Universidad Andrés Bello

Facultad de Ciencias de la Salud

Departamento de Ciencias Biológicas
Laboratorio de Microbiología y Genética Bacteriana

Guía de Trabajos Prácticos

Laboratorio de Microbiología II
BIO351
Trabajo Práctico Nº 3

Mutagénesis por recombinación de DNA

lineal (Red-Swap):
Sistema de Wanner
Bioquímica
Segundo Semestre 2011

Profesores:
NICOLÁS VILLAGRA
Lic. Ciencias Biológicas, PUC
Doctor (c) en Biociencias Moleculares, UNAB
MATIAS JOFRÉ
Bioquímico UNAB
Doctor (c) en Biociencias Moleculares, UNAB
MARIO CASTILLO
Bioquímico. PUC
Doctor (c) en Biotecnología, UNAB
ITALO URRUTÍA
Lic. Bioquímica, UNAB
JUAN FUENTES
Dr. Genética molecular y Microbiología, PUC
 La recombinación homóloga es muy eficiente en muchos organismos. Por ejemplo,
cortos productos de PCR han sido utilizados para generar reemplazos de genes en la
levadura Saccharomyces cerevisiae (revisado en Que y Winzeler 2002). Regiones muy
cortas de identidad (desde 25 a 50 pb) son suficientes para realizar una recombinación
homóloga eficiente en este sistema, presentando aproximadamente un 95% de las levaduras
transformantes el intercambio deseado. Por el contrario, fragmentos cortos de DNA lineal
se degradan rápidamente por las exonucleasas en la mayoría de las bacterias, por lo que son
considerados sustratos pobres para la recombinación.

La recombinación eficiente entre fragmentos lineales cortos de DNA y el

cromosoma bacteriano pueden ser catalizados tomando ventaja de los sistemas de
recombinación de fagos (revisado en Court et al. 2002). El locus Red del fago λ codifica un
sistema que promueve la recombinación homóloga. El locus λ Red incluye tres genes: bet
(akaβ), exo y gam (akaγ) (fig. 1) (Datsenko y Wanner 2000, Murphy 1998, Yu et al. 2000,
Poteete y Fenton 1999, Kuzminov 1999). Exo es una exonucleasa 5’-3’ que degrada el
término 5’ de moléculas de DNA lineal. Bet es una proteína de unión a hebras simples de
DNA que se une a los términos 3’ generados por Exo y promueve apareamiento de DNAs
complementarios, favoreciendo la recombinación homóloga (Kuzminov 1999, Murphy
1998, Yu 2000, Poteete y Fenton 2000). Gam se une al complejo RecBCD del hospedero e
inhibe su actividad exonucleasa (Murphy 1991, Murphy 1998, Karu 1975).

Fig. 1. Esquema del locus λ Red del fago lamba. Obsérvese la ubicación del los genes exo, bet y gam, los
cuales se encuentran cercanos al sitio de unión attP.

El uso del sistema λ Red para promover reemplazo de genes es E. coli utilizando
fragmentos cortos de DNA lineal fue descrito por primera vez por Murphy (Murphy 1998,
Murphy et al. 2000). En el sistema original, las funciones Red fueron provistas desde un
plásmido o directamente desde el cromosoma de E. coli. En el constructo plasmidial, se
incluyó el gen gam para inactivar la exonucleasa RecBCD del hospedero. En el constructo
cromosomal, los genes recBCD del hospedero se reemplazaron por los genes λ Red, por lo
que gam no era necesario. La eficiencia de recombinación se probó utilizando fragmentos
obtenidos por enzimas de restricción o productos de PCR con amplias regiones de identidad
(>1 kpb). El reemplazo de genes ocurría a una alta frecuencia en presencia de los genes Red
en ambos constructos, pero la frecuencia de recombinación fue superior cuando las
funciones Red se expresaron desde el cromosoma. La frecuencia de recombinación con el
sistema λ Red fue más alta que las frecuencias obtenidas con hospederos recBC sbcBC,
recBC sbcA, o recD, los cuales han sido ampliamente utilizados para promover
recombinación homóloga con moléculas de DNA lineal en E. coli (Biek y Cohen 1986,
Jasin y Schimmel 1984, Russell et al. 1989, Winans et al. 1985).
 Un sistema análogo fue desarrollado, el cual utiliza las funciones de recombinación
de los profagos lambdoides crípticos Rac (recombinasa RecET) para interrumpir genes o
para general deleciones cromosomales. Sin embargo este sistema presenta la desventaja de
requerir largas regiones de identidad (>138 kpb) (Zhang et al. 1998). El sistema Rac es la
plataforma de una patente.

