ADN Recombinante

El término DNA recombinante hace referencia a la creación de nuevas combinaciones de segmentos

o de moléculas de DNA que no se encuentran juntas de manera natural. Aunque el proceso genético
de la recombinación produce DNA recombinante, este término se reserva a las moléculas de DNA
producidas por la unión de segmentos que provienen de diferentes fuentes biológicas.

La tecnología del DNA recombinante utiliza técnicas que provienen de la bioquímica de los ácidos
nucleicos unidas a metodologías genéricas desarrolladas originalmente para la investigación de
bacterias y de virus. La utilización del DNA recombinante es una herramienta poderosa para el
aislamiento de poblaciones puras de secuencias específicas de DNA a partir de una población de
secuencias mezcladas. Los procedimientos básicos incluyen una serie de pasos:

1. Los fragmentos de DNA se generan utilizando unas enzimas denominadas endonucleasas de

restricción, que reconocen y cortan las moléculas de DNA por secuencias nucleotídicas
específicas.

2. Los fragmentos producidos mediante la digestión con enzimas de restricción se unen a otras
moléculas de DNA que sirven de vectores. Los vectores pueden replicarse autónomamente en
una célula huésped y facilitan la manipulación de la molécula de DNA recombinante recién
creada.

3. La molécula de DNA recombinante, formada por un vector que lleva un segmento de DNA
insertado, se transfiere a una célula huésped. Dentro de esta célula, la molécula de DNA
recombinante se replica, produciendo docenas de copias idénticas conocidas como “clones”.

4. Al replicarse las células huésped, las células descendientes heredan el DNA recombinante,
creándose una población de células idénticas, que llevan toda la secuencia clonada: Biblioteca
de ADN (genoteca).

5. Los segmentos de DNA clonados pueden recuperarse de las células huésped, purificarse y
analizarse.

6. Potencialmente, el DNA clonado puede transcribirse, su mRNA puede traducirse, y el producto

génico puede aislarse y examinarse. (Hibridación)

Enzimas
• ADN ligasa: une dos fragmentos de ADN
• ADN polimerasa I (E. coli): polimeriza a partir de extremo 3´OH
• Transcriptasa reversa: copia ADN de molde de ARN (retrovirus)
• Polinucleótido quinasa: agrega los grupos fosfata a extremos 5´OH
• Endonucleasa de restricción: digieren el ADN en secuencias específicas.

Endonucleasa de restricción
La piedra angular de la tecnología del DNA recombinante es un tipo de enzimas denominadas
endonucleasas de restricción. Estas enzimas, aisladas en bacterias, reciben este nombre debido a
que limitan o previenen las infecciones víricas degradando el ácido nucleico invasor. Las enzimas de
restricción reconocen una secuencia específica de nucleótidos (denominada sitio de restricción) de
una molécula de DNA de doble cadena, y cortan el DNA por esa secuencia (4-8 pares de bases).
Encargándose de proteger el ADN de la bacteria huésped del genoma de ADN de organismos

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extraños, mediante la inactivación específica del ADN del organismo extraño por digestión. Estas
endonucleasas obligatoriamente poseen una enzima acompañante que metila específicamente el
ADN del huésped bacteriano.

Las diferentes nucleasas de restricción tienen diferentes especificidades de secuencia.

• Enzimas que generan “extremos romos” (parejos)

• Enzimas que generan “extremos cohesivos o pegajosos” (desparejos): ya que cada cola
puede formar pares de bases complementarias con la cola en cualquier otro extremo
producido por la misma enzima, que permiten que dos fragmentos de ADN se unan
fácilmente juntos, siempre que los fragmentos se hayan generado con la misma nucleasa
de restricción (o con otra nucleasa que produzca los mismos extremos cohesivos).

Para complementar el uso de endonucleasas, se ha comenzado a utilizar recombinasas que llevan

a cabo la recombinación homóloga.

Sistema CRISPR-Cas9: representa una forma de inmunidad adquirida para prevenir la

reinfección de una bacteria. Usa la orientación basada en ARN para llevar la nucleasa Cas9 al
ADN extraño (complementario). Permitiendo la delección, visualización y edición de genes e
incluso la modulación de la transcripción de genes.

Sistema mi/siARN: gran similitud con CRISPR-Cas9

Se siguen ambos con fines experimentales y terapéuticos.

Clonación
Un clon es una gran población de moléculas, células u organismos idénticos que surgen de un
ancestro en común. Esto permite la producción de un gran número de moléculas de ADN idéntico;
para ello se necesitan vectores de clonación:

*Vectores
Después de unirse a un vector o vehículo de clonación, un segmento de DNA puede llegar a entrar
en una célula huésped y replicarse o clonarse. Los vectores son, esencialmente, moléculas de DNA
transportadoras. Para servir de vector, una molécula de DNA debe tener unas determinadas
características:

1. Debe poder replicarse independientemente junto con el segmento de DNA que transporta.

2. Debe contener algunos sitios de corte para enzimas de restricción, presentes sólo una vez en
el vector. Estos sitios de restricción se cortan con una enzima de restricción y se utilizan para
insertar segmentos de DNA cortados con la misma enzima.

