Efecto antimicrobiano, fisicoquímico y sensorial del aceite esencial de Mentha

Spicata (Hierbabuena) incorporado en la formulación del queso Dip

Elaborado por:

Jhon Milciades Morales Castro

Asesora:

MSc. Claudia Lorena Betancur

Universidad Nacional Abierta y a Distancia UNAD

Escuela de Ciencias Básicas, Tecnología e Ingeniería ECBTI

Pregrado Ingeniería de alimentos

Medellín, Octubre de 2020

1
 Resumen Analítico Especializado RAE

Titulo Efecto antimicrobiano, fisicoquímico y sensorial del aceite esencial de

Mentha Spicata (Hierbabuena) incorporado en la formulación del queso Dip.

Modalidad de Proyecto aplicado

trabajo de grado

Línea de Ciencia y Tecnología de los alimentos

investigación

Autor Jhon Milciades Morales Castro 8156219

Institución Universidad nacional abierta y a distancia UNAD

Fecha Julio de 2020

Palabras clave Conservante natural, Concentración mínima inhibitoria, Hierbabuena, Queso

Dip.

Descripción Este documento presenta los resultados del trabajo de grado realizado en la

modalidad de Proyecto aplicado, bajo la asesoría de la Magister Claudia

Lorena Betancur, inscrito en la línea de investigación Ciencia y Tecnología

de los Alimentos, de la Escuela de ciencias básicas, tecnología e ingeniería

ECBTI y que se realizó en el Nodo Occidente CEAD Medellín, Estudiando

el uso como aditivo antimicrobiano alimentario del aceite esencial de

Hierbabuena extraído de muestras cultivadas en el corregimiento de Santa

Helena del municipio de Medellín, Antioquia.

Fuentes Ansari, K., & Goodarznia, I. (2012). Optimization of supercritical carbon

dioxide extraction of essential oil from spearmint (Mentha spicata L.) leaves

by using Taguchi methodology. The Journal of Supercritical Fluids, 67, 123–

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2
 Benites, Julio. Bravo, Felipe. Rojas, Mauricio. Feuntes, Rose. Moiteiro,

Cristina. Venancia, F. (2011). Composition and antimicrobial screening of

the essential oil from the leaves and plant material, 2(12602), 2009–2011.

Ciro Gelmy. (2010). Actividad bactericida del extracto etanólico y del aceite

esencial de hojas de Rosmarinus officinalis L. sobre algunas bacterias de

interés alimentario. Vitae, 17(2), 149-154.

Ramírez, L. S., Isaza, J. H., Veloza, L. Á., & Stashenko, E. (2009). Actividad
antibacteriana de aceites esenciales de Lippia origanoides de diferentes
orígenes de Colombia Antibacterial activity of Lippia origanoides essential
oils from different Colombian regions, 17(December), 313–321.

Rodríguez, E. (2011). Uso de agentes antimicrobianos naturales en la

conservación de frutas y hortalizas. Ra Ximhai, 7(1), 153–170.

Contenidos Portada
RAE Resumen analítico especializado
Índice general
Índice de tablas, figuras, imágenes y fotografías
Introducción
Objetivos
Marco teórico
Aspectos metodológicos
Resultados
Discusión de resultados
Conclusiones y recomendaciones

3
 Bibliografía

Metodología Primera etapa: se realizó en tres fases

Fase I: Obtención del Material Vegetal

Fase II: Extracción de Aceites Esenciales

Fase III: Caracterización de Aceites Esenciales

Segunda etapa: Determinación del efecto antimicrobiano del AE de Mentha

Spicata (Hierbabuena), sobre los microorganismos patógenos E. coli y

Aspergillus N. A través del método de difusión de agar para establecer el

crecimiento en placa. Posteriormente se determinará la concentración

mínima inhibitoria mediante la prueba CMI colorimétrica por diluciones, con

microplatos de 96 pozos.

Tercera etapa: Inclusión del aceite esencial al producto y analisis:

determinada la concentración adecuada del AE de Mentha Spicata

(Hierbabuena) para ser incorporado en la formulación del Queso Dip,

tomando como referencia el porcentaje máximo de adición permitidas al usar

conservantes en los derivados lácteos y los resultados de concentración

mínima inhibitoria.

Cuarta etapa: Análisis Sensorial por Aproximación Multidimensional

Conclusiones Se obtuvo aceite esencial de Hierbabuena Mentha spicata cultivada en el

corregimiento de Santa helena municipio de Medellín, Antioquia, empleando

4
 la metodología de extracción por arrastre con vapor obteniendo un

rendimiento de 1,82%, por medio del análisis cromatográfico se identificó

que el componente con mayor abundancia relativa es el mentol, la actividad

bactericcida del aceite esencial para la bacteria E. Coli se presenta en la

concentración de 1024ppm y no presenta sobre Aspergillus Niger. Dado que

la concentración mínima inhibitoria es acorde con la normatividad vigente

en cuanto a los porcentajes de adición en alimentos como aditivos

conservantes, fue adicionado en la formulación y elaboración del queso Dip,

el producto final fue evaluado mediante un análisis sensorial por

aproximación multidimensional

Referencias (Albarracin et al., 2006).

(Benites et al., 2011).
bibliográficas
(Cadillo, 2014).
(CODEX STAN 192, 1995).
(Correa y Fonseca, 2004).
(Estrada, 2010).
(Gallegos et al., 2007).
(Pedraza & Henao, 2008).
(Ramírez et al., 2009).
(Solís, 2011).
(Vásquez & Alenguer, 2001).

