Este documento presenta un ejercicio sobre secuenciación de ADN por el método de Sanger. Se proporciona una secuencia de ADN y se pide realizar diferentes tareas como dibujar el patrón de bandas esperado en un gel virtual, construir un cromatograma de secuenciación con ddNTPs fluorescentes y determinar qué parte de una secuencia de referencia se muestra en dos secuencias obtenidas.
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Este documento presenta un ejercicio sobre secuenciación de ADN por el método de Sanger. Se proporciona una secuencia de ADN y se pide realizar diferentes tareas como dibujar el patrón de bandas esperado en un gel virtual, construir un cromatograma de secuenciación con ddNTPs fluorescentes y determinar qué parte de una secuencia de referencia se muestra en dos secuencias obtenidas.
Este documento presenta un ejercicio sobre secuenciación de ADN por el método de Sanger. Se proporciona una secuencia de ADN y se pide realizar diferentes tareas como dibujar el patrón de bandas esperado en un gel virtual, construir un cromatograma de secuenciación con ddNTPs fluorescentes y determinar qué parte de una secuencia de referencia se muestra en dos secuencias obtenidas.
Este documento presenta un ejercicio sobre secuenciación de ADN por el método de Sanger. Se proporciona una secuencia de ADN y se pide realizar diferentes tareas como dibujar el patrón de bandas esperado en un gel virtual, construir un cromatograma de secuenciación con ddNTPs fluorescentes y determinar qué parte de una secuencia de referencia se muestra en dos secuencias obtenidas.
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Taller de Secuenciación de ADN
Integrantes del equipo de trabajo
Juan Sebastián Castillo Angarita – 2211183
Fabian Steven Beltrán Anguita – 2211156 Paula Camila Casas Carvajal – 2210976 Jefferson Leandro Adarme – 2210968 Ximena Granados Muñoz – 2211738
Ejercicios: I. Secuenciación por el método de Sanger. 1) El fragmento de ADN que se muestra a continuación es secuenciado con el oligonucleótido azul. ¿Cuál es el patrón de bandas esperada en el gel virtual? Use la tabla adjunta como si fuera un gel de poliacrilamida y dibuje una línea gruesa horizontal en la casilla donde migraría cada fragmento, que se diferencia de la longitud del fragmento anterior por una sola base, y que representa un punto de terminación. Recuerde que en las casillar de abajo irán las bandas más pequeñas. Por ejemplo, la primera banda, de abajo hacia arriba, corresponde a la casilla C, ya que ddCTP es el primer terminador que se puede unir después de la secuencia del oligo azul. Recuerde que esto es poblacional, entonces algunas moléculas unen el deoxinucleótido correcto y pueden elongar la molécula hasta el siguiente terminador y así sucesivamente. Como referencia, tomar como ejemplo la figura 1.
CACGACTTTCTC* …5´ G (ddGTP) A (ddATP) T (ddTTP) C (ddCTP) secuenciia T A C C C A C T C A A T G G T T A A C G G G G T T A G C C T T C T T A G T A T T T T T T G C G A C
• Indique en la secuencia referencia (la secuencia complementaria al oligo azul) hasta
que punto se puede leer la secuencia en el gel virtual.
Con base en la secuencia referencia y la complementaria, se pudo concluir que estas
se pueden leer en el gel virtual hasta el siguiente fragmento, dando como resultado la lectura de 31 bases nitrogenadas: 5´… ATGGGTGAGTTACCAATTGCCCCAATCGGAAGAATCATAAAAAACGCTGGTGCTGAAAGAG …3´ CGGGGTTAGCCTTCTTAGTATTTTTTGCGACCACGACTTTCTC* …5
2) Imagine que los dideoxinucleótidos están marcados con fluorocromos que se leen a diferentes longitudes de onda. Se realiza la secuencia con el mismo molde y el mismo oligonucleótido en presencia de estos ddNTPs fluorescentes. En vez de correrlos en un gel de poliacrilamida, se corren un capilar acoplado lector de fluorescencia, que va determinando la identidad de los deoxinucleótidos a medida que van pasando los fragmentos, empezando por el de menor peso molecular. Como ejemplo se muestra abajo un perfil de electroforesis fluorescente (cromatograma) :
• Dibuje el perfil electroforético (cromatograma) resultante de la secuenciación del
fragmento presentado en el punto I-1. Usar los mismos colores que identifican a los bases del cromatograma del ejemplo. Suponga que la incorporación de cada ddNTP es 100%, de esta manera todos los picos serán de la misma altura.