La evidencia para un reemplazo de genes promovido por el sistema λ Red utilizando

productos de PCR generó la inquietud de realizar modificaciones a esta aproximación para
facilitar la recombinación con segmentos cortos de DNA (Datsenko y Wanner 2000, Yu et
al. 2000). Aunque Murphy proveyó la primera evidencia para los reemplazos alélicos
generados por productos de PCR, las recombinaciones homólogas que presentaban cortas
regiones de identidad eran infructuosas. Dos métodos independientes, los cuales toman
ventaja de la recombinación promovida por el sistema λ Red fueron recientemente
desarrollados para promover interrupciones de genes con productos de PCR que contienen
regiones de identidad muy cortas (30 a 50 pb). Un intercambio hecho por cualquiera de
estos métodos se denomina genéricamente como una “intercambio Red” o, en inglés, un
“Red-swap”. La figura 2 muestra los pasos básicos de este procedimiento.

Fig. 2. Esquema general del procedimiento de Red-swap. En la figura se observa el intercambio de un alelo
pro- por un alelo pro+.

El método desarrollado por Court y colegas (Yu et al. 2000, Ellis et al. 2001) (fig. 3)
usa un profago defectuoso, el cual expresa los genes bet, gam y exo desde λPL bajo el
control de del represor termosensible cI1857 (Ts). En este sistema, la expresión de los
genes Red se induce al cambiar la temperatura a 42ºC aproximadamente durante 7-40 min.
El alto nivel de expresión de los genes Red provoca que PL induzca una muerte celular
dentro de los 60 min. La frecuencia de recombinación se satura a concentraciones de DNA
de alrededor de 300 moléculas por célula. Bajo condiciones óptimas, las eficiencias de
recombinación alcanzan 0,1% de las células sobrevivientes.
Fig. 3. La técnica de Court. Los genes Red se expresan a partir de un fago lambdoide defectuoso bajo el
control del represor termosensible cI857.

Un método alternativo desarrollado por Wanner y colegas (Datsenko y Wanner

2000) expresa los genes λ Red desde el control de un promotor inducible por arabinosa
ubicado en una plásmido termosensible de bajo número de copias (fig. 4). La expresión de
las funciones Red desde el promotor PBAD facilita una fina regulación de la inducción
gracias a la adición de arabinosa.

Fig. 4. La técnica de Wanner. Los genes Red se expresan desde el vector pKD46 bajo el control del promotor
PBAD dependiente de arabinosa.

Los fragmentos lineales de DNA usados para la recombinación pueden ser

generados por varias maneras, incluyendo fragmentos de restricción purificados, productos
de PCR u oligonucleótidos. El fragmento debe incluir 20-50 pb de identidad en cada
extremo. El efecto de la identidad se esquematiza en la figura 5.
Fig. 5. Efecto de la identidad en la frecuencia de recombinación mediada por el sistema Red (tomado de Yu et
al. 2001). Los círculos cerrados indican resultados en una hospedera recA+ mientras que los círculos abiertos
indican resultados obtenidos en una mutante recA.

