Orlandini Mendoza Claudia ACTIVIDAD 2. MEMORIA DE PRÁCTICAS

MEMORIA DE PRÁCTICAS
AISLAMIENTO Y SELECCIÓN DE MICROORGANISMOS

PRODUCTORES DE AMILASAS
EXTRACCIÓN E INMOVILIZACIÓN DE AMILASAS DE ORIGEN
MICROBIANO
MÁSTER EN CALIDAD, DESARROLLO E INNOVACION DE ALIMENTOS
AVANCES EN BIOTECNOLOGIA DE ALIMENTOS
CURSO 2021- 2022

Realizado por:
Claudia Melissa Orlandini Mendoza
N° horas aportadas: 4 horas

INDICE
INTRODUCCIÓN
PARTE EXPERIMENTAL
AISLAMIENTO Y SELECCIÓN DE MICROORGANISMOS
PRODUCTORES DE AMILASAS
EXTRACCIÓN E INMOVILIZACIÓN DE AMILASAS DE
ORIGEN MICROBIANO
RESULTADOS
ANEXOS
BIBLIOGRAFÍA
AISLAMIENTO Y SELECCIÓN DE MICROORGANISMOS PRODUCTORES DE AMILASAS
EXTRACCIÓN E INMOVILIZACIÓN DE AMILASAS DE ORIGEN MICROBIANO
1. INTRODUCCIÓN
El aislamiento de microorganismos con capacidad amilolítica es el punto de partida para
aprovechar la biodiversidad microbiana en la producción de amilasas con características
específicas que permitan obtener nuevos productos y optimizar procesos industriales donde
sean aplicables (Calderón M, 2017).
Las amilasas microbianas son más estables que las obtenidas a partir de plantas o animales y
han reemplazado tecnologías químicas en la industria alimentaria debido a su bajo costo, alto
productividad, estabilidad química, bajos niveles de contaminación, amplia disponibilidad y
puede ser fácilmente evaluada su actividad por diversas técnicas de laboratorio (Sánchez E,
2020).
La inmovilización de enzimas es un proceso en el que se ubica a la enzima en una región
definida del espacio, para dar lugar a formas insolubles que retienen su actividad catalítica y
que pueden ser reutilizadas repetidamente (Arroyo M, 1998).
Como ventajas del empleo de enzimas inmovilizadas podemos destacar:
1. El aumento de la estabilidad de la enzima.
2. La posible reutilización del derivado, por lo que disminuyen los costes del proceso.
3. La posibilidad de diseñar un reactor enzimático de fácil manejo y control, adaptado a la
aplicación de la enzima inmovilizada.
En esta práctica, se buscarán hongos productores de enzimas amilolíticas procedentes de
tierra. Para ello se inocularán sobre agar con almidón y se revelará su presencia con el
reactivo yodado. Posteriormente, se aislarán las cepas productoras de amilasas, se harán
crecer en medio específico (con almidón) y se reproducirán en medio de salvado para obtener
una buena cantidad de biomasa de la que poder aislar las enzimas.
Luego, el extracto enzimático obtenido a partir del cultivo sólido de un microorganismo
productor de amilasa, se inmovilizará en alginato de sodio Al polimerizar una solución de
alginato conteniendo enzimas estas quedan atrapadas dentro de las esferas que se generan.
Finalmente, se evaluará la actividad amilásica del extracto enzimático y de las perlas.
2. PARTE EXPERIMENTAL
2.1. AISLAMIENTO Y SELECCIÓN DE MICROORGANISMOS PRODUCTORES
DE AMILASAS
Se recolectó muestras de tierra seca de 2 zonas de la Ciudad de Palencia (A: Zona Hospital
San Telmo y B: Zona Calle Cenera de Zalima). Las muestras fueron colocadas en frascos de
plástico rotulados y llevadas al laboratorio.
En la primera jornada, se colocó 1 g de tierra en un tubo con 15 ml de agua destilada estéril
y se agitó en el agitador de tubos. Este procedimiento se realizó con ambas muestras y se
rotuló correspondientemente. Finalmente, las placas inoculadas se colocaron en la cámara de
incubación, en posición invertida, durante una semana a 28 °C.
En la segunda jornada, se vertió la disolución de yodo (I 2/KI) sobre las placas inoculadas,
hasta cubrir por completo la superficie del agar, con una capa de yodo de 1 mm
aproximadamente. Se detectaron las colonias de las cepas productoras de amilasas y se
sembraron las colonias en tubos de agar inclinado YPD con almidón al 1%. Se incubaron
durante 4 días y se mantuvieron en refrigeración.
En la tercera jornada, se añadió 5 ml de agua estéril a cada tubo de agar inclinado, se agitó
con el agitador de tubos y se obtuvo una suspensión correspondiente al inóculo. Se inoculó 1
ml de la suspensión en un matraz Erlenmeyer de 250 ml conteniendo 5g de salvado estéril y
5 ml de agua destilada estéril, como se observa en la Fig. 1 y se incubó a 28ºC durante una
semana.
2.2. EXTRACCIÓN E INMOVILIZACIÓN DE AMILASAS DE ORIGEN