5
 Índice General

Resumen Analítico Especializado RAE………………………..……………………..… 2

Índice general, tablas, figuras, imágenes y fotografías……………………………….….6

Introducción……………………….…………………………………………………....11

Justificación……………………….………………………………………………..…..14

Definición del problema……………………………………...…….…………………..…16

Objetivos..........................................................................................................................18

Marco Teórico y conceptual ............................................................................................19

Aspectos metodológicos……………………………………………….………………….….26

Resultados obtenidos……………………………………...…………………………....29

Discusión de resultados………………………………………………………………....42

Conclusiones y recomendaciones ....................................................................................44

Bibliografía ......................................................................................................................45

6
 Índice de tablas

Tabla 1. Caracterización de algunas especias aromáticas…………………………..… 22

Tabla 2. Datos obtenidos extracción aceite esencial de Hierbabuena …………………..33

Tabla 3. Participación de los componentes del AE de hierbabuena (Mentha spicata). ..36

Tabla 4. Halos de inhibición del AE de hierbabuena contra E. Coli………………………37

Tabla 5. Concentraciones Mínimas Inhibitorias obtenidas. ............................................40

7
 Índice de figuras

Figura 1. Extractor de aceites escenciales por arrastre con vapor. ..................................24

8
 Índice de Imágenes

Imágen 1. Gráfica resultados caracterización Cromatográfica………..…………..…… 34

Imágen 2. Identificación de compuestos con mayor abundancia relativa……………….……..35

Imágen 3. CMI Aceite esencial Hierbabuena contra Escherichia coli ATCC 8739…….38

Imágen 4. CMI Aceite esencial Hierbabuena contra Aspergillus niger ATCC 0392……38

Imágen 5. Gráfica perfil sensorial por aproximación multidimensional .........................40

9
 Índice de fotografías

Fotografía 1.Vista panorámica cultivos especies aromáticas………………..………… 30

Fotografía 2. Invernadero Hierbabuena por semanas de siembra……………………....…30

Fotografía 3. Lote muestra obtenida de Hierbabuena….……………………………………30

Fotografía 4. Muestra de Hierbabuena 7 semanas objeto del estudio.………………....…31

Fotografía 5. Montaje equipo Hidrodestilación. ..............................................................31

Fotografía 6. Muestra en recipiente de arrastre con vapor. .............................................32

Fotografía 7. Montaje Embudo de decantación para separación del aceite esencial……32

Fotografía 8. Aceite esencial obtenido…………..………………………………..…… 33

Fotografía 9. Siembra en agar con discos de papel filtro…………….…………….…...…37

Fotografía 10. Halo de inhibición, Control negativo y Control positivo…………….……..37

Fotografía 11. Foto del queso Dip con AE de Mentha spicata….……………………..……41

10
 Introducción

Las enfermedades transmitidas por alimentos, son un cuadro sintomático

ocasionado por la ingesta de alimentos contaminados por microorganismos patógenos o

sustancias químicas. Estos contaminantes presentes en los productos alimenticios se

encuentran en presentes a causa de fallas de calidad e inocuidad en las etapas de

fabricación, manipulación, almacenamiento, transporte y distribución. (Correa y

Fonseca, 2004)

La ciencia y tecnología de los alimentos se ha dedicado a investigar y desarrollar

métodos y técnicas que permitan asegurar la inocuidad y seguridad en diferentes

productos alimenticios, con el objeto de evitar la presencia de microorganismos

patógenos.

Los métodos y tecnologías para el control en materia de inocuidad son: La

irradiación, el tratamiento térmico, la refrigeración del producto terminada, las

tecnologías emergentes, el desarrollo de empaques y el uso de conservantes.

Actualmente se estudia el uso de conservantes naturales (biocidas), dentro de estas

sustancias en desarrollo se encuentran los aceites esenciales.

La marcada tendencia mundial respecto el consumo de alimentos sanos sin

aditivos sintéticos y con interesantes potenciales nutraceúticos y funcionales, ha

direccionado a la ciencia y tecnología de los alimentos para desarrollar de productos

innovadores que otorguen funcionalidad tecnológica, beneficios en la calidad

microbiológica y la conservación de los mismos. Los compuestos de origen natural

han sido empleados con el objetivo de incrementar las cualidades sensoriales y eliminar

11
del mercado de aditivos alimentarios las sustancias químicas que son cuestionadas en

materia de salud pública como son los aditivos conservantes de origen sintético.

El uso de los aceites esenciales como una alternativa para el control microbiológico en

diferentes matrices alimentarias, presenta una alternativa viable con alto potencial dados

los estudios recientes que arrojan un espectro amplio de actividad funcional, bactericida

y su biodegradabilidad comparada con los conservantes sintéticos más usados en la

industria de alimentos (García, Martínez, Ortega, & Castro, 2010).

El efecto biocida del aceite esencial en una matriz alimentaria consiste en el

mecanismo de acción sobre la membrana microbiana incrementando la fluidez y la

pérdida de iones, que conlleva a reducir significativamente la magnitud del pH, que

ocasionan el colapso y la muerte celular (Solís, 2012).

Los aceites esenciales han sido estudiados con fines de control microbiológico

en diferentes productos como los extractos, jugos de fruta, derivados cárnicos,

productos de panificación y confitería. La autoridad Europea en materia de seguridad

alimentaria ha registrado diversos aceites esenciales como saborizantes por su uso

seguro e inocuo; su homologo para América (FDA) los han considerado como

sustancias GRAS recomendando su uso como seguro, recibiendo su aprobación como

aditivos alimentarios. (Sauceda, 2011).

Los desarrollos reportados en la literatura respecto al uso de aceites esenciales

en derivados lácteos son escasos, los estudios actuales se refieren a investigaciones con

aplicación desarrolladas en derivados cárnicos y de la panificación.

12
 Se evidencia la importancia y necesidad de emprender nuevos estudios y

desarrollos referentes al uso de aceites esenciales como fuente natural de conservantes

para el control e inhibición de microorganismos patógenos causantes de enfermedades

transmitidas por alimentos, en especial en el área de los derivados lácteos, reduciendo

así el riesgo asociado a la contaminación microbiológica y obteniendo características

sensoriales y/o tecnológicas que proporcionen valor agregado a los productos.

Dando respuesta a la necesidad que tiene la industria de los alimentos en

investigar y desarrollar conservantes de origen natural para diversos productos

alimenticios, partiendo del hecho de que los aceites esenciales son sustancias permitidas

y previamente estudiadas para este fin, se ha identificado como un producto de alta

comercialización a los quesos de coagulación mixta como un producto de alto potencial

de estudio dado su alto aporte nutricional y biológico y la pertinencia en materia de

legislación vigente respecto al uso permitido de aditivos alimentarios conservantes en su

formulación.

Dado lo anterior, se planteó como trabajo aplicado una extracción del aceite

esencial de Hierbabuena (Mentha Spicata) empleando el método de arrastre por vapor

de agua o hidrodestilación simple, para estudiarlo y determinar el efecto antimicrobiano

del mismo con el propósito de su uso como aditivo conservante biocida en el queso Dip.

13
 Justificación

El presente proyecto aplicado busca contribuir a la economía de la Agroindustria

a través del aprovechamiento integral de materias primas locales abundantes,

consideradas poco relevantes pero con un gran potencial como son las plantas

aromáticas; estudiar el carácter antimicrobiano del aceite esencial extraído de la Mentha

Spicata (Hierbabuena) y su posible aplicación en alimentos de alto riesgo en salud

pública como es el queso Dip, permitirá “innovar” en el campo de los aditivos naturales,

aportando un nuevo ingrediente, que pretende prolongar la vida útil fisicoquímica,

sensorial y microbiológica del producto reduciendo perdidas y generando un

significativo valor agregado al producto final.

La pertinencia y necesidad de desarrollar el presente proyecto radica en el aporte

a la Agroindustria local, especialmente a los cultivadores de hierbas y especias

aromáticas, las cuales son uno de los sectores seleccionados como eslabones prioritarios

en la política nacional de desarrollo y cierre de brechas tecnológicas, estos subsectores

presentan poco conocimiento científico de sus plantas y una necesidad de desarrollo de

tecnologías para los diferentes eslabones de la cadena, desde la selección de las especies

vegetales a trabajar, utilización integral del material vegetal apto y no apto para exportar

para obtener nuevos productos innovadores.

Alcanzando satisfactoriamente los resultados esperados del proyecto, se podrá

prolongar la vida útil sensorial y microbiológica del queso Dip empleando ingredientes

naturales, generando un gran impacto económico para el sector productivo, reduciendo

pérdidas, generando un significativo valor agregado y por ende incrementando las

ganancias para un producto de alto consumo.

Los resultados obtenidos, podrán introducirse al sector productivo mediante un

14
modelo de transferencia tecnológica de nuevo conocimiento “Universidad-Empresa-

Estado”. Actualmente institutos de investigación pertenecientes al sector productivo

privado como Grupo Nutresa en sus diferentes unidades de negocio e instituciones

públicas como Colciencias, se encuentran desarrollando iniciativas de este tipo para

impactar comunidades de sectores productivos específicos agropecuarios buscando

desarrollar productos sanos con alto valor agregado y componente innovador.

15
 Definición del problema

El Queso tipo Dip, es un derivado Lácteo tipo untable producido por

coagulación mixta, de alta demanda en el mercado, es un producto que facilita la

sinergia sensorial con hierbas, especias y es versátil como acompañante de diversos

productos muy posicionadas en la mentalidad gourmet de consumo actual.

Estudios realizados sobre la calidad y contaminación microbiológica en quesos,

reportan la presencia de los microorganismos: Coliformes totales y Fecales, Aspergillus

niger y Staphylococcus aureus (Gallegos et al., 2007).

Según estos estudios, el deterioro de la calidad nutricional y fisicoquímica de

este tipo de derivado lácteo es causado por la presencia de los microorganismos E. Coli

ssp. y Aspergillus niger, los cuales tienen ampliamente demostrada una actividad

patógena sobre los consumidores.

La formulación y producción del queso tipo Dip, contempla en su flujograma de

proceso etapas con tratamientos térmicos, aplicación de buenas prácticas de

manufactura (BPM) y uso regulado de aditivos antimicrobianos, todo ello con el fin de

prevenir la presencia y desarrollo de estos microorgnismos patógenos en el producto

final con destino de consumo masivo. Actualmente, en la formulación del Queso Dip se

emplean aditivos biocidas de origen sintético, los más empleados son el Sorbato de

Potasio y el Benzoato de Sodio; según la regulación internacional contemplada, el

Codex Alimentarius expedido por OMS en 1995, estos pueden ser usados en una

cantidad no superior al 0.1%.

Actualmente, el uso de compuestos sintetizados químicamente viene siendo

cuestionado por la autoridades y consumidores por sus impactos sobre la salud al ser

16
consumidos de manera prolongada, es por ello que se presenta una marcada tendencia

hacia la alimentación más sana y natural, adicionalmente a esta tendencia saludable,

diferentes estudios han asociado aditivos sintéticos a patologías cancerígenas y

teratogénicas por su toxicidad residual, lo cual es actualmente una preocupación para las

autoridades sanitarias a nivel mundial como la Food and Drug Administration (FDA),

quienes coordinan estudios sobre consecuencias en materia de salud por consumo de

estos aditivos y han comenzado a vigilar estrictamente e incluso como en la Unión

Europea a restringir el uso de estos aditivos cuestionados por efectos adversos en salud.

Reemplazar aditivos conservantes y antimicrobianos tradicionales de origen

sintético, se ha convertido en una prioridad para la industria alimentaria; las tendencias

en investigación, desarrollo e innovación en alimentos de los últimos años se refieren al

diseño y formulación de productos más sanos con actividad bioactiva y funcional,

encaminados a un mercado creciente de consumidores preocupados por la salud donde

se destaca el uso de plantas aromáticas para obtener sustancias bioactivas.

¿Cuál es el efecto antimicrobiano, fisicoquímico y sensorial del aceite de Mentha

spicata sobre el queso tipo Dip?

17
 Objetivos

Objetivo General

Determinar el efecto antimicrobiano, fisicoquímico y sensorial del aceite esencial

extraído de la Mentha Spicata (Hierbabuena) empleado como conservante en el Queso

Dip.

Objetivos específicos

Analizar el aceite esencial de Mentha Spicata (Hierbabuena) extraído usando método de

arrastre con vapor y caracterizar el aceite esencial obtenido por medio de Cromatografía

de Gases con acople a Espectrómetro de Masas (CG-EM).

Determinar el efecto biocida del aceite esencial de Mentha Spicata (Hierbabuena) sobre

los microorganismos de interes E. Coli y Aspergillus Niger.

Establecer la formulación de un Queso Dip empleando el aceite esencial de Mentha

Spicata (Hierbabuena) como aditivo conservante de origen natural.

Caracterizar las propiedades microbiológicas, sensoriales y fisicoquímicas del Queso

Dip adicionado con el aceite esencial.

Línea de Investigación

Ciencia y Tecnología de los Alimentos

18
 Marco Teórico y conceptual

Enfermedades Transmitidas por ingesta de Alimentos Contaminados

Las ETAs o enfermedades transmitidas por alimentos son cuadros clínicos de

carácter sintomáticos que son ocasionados por el consumo de alimentos o agua con

presencia de microorganismos patógenos o sustancias toxicas. (Orberá R., 2004).

Las enfermedades transmitidas por alimentos son ampliamente reportadas por las

autoridades sanitarias y tienen un importante impacto negativo en materia de salud

pública y en la economía global, la persistencia de las ETAs se atribuye a factores como

la geo demografía, cultura y economia. (Gandhi & Chikindas, 2007).

Para la región de Latinoamérica, la OPS como organización directora, ha

trabajado con los países del hemisferio, buscando una respuesta efectiva respecto al

tema de las enfermedades transmitidas por alimentos, buscando crear y fortalecer los

programas nacionales de vigilancia y control de alimentos. No obstante, se han

evidenciado debilidades en la implementación de dichos programas, especialmente en

cuanto a la notificación y seguimiento de los brotes y el análisis de datos obtenidos para

direccionar a las autoridades sanitarias en cuanto a la identificación del tipo de

microorganismos patógenos causantes de diferentes cuadros clínicos y así evitar que se

sigan presentando (Kopper et al., 2009).

19
 En Colombia las ETAs son catalogadas por las autoridades sanitarias como un

grave problema de salud pública, dado que se han reportado y registrado un incremento

en el reporte anual de brotes de enfermedades, se resalta que a partir del año 2010 se ha

visto un incremento gradual, destacando una importante participación de los casos por

parte del departamento de Antioquia (Marina, 2010).

Tecnologías para la prevención de ETAs

Los diferentes sistemas de calidad adoptados en el mundo con el ánimo de

garantizar la inocuidad de los alimentos, han establecido y regulado diversos métodos

para evitar la contaminación microbiana, estas directrices básicamente han descrito

diferentes metodologías y tecnologías. Dentro de los métodos de control microbiológico

y de calidad más utilizados se destacan: las tecnologías para aplicar tratamientos

térmicos, el almacenamiento en condiciones de refrigeración, el desarrollo de empaques

y atmosferas modificadas y el uso de conservantes químicos.

Métodos empleados para tratamiento térmico

Los microorganismos patógenos: bacterias y levaduras son eliminados a

temperaturas cercanas a los 100 grados Celsius, algunos bacilos capaces de esporular

presentan resistencias al calor. Los tratamientos térmicos generalmente deben

acompañarse de otras medidas de control, para evitar la presencia de patógenos en el

producto final. Dentro de los tratamientos térmicos más empleados actualmente se

encuentra la pasterización y la esterilización. (Forsythe, Hayes, Pérez, & Scott, 2002).

20
Aditivos conservantes y biocidas químicos

El control microbiológico ejercido por estas sustancias tiene como fundamento

la reducción del pH y la actividad acuosa del producto al cual han sido adicionados. En

este grupo de aditivos conservantes se destacan los siguientes compuestos permitidos

para su uso en alimentos: benzoatos, acetatos, sorbatos, propionatos, y antibióticos.

Estos compuestos tienen un efecto bactericida que destruye los microorganismos

patógenos o actúan fundamentalmente como inhibidores que se conocen como

bacteriostáticos del crecimiento microbiano.

El uso de los aditivos conservantes está regulado por las autoridades sanitarias

mundiales y nacionales, referente a las concentraciones permitidas en Colombia, solo se

puede añadir un conservante hasta el 0.1% en la formulación de una matriz alimentaria.

(Sauceda, 2011).

Sustancias naturales de conservación

Las plantas mediante su metabolismo secundario tienen la capacidad de

sintetizar sustancias aromáticas, que son fenoles y terpenos, dentro de esta mezcla de

compuestos obtenidos por diferentes metodologías de extracción y purificación se

destacan los aceites esenciales provenientes de las especias aromáticas, diferentes

estudios a partir de estos compuestos se han encontrado actividad inhibitoria sobre

bacterias y hongos (Acevedo et al., 2007).

Los aceites esenciales poseen una demostrada funcionalidad como:

farmacológicos, antioxidantes y biocidas, adicionalmente son más biodegradables que

otras sustancias como antibióticos y conservantes de uso tradicional en alimentos (Ríos

& Recio, 2005).

21
Mecanismo de acción bactericida de los aceites esenciales

El fenómeno bioquímico o mecanismo es el de incrementar la permeabilidad de

la membrana microbiana, permeando la membrana citoplasmática ocasionando la

pérdida de iones, esto conduce a la disminución del pH, así mismo, se ha demostrado la

inhibición en la síntesis de ATP y la replicación de ADN, eventos que conllevan a la

muerte celular. (Ben Arfa et al., 2006).

Algunos estudios del efecto antimicrobiano de los aceites esenciales sobre

microorganismos patógenos y su caracterización se pueden observar en la tabla 1.

Tabla 1. Caracterización de algunas especies aromáticas (Acevedo 2007)

22
Fundamentos de los Aceites Esenciales

Los AEs son productos químicos derivados del metabolismo secundario de las

plantas y estan presentes en diferentes partes de las mismas, especialmente en las hojas.

Son mezclas de componentes volátiles que poseen una fracción de hidrocarburos

polimetilénicos conocidos como terpenos, junto con otros compuestos casi siempre

oxigenados como mezclas complejas de aldehídos, cetonas, ésteres y terpenos, con alta

solubilidad en alcohol y característica apolar. Esta composición quimica atribuye a los

aceites esenciales un aroma característico y les reviste interés tecnológico en las

industrias farmacéuticas y alimenticias. (García et al., 2010).

Metodologías para la extracción de los aceites esenciales

Para obtener el aceite esencial contenido en la muestra en fresco de material

vegetal, se han reportado diferentes técnicas y métodos dentro de las cuales se destacan:

el enfleurage, el arrastre con vapor de agua y la extracción por fluidos supercríticos

empleando gas carbónico, estas técnicas se han empleado para cada estudio

dependiendo de las necesidades. (Martinez M., 2003).

El método más utilizado para obtener aceites esenciales es la destilación simple:

hidrodestilación y el arrastre por vapor, técnicas sencillas y económicas.

El método del extracción por arrastre con vapor es una técnica consiste en tomar

una muestra vegetal fresca, la cual es depositada en una cámara sometida a un flujo

constante de vapor saturado; El aceite esencial es arrastrado y posteriormente

condensado, para ser recolentado en un embudo de decantación donde es separado de la

fracción acuosa. Esta metodología reporta altos rendimientos y pureza del aceite

obtenido. (Peredo, Garcia, & Lopez, 2009).

23
 Figura 1. Extractor de aceites esenciales por arrastre con vapor (Martínez, 2003)

Caracterización de los Aceites esenciales

Los estudios realizados sobre composición química de aceites esenciales

pretenden identificar los componentes individuales mediante técnicas analíticas que

abarcan el aislamiento y la purificación de las sustancias.

Dentro de estas técnicas analíticas se destaca la cromatografía de gases, una tecnología

que permite la separación de mezclas; una vez separados los compuestos se pueden

detectar e incluso cuantificar individualmente. (Gutiérrez & Droguet, 2002).

Acoplado a la cromatografia se emplea la espectrometría de masas, por medio de la

cual se puede identificar cualquier sustancia pura. (Gutiérrez & Droguet, 2002).

Métodos implementados para la identificación de actividad biocida en los AEs

Metodología de halos de inhibición

24
 Es un estudio fundamentado en la difusión en disco de papel filtro, este método

permite identificar si hay inhibición sobre el crecimiento de los microorganismos

patógenos a estudiar, se utilizan cajas de Petri inoculadas con el MO a evaluar; se

emplean los siguientes métodos para la incorporación del AE: en un disco de papel

filtro o un pozo en medio de la placa.

La actividad antimicrobiana es observable y se mide por el diámetro en la zona de

inhibición que rodea el disco y se registra en milímetros (Cano, Bonilla, & Roque,

2008).

La sustancia antimicrobiana difunde desde el disco de papel impregnado hacia el

medio produciendo un perímetro de inhibición en la cual una concentración específica

inhibe el crecimiento poblacional de la bacteria que se estudia.

Hierbabuena

La variedad Mentha espicata es una especia aromatica originaria de Asia,

pertenece a la familia Lamiaceae, que puede llegar a medir hasta 30 centímetros de

altura, tiene Hojas verdes oscuras y ovaladas con un marcado aroma a menta, es una

planta perenne, catalogada como su arbusto, como la mayoria de las especias aromáticas

es el tallo erecto con hojas enteras. (Fuentes, 2005).

25
 Aspectos Metodológicos

Primera etapa:

La primera etapa del proyecto se realizó en tres fases: la obtención de material

vegetal, la extracción del aceite esencial y su respectiva caracterización:

Fase I: Obtención del Material Vegetal:

El material vegetal se obtuvo en el corregimiento de Santa Helena, Municipio de

Medellín, Oriente Antioqueño Cercano, Este material será verde y fresco de corte

reciente cosechado a siete semanas de cultivado, se acopiaran 1 kilogramos para cada

sesión de extracción, este material será acondicionado mediante limpieza y separación

de tallos

Fase II: Extracción de Aceites Esenciales:

Se empleó el método de arrastre con vapor porque es la técnica más económica y

de fácil montaje, se reportan óptimos rendimientos en la literatura a bajo costo. En esta

fase se realizó el montaje y la optimización del método de extracción del AE en las

instalaciones de la UNAD CEAD Medellín.

El montaje requiere de tres componentes básicos: generador de vapor, tanque de

extracción y condensador, además de tres variables importantes como: tiempo de secado

del material, tiempo de extracción, presión de vapor, temperatura de destilación y

eficiencia del condensador. Con un buen control de los factores anteriormente

mencionados se han alcanzado rendimientos en la extracción de AEs en el rango de

0.15% al 1%expresado en volumen (mL)/100 (g).

Fase III: Caracterización de Aceites Esenciales:

26
 Posterior a la extracción se realizó la caracterización química del aceite esencial,

con la finalidad de determinar sus componentes bioactivos, esto se logró usando la

técnica Cromatografía de gases acoplada a Espectrometría de masa (CG-EM). La

identificación de las sustancias se basó en un análisis comparativo de sus espectros de

masas con el banco de datos.

Segunda etapa: Determinación del efecto biocida

La segunda etapa del trabajo se centró en determinar el efecto biocida del AE de

Mentha Spicata (Hierbabuena), sobre los microorganismos de interés: E. coli spp y

Aspergillus Niger, cepas que fueron adquiridas en laboratorio de referencia para la

prueba CMI, se empleó el método de difusión de agar para estimar el grado de

inhibición o crecimiento de los microorganismos. Se usó para la incorporación del AE

el método en disco de papel filtro. El efecto biocida del AE se estableció observando y

midiendo el diámetro de la zona o halo de inhibición alrededor del disco de papel filtro

impregnado. (Kalemba & Kunicka, 2003).

Estandarización para implementar el método en disco de papel filtro y CMI

Para la muestra control y la muestra testigo, se emplearon dos de los aditivos

conservantes más comunes en la industria láctea para la formulación de un queso Dip:

Sal de sodio del ácido benzoico y sal de potasio del ácido sorbico en concentración 0.01%,

acorde con la dosis establecida por la resolución 4125 de 1991.

Posteriormente se determinó la concentración mínima inhibitoria mediante la

prueba CMI colorimétrica por diluciones, ensayos con cepas de E. Coli y Aspergillus

Niger, con microplatos de 96 pozos (Ciro Gelmy, 2010).

El crecimiento de la bacteria se comparó con una muestra control y una muestra testigo.

27
Tercera etapa: Inclusión del aceite esencial al producto y análisis

En esta etapa del proyecto hallada la concentración adecuada del AE de Mentha

Spicata (Hierbabuena) para ser incorporado en la formulación del Queso Dip, para lo

cual se tomó como referencia el porcentaje máximo de adición permitidas al usar

conservantes en los derivados lácteos y los resultados de concentración mínima

inhibitoria. Además, se evaluó el momento y modo de inclusión de este aditivo,

tomando los tres momentos cruciales del proceso de fabricación del Queso Dip, con el

fin de lograr estandarizar el momento del proceso de elaboración adecuado para

adicionar el AE; el modo de inclusión se realizó basándose en los análisis de difusión de

los AEs.

Cuarta etapa: Análisis Sensorial por aproximación Multidimensional

Los análisis sensoriales se realizaron con el objetivo de conocer la preferencia,

aceptación y grado de satisfacción de los posibles consumidores determinando la

posible diferencia entre los caracteres sensoriales propios del producto. El conjunto de

pruebas, utilizadas para la valoración de los caracteres sensoriales de un queso Dip se

distribuye en tres grupos: hedónicas, discriminantes y descriptivas (Goñi et al., 2009).

Se realizó una prueba discriminativa, para la cual se contrataron por servicios técnicos

la prueba por jueces entrenados. Los análisis sensoriales: color, olor, sabor y textura se

diseñaron con una prueba de Perfil Sensorial por aproximación multidimensional según

los parámetros establecidos en la NTC 3932 y GTC 165, para determinar cambios en la

calidad sensorial del producto con diferentes niveles de adición del AE. Se diseñó una

prueba hedónica, en la cual los panelistas determinaron la aceptación del Queso Dip con

AE de Hierbabuena.

28
 Resultados obtenidos

1. Primera etapa:

La primera etapa del proyecto se ha realizado en tres fases: la obtención de

material vegetal, la extracción del aceite esencial y su respectiva caracterización:

1.1. Obtención del Material Vegetal:

Características del material obtenido:

Este material recolectado de la especie Hierbabuena (Mentha spicatta) es verde

y fresco, condiciones fenotípicas aptas para exportación, de corte reciente cosechada a

siete semanas de cultivado, se acopian 6 Kilogramos para emplear 1 kilogramo en Seis

sesión programadas para la extracción del aceite esencial. Este material será

acondicionado mediante limpieza y separación de tallos.

Fotografía 1. Vista panorámica cultivos especies aromáticas. Morales J.

29
 Fotografía 2. Invernadero Hierbabuena por semanas de siembra. Morales J.

Fotografía 3. Lote muestra obtenida de Hierbabuena 7 semanas. Morales J.

Fotografía 4. Muestra de Hierbabuena 7 semanas objeto del estudio. Morales J.

30
1.2. Proceso de extracción del aceite esencial:

Se utilizó el método de arrastre con vapor de agua porque es la técnica más

económica y de fácil montaje, el equipo empleado se visualiza en la fotografía número

5, se realizaron doce sesiones de extracción que duraron 45 minutos cada una.

Fotografía 5. Montaje equipo Hidrodestilación. Morales J.

Admisión de la muestra el equipo de extracción:

Se emplearon 1000 gramos de muestra aproximadamente tras la adecuación del

material vegetal según se reporta en la tabla 1.

31
 Fotografía 6. Muestra en recipiente de arrastre con vapor. Morales J.

Fotografía 7. Montaje Embudo de decantación para separación del aceite esencial.

Morales J.

32
 Fotografía 8. Aceite esencial obtenido. Morales J.

1.3. Caracterización del aceite esencial:

Se realizó la caracterización química del aceite esencial, con la finalidad de

determinar sus componentes bioactivos empleando la técnica de Cromatografía de gases

acoplada a Espectrometría de masa (CG-EM). La identificación de las sustancias será

basada en un análisis comparativo de sus espectros de masas con el banco de datos.

Tabla 2. Datos obtenidos extraccion del aceite esencial de Hierbabuena

Cálculo de rendimiento extracción (%):

Volumen obtenido AE (ml) * densidad (0,9 g/ml) / Masa muestra (g) * 100

33
Sesión de muestra temperatura Presión Tiempo AE Calculo del

extracción peso en de trabajo cilindro empleado obtenido rendimiento

Nro. fresco (g) (°C) (PSI) (min) (mL) (%)

1 946 95-100 30 45 1,9 1,80

2 1103 90-95 30 45 2,3 1,87

3 990 94-98 30 45 2,0 1,81

4 1032 97-100 30 45 2,1 1,83

5 988 92-98 30 45 2,0 1,82

6 1040 95-98 30 45 2,2 1,90

7 930 96-100 30 45 1,9 1,83

8 1030 94-98 30 45 2,1 1,83

9 984 97-99 30 45 2,0 1,82

10 1000 98-100 30 45 2,0 1,80

11 1100 96-100 30 45 2,2 1,80

12 1040 97-99 30 45 2,1 1,81

34
 Imágen 1. Grafica resultados caracterización Cromatográfica

La identificación individual de los compuestos se estableció según los espectros

de masas, usando la base de datos que presente una mayor probabilidad de coincidencia

en las bases de datos NISTO2.L y NIST5A.L mayores a 90%.

La siguiente información es generada por el software MSD 100CHEM Station. En esta

se identifican:

(1) Numero de pico, (2) Tiempo de retención, (3) Porcentaje de área, (4) Base de datos e

identificación tentativa, (5) referencia en las bases de datos NIST, (6) Numero CAS del

compuesto y (7) Probabilidad de coincidencia.

35
 Imagen 2. Identificación de compuestos con mayor abundancia relativa

Tabla 3. Participación de los componentes del AE de hierbabuena (Mentha spicata).

Tiempo de Componentes Tiempo de Abundancia

cosecha mayoritarios retención (min) relativa (%)

Menthol 19.582 75.96

7 semanas
Carvotanaceton 21.67 5.90

2. Segunda etapa: Determinación del efecto antimicrobiano

La segunda etapa del trabajo se concentró en determinar el efecto biocida del AE

de Mentha Spicata (Hierbabuena), sobre la actividad patógena los microorganismos

objeto del estudio.

Los microorganismos de referencia empleados en el estudio son: Escherichia coli

ATCC 8739 y Aspergillus niger ATCC 0392.

36
2.1. Estudio del grado de inhibición del crecimiento de microorganismos:

Fotografía 9. Siembra en agar con discos de papel filtro. Morales J.

Fotografía 10. Halo de inhibición Control negativo, Control positivo y. Morales J.

Tabla 4. Halos de inhibición del AE de hierbabuena sobre E. Coli.

Caja 1 Caja 2 Caja 3

Concentración empleada AE (mm) (mm) (mm)

14 µL 13 11 12

37
 Caja de Petri
No se observa crecimiento del MO.
control negativo

Se observa crecimiento del

Caja de Petri control positivo microorganismo de forma uniforme y

completa.

2.2. Estudio de la Concentración Mínima Inhibitoria del Aceite esencial:

Para la evaluación de la CMI del aceite esencial de Hierbabuena, fue utilizado el

método colorimétrico de microdilución.

La prueba se efectuó en dos micro platos de 96 pozos con fondo plano. Inicialmente, se

realizaron diluciones seriadas del aceite esencial en diferentes concentraciones hasta

8192 partes por millón.

Se realizó la siembra en los pozos de una fila a los cuales se le adicionó el medio

para cultivo: caldo MH. Una alícuota de los microorganismos, en crecimiento

exponencial, se diluyó hasta una absorbancia similar al patrón de McFarland

(1,5x108UFC/mL), suspensión microbiana que fue utilizado inocular los microplacas.

La incubación de los microplatos se realizó a 37° C durante 4 h. Como controles de la

prueba se implementó el control del medio de cultivo con el inóculo, el control del

medio de cultivo estéril y el control del diluyente.

Cada una de las muestras fue evaluada por triplicado.

Transcurridas 4 horas después de la incubación se adicionó bromuro MTT en

una concentración de 0.8 mg / mL a cada pozo y las placas se incubaron a 37 grados

38
Celsius por una hora, tiempo necesario para que los microorganismos metabolicen el

MTT.

Un cambio de color a un azul nos demuestra visualmente el crecimiento del MO.

Imagen 3. CMI Aceite esencial Hierbabuena contra Escherichia coli ATCC 8739

Imagen 4. CMI Aceite esencial Hierbabuena contra Aspergillus niger ATCC 0392.

39
 Tabla 5. Concentraciones Mínimas Inhibitorias obtenidas.

ACEITE ESENCIAL MICROORGANISMO

Hierbabuena (Mentha Escherichia coli ATCC Aspergillus niger ATCC

spicata) 8739 0392

1024 *

* No presento actividad antimicrobiana en los rangos de 8 a 8192 ppm

(0.08– 8.192 %)

3. Tercera etapa: Inclusión del aceite esencial al producto y análisis

Elaboración y Análisis Sensorial del queso Dip

El queso Dip fue elaborado usando leche pasterizada y homogenizada con una

acidez titulable de 0,16% de ácido láctico según la norma vigente con una adición de

crema de leche del 20% sobre la base de la formulación en gramos, el queso untable se

obtuvo por medio de coagulación mixta a 35 grados Celsius usando bacterias acido

lácticas y cuajo de origen fúngico, luego de desuerado se procedió a adicionar el aceite

esencial en concentración de 1024 ppm acorde con la normativa de aditivos

conservantes, posteriormente se empaco en estéril y almaceno en condiciones de

refrigeración.