3. Debe tener algún marcador de selección (normalmente genes de resistencia a antibióticos o

genes de enzimas que la célula huésped no tiene) para poder distinguir las células huésped
que transportan el vector de las que no lo contienen.

4. El vector de la célula huésped debe ser fácil de recuperar.

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*Tipos
• Plásmidos
Los plásmidos son moléculas de DNA de doble cadena extracromosómicas de origen natural
que tienen un origen de replicación (ori+) y que se replican autónomamente en las células
bacterianas. Para poder utilizarlos en ingeniería genética, se han modificado o diseñado
muchos plásmidos de manera que contengan un número limitado de sitios de restricción y
genes de resistencia a antibiótico s específicos. Tienen tamaño pequeño, se replican con
independencia del ADN bacteriano como episomas
Ejemplo: el vector El vector pBR322 fue uno de los primeros plásmidos diseñados que se
utilizó en DNA recombinante. Este plásmido tiene un origen de replicación (ori+), dos genes
de selección (resistencia a los antibióticos ampicilina y tetraciclina), y algunos sitios de
restricción únicos.
• Fagos
Poseen genoma de ADN lineal; una ventaja de este vector es que pueden aceptar
fragmentos de ADN de hasta 20 Kb de longitud; el tamaño de ADN que se puede aceptar
se debe a la cantidad de ADN que puede empaquetar la cabeza del fago durante la
propagación del virus.
• Cósmidos
Estos cósmidos combinan las mejores características de plásmidos y fagos; estos pueden
aceptar fragmentos de hasta 35-50 Kb de longitud. Los cósmidos contienen la secuencia
“cos” del fago lambda, necesaria para el empaquetamiento del DNA del fago dentro de su
cubierta proteica, y secuencias plasmídicas de replicación y de genes de resistencia a
antibióticos, que permiten identificar las células huésped que los contienen.
• Otros: Existen fragmentos más grandes de ADN que se pueden incorporar en el
cromosoma artificial bacteriano (BAC), cromosoma artificial de levadura (YAC) o a los
vectores de cromosoma artificial derivados del bacteriófago P1 (PAC); estos vectores han
remplazado en gran medida a los plásmidos, fagos y cósmidos para algunas aplicaciones
de clonación y mapeo de genes eucarióticos.}

Genoteca o biblioteca de ADN

Puesto que cada segmento de DNA clonado es relativamente pequeño, deben construirse muchos
clones diferentes para incluir todas las pequeñas porciones del genoma de un organismo. El conjunto
clonado de todas las secuencias genómicas de un sólo individuo se denomina biblioteca. Las
bibliotecas genómicas (o genotecas) suelen construirse utilizando vectores fágicos, que pueden
contener grandes fragmentos cromosómicos. En una biblioteca genómica están representados
todos los genes de un organismo. La biblioteca es un medio para recuperar cualquier gen del
genoma del organismo, pudiéndose estudiar con detalle junto con sus secuencias reguladoras
adyacentes. Teóricamente, una biblioteca genómica contiene al menos una copia de todas las
secuencias representadas en el genoma. Sin embargo, cada molécula de vector puede contener sólo
unas relativamente pocas kilobases de DNA insertado, por lo que una de las primeras tareas al
preparar una biblioteca genómica es seleccionar el vector más adecuado para contener el genoma
completo en el menor número posible de clones.

Para detectar moléculas de cADN específicas en genotecas y para producir proteínas mediante
técnicas de ingeniería genética; se usan a los vectores de expresión, el caul es virus o plásmido
que lleva una secuencia de ADN a una célula huésped adecuada y allí dirige la síntesis de
la proteína codificada por la secuencia.

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  Sondas de búsqueda
Son pedazos de ADN o ARN marcados con fluorescencia; esta sonda reconoce una
secuencia complementaria. Las sondas de cADN/oligonucleótido/cARN para detectar
fragmentos de ADN por electrotransferencia Southern y para detectar y cuantificar
ARN en transferencia Northern Blot.
 Colectivo de electrotransferencia
 Electrotransferencia Southern (ADN): determina cuantas copias de un gen hay
en un tejido determinado o si hay alteraciones en un gen, porque el paso inicial de
electroforesis en gel separa las moléculas en función del tamaño.
 Electrotransferencia de Northern (ARN): dimensionan y cuantifican moléculas
específicas de ARN mediante incubación con una sonda de ácido nucleico.
 Electrotransferencia de Western (proteína) dimensionan y cuantifican moléculas
proteicas específicas por incubación de una sonda proteica.
 Electrotransferencia Soutwester : se encarga deexaminar interacciones entre
ADN y proteínas

Técnicas manuales y automatizadas para determinar la secuencia de DNA

En el método enzimático manual de Sanger se emplean desoxinucleótidos específicos que terminan

la síntes de cadena de ADN en nucleótidos específicos a medida que el ácido nucleico se sintetiza
sobre la plantilla purificada. Al tener una marca radioactiva incorporada en el sitio de terminación
, eso permite separar los fragmentos de acuerdo al tamaño usando electroforesis en gel de
poliacrilamida. Cada uno de los fragmentos mediante una placa de imágenes proporciona una
imagen, en las que se lee el orden de la secuencia .

