Segunda Unidad Bioenergética y metabolismo de glúcidos, lípidos, aminoácidos, proteínas y nucleótidos

- DETERMINACION DE ÚREA, CREATININA Y TRANSAMINASAS --

INTRODUCCION:
El metabolismo del nitrógeno tiene utilidad clínica en la determinación del perfil renal, que se define como
un conjunto de pruebas de laboratorio necesarias para evaluar la función de los riñones mediante las cuales
se miden niveles séricos de sustancias como electrolitos, minerales, proteínas y glucosa.

FINALIDAD:
▪ Realizar la medición sérica de urea por el método de la ureasa y creatinina.
▪ Realizar la medición sérica de transaminasa glutámico pirúvica o alanina aminotransferasa
▪ Realizar la medición sérica de transaminasa glutámico oxalacética o aspartato aminotransferasa

MATERIAL Y EQUIPOS
▪ Material de vidrio: tubos de ensayo, pipetas milimétricas.
▪ Equipo de extracción de muestra: guantes, alcohol, algodón, agujas N° 20, jeringas x 5 cc.
▪ Equipos: centrífuga, micropipetas x 10 ul, baño maría, espectrofotómetro.

PROCEDIMIENTO 1: Determinación de Urea.

1) Introducción:
La urea, es el principal producto del catabolismo de las proteínas y se distribuye en todos los tejidos.
Normalmente no tiene función útil en el organismo, es sintetizada en el hígado y excretado casi enteramente
por los riñones (20 a 40 gramos). La urea en el plasma es filtrada por los glomérulos renales, pero en
condiciones normales aproximadamente el 40% de este filtrado regresa por difusión a la sangre. La
importancia clínica de la urea viene del hecho de una elevada concentración sanguínea puede estar
asociada con una mala función renal. El grado de azoemia depende de la extensión y tipo de lesión renal.

La concentración de la urea en la corriente sanguínea es el resultado del balance entre el grado de

degradación de las proteínas y el grado de eliminación por los riñones. Los valores normales de urea en
suero (como nitrógeno ureico sanguíneo o BUN) es de 9 – 19 mg/100 ml. Las concentraciones de urea en
sangre total, suero o plasma, son muy similares. La uremia es determinada colorimétricamente por el uso
de ureasa. Este método es altamente específico y aunque está basado en reacciones de urea, es
convencionalmente reportado como nitrógeno ureico.

Los valores de urea se reportan siguiendo la siguiente fórmula: Nitrógeno ureico sanguíneo x 2,14 = UREA
En sentido inverso, conociendo los valores de urea, se informa el BUN según la siguiente fórmula:
Urea x 0,4665 = Nitrógeno ureico sanguíneo

2) Fundamento de la Técnica:
La secuencia de recciones que se emplean en esta determinación es la siguiente:
Ureasa pH
Urea CO2 + NH3; NH3 + Salicilato +Alcalino
Hipoclorito Indofenol (verde)

3) Muestra y Reactivos a emplear:

▪ Muestra: suero sanguíneo.
▪ S. Estándar: solución de urea = 0.60 g/l (28.04 mg/dl de BUN).
▪ A. Reactivo A: Solución conteniendo buffer fosfatos 200 mmol/l, ácido salicílico 750 mmmol/l.
nitroprusiato de sodio 20 mmol/l y EDTA 10 mmol/l.
▪ B. Reactivo B: solución concentrada de hipoclorito de sodio 10 mmol/l en hidróxido de sodio 0.1 mol/l

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▪ C. Reactivo C: ureasa ≥ 75 U/ml en solución glicerada.