MICROBIANO
2.2.1. EXTRACCIÓN DE AMILASAS EN CULTIVO SÓLIDO MICROBIANO
Se añadió 5 ml de NaCl 0.1 % (p/v) a cada cultivo microbiano con salvado (A y B), se
centrifugó por 5 min a temperatura ambiente y se obtuvo un sobrenadante. Se tomó
1.5 ml del sobrenadante (extracto) por cada muestra y se colocó en un tubo Falcon. Se
preparó una muestra control con 1.5 ml de agua. Se procedió a centrifugar los tubos
FalconFig.
por 51 min
Matraz
a 4 Erlenmeyer
000 rpm. Sede 250 ml
obtuvo el conteniendo 5g de salvado estéril
extracto enzimático.
y 5 ml de agua destilada estéril
2.2.2. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD AMILÁSICA DEL EXTRACTO
Se ensayó la actividad amilásica del extracto sin diluir. Se añadió 0.5 ml del extracto
enzimático a un tubo de ensayo con 5 ml de sustrato por cada muestra (A y B) y 0.5
ml de agua para el control. Se incubaron los 3 tubos a 30 °C por 30 min.
Mientras tanto, se procedió a preparar una batería de tubos para cada muestra (A y B)
y para el control. Cada batería consistía en un tubo con 5 ml de HCl 0.1 N y un tubo
con 5 ml de solución reveladora.
Se añadió 0.5 de la solución incubada (extracto enzimático con sustrato) al tubo con 5
ml de HCl 0.1 N y se mezcló en el vortex, luego se añadió 0.5 ml de esta última
mezcla al tubo con 5 ml de solución reveladora y se mezcló en el vortex. Se realizó el
procedimiento anterior con cada muestra (A y B) y la muestra control.
Finalmente, se midió la absorbancia a 640 nm de la solución de cada tubo usando el
espectrofotómetro. Se procedió a calcular la actividad amilásica.
2.2.3. INMOVILIZACIÓN DE LAS ENZIMAS EN GELES DE ALGINATO
Previamente, se escogió la muestra que tiene mayor actividad amilásica, se vació el
cultivo correspondiente a un tubo Falcon y se centrifugó por 5 min. Se obtuvo un
sobrenadante, es decir el extracto enzimático.
A. Inmovilización de amilasas en geles de alginato (Fig. 2)
Para la inmovilización se cargó 5 ml del extracto enzimático obtenido del cultivo
microbiano en un tubo de jeringuilla tapando la pequeña abertura que presenta con
el dedo y se agregó 5 ml de alginato de sodio (2,0 % final). Se homogenizó el
extracto y el alginato dando vueltas de forma vertical cuidadosamente y se
procedió a introducir el émbolo hasta que la disolución se encuentra cerca a la
abertura pequeña. Se hizo gotear la solución en un vaso de precipitado
conteniendo 100 ml de una solución de CaCl 2 0.2 M y se produjeron esferas de 3 a
5 mm de diámetro que se polimerizan al entrar en contacto con la solución de
CaCl2. Las esferas se estabilizaron, en agitación, durante 30 min en la solución de
CaCl2 a temperatura ambiente y posteriormente, se lavaron con 100 ml de agua
destilada a pH 7.
A.
B. C.
Fig. 2 Procedimiento para inmovilización de amilasas en geles de