Procedimiento automatizado se usa con más frecuencia, usando 4 marcas fluorescentes, una para
cada nucleótido, en dónde cada una emite una señal que es captada por una computadora para su
registro y obtener así la secuencia.

El método de reacción en cadena de la polimerasa(PCR)

Es un método que se usa para ampliar una secuencia específica de ADN blanco, proporcionando
una forma sensible, selectiva y rápida para amplificar cualquier sección específica del ADN, la
especificidad se debe al uso de 2 cebadores de oligonucleótidos que se unen por complementariedad
en una sección específica del ADN. El funcionamiento de la PCR se debe al uso de ADN polimerasas
resistentes a elevadas temperaturas, purificadas de varias bacterias termófilas, permitiendo
que no se desnaturalice en el proceso de desnaturalización por temperatura elevadas

Desnaturalización  La muestra de ADN se desnaturaliza por calor mayor a 90 grados, para

separar las dos cadenas de la plantilla de ADN que contiene a la secuencia blanco, esto permite
que los cebadores que han sido añadidos en gran cantidad de hibriden con el ADN

Copia por DNA polimerasa  Se empieza en los sitios de los cebadores, en dónde cada cadena
sirve como plantilla para la síntesis de nuevo ADN.

Se generan ciclos repetidos de desnaturalización, hibridación, copia del ADN hasta obtener la
amplificación definida, cada ciclo requiere de 5 a 10 minutos, la PCR tiene distintas aplicaciones.

Detectar agentes infecciosos, Diagnósticos genéticos prenatales, Detectar polimorfismos alélicos,

Establecer tipos de tejidos para transplantes,etc.

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MAPEO GEÉTICO  localiza genes específicos dentro del cromosoma, mediante 2 técnicas muy
utilizadas.

Hibridación in situ, es el procedimiento más simple y directo, se añade una sonda radioactiva a una
dispersión de cromosomas en metafase sobre una laminilla de vidrio, y al momento de colocar las
capas de emulsión fotográfica y luego de la posición y alineación de los granos se da la identificación
histológica del cromosoma identificando el área de hibridación.

La hibridación in situ del fluorescente, en esta técnica a diferencia de la anterior no se usan sondas
radioactivas, si no fluorescentes.

El ADN RECOMBINANTE PERMITE OBTENER MATERIALES PARA APLICACIONES

BIOMÉDICAS

Se puede obtener  materiales que no pueden obtenerse mediante métodos de purificación

convencionales y proteínas humanas, generando estos productos para tratamiento, diagnóstico y
prevención de enfermedades.

El ADN recombinante es la producción de segmentos de ADN de segmentos que provienen de

diferentes fuentes biológicas. Son técnicas que provienen de la bioquímica de los ácidos nucleicos
unidas a la metodología genética, originada por la investigación en modelos procariotas.

Procesos de la tecnología

• Los fragmentos de DNA se obtienen utilizando enzimas de restricción

• Los fragmentos producidos se unen a otras moléculas de ADN que sirven como vectores
• Dentro de cada célula que actúa como huésped, la molécula de ADN recombinante se replica
produciendo decenas de copias idénticas conocidas como Clones.
• Al replicarse las cel. huésped, las células descendientes heredan el ADN recombinante,
creándose una población de células idénticas que llevan toda la secuencia clonada
• Los segmentos clonados pueden purificarse y analizarse
• El ADN clonado puede transcribirse, su ARNm puede traducirse y el producto genético puede
aislarse y examinarse.
• Existe una manipulación del material genético
• Enzimas de restricción (tijeras moleculares)  polimerasas, ligasas, etc.
• DNA recombinante ( clonación molecular)  PCR , secuenciamiento ( deletreo de las pares de
bases)
• Los vectores que primero se han utilizado son los virus (fagos).
• La transformación genética fue uno de los primeros experimentos utilizados para tratar una
neoplasia vegetal.
• DNA complementario (sonda)
• Descubrieron una transcriptasa inversa que copia ADN a partir de ARNm , este ADN se
denomina copia cDNA
• Para visualizar los fragmentos de ADN se usó la electroforesis en AGAROSA y tinción en
bromoduro de ETIdium(cancerígeno, por lo que ya no es muy utilizado)
• Se debe tener conocimiento del porcentaje de la agarosa, ya que a partir de esto se va a poder
identificar el peso molecular del ADN

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