla 4). Por otro lado, el 81,8%
de las 33 cepas de B. cereus hidrolizaron el almidón. El 100% de las 24 cepas
enterotoxinas-positivo fueron capaces de hidrolizar el almidón, mientras que
solamente el 33,3% de las 9 cepas enterotoxinas-negativo lo hidrolizaron.
4.1.6.- Temperaturas de crecimiento.
Ninguna de las 33 cepas fue capaz de crecer a 5 ºC. Sólo la cepa EPSO-
35AS (el 3%) creció a 8 ºC, mientras que 29 cepas (el 87,9%) crecieron a 10 ºC.
Todas las cepas fueron capaces de crecer a temperaturas de 12, 30 y 37 ºC,
mientras que a 42 ºC sólo lo hicieron 19 cepas (el 57,6%) (Tabla 5).
75
Tabla 5. Cepas de B. cereus aisladas de vegetales frescos, alimentos vegetales
mínimamente procesados (RMPFs) y ensalada americana que fueron capaces de

a
crecer a temperaturas que oscilaron entre los 8 y 42 ºC. Cepas aisladas de
pimiento (PE), tomate (TO), cebolla (ON), calabacín (ZU), pepino (CU) y
zanahoria (CA). b Cepas aisladas de RMPFs tales como gazpacho (GZ), salmorejo
(SA) y ajoblanco (AB).
Crecimiento
observado a Cepas Total
temperatura (ºC) de:
8, 10, 12 , 30, 37 EPSO-35AS 1

a b
10, 12, 30, 37 EPSO-1PE , 9PE, 16GZ , 17SA, 18SA, 20TO, 21TO,
22TO, 24TO, 25TO, 26TO, 29ON y 34ZU 13
10, 12, 30, 37, 42 EPSO-2PE, 5PE, 6PE, 7PE, 8PE, 10PE, 11CU, 12CU,
14CA, 15CA, 19SA, 31ZU, 32TO, 33AB y 37SA 15
12, 30, 37, 42 EPSO-3PE, 4PE, 23TO y 27TO 4
4.2.- Supervivencia de la cepa psicrótrofa de B. cereus EPSO-35AS.
4.2.1.- Resistencia térmica.
La resistencia térmica de las esporas de la cepa de B. cereus EPSO-35AS
resuspendidas en agua destilada se determinó en un rango de temperaturas que
osciló entre 80 y 95 ºC, mostrando la tabla 6 sus resultados. A partir de estos
resultados se obtuvo un valor Z de 6,79 ºC.
76
Tabla 6. Valor D (min) obtenido por las esporas de B. cereus EPSO-35AS
suspendidas en agua destilada y calentadas a diferentes temperaturas. Los datos
expresan el valor medio  la desviación estándar de tres repeticiones.
Temperatura (ºC) Valor D (min) Coeficiente de correlación (ro)