4) Procedimiento:
▪ Extracción de muestras: previa limpieza de la zona con alcohol, se extraerá 5 cc de sangre de la flexura
del codo con jeringa hipodérmica de 5 cc y aguja N° 20, de un paciente en ayunas.
▪ Una vez obtenida la muestra, colocarla en un tubo de ensayo y dejarlas reposar durante 10 minutos.
▪ Terminado el reposo, contrapesar los tubos conteniendo las muestras y centrifugarlos a 3000 RPM
durante 10 minutos.
▪ Finalizado el centrifugado separar el suero para trabajar la determinación.
▪ Para la determinación de úrea: En 3 tubos de ensayo marcados con B (Blanco), S (estándar) y D
(Desconocido), se debe colocar:

TUBOS DE ENSAYO
COMPONENTES
B S D
Muestra (suero / ul) -- -- 10
Estándar (ul) -- 10 --
Reactivo A + C (ml) 1.0 1.0 1.0
Mezclar e incubar por 5 minutos a 37 °C o 10 minutos a temperatura
ambiente (18 a 25 °C). Luego agregar:
Reactivo B (ml) 1.0 1.0 1.0
Mezclar e incubar por 5 minutos a 37 °C o 10 minutos a temperatura
ambiente (18 a 25 °C). Leer en espectrofotómetro a 570 nm. dentro del
plazo de una hora.

5) Resultados:
▪ Luego de la incubación de las muestras:

B
D

▪ Lecturas en el espectrofotómetro:

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6) Actividades a desarrollar por el alumno:

- Cálculos de resultados:
▪ Cálculo del factor:
𝟎. 𝟔𝟎 𝐠/𝐥
𝐅=
𝐒

▪ Cálculo de la concentración de Urea.

Urea (g/l) = D x F

- Interpretación de los resultados.

▪ Valores Referenciales: 0.10 – 0.50 g/l

- Explique bioquímicamente lo encontrado.

7) Preguntas de aplicación:
a) Identifique las variables que intervinieron en el experimento realizado en la práctica.
✓ La Dieta, Grado De Azoemia Depende De La Extensión Y Tipo De Lesión
Renal.
✓ Procedimiento para la determinación de urea en suero, plasma y orina
b) Identifique los componentes del sistema enzimático empleado en la práctica y señale sus
principales características.
Solución conteniendo buffer fosfatos: El buffer de fosfatos, BPS o buffer fosfato salino es una
solución amortiguadora e isotónica, cuya función es mantener el pH y la presión osmótica lo más
parecido al ambiente biológico natural (fisiológico).
Nitroprusiato de sodio: Vasodilatador arteriovenoso. Por su potente acción vasodilatadora,
produce una disminución de la resistencia vascular periférica y un marcado descenso de la
presión arterial.
EDTA: se utiliza comúnmente para estandarizar las soluciones acuosas de cationes de metales
de transición.
Solución concentrada de hipoclorito de sodio: hidróxido de sodio 0.1 mol/l El hipoclorito de
sodio (cuya disolución en agua es conocida como lejía, cloro o lavandina, según la zona) es un
compuesto químico, fuertemente oxidante de fórmula NaClO. Contiene cloro en estado de
oxidación +1, es un oxidante fuerte y económico. Debido a esta característica se utiliza como
desinfectante; además destruye muchos colorantes por lo que se utiliza como blanqueador.
Ureasa: La ureasa es la enzima responsable de la degradación de la urea en amoníaco y
bicarbonato, lo que aumenta el pH del lugar en que está presente y favorece su proliferación.
Esta prueba se utiliza principalmente para el diagnóstico de la infección por Helicobacter pylori,
o H.
Glicerada: alcohólica glicerada contienen 73,7 mL de alcohol etílico impotabilizado al 95%
c) ¿Qué influencia tiene la ingesta proteica sobre la concentración sérica de urea?
Con la ingesta excesiva de proteína, se incrementa cantidad de aminoácidos en el pool, por ello va a
aumentar el catabolismo de proteínas (aminoácidos), y gracias a la desaminación con ayuda de la
enzima amino peptidasa se va a separar el amoniaco (NH 3) del lado extremo del aa. El

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80% del amoniaco proviene del intestino y el 20% del hígado. El amoniaco más el CO2 van a formar la
urea (ciclo de urea), la enzima reguladora de este ciclo es el carbamil fosfato sintetasa, los 5aminoácidos
que participan en este proceso son el glutamato, aspartato, arginina, ornitina y citrulina. Es decir, a mayor
consumo de proteínas mayor cantidad de urea.
d) ¿Qué alteraciones en las concentraciones séricas de urea y amoniaco podrían encontrarse en el
coma hepático?
El amoniaco aumenta cuando es coma hepático, esta alteración se llega a dar por un proceso
inflamatorio, si el hígado llega a estar dañado el 80% de amoniaco que provienen del intestino llegaría
hacia los hepatocitos, no se transformaría en urea, el amoniaco aumentaría en sangre y la
urea disminuye su concentración en sangre. La hepatitis o cirrosis son las alteraciones más
comunes que se dan en un coma hepático, en la hepatitis, algunos factores que se desencadenan en
infecciones o por deshidratación, la cirrosis hepática se da por los niveles bajos de aminoácidos,
también se genera una hiperamonemia, se define como una concentración elevada en amoniaco en la
sangre.
e) ¿Cuál es la importancia metabólica de la existencia del ciclo de la ornitina en el hígado de los
seres humanos?
La ornitina es un precursor biosintético de la arginina, el cual es sintetizado en la mitocondria como
producto del glutamato, amoniaco y CO2. La arginina junto con la ornitina estimula la función
inmunológica al incrementar el número de leucocitos en el organismo. El ciclo de la ornitina es
importante porque contribuye en la eliminación de sustancias tóxicas del organismo, convirtiendo
en el hígado el amoníaco en urea. La urea en condiciones normales entra en el torrente sanguíneo y
luego es filtrada por los riñones para ser excretada finalmente en la orina.
f) Esquematice y explique el ciclo de la urea.
El ciclo de la urea es el proceso metabólico en el cual se procesan los derivados proteicos y se genera
urea como producto final. Si no se reutilizan para la síntesis de nuevos aminoácidos u otros productos
nitrogenados, los grupos amino se canalizan a un único producto final de excreción.

g) Elabore un esquema y explique ciclo de la ornitina.

La ornitina, más concretamente la L-ornitina, es un aminoácido no esencial poco conocido, pero con
funciones muy importantes en el cuerpo humano. La ornitina se sintetiza a partir del glutamato y es
precursor de la arginina mediante el ciclo de la urea

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PROCEDIMIENTO 2: Determinación de Creatinina.

1) Introducción:
La creatina, precursora de la creatinina, aumenta en el cuerpo humano fundamentalmente por síntesis,
aunque una pequeña cantidad pre formada es ingerida con los alimentos. La creatina fosfato se forma en
los miocitos y es un compuesto importante como fuente de energía en la contracción muscular.
Aproximadamente 2% de la creatina fosfato muscular es convertida en creatinina diariamente; la cantidad
total depende de la masa muscular. La creatinina es fácilmente difusible y es igualmente distribuida en el
agua corporal. Es excretada fundamentalmente por el riñón el cual clarifica el plasma de creatinina. La
concentración de creatinina en suero no es afectada por la dieta, catabolismo de proteínas, edad, sexo o
ejercicios. Elevadas concentraciones se producen solamente cuando la función renal está muy alterada y
aunque el mismo tipo de información acerca del diagnóstico y pronóstico se obtiene por la determinación de
nitrógeno ureico o creatinina, esta última determinación se prefiere porque proporciona mayor información
relacionada con el estado de la función renal, ya que los niveles de creatinina sérica dependen del grado de
excreción, siendo la producción endógena constante.

El suero es depurado de creatinina en el riñón por filtración glomerular proporcionando una buena base para
el test de clearance. La concentración normal en suero varía de 0,5 a 1,4 mg /100 ml. El clearence de
creatinina normal es mayor de 100 ml / min.

La determinación de creatinina tiene utilidad en la práctica médica para la evaluación de la función renal, la
cual puede alterarse por diversas causas; las que pueden ser de origen pre renal como el shock o la
insuficiencia cardíaca; renal, como las glomerulonefritis o la nefropatía diabética o post renal, como las
uropatías obstructivas.

2) Fundamento de la Técnica:
La creatinina en medio alcalino reacciona con el ácido pícrico produciendo un cromógeno de picrato de
creatinina de color rojo (Reacción de Jaffé). La determinación se realiza en un filtrado de proteínas obtenido
a partir del suero (desproteinizado).

3) Muestra y Reactivos a emplear:

▪ Muestra: suero sanguíneo.
▪ S. Estándar: solución de creatinina = 20 mg/l.
▪ A. Reactivo A: Ácido pícrico 41.4 mmol/l.
▪ B. Reactivo B: Buffer glicina/NaOH 1mol/l.

4) Procedimiento:
▪ Extracción de muestra: previa limpieza de la zona con alcohol, se extraerá 5 cc de sangre de la flexura
del codo con jeringa hipodérmica de 5 cc y aguja N° 20, de un paciente en ayunas.
▪ Una vez obtenida la muestra, colocarla en un tubo de ensayo y dejarlas reposar durante 10 minutos.
▪ Terminado el reposo, contrapesar los tubos conteniendo las muestras y centrifugarlos a 3000 RPM
durante 10 minutos.

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▪ Finalizado el centrifugado separar el suero para trabajar la determinación.

▪ Para la determinación de creatinina: En 3 tubos de ensayo marcados con B (Blanco), S (estándar) y D
(Desconocido), se debe realizar lo siguiente:
Desproteinización del suero: Colocar en un tubo 0.4 ml de suero y
agregar 2 ml de Reactivo A. Mezclar por inversión. Dejar en reposo
durante 10 minutos y luego centrifugar a 3000 rpm por cinco minutos.
Transcurrido el tiempo armar el siguiente sistema:
TUBOS DE ENSAYO
COMPONENTES
B S D
Desproteinizado (ml) -- -- 1.5
Estándar (ml) -- 0.25 --
Agua Destilada (ml) 0.5 0.25 --
Reactivo A (ml) 1.0 1.0 --
Reactivo B (ml) 0.25 0.25 0.25
Mezclar por inversión. Incubar 20 minutos a temperatura ambiente.
Luego leer en espectrofotómetro a 510 nm, llevando a cero el aparato
con agua destilada.

5) Resultados:
▪ Luego de la incubación de las muestras:

B D

▪ Lecturas en el espectrofotómetro:

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6) Actividades a desarrollar por el alumno:

- Cálculos de resultados: Corregir las lecturas S y D restándoles el blanco (B).
▪ Cálculo del factor:
𝟐𝟎 𝐦𝐠/𝐥
𝐅=
𝐒

▪ Cálculo de la concentración de Creatinina.

Creatinina (mg/l) = D x F

- Interpretación de los resultados.

▪ Valores Referenciales:
• Suero = 8 a 14 mg/l

- Explique bioquímicamente lo encontrado.

7) Preguntas de aplicación:
a) Identifique las variables que intervinieron en el experimento realizado en la práctica.
Aumento de la masa muscular, ingesta proteica, ejercicio, droga
Evaluación de la función renal, insuficiencia cardíaca, la glomerulonefritis o la
nefropatía, diabética o post renal, las uropatías obstructivas.
b) Identifique los componentes del sistema enzimático empleado en la práctica y señale sus
principales características.
✓ Solución de creatinina. Método enzimático para la determinación de creatinina en suero,
plasma u orina
✓ Ácido pícrico El Ácido Pícrico es un sólido cristalino amarillo. Se utiliza como explosivo potente
y oxidante fuerte en los combustibles de cohetes, cerillas, técnicas de tratamiento del cuero, en
los métodos de grabado de metales, las baterías. Puede servir también de tinte para tejidos o
para tintar el vidrio.
✓ Buffer glicina/NaOH La capacidad amortiguadora es máxima cuando el cociente sal/ácido es
próximo a la unidad. Si tenemos 50 moléculas de acético y 50 de acetato, el pH será igual al pK.
c) ¿Por qué se prefiere la determinación de creatinina urinaria a la de nitrógeno ureico?
La determinación de creatinina urinaria consiste en medir la cantidad de esta sustancia en la orina
mediante el proceso de filtración y a la vez esta prueba permite diagnosticar la insuficiencia renal,
el nivel de creatinina no se verá afectado por la función hepática sino renal. Por otro lado, un
análisis de nitrógeno BD ureico (BUN) mide la cantidad de nitrógeno ureico que hay en la sangre, cuando
el hígado produce amoniaco (que contiene nitrógeno) después de desintegrar las proteínas usadas por
las células del cuerpo. Este nitrógeno se combina con otros elementos, tales como el carbono, el
hidrógeno y el oxígeno, para formar la urea. Los riñones serán los encargados de filtrar la urea y eliminan
otros productos de desecho de la sangre. Por lo tanto, es más recomendable realizar un examen de
creatinina urinaria porque con ella se podrá comprobar el correcto funcionamiento del riñón.
d) ¿Por qué se prefiere suero y no sangre total para la determinación de creatinina?
La determinación de la creatinina en suero sirve para el diagnóstico y el control de enfermedades renales
agudas o crónicas y también para la estimación del filtrado glomerular, es decir, es más factible al
manipular y recolectar las sustancias que se encontraran al momento de realizar este examen
ya que no contiene anticoagulantes a diferencia del examen de la sangre total ya que puede generar
algún bloqueo durante el proceso para la determinación de la creatinina.
e) ¿Qué importancia tiene, determinar el clearence de creatinina?

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Los médicos utilizan pruebas de creatinina y depuración de creatinina para ver que tan bien funcionan
los riñones, la prueba de la tasa de depuración de creatinina muestra la capacidad de los riñones para
filtrar la sangre. La prueba de aclaramiento de creatinina estima la tasa de filtración glomerular (TFG).
La TFG es una medida de qué tan bien están funcionando los riñones, especialmente los
glomérulos (son las unidades de filtrado de los riñones) La creatinina es eliminada del cuerpo en su
totalidad por los riñones. Si la función renal es anormal, el nivel de creatinina aumenta en la sangre
porque se excreta menos creatinina a través de la orina. Los resultados anormales (aclaramiento de
creatinina más bajo de lo normal; hombres 97-137 ml/min y en mujeres 88-128 ml/min).
f) Esquematice y explique la formación de creatinina.

En el RIÑÓN a partir del aminoácido L-arginina al unirse con la Glicina tenemos como productos a la
Guanidoacetato y la Ornitina; utilizando como enzima a la Arginino Glicina Transamidinasa. Luego
al unirse el Guanidoacetato con la S-Adenosilmetionina, tenemos como producto la Creatinina
Fosfato y la S-Adenosilhomocisteina en el HIGADO; esta reacción necesita de la enzima
Guanidoacetato metil transferasa además del uso de energía (ATP). Finalmente la Creatinina Fosfato en
una reacción directa NO ENZIMATICA en el MUSCULO se transforma en Creatinina produciendo
además una molécula de aguay Pi (fosfato inorgánico).
g) Elabore un esquema de la molécula de creatinina y explique sus componentes.
La creatinina es una base orgánica compuesta por 4 átomos de Carbono, 7 átomos de hidrógeno, 3
átomos de Nitrógeno y 1 átomo de oxígeno (C4H7N3O); y nos demuestra el trabajo que realizan los
riñones, los cuales absorben y eliminan esta sustancia por medio de la orina, indicando problemas
renales si no son eliminados adecuadamente por la orina

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PROCEDIMIENTO 3: Determinación de Transaminasa glutámico pirúvica o alanina

aminotransferasa (ALT).
1) Introducción:
La transaminasa glutámica pirúvica, llamada también alanina aminotransferasa cataliza la reacción de
transaminación de alanina y alfacetoglutarato formando como productos piruvato y glutamato. Esta enzima
es exclusivamente citoplasmática y es más específica de daño hepático o renal.

También se encuentra presente en el tejido muscular y puede aumentar en Hepatitis aguda, GPT>GOT,
generalmente >500 U/l. Hepatitis crónica: GPT>, <300 U/l. Hepatitis alcohólica y cirrosis hepática, GOT:
GPT >2, sugestivo e Ictericia obstructiva: discreto aumento. Otras causas: daño muscular la AST aumenta
en forma significativa y la ALT menos, igualmente con la hemólisis. La AST aumenta en el infarto de
miocardio

2) Fundamento de la Técnica:
La técnica empleada en la determinación de transaminasa ALT, es una técnica enzimática basada en la
siguiente reacción:
GPT
L-alanina + alfa cetoglutarato L- Glutamato + Piruvato
El piruvato reacciona con la fenilhidrazina dando un compuesto coloreado en medio alcalino que se lee a
505 nm.

3) Muestra y Reactivos a emplear:

▪ Muestra: Suero sanguíneo
▪ S. Estándar: solución de piruvato de sodio 2 mmol/l.
▪ A. Reactivo A: solución con 200 mM de dl-alanina y 2 mM de α-cetoglutarato en buffer fosfatos 100 mM,
pH 7,4
▪ B. Reactivo B: solución conteniendo 1 mmol de 2,4-dinitrofenilhidracina (2,4-DNFH) en ácido clorhídrico
1 mol/l.
▪ C. Reactivo C: solución de hidróxido de sodio 4 mol/l.

4) Procedimiento:
▪ Extracción de muestras: previa limpieza de la zona con alcohol, se extraerá 5 cc de sangre de la flexura
del codo con jeringa hipodérmica de 5 cc y aguja N° 20.
▪ Una vez obtenida la muestra, colocarla en un tubo de ensayo y dejarlas reposar durante 10 minutos.
▪ Para la determinación de transaminasa GPT: En 2 tubos de ensayo marcados con B (Blanco) y D
(Desconocido), se coloca:
TUBOS DE
COMPONENTES ENSAYO
B D
Reactivo A: GPT (ml) 0.5 0.5
Colocar en baño de agua a 37°C unos cinco minutos.

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Muestra: Suero (ul) -- 100.0

Agua Destilada (ul) 100.0
Mezclar por agitación suave e incubar exactamente 30
minutos y luego agregar:
Reactivo B (ml) 0.5 0.5
Mezclar. Dejar 10 minutos a 37°C. Luego agregar:
Reactivo C: diluido (ml) 5.0 5.0
Mezclar por inversión y retirar del baño. Después de 2
minutos leer la absorbancia en espectrofotómetro a 505 nm,
llevando el aparato a cero con agua destilada.
▪ Curva de Calibración para GPT:
• Se construirá usando diferentes concentraciones del Estándar (piruvato de sodio) de acuerdo al
protocolo señalado por el laboratorio. Se obtuvieron las siguientes absorbancias para las unidades
señaladas.
Actividad:
Absorbancia
Unidades Absorbancia
Neta
(U/l)
0 0.217 0.000
9 0.264 0.047
18 0.339
25 0.384
37 0.464
46 0.519
56 0.563
79 0.679
113 0.786
• Calcular la absorción neta de cada actividad.

5) Resultados:
▪ Luego de la incubación de las muestras:

B D

▪ Lecturas en el espectrofotómetro:

La absorbancia neta se obtiene de la resta de Desconocido – Blanco.

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6) Actividades a desarrollar por el alumno:

- Calcular la absorbancia neta de cada actividad en el cuadro de calibración.

- Graficar la curva de calibración.

- Obtener la actividad del paciente.

- Interpretación de los resultados.

▪ Valores Referenciales:
• Transaminasa GPT = Hasta 12 U/l.

- Explique bioquímicamente lo encontrado.

PROCEDIMIENTO 4: Determinación de Transaminasa glutámico oxalacética o aspartato

aminotransferasa (AST).
1) Introducción:
Aspartato amino transferasa (AST) o Transaminasa Glutámico Oxalacética o GOT, es una enzima
citoplasmática y mitocondrial presente en los hepatocitos, pero también en las células de otros tejidos como
corazón, músculo esquelético y riñón. Se emplea en el diagnóstico de hepatitis aguda igual que la TGP. En
hepatitis alcohólica y cirrosis en donde la relación GOT/GPT se invierte.

2) Fundamento de la Técnica:
La técnica empleada en la determinación de transaminasa AST, es una técnica enzimática basada en la
siguiente reacción:
GOT
L-aspartato + alfa cetoglutarato L- Glutamato + Oxalacetato
El oxalacetato se convierte en piruvato, el cual reacciona con la fenilhidracina formando un compuesto de
color marrón en medio alcalino, el que se lleva a lectura en el espectrofotómetro a 505 nm.

3) Muestra y Reactivos a emplear:

▪ Muestra: Suero sanguíneo
▪ S. Estándar: solución de piruvato de sodio 2 mmol/l.
▪ A. Reactivo A: solución con 100 mM de l-aspartato y 2 mM de α-cetoglutarato en buffer fosfatos 100
mM, pH 7,4
▪ B. Reactivo B: solución conteniendo 1 mmol de 2,4-dinitrofenilhidracina (2,4-DNFH) en ácido clorhídrico
1 mol/l.
▪ C. Reactivo C: solución de hidróxido de sodio 4 mol/l.

4) Procedimiento:
▪ Extracción de muestras: previa limpieza de la zona con alcohol, se extraerá 5 cc de sangre de la flexura
del codo con jeringa hipodérmica de 5 cc y aguja N° 20.
▪ Una vez obtenida la muestra, colocarla en un tubo de ensayo y dejarlas reposar durante 10 minutos.
▪ Para la determinación de transaminasa GPT: En 2 tubos de ensayo marcados con B (Blanco) y D
(Desconocido), se coloca:
TUBOS DE
COMPONENTES ENSAYO
B D
Reactivo A: GOT (ml) 0.5 0.5
Colocar en baño de agua a 37°C unos cinco minutos.
Muestra: Suero (ul) -- 100.0
Agua Destilada (ul) 100.0

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Mezclar por agitación suave e incubar exactamente 30

minutos y luego agregar:
Reactivo B (ml) 0.5 0.5
Mezclar. Dejar 10 minutos a 37°C. Luego agregar:
Reactivo C: diluido (ml) 5.0 5.0
Mezclar por inversión y retirar del baño. Después de 2
minutos leer la absorbancia en espectrofotómetro a 505 nm,
llevando el aparato a cero con agua destilada.
▪ Curva de Calibración para GOT:
• Se construirá usando diferentes concentraciones del Estándar (piruvato de sodio) de acuerdo al
protocolo señalado por el laboratorio. Se obtuvieron las siguientes absorbancias para las unidades
señaladas.
Actividad:
Absorbancia
Unidades Absorbancia
Neta
(U/l)
0 0.223 0.000
7 0.269 0.046
12 0.295
20 0.327
28 0.358
37 0.389
48 0.426
81 0.510
• Calcular la absorción neta de cada actividad.

5) Resultados:
▪ Luego de la incubación de las muestras:
B D

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▪ Lecturas en el espectrofotómetro:

La absorbancia neta se obtiene de la resta de Desconocido – Blanco.

6) Actividades a desarrollar por el alumno:

- Calcular la absorbancia neta de cada actividad en el cuadro de calibración.

- Graficar la curva de calibración.

- Obtener la actividad del paciente.

- Interpretación de los resultados.

▪ Valores Referenciales:
• Transaminasa GOT = Hasta 12 U/l.

- Explique bioquímicamente lo encontrado.

PREGUNTAS DE APLICACIÓN:
h) Identifique las variables que intervinieron en el experimento realizado en la práctica.
✓ hepatitis alcohólica y cirrosis y hepatitis
✓ hígado, corazón, musculo, riñones, cerebro
i) Identifique los componentes del sistema empleado en la práctica y señale sus principales
características.
1) Solución de piruvato de sodio piruvato sódico está indicado para combatir la flacidez muscular,
estimula la respiración celular e incrementa la energía y es recomendado para tratamientos de
reafirmación muscular corporal.
2) l-aspartato La L-ornitina L-aspartato reduce los niveles de amoníaco en sangre y, por lo tanto, puede
tener efectos beneficiosos en los pacientes con encefalopatía hepática o ayudar a interrumpir su
desarrollo.
3) α-cetoglutarato La alfa-cetoglutarato deshidrogenasa no actúa sobre lipoamidas o lipoil-lisinas libres.
El complejo 2-oxoglutarato deshidrogenasa cataliza la conversión global del 2-oxoglutarato a succinil-
CoA y dióxido de carbono (quinta reacción del ciclo de Krebs).
4) Buffer fosfatos El buffer de fosfatos, BPS o buffer fosfato salino es una solución amortiguadora e
isotónica, cuya función es mantener el pH y la presión osmótica lo más parecido al ambiente biológico
natural (fisiológico).
5) 2,4-dinitrofenilhidracina (2,4-DNFH) La 2,4-dinitrofenilhidracina (también conocido reactivo de Brady)
es un compuesto orgánico relativamente sensible a golpes y fricción, por lo que debe tener especial
cuidado con su uso y suele ser provisto mojado para disminuir el riesgo. Es una hidrazina substituida
y es usada generalmente como prueba cualitativa para grupos carbonilos.
6) Ácido clorhídrico El ácido clorhídrico es la solución con base en agua, o acuosa, del gas cloruro de
hidrógeno. También es el componente principal del ácido gástrico, un ácido producido de forma natural
en el estómago humano para ayudar a digerir los alimentos.

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 Segunda Unidad Bioenergética y metabolismo de glúcidos, lípidos, aminoácidos, proteínas y nucleótidos

7) Hidróxido de sodio El hidróxido de sodio es un sólido blanco e industrialmente se utiliza como

disolución al 50 % por su facilidad de manejo. Es soluble en agua, desprendiéndose calor. Absorbe
humedad y dióxido de carbono del aire y es corrosivo de metales y tejidos.

j) ¿Cuál es la utilidad de las transaminasas en el diagnóstico médico?

Las transaminasas también llamadas aminotransferasas son enzimas que llevan a cabo la
reacción de transferencia del grupo amino, de un aminoácido a un alfa cetoácido. Las más
conocidas son Aspartato aminotransferasa (AST), y Alanina aminotransferasa (ALT). La utilidad
de estas en el diagnóstico clínico radica en que siempre actúan de forma intracelular
por eso, cuando se encuentran elevadas en el suero o plasma son de gran utilidad
en el diagnóstico de enfermedades. Por ejemplo, la determinación de AST o ALT en plasma
nos indícala presencia de alguna enfermedad hepática o isquemia miocárdica
k) ¿Cuál es el rol del piridoxal fosfato en la transaminación?
El Fosfato de Piridoxal (PLP), también conocido como vitamina B6. va a actuar como coenzima en las
reacciones de transaminación llevadas a cabo por la AST y ALT.
l) ¿Cuál es la ubicación intracelular de las transaminasas GPT y GOT?
✓ GPT es una enzima específica del hígado.
✓ La GOT se encuentra en varios tejidos como el músculo cardíaco, hepático, cerebro, páncreas,
pulmones, leucocitos y eritrocitos.
m) Aspartato-aminotransferasa o transaminasa glutámico oxalacética (AST o GOT) es una enzima
bilocular, se encuentra distribuida en el citoplasma y en las mitocondrias de las células. Alanino
aminotransferasa o transaminasa glutámico-pirúvica (ALT o GPT) es una enzima unilocular
(citoplasmática), se localiza en el parénquima del tejido hepático
n) Esquematice la transaminación y explique sus características.

La transaminación cataboliza un equilibrio donde el grupo amino (H3N+) de un aminoácido

(aspartato) se transfiere a un alfa-cetoácido (alfa-cetoglutarato) y el resultado es que el
aminoácido que perdió el grupo amino se transforma en alfa-cetoácido (oxalacetato) y el alfa-
cetoácido que gana el grupo amino se convierte en un aminoácido (glutamato).

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.
1) Murray R. Harper Bioquímica Ilustrada. 31° edición, México 2019.
2) Nelson D, Cox M. Lehninger. Principios de Bioquímica. 6ta Edición, Editorial Omega, España, 2011

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