alginato. A: Enzima y alginato cargado, B: Goteo en CaCl2 y C: Lavado
de esferas.
B. Medida de la actividad enzimática del inmovilizado
Se pesó las perlas y se dividió en 2 partes, luego se colocó una parte en un tubo
Falcon con 5 ml de solución de sustrato y se incubó por 30 min a 30°C en
agitación orbital (120 rpm).
Se procedió a preparar una batería de tubos para la muestra y para el control. Cada
batería consistía en un tubo con 5 ml de HCl 0.1 N y un tubo con 5 ml de solución
reveladora. Se añadió 0,5 ml de la solución de sustrato hidrolizado del tubo Falcón
de la fracción de perlas N/2 al tubo al tubo con 5 ml de HCl 0,1 N y se mezcló en
el vortex, luego se cogió 0.5 ml de la mezcla, se añadió al tubo con 5 ml de
solución reveladora y se mezcló en el vortex. En el caso de muestra control, se
cogió 0.5 ml de solución de sustrato sin hidrolizar y se realizó el mismo
procedimiento descrito.
Se cuantificó la desaparición del sustrato por espectrofotometría midiendo la
absorbancia a 640 nm.
C. Cálculo de la actividad amilásica de las perlas
Se procedió a calcular la actividad amilásica de las perlas.
3. RESULTADOS
3.1. Aislamiento y selección de microorganismos productores de amilasas: Primera
y segunda jornada
En la Fig. 3 podemos observar el crecimiento de las colonias en el agar YPD. Tras el
revelado con la disolución de yodo, se produjo la aparición de zonas de color marrón claro
en los bordes de las colonias de ambas placas, este color corresponde al color de la solución
de yodo evidenciando la formación de un halo, lo cual es característico de las cepas
productoras de enzimas hidrolíticas del almidón (amilasas). Las zonas más oscuras (color
azul-negruzco) corresponden a la presencia del almidón que no ha sido degradado por las
amilasas y fue teñido con la adición de la disolución de yodo.
A. B.
Fig. 3 Revelado de almidón con la adición de la disolución de yodo en

placa de Agar YPD inoculada e incubada. A: Zona Hospital San Telmo
y B: Zona Calle Cenera de Zalima.
En la Fig. 4 podemos observar el crecimiento de las colonias de cepas productoras de

enzimas hidrolíticas del almidón (amilasas) en agar inclinado YPD con almidón al 1%.
B.
A.
A.
Fig. 4 Colonias de cepas productoras de amilasas en agar

inclinado YPD con almidón al 1%. A: Zona Hospital San
Telmo y B: Zona Calle Cenera de Zalima.
3.2. Aislamiento y selección de microorganismos productores de amilasas: Tercera
jornada
En la Fig. 5 se observa el cultivo de las cepas productoras de amilasas en cultivo sólido,
donde ocurrió la fermentación del almidón presente en el endospermo residual del salvado
de trigo. Esta práctica favorece la producción de las amilasas.
B.
A.
Fig. 5 Inóculo en matraz Erlenmeyer de 250 ml

conteniendo 5g de salvado estéril y 5 ml de agua destilada
estéril tras incubación. A: Zona Hospital San Telmo y B:
Zona Calle Cenera de Zalima.
3.3. Extracción e inmovilización de amilasas de origen microbiano: Determinación

de la actividad amilásica del extracto
En la Fig. 6 podemos observar un degradado de colores azul-negruzco en los

tubos producto del revelado con la disolución de yodo, el cual se acompleja con
la amilosa en presencia de almidón y forma ese color. La intensidad de esta
coloración es proporcional a la cantidad de almidón que hay en el medio. Una
coloración más clara como en el tubo B ( Zona Calle Cenera de Zalima) supondría
una menor presencia de almidón debido a que ha sido degradado por la amilasa,
evidenciando de esta manