Cromatografia Papel

Química Biológica I TP 9 CROMATOGRAFIA de Partición
OBJETIVO:
-Separar mediante cromatografía de partición en papel los hidratos de carbono presentes en
una muestra.
-Separar mediante cromatografía de partición en papel los aminoácidos de una muestra dada.
FUNDAMENTO
La cromatografía en papel se utiliza para compuestos muy polares o polifuncionales. El uso
más común es para azúcares, aminoácidos y pigmentos naturales. En esta cromatografía se
utiliza el fenómeno de partición en donde la fase estacionaria se halla sobre un soporte activo
(el papel) que en realidad forma parte de la fase estacionaria que es el agua. Las fases móvil y
estacionaria estarán en contacto en una gran interfase, lo que permite una rápida obtención de
una distribución de equilibrio del soluto entre ellas. Si la muestra problema está formada por
más de un soluto, éstos se separan por sus diferentes coeficientes de partición.
La realización de la cromatografía en papel implica la siembra de la muestra problema en un
trozo de papel de buena calidad, en general Whatman N°1 para cromatografía analítica, que
luego se introducirá en una cuba de desarrollo de modo que el solvente ( fase móvil) ascienda
por capilaridad (técnica ascendente) o descienda por capilaridad y gravedad (técnica
descendente). La fase estacionaria es un complejo celulosa - agua que tiene un poder diferente
que el del agua pura.
ETAPAS DE LA CROMATOGRAFÍA EN PAPEL
Siembra:
Se aplican muestras en solución a no menos de 1,5 cm del borde inferior de una tira
rectangular de papel, y a no menos de 1,5 cm de los bordes laterales, manteniendo a su vez,
entre mancha y mancha una distancia no menor de 1 cm. Se hace un toque, se evapora el
solvente, se hace otro toque, tratando de concentrar la muestra sin superar un diámetro de la
mancha de 3 mm. La siembra es puntual para fines analíticos, y en banda para fines
preparativos.
Desarrollo:
Ascendente: el solvente se coloca en el fondo de la cuba y el papel se suspende colocado en la
parte superior de la cuba.
Descendente: el solvente se coloca en un depósito inerte ubicado en la parte superior de la
cuba cromatográfica. En el fondo de la cuba se coloca también un poco de solvente para
asegurar la saturación con el vapor. La parte superior del papel se sumerge en el disolvente y
se tapa herméticamente la cuba (al igual que en la técnica ascendente). La siembra quedará en
la parte superior del papel.
Bidimensional: se corre el papel en una dirección y luego del desarrollo y secado se gira 90° y
se corre con otro solvente.
Revelado:
Si los compuestos de la mezcla son coloreados, las manchas son visibles directamente. De lo
contrario habrá que revelarlas.
Luz UV: si los compuestos absorben esta radiación las manchas se verán con fluorescencia.
Reactivos de color: especiales para cada compuesto. Se deberá tener en cuenta que no se
pueden usar reveladores que destruyan el papel como el ácido sulfúrico o el calor.
Vapores de yodo sublimado: es un revelador universal.
Evaluación:
Se efectúa el cálculo del Rf para cada componente de la mezcla por separado, que es
característico de cada compuesto en condiciones constantes: soporte, temperatura, solventes,
altura de desarrollo.
Distancia recorrida por el compuesto desde el origen o punto de siembra

Rf =
Distancia recorrida por el solvente desde el origen o punto de siembra
El Rf toma valores entre 0 y 1 y puede ser usado para la identificación de los componentes de
una muestra, siempre y cuando se trate de sistemas cromatográficos idénticos.
Parte experimental:
Separación y detección de hidratos de carbono en jugo de fruta por cromatografía en papel

Materiales a utilizar:
Tiras de papel Whatman Nº 1 (15 x 20 cm)
Lápiz de grafito
Cuba de desarrollo
Capilares para siembra
Secador de pelo
Siembra: puntual
Muestra: jugo de fruta
Exprimir 5 ml de jugo de naranja, uva, kiwi y centrifugar a 3000 rpm por 3 minutos. A 1 ml
de sobrenadante agregar 3 ml de etanol para precipitar las proteinas y sales. Centrifugar.
Sembrar en forma puntual 3 gotas.
Muestra problema: mezcla al 1% de H de carbono. Sembrar 2 gotas
Standard de glucosa, fructosa y sacarosa: Sembrar 2 gotas de cada uno.
Desarrollo: ascendente
Fase móvil: butanol: ac.acético: agua (5:1:2)
Revelador: Nitrato de plata 40% (para usar diluir 1:40 en acetona)

NaOH en etanol (1ml NaOH 1N + 20 ml etanol)
Tiosulfato de sodio 2,5 %
La reacción en medio alcalino es la siguiente:
Reacción principal: Ag+-------------Agº

Reacción secundaria Ag+-------------Ag2O
Los reactivos deben estar en solución no acuosa para no disolver los azúcares, el tiosulfato
compleja y solubiliza la plata del óxido de plata.
Resultados: determinación de Rf.

Separación y detección de aminoácidos en jugo de fruta por cromatografía en papel.
Materiales a utilizar:
Tiras de papel Whatman Nº 1 (15 x 20 cm)
Lápiz de grafito
Cuba de desarrollo
Capilares para siembra
Secador de pelo
Siembra: puntual
Muestra: jugo de fruta
Exprimir 5 ml de jugo de naranja, limón o tomate y centrifugar a 3000 rpm por 3 minutos. A 1
ml de sobrenadante agregar 3 ml de etanol para precipitar las proteinas y sales. Centrifugar.
Sembrar en forma puntual 3 gotas.
Muestra problema: mezcla al 0,1% de aminoácidos. Sembrar 2 gotas
Standard de lisina, aspártico y alanina. Sembrar 2 gotas de cada uno.
Desarrollo: ascendente
Fase móvil: etanol : agua : amoníaco (70:20:10)
Revelador: ninhidrina 0,2% en acetona y luego calentar a 100°C durante 15 minutos
Marcar las manchas, calcular Rf y comparar con estándares.

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ETAPAS DE LA CROMATOGRAFÍA EN PAPEL

Distancia recorrida por el compuesto desde el origen o punto de siembra

Separación y detección de hidratos de carbono en jugo de fruta por cromatografía en papel

Revelador: Nitrato de plata 40% (para usar diluir 1:40 en acetona)

Reacción principal: Ag+-------------Agº

Resultados: determinación de Rf.

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