80,0 64,9 ± 0,9 0,999
85,0 9,5 ± 0,2 0,991
87,5 3,7 ± 0,1 0,993
90,0 2,1 ± 0,1 0,986
95,0 0,4 ± 0,0 0,996
Aunque la relación entre la resistencia térmica de las esporas y la
temperatura mínima de crecimiento no esta clara, se ha descrito que las cepas
psicrótrofas de B. cereus son más sensibles al calor que las cepas mesófilas
(Choma et al., 2000). Los valores D90 descritos para cepas psicrótrofas de B.
cereus se encuentran en un rango comprendido entre 0,8 y 100 min (Dufrenne et
al., 1995; Choma et al., 2000). Como ya hemos comentado en el apartado “4.1.4.-
Resistencia térmica de las esporas de B. cereus”, los valores D90 de las cepas de
B. cereus aisladas oscilaron entre 1,4 y 21,2 min (Tabla 4), situándose por tanto
los 2,1 min de la cepa B. cereus EPSO-35AS en el extremo inferior de ambos
rangos. Solamente 3 cepas de B. cereus han mostrado un valor D90 igual o inferior
al de la cepa EPSO-35AS (Tabla 4), y ninguna de ellas ha sido capaz de crecer a
42 ºC.
4.2.2.- Crecimiento en caldo nutritivo (NB) y caldo de tindalizado (TCB).
Las cinéticas de crecimiento en NB y TCB de las células germinadas
procedentes de las esporas térmicamente activadas fueron evaluadas a 8, 12 y 16
77
ºC. En la tabla 7 podemos observar como a medida que aumenta la temperatura
se incrementa el crecimiento, todos los parámetros de crecimiento. Las esporas
germinadas de B. cereus en NB frente a las germinadas en TCB muestran a 8 ºC
una mayor fase de latencia (290 frente a 224 h) y tiempo de generación (77,00
frente a 18,73 h), con lo que la densidad de población final es de 6,59 frente a
7,47 Log10 (UFC mL-1).
Tabla 7. Parámetros de cinética de crecimiento calculados para la germinación de
células procedentes de esporas activadas térmicamente de B. cereus EPSO-
35AS incubadas a diferentes temperaturas en caldo nutritivo (NB) y caldo de
tindalizado (TCB). N0, número inicial de bacterias (UFC mL-1). LT, fase de latencia
(h). SGR, ratio de crecimiento específico (Log10 UFC mL-1 h-1). GT, tiempo de
generación (h). MPD, densidad máxima de población (UFC mL-1). R2, coeficiente
de determinación para la ecuación de Baranyi et al. (1993) para la media de
valores de los datos de crecimiento obtenidos por los dos ensayos.
Medium Temperature Log10 No LT (h) SGR GT (h) Log10 MPD R2

(ºC)
NB 16 2,697 9,56 0,144 4,81 7,296 0,998
12 2,392 22,34 0,074 9,36 6,631 0,990
8 2,845 290,11 0,009 77,00 6,591 0,993
TCB 16 2.984 9,79 0,177 3,92 7,543 0,991
12 2,884 24,22 0,085 8,15 6,897 0,995
8 2,140 224,08 0,037 18,73 7,472 0,996
78
4.3.- Control químico del crecimiento de la cepa psicrótrofa de B. cereus
EPSO-35AS.
4.3.1.- Crecimiento en caldo nutritivo (NB) y caldo de tindalizado (TCB) acidificado
con ácido cítrico o zumo de limón.
Los parámetros cinéticos de crecimiento de la cepa psicrótrofa EPSO-
35AS, en NB y en TCB fueron evaluados a diferentes temperaturas (8, 12 y 16 ºC)
en combinación con la acidificación con ácido cítrico o zumo de limón a valores de
pH comprendidos entre 4,8 y 5,5. Bajando el pH desde 7,4 en NB o 6,2 en TCB
hasta 5,2 se inhibe el crecimiento bacteriano en ambos medios testados después
de 60 días a 12 ºC o temperaturas inferiores (Tablas 8 y 9). La muerte bacteriana
debida al bajo pH del medio se debe tanto a la inhibición de la actividad de las
enzimas como de las proteínas transportadoras de la membrana. El menor pH
para el crecimiento en NB y TCB a la temperatura más alta (16 ºC) fue 5,0. En
general, es evidente que un incremento en el pH siempre produce una reducción
en la duración en la fase de latencia e incrementos en el ratio de crecimiento
específico, excepto para los cultivos en TCB a 12 ºC, donde los valores de ratio
de crecimiento específico son similares.
El mínimo pH para el crecimiento bacteriano varía con las cepas y también
depende de los acidulantes, por ejemplo, los ácidos orgánicos son más capaces
de penetrar en la membrana celular que los inorgánicos. En nuestro ensayo, el
crecimiento de B. cereus EPSO-35AS se produjo para ambos acidulantes, ácido
cítrico y zumo de limón, a los mismos valores de pH y temperatura.
79
Tabla 8. Parámetros de crecimiento estimados usando la ecuación de Baranyi et
al. (1993) para cultivos de B. cereus EPSO-35AS procedentes de esporas
activadas térmicamente e incubadas en caldo nutritivo (NB) y caldo de zanahoria
tindalizado (TCB) acidificado con ácido cítrico. N0, número inicial de bacterias
(UFC mL-1). LT, fase de latencia (h). SGR, ratio de crecimiento específico (Log10
UFC mL-1 h-1). GT, tiempo de generación (h). MPD, densidad máxima de
población (UFC mL-1). R2, coeficiente de determinación para la ecuación de
Baranyi et al. (1993) para la media de valores de los datos de crecimiento
obtenidos por los dos ensayos. NG, no crecimiento durante 60 días.
Medio Temperatura pH Log10 No LT (h) SGR GT (h) Log10 MPD R2

(ºC)
NB 16 5,2 2,580 78,35 0,074 9,36 7,128 0,999
5,1 2,763 80,45 0,065 10,66 7,255 0,994
5,0 2,592 82,94 0,059 11,74 6,838 0,996
4,9 2,954 NG - - - -
4,8 1,967 NG - - - -
12 5,5 2,123 173,49 0,028 24,75 7,539 0,995
5,4 2,216 343,99 0,014 49,50 7,340 0,992
5,3 2,125 NG - - - -
5,2 2,237 NG - - - -
8 5,5 2,422 NG - - - -
TCB 16 5,2 2,683 70,84 0,065 10,66 7,042 0,992
5,1 2,650 84,45 0,060 11,55 6,977 0,991
5,0 2,442 94,06 0,057 12,16 6,663 0,995
4,9 2,380 NG - - - -
4,8 2,320 NG - - - -
12 5,5 2,506 76,88 0,044 15,75 6,820 0,997
5,4 2,377 112,76 0,047 14,74 6,892 0,992
5,3 2,338 223,73 0,045 15,40 6,904 0,995
5,2 2,444 NG - - - -
5,1 2,101 NG - - - -
8 5,5 2,223 NG - - - -
80
tindalizado (TCB) acidificado con zumo de limón. N0, número inicial de bacterias
(UFC mL-1). LT, fase de latencia (h). SGR, ratio de crecimiento específico (Log10
UFC mL-1 h-1). GT, tiempo de generación (h). MPD, densidad máxima de
población (UFC mL-1). R2, coeficiente de determinación para la ecuación de
Baranyi et al. (1993) para la media de valores de los datos de crecimiento
obtenidos por los dos ensayos. NG, no crecimiento durante 60 días.
Medio Temperatura pH Log10 No LT (h) SGR GT (h) Log10 MPD R2

(ºC)
NB 16 5,2 2,540 64,65 0,077 9,00 7,127 0,991
5,1 2,123 72,55 0,063 11,00 6,964 0,993
5,0 2,664 84,35 0,059 11,74 6,836 0,997
4,9 2,065 NG - - - -
4,8 2,693 NG - - - -
12 5,5 2,142 195,83 0,028 24,75 6,442 0,997
5,4 2,127 341,48 0,016 43,31 6,528 0,998
5,3 2,598 NG - - - -
5,2 2,124 NG - - - -
8 5,5 2,441 NG - - - -
TCB 16 5,2 2,714 69,35 0,055 12,60 7,069 0,996
5,1 2,137 81,43 0,056 12,37 6,987 0,995
5,0 2,444 89,11 0,051 13,59 7,188 0,994
4,9 2,103 NG - - - -
4,8 2,049 NG - - - -
12 5,5 2,518 83,27 0,044 15,75 6,885 0,998
5,4 2,428 112,06 0,042 16,50 7,007 0,997
5,3 2,342 229,28 0,041 16,90 6,903 0,996
5,2 2,763 NG - - - -
5,1 1,967 NG - - - -
8 5,5 2,503 NG - - - -
81
4.3.2.- Efectos de los antimicrobianos sobre el crecimiento de B. cereus EPSO-
35AS e INRA TZ415 en caldo nutritivo (NB) y caldo de zanahoria
tindalizado (TCB).
La actividad antibacteriana de 4 compuestos naturales (aceite esencial de
cinnamon, cinamaldehído, carvacrol y eugenol) fue evaluada para proporcionar
información sobre el uso potencial como una alternativa a los conservantes
sintéticos tradicionales de alimentos, debido al daño que pueden inducir sobre la
membrana citoplasmática de la célula vegetativa (Helander et al., 1998; Ultee et
al., 2002; Walsh et al., 2003). Estos antimicrobianos fueron ensayados en las
cepas de B. cereus EPSO-35AS e INRA TZ415 en ambos medios (NB y TCB) y al
mismo rango de temperaturas (8, 12 y 16 ºC). La adición de aceite esencial de
cinnamon o de cinamaldehído a concentraciones de 5 y 2 µL/100mL
respectivamente, causaron la completa inhibición del crecimiento de ambas cepas
psicrótrofas a 12 ºC (Tablas 10 y 11). Así pues, la combinación de uno de estos
compuestos y la temperatura de refrigeración podría ser usada para la
conservación de los RMPFs, cuyo ingrediente principal sea la zanahoria. Por el
contrario, el carvacrol y eugenol fueron menos efectivos, a concentraciones de 5 y
35 µL/100mL respectivamente, sólo fueron capaces de prevenir el crecimiento de
B. cereus EPSO-35AS durante el almacenamiento a 8 ºC. Esta acción inhibitoria
pudo ser debida a un efecto sinérgico entre la refrigeración y el carvacrol o
eugenol, sobre la germinación de células de las esporas de B. cereus EPSO-
35AS activadas térmicamente.
82
Además de resultar poco eficaces como antimicrobianos, carvacrol y
eugenol afectaron negativamente a las características sensoriales del TCB a las
concentraciones ensayadas. Sin embargo, el aceite de cinnamon y cinamaldehído
influenciaron positivamente al gusto y olor del TCB. Por tanto, una combinación
de uno de estos componentes y el almacenamiento refrigerado podría ser útil para
la conservación de RMPFs basados en zanahoria. El eugenol, a concentraciones
superiores o iguales a 35 µL/100 mL, confirió un flavor agrio al TCB que fue
inaceptable por los catadores. Por tanto, para la posible utilización de estos dos
compuestos habría que determinar con más exactitud las concentraciones a
utilizar para lograr un efecto antimicrobiano minimizando los efectos sobre la
calidad sensorial del TCB.
83
tindalizado (TCB) que contenían antimicrobianos naturales. N0, número inicial de
específico (Log10 UFC mL-1 h-1). GT, tiempo de generación (h). MPD, densidad
máxima de población (UFC mL-1). R2, coeficiente de determinación para la
ecuación de Baranyi et al. (1993) para la media de valores de los datos de
crecimiento obtenidos por los dos ensayos. NG, no crecimiento durante 60 días.
Medio Antimicrobiano Concentración Temperatura Log10 LT (h) SGR GT Log10 R2

-1
(L 100 mL ) (ºC) No (h) MPD
NB Cinnamon 5 16 2,445 37,86 0,090 7,70 6,962 0,995
12 2,122 NG - - - -
8 2,584 NG - - - -
Cinamaldehído 2 16 2,180 32,76 0,112 6,19 7,452 0,996
12 2,103 NG - - - -
8 2,503 NG - - - -
Carvacrol 5 16 3,687 92,93 0,035 19,8 7,363 0,997
12 3,650 118,22 0,018 38,5 6,558 0,998
8 2,441 NG - - - -
Eugenol 35 16 3,123 11,67 0,122 5,68 7,260 0,991
12 3,071 32,72 0,057 12,16 7,121 0,997
8 2,693 NG - - - -
TCB Cinnamon 5 16 2,102 14,26 0,080 8,66 7,193 0,994
12 2,124 NG - - - -
8 2,600 NG - - - -
Cinamaldehído 2 16 2,401 16,19 0,087 7,96 7,265 0,990
12 2,137 NG - - - -
8 2,065 NG - - - -
Carvacrol 5 16 2,478 13,50 0,105 6,60 7,304 0,997
12 2,397 49,17 0,045 15,4 6,332 0,992
8 1,938 NG - - - -
Eugenol 35 16 2,559 9,97 0,135 5,13 7,792 0,997
12 2,433 24,33 0,055 12,6 6,855 0,991
8 2,142 NG - - - -
84
al. (1993) para cultivos de B. cereus INRA TZ415 procedentes de esporas
tindalizado (TCB) que contenían antimicrobianos naturales. N0, número inicial de
específico (Log10 UFC mL-1 h-1). GT, tiempo de generación (h). MPD, densidad
máxima de población (UFC mL-1). R2, coeficiente de determinación para la
ecuación de Baranyi et al. (1993) para la media de valores de los datos de
crecimiento obtenidos por los dos ensayos. NG, no crecimiento durante 60 días.
Medio Antimicrobiano Concentración Temperatura Log10 LT (h) SGR GT Log10 R2