Aunque las enzimas λ Red permiten la recombinación de fragmentos cortos de DNA

lineales, la frecuencia es suficientemente baja para necesitarse de una selección para
obtener las recombinantes deseadas. EN algunos casos, es posible seleccionar por la
pérdida del fenotipo cromosomal (Ej. Un requerimiento auxotrófico o una marca
contraseleccionable como tetA) (Gómez-Curet 2001). Alternativamente, es posible
seleccionar las recombinantes deseadas incluyendo un marcador dominante seleccionable el
DNA lineal (Ej. Un marcador de resistencia a antibiótico). Los plásmidos utilizados como
templados han sido construidos para la producción de fragmentos de PCR que contienen
algún marcador de resistencia a algún antibiótico. Tres plásmidos suicidas dependientes de
la proteína π (pKD3, pKD4 y pKD13) (fig. 6), los cuales carecen de identidad con el
cromosoma de E. coli, fueron construidos para usarse como templados para las
amplificaciones de PCR que generan un marcador seleccionable flanqueado por regiones
cortas de identidad (36-50 pb) con el gen blanco. La presencia de origen de replicación
condicional reduce el ruido de fondo generado por colonias resistentes que poseen
productos de PCR aberrantes que sean homólogos a secuencias del plásmidos (Datsenko y
Wanner 2000). Los sitios FRT que flanquean al marcador de resistencia al antibiótico
facilita la escisión del marcador de resistencia seleccionable al expresar la recombinada
FLP desde un plásmido fácilmente curable. La remoción de los marcadores mediante la
recombinasa FLP genera cicatrices idénticas en interrupciones generados por pKD3 o
pKD4. Estas cicatrices generar codones STOP en los 6 marcos de lectura. Además,
contienen un sitio de unión a ribosomas (Shine-Dalgarno) y un codón de inicio para
facilitar la creación de interrupciones génicas no polares. pKD13 no contiene señales de
traducción y puede ser utilizado principalmente para interrupciones de operones. Además,
las cicatrices FRT proveen de identidad para eventos de recombinación subsecuentes, los
que pueden ser utilizados para realizar fusiones de operón, por ejemplo, entre un promotor
determinado y un reportero lacZY (Ellermeier 2001).
Fig. 6. Plásmidos designados para generar mutaciones seleccionables por marcadores de resistencia a
antibióticos. El esqueleto de estos plásmidos está relacionado con el plásmido suicida dependiente de π
denominado pGP704 (http://www.salmonella.org/vectors/pgp704/). Las representaciones lineales de estos
plásmidos templados se muestran en A. Las cabezas de flechas indican las locaciones y orientaciones de los
sitios de unión a los partidores. P1: Sitios de unión de partidores 0, 1 y 3; P2: Sitio de unión de partidor 2; P4:
Sitio de unión de partidor 4. c1, c2, k1, k2 y kt: partidores de prueba comunes. Las secuencias remanentes
luego de la escisión de los genes de resistencia a antibiótico mediada por la recombinasa sitio específica FLP
se muestra en B. Los sitio de unión de partidores 0, 1 y 3 comienzan en los nucleótidos 1, 2 y 3
respectivamente. Los sitios de unión de partidores 2 y 4 comienzan en los términos izquierdos o derechos, tal
y como se indica. Las flechas con cabezas vacías muestran los FRT, los cuales representan cuasi repetidos
invertidos perfectos. El sitio de unión a ribosomas (rbs) y el codón de inicio metionina (met) se indican en la
figura. Tomado de Datsenko y Wanner 2000.

Debido a que los genes Red pueden favorecer eventos de recombinación no

deseados, es importante remover estos genes de la célula recombinante una vez que ésta ha
sido obtenida. Es posible eliminar el vector λ portador de los genes red en el sistema de
Court simplemente remplazando el profago con un pequeño fragmento de PCR flanqueado
por las secuencias que bordean el sitio att. Por otra parte, el uso de un plásmido
termosensible (pKD46) para el caso del sistema diseñado por Wanner permite una fácil
eliminación de las funciones Red al crecer las bacterias recombinantes a 42ºC en ausencia
de selección. Sin embargo, siempre que sea posible, es una buena idea realizar un
retrocruce de las mutaciones a un fondo genético limpio. Cuando las bacterias
recombinantes codifican un fenotipo seleccionable, el retocruce puede realizarse mediante
bacteriófagos o utilizando la técnica del DNA lineal (Toro et al. 1998).

Una vez que un gen ha sido mutado mediante la inserción de un cassette de

resistencia a algún antibiótico, frecuentemente es útil eliminar la resistencia a antibióticos
para eliminar efectos polares positivos no deseados. Los genes de resistencia a antibióticos
presentes en los plásmidos diseñados por Wanner están flanqueados por sitios FRT, los
cuales permiten una escisión eficiente al utilizar una recombinasa sitio específica, la que
utiliza estas secuencias como sustrato de recombinación (Fig. 7).
Fig. 7. Esquema de la escisión de un cassette de resistencia flanqueado por secuencias FRT con la ayuda de la
recombinasa Flp codificada en el plásmido auxiliar pCP20.

La recombinasa Flp puede ser provista en un plásmido: pCP20 AmpR CatR cI857
λPR flp oripSC101 (TS). A 37ºC se produce una alta cantidad de Flp, sin embargo, el plásmido
es incapaz de replicar por lo que es rápidamente segregado. El plásmido es incorporado a la
bacteria recombinante mediante electrotransformación o transducción.

Aunque el sistema λ Red ha sido mayoritariamente utilizado en E. coli y en

Salmonella, funciona con otras bacterias (Copeland et al. 2001; Sergueev et al. 2001). Al
parecer, la limitación radicaría en la expresión de los genes Red en la bacteria receptora.

Diseño de partidores para experimentos de Red-Swap

Para recombinaciones óptimas usando templados de doble hebra, típicamente se

diseñan partidores que hibridizan con las hebras complementarias con >35 pb de homología
perfecta con la secuencia blanco y >25 pb de homología perfecta con el locus de resistencia
al antibiótico. Estos partidores se utilizan para amplificar el gen de resistencia a antibiótico
mediante PCR antes de efectuar la recombinación (Fig. 8).
Fig. 8. Esquema que muestra los partidores utilizados para realizar Red-Swap. Los partidores presentan las
dos zonas señaladas en el texto. H: Zona de homología perfecta con la secuencia blanco que se desea
interrumpir. P: Zona de homología perfecta con el locus de resistencia a antibiótico ubicado en los plásmidos
auxiliares pKD3, pKD4 o pKD13 en el sistema diseñado por Wanner (Tomado de Datsenko y Wanner 2000).

Los partidores deben ser diseñados teniendo especial precaución de evitar auto-
hibridaciones o dímeros. Es útil realizar blast a las secuencias de los partidores contra el
genoma completo de la cepa receptora de la mutagénesis para determinar si existe
homología sustancial en sitios alternativos. La probabilidad de errores de síntesis
incrementa con el tamaño de los partidores, y apareamientos indeseados decrecen
fuertemente la frecuencia de recombinación, por lo que la longitud del partidor también
tiene que ser tomada en cuenta. Hemos encontrado que algunas veces cuando los
experimentos de Red-Swap fracasan, el problema se soluciona fácilmente mandando a
sintetizar nuevos partidores.

Procedimiento

Protocolo PCR (generación de Wanner) (25 μl)

- PCR buffer 10x 2,5μl

- MgCl2 (25mM) 1,5μl
- P1 2,5μl
- P2 2,5μl
- dNTPs (40mM) 0,5μl
- templado (plásmido) 1μl
- taq polimerasa 0,5μl
- H2O destilada 14 μl
30 ciclos de annealing 60ºC y extensión de 1:30 min
A continuación, alícuotas de 3 a 5 µl de cada preparación se sometieron a electroforesis en
geles de agarosa al 0,8% con el fin de comprobar la eficiencia de la purificación y estimar
la cantidad de DNA presente en cada muestra.

2) Preparación de Células Electrocompetentes

- Sembrar 2 ml de 14028 / pKD46 en caldo luria con glucosa y ampicilina a

30 ºC toda la noche
- En un matraz con vástago agregar 25 ml de caldo luria y suplementar con
arabinosa, luego agregar 200 μl de preinóculo
- Incubar a 30 ºC con agitación hasta OD600 = 0,4
- Llevar los 25 ml de cultivo a 2 tubos córex de 30 ml. Centrifugar por 10 min. a
13000 rpm
 - Eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet en 20 ml de glicerol 10%
estéril. Centrifugar por 10 a 13000 rpm
- Repetir el paso previo 2 veces, resuspendiendo en 25 ml de glicerol 10% estéril
cada vez
- Eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet en 2 ml de glicerol 10% estéril.
Llevar 1 ml de la solución a un tubo eppendorff.
- Centrifugar por 10 min. a 10000 rpm. Eliminar el sobrenadante y resuspender el
pellet final en 50 μl de glicerol 10% , para obtener un volumen aproximado de
100 μl de bacteria electrocompetente

3) Electrotransformación con Producto de PCR

- Mezclar 100 μl de células competentes con 10 μl de amplificado

- Colocar la mezcla en una cubeta para electroporación. Fijar el equipo a 2,5
KV,25μF, 800Ώ y electroporar
- Resuspender la mezcla en 1 ml de CL. Incubar 1 h a 37ºC con agitación, para
expresión fenotípica
- Plaquear 200 μl en 5 placas agar luria con Kan (50 μg/ml) o Cam (20 μg/ml)
- Incubar a 37ºC por 24 h

4) Confirmación de la Mutagénesis

1) Confirmación fenotípica

- Depende del gen que se esté mutagenizando

2) Confirmación por PCR

Mediante PCR con los juegos de partidores correctos, y con una electroforesis en geles de
agarosa, se observa los distintos tamaños del amplificado en la cepa silvestre y en la cepa
mutante antes isogénica con el gen reemplazado por un cassette de resistencia.

5) Remoción de cassettes génicos flanqueados por secuencias FRT

- Se transforma células electrocompetentes con el plásmido pCP20

- Se siembra en placas de agar luria con ampicilina (100 μg/ml)
- Se incuban toda la noche a 30ºC
- Las colonias obtenidas se aíslan 3 veces en placas de agar luria, incubándola a 37 ºC
- La perdida del cassette se confirma vía PCR, utilizando la pareja de partidores
adecuadas
Plásmidos Utilizados:

pKD3: Este plásmido posee clonado el gen cat (que codifica para la cloranfenicol
acetiltransferasa) flanqueado por secuencias FRT (Flp Recombinase Target). Además,
posee el gen bla como marcador de selección (β-lactamasa; resistencia a ampicilina) y un
origen de replicación condicional (oriR6K) dependiente de la presencia de la proteína Pi
(π). Se utiliza como molde para la amplificación por PCR del gen cat en la generación de
mutantes mediante reemplazo alélico por transformación directa con productos de PCR.

pKD4: Este plásmido posee clonado el gen aph (que codifica para la aminoglicósido
fosfotransferasa presente en el transposón Tn5) flanqueado por secuencias FRT (Flp
Recombinase Target). Además, posee el gen bla como marcador de selección (β-lactamasa;
resistencia a ampicilina) y un origen de replicación condicional (oriR6K) dependiente de la
presencia de la proteína Pi (π). Se utiliza como molde para la amplificación por PCR del
gen aph en la generación de mutantes mediante reemplazo alélico por transformación
directa con productos de PCR.

pKD46 : Este plásmido posee clonados los genes que codifican para las subunidades Bet,
Gam y Exo de la recombinasa Red del fago λ, bajo el control del promotor Para (este
promotor se induce en presencia de L-arabinosa en el medio de cultivo). Además, posee el
gen que codifica para la β-lactamasa como marcador de selección y un origen de
replicación termosensible (no se replica a temperaturas iguales o superiores a 37°C). Se
utiliza para generar mutaciones mediante reemplazo alélico por transformación directa con
productos de PCR. Este proceso ocurre mediante eventos de recombinación homóloga
catalizados por la recombinasa Red del fago λ .

pCP20: Este plásmido posee clonado el gen que codifica para la recombinasa Flp bajo el
control de un promotor termoinducible. Además, posee el gen bla como marcador de
selección (β-lactamasa; resistencia a ampicilina) y un origen de replicación termosensible
(no se replica a temperaturas iguales o superiores a 37°C). Se utiliza para generar
deleciones de material genético flanqueado por las secuencias FRT, mediante un evento de
recombinación sitio-específica catalizado por la recombinasa Flp.
Referencia obligatoria

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