G A A C T C C G C A G T C A T T G T
5´ … C A G C G T T T T T T A T G A T T C T T C C G A T T G G G G C … 3´ 3) La siguiente secuencia de referencia fue analizada mediante secuenciación Sanger en dos individuos de una especie. La secuencia de uno de los individuos fue realizada en gel de poliacrilamida (nuestro gel virtual, izquierda) mientras que la secuencia del otro individuo se corrió en capilar acoplado a un lector de fluorescencia (derecha). Secuencia de referencia:
No, las secuencias anteriores no son idénticas, debido a que no codifican para la producción de las mismas sustancias. En este caso, se pudo observar que la especie 1, la cual tenía su secuencia ilustrada en el cuadro de Sanger, presentaba el codón para Serina (tripleta de bases TCA). Por otro lado, la especie 2, la cual tenía su secuencia representada en el cromatograma, presentaba el codón de la Treonina (tripleta de bases TGA).
Tabla de código genético. Tomado de https://bit.ly/3J3x8ke
• Si encuentra diferencias y teniendo en cuenta que la secuencia referencia está en
marco de lectura +1 (es decir, la primera tripleta de bases CAC corresponde al codón de la Histidina, la segunda tripleta CAG al de la glutamina y así sucesivamente, https://www.genome.gov/geneticsglossary/Genetic-Code de qué manera afectan las diferencias al codón? Es un cambio sinónimo o no sinónimo, que tipo de cambio detecta?
Inicialmente, es posible confirmar que las variaciones encontradas en la especie 2
con respecto a su código en la base número 20 (C → G) TGTTACTCACGCCTCAAG corresponden a un cambio de tipo no sinónimo, el cual se cataloga como una mutación de transversión, es decir, el cambio fue de una pirimidina a una purina. Con base en lo anterior, se puede decir que las diferencias en la secuenciación afectan en la codificación de los aminoácidos, posiblemente ocasionando la síntesis de proteínas no deseadas.
4) Determine la secuencia de nucleótidos del gel en la región indicada. Recuerde
empezar a leer de abajo hacia arriba.
A C G T
TGTACACTTTTACTATGGCGTGACACCTAAATTATAGGCAGAAATAAGTACATG ACTATGGAGAGCAGACA • Determine la identidad de la secuencia encontrada, copiando la secuencia deducida y pegándola en la ventana de búsqueda del programa Blast del NCBI (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastSearch) y presionen el botón azul “Blast”. Les saldrá una ventana con las secuencias mas parecidas a la secuencia problema, incluya la secuencia con el mejor “score”.
A partir de la búsqueda con el programa Blast, se encontró una similitud del 95% con la secuencia “Human papilloma virus 31 isolate 101A.31; con valores de total score y max score de 108. A partir de la relación entre la secuencia deducida con el valor “Query Cover”, se puede decir que la secuencia encontrada fue bastante cercana a la proporcionada por el sitio web.
II. Secuenciación por el método de Maxam-Gilbert.
Cuál es el patrón de bandas esperada en el gel a partir del fragmento de ADN del numeral A-1 secuenciado por el método de Maxam-Gilbert? Use la tabla adjunta como si fuera un gel de poliacrilamida y dibuje una línea gruesa horizontal en la casilla donde migraría cada fragmento que se diferencia de su anterior por una base y que representa la terminación.