-1
(L 100 mL ) (ºC) No (h) MPD
NB Cinnamon 5 16 2,275 28,63 0,101 6,86 6,777 0,997
12 2,417 NG - - - -
8 2,333 NG - - - -
Cinamaldehído 2 16 2,172 24,38 0,117 5,92 7,400 0,995
12 2,319 NG - - - -
8 2,428 NG - - - -
Carvacrol 5 16 3,701 55,92 0,041 16,90 7,761 0,999
12 3,673 94,32 0,025 27,72 7,597 0,998
8 3,614 396,66 0,013 53,31 6,308 0,997
Eugenol 35 16 2,800 18,26 0,139 4,98 7,437 0,995
12 2,996 33,63 0,083 8,35 7,174 0,993
8 2,882 47,56 0,029 23,90 6,801 0,996
TCB Eugenol 35 16 2,434 10,10 0,160 4,33 7,774 0,999
12 2,505 26,78 0,137 5,06 7,716 0,992
8 2,441 112,79 0,033 21,00 7,463 0,999
85
5.- CONCLUSIONES
Conclusiones
5.- CONCLUSIONES.
Primera. Todos los vegetales y productos mínimamente procesados presentaron
contaminación por Bacillus cereus excepto el ajo y la zanaranja. Los pepinos,
zanahorias y ensalada americana presentaron los mayores recuentos de todos los
alimentos ensayados, que en ningún caso superaron los 104 UFC/g.
Segunda. Un total de 37 presuntas cepas de B. cereus fueron aisladas de 97
muestras. De las cuales, 33 (el 89,2%) fueron confirmadas como B. cereus, 2 (el
5,4%) como B. licheniformis, y las 2 (el 5,4%) cepas restantes fueron identificadas
como B. firmus.
Tercera. De las 33 cepas de B. cereus aisladas, 27 (81,8%) son capaces de
hidrolizar el almidón y 24 (72,7%) son productoras de la enterotoxina diarreica en
cultivos de TSB.
Cuarta. La resistencia térmica a 90 ºC de las esporas de las 33 cepas de B.
cereus varió entre 1,4 y 21,2 min. Las cepas incapaces de hidrolizar el almidón
mostraron mayor resistencia térmica, con valores D90 superiores a 10,8 min.
Todas las cepas productoras de enterotoxinas fueron capaces de hidrolizar el
almidón.
Quinta. Solamente se aisló una cepa de B. cereus psicrótrofa, EPSO-35AS,
capaz de crecer a 8 ºC.
87
Conclusiones
Sexta. La cinética de crecimiento de la cepa EPSO-35AS a 8 ºC mostró un
crecimiento más rápido y una población final más elevada en caldo zanahoria
tindalizado que en caldo nutritivo.
Séptima. La acidificación con ácido cítrico o zumo de limón a pH 5,2 en caldo
nutritivo o caldo zanahoria tindalizado inhibe el crecimiento bacteriano en ambos
medios durante al menos 60 días a 12 ºC o temperaturas inferiores.
Octava. La adición de aceite esencial de cinnamon o de cinamaldehído a
concentraciones de 5 y 2 µL/100mL respectivamente, causan la completa
inhibición del crecimiento de las cepas de B. cereus EPSO-35AS e INRA TZ415
en caldo nutritivo y caldo zanahoria tindalizado a 12 ºC.
Novena. Carvacrol y eugenol, a concentraciones de 5 y 35 µL/100mL
respectivamente, previenen el crecimiento durante 60 días de B. cereus EPSO-
35AS solamente a la temperatura de 8 ºC.
Décima. Carvacrol y eugenol, a concentraciones de 5 y 35 µL/100mL
respectivamente, afectan negativamente a las características sensoriales del
caldo zanahoria tindalizado, aportando un flavor agrio. Sin embargo, el aceite de
cinnamon y cinamaldehído influyen positivamente sobre el gusto y olor de éste.
88
BIBLIOGRAFÍA
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Universidad Miguel Hernández