Se envió muestra para realizar la prueba sensorial mediante un perfil por

aproximación multidimensional, la evaluación por parte de jueces entrenados se

registran en la gráfica 1. La calidad del queso Dip fue establecida como media - alta, la

nota de sabor que resalta es refrescante con alta intensidad. La característica física

predominante fue la yesosidad del queso, cabe anotar que esta característica no se le

40
atribuye a la adición de AE, esta se atribuyen los insumos empleados en la formulación

del queso Dip.

Los aspectos físicos y de apariencia general son los caracteristicos del queso

Dip. Se evidencia la pérdida parcial de notas lácteas, sobresale la nota herbal, lo cual es

atribuible a la adición del AE de hierbabuena.

Imagen 5. Gráfica perfil sensorial.

Fotografía 11. Foto del queso Dip con AE de hierbabuena

41
 Discusión de resultados

Proceso de extracción

Trabajos realizados para extraer de especias aceites esenciales empleando la

metodología de arrastre con vapor reportan rendimientos de 1.3%. (Martinello &

Pramparo, 2005).

Mediante la implementacion de la metodología de destilación simple con vapor

de agua se reportan rendimientos de 1.35% (Cerpa, 2007).

Los rendimientos y pureza obtenidos en las sesiones de extracción se encuentran

acordes con lo reportado en la literatura, donde se expresan rendimientos desde 0.5

hasta el 2% de aceite esencial.

Se puede afirmar que empleando para el estudio la metodología de arrastre con

vapor, los porcentajes en cuanto a rendimientos de extracción son menores al 1,96%, se

exceptúan resultados de experimentos a partir del clavo de olor donde se reportan altos

contenidos de aceites esenciales empleando la misma metodologia. (Ribeiro, 2001).

Estudio del aceite esencial extraído

El cromatograma obtenido del análisis CG-EM efectuado al aceite esencial de

hierbabuena ilustra al Mentol como componente mayoritario con una abundancia

relativa de 75.96% como se ilustra en la tabla 6.

A este compuesto se le puede atribuir la nota menta como característica de olor y sabor

en el producto final y se supone la mayor responsabilidad en el efecto biocida.

Actividad inhibitoria sobre microorganismos de estudio

42
 El aceite esencial de hierbabuena presento actividad antimicrobiana frente al

microorganismo patógeno E. coli. Los resultados de la metodología de la inhibcion en

placas de petri en la tabla 4, donde se evidencia esta actividad. En la imágen 3 y la

imágen 4, se relacionan los resultados encontrados en la prueba de CMI, donde se

observa actividad bactericida en 1024 ppm como concentración mínima sobre E. coli. y

no se presenta inhibición de crecimiento sobre Aspergillus niger.

Análisis sensorial del producto con el aceite esencial aplicado

Los resultados arrojados al someter la muestra a un estudio sensorial, se pueden

apreciar en la Imagen 5. Se estableció para el queso Dip una calidad genera media -

alta, aunque hay pérdida parcial de notas lácteas, sobresaliendo atributos sensoriales

como el herbal producido por la adición del AE de hierbabuena es una evaluación de

aceptación positiva dado el alto impacto de los aceites esenciales en matrices

alimentarias.

En investigaciones relacionadas con los derivados lácteos adicionando AE de tomillo

en quesos y en bebidas lácteas con aceites esenciales de clavo de olor y la canela, estos

resultados demostraron que las características organolépticas son afectadas

siginificativamente, lo cual refuerza que la sinergia y matiz sensorial de sabor y olor del

mentol en quesos tipo Dip es prometedora.

43
 Conclusiones y recomendaciones

La especia aromática Hierbabuena (Mentha Spicata) cultivada en el

corregimiento de Santa Helena Antioquia, cosechada con 7 semanas al corte fue

seleccionada en cuanto al tiempo para la extracción del aceite esencial por ser esta la

edad óptima para su comercialización y/o exportación dada su plenitud de

características físicas y bilógicas, respecto a los rendimientos de extracción se puede

afirmar que no obstante el uso de la metodología de extracción del aceite esencial por

arrastre con vapor cuyo rendimiento y pureza es inferior a técnicas analíticas como la

extracción por fluidos supercríticos, se obtuvieron rendimientos y pureza acordes con

los reportados en el estado del arte; En cuanto al análisis de componentes se encontró

como el componente de mayor abundancia en el aceite esencial extraído el menthol; El

efecto bactericida sobre el microorganismo patógeno E. Coli ssp en su concentración

mínima inhibitoria es 1024ppm y no hay actividad biocida sobre el microrganismo

Aspergillus Niger. La formulación del queso Dip y su elaboración se realizó bajo las

condiciones de proceso ceñidos a la normatividad vigente y la muestra sometida a la

evaluación sensorial permite recomendar el uso del aceite esencial estudiado como

aditivo antimicrobiano de origen natural para el queso tipo Dip.

Los resultados sugieren como recomendación general el desarrollo de otros

estudios, para cubrir un amplio espectro de microorganismos patógenos empleando el

aceite esencial de hierbabuena y a su vez estudiar los Aes provenientes de otras especias

aromáticas que se cultivan en la región de Antioquia con alto potencial de

aprovechamiento de residuos agroindustriales provenientes de esta cadena productiva.

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