Escuela Politécnica Superior de Orihuela

Luis Alberto Hernández Herrero

QUÍMICO DE BACILLUS CEREUS

Tesis doctoral realizada por D. Luis Alberto Hernández Herrero, Ingeniero

Agrónomo, en el Departamento de Tecnología Agroalimentaria de la Universidad

Miguel Hernández de Elche, para la obtención del grado de Doctor.

D. Luis Alberto Hernández Herrero.

Orihuela, _____ de ______________ de _______.

de Producción Vegetal y Microbiología de la Universidad Miguel Hernández de

Que el presente trabajo ha sido realizado bajo mi dirección, y recoge la

labor realizada por el Ingeniero Agrónomo D. Luis Alberto Hernández Herrero

para optar al grado de Doctor.

Dr. Manuel Valero Roche.

Orihuela, _____ de ______________ de _______.

Escuela Universitaria y Director del Departamento de Tecnología Agroalimentaria

de la Universidad Miguel Hernández de Elche

Que da su conformidad a la lectura de la Tesis Doctoral presentada por D.

Luis Alberto Hernández Herrero, titulada “Aislamiento, caracterización,

supervivencia y control químico de Bacillus cereus” que se ha desarrollado dentro

del programa de doctorado de “Tecnología Agroalimentaria” de este

conforme en cuanto a forma y contenido para que sea presentada para su

correspondiente exposición pública.

en Orihuela a______ de ______________ de _______.

Dr. José Ramón Díaz Sánchez.

En primer lugar quisiera agradecer a mi director de tesis, Manuel Valero

Roche, su dedicación, enseñanzas y apoyo técnico, pues han sido fundamentales

para la elaboración de este trabajo.

También quisiera agradecer a D. Manuel Javier Giner Pastor, técnico de

laboratorio del Departamento, su siempre amable colaboración.

Por último, agradecer a los conserjes y guardias jurados su paciencia y

trato por la necesidad de entrar al laboratorio a deshoras y días festivos.

La presente Tesis Doctoral se ha elaborado siguiendo la normativa de la

Universidad Miguel Hernández de Elche para la “Presentación de Tesis

Doctorales como un conjunto de publicaciones”, y se ha dividido en los siguientes

 Publicaciones, este apartado consta de tres artículos publicados:

Valero, M., Hernández-Herrero, L. A., Fernández, P. S., Salmerón, M. C.

Valero, M., Hernández-Herrero, L. A., Giner, M. J. 2007. Survival,

Hernández-Herrero, L. A., Giner, M. J., Valero, M. 2008. Effective

 Resumen de Resultados, Discusión y Conclusiones de las tres

citadas en el texto, aunque también lo estén en las publicaciones.

Este documento no incluye el apartado “Materiales y Métodos”, puesto que

éstos se encuentran descritos en las diferentes publicaciones.

1.1.- Características principales de Bacillus cereus. 20

1.2.- Características de crecimiento. 21

1.3.- Reservorios y contaminación. 22

1.4.- La espora bacteriana. 23

1.5.- Termorresistencia bacteriana y métodos para su determinación. 25

1.5.1.- Método de los tubos TDT (tiempo de destrucción térmica) 26

1.5.2.- Método de los tubos TDT abiertos. 27

1.5.3.- Método de los tubos capilares. 27

1.6.- Aislamiento, cuantificación y caracterización. 28

1.7.1.- Toxina diarreica. 30

1.7.2.- Toxina emética. 31

1.8.- Mecanismos de control. 34

1.8.1.- La esterilización térmica. 34

1.8.3.- Efecto del pH. 35

1.8.4.- Los antimicrobianos. 36

1.9.- Evaluación de la cinética de crecimiento de Bacillus cereus. 37

Orihuela, _ de ____ de _.

Orihuela, _ de ____ de _.

en Orihuela a de __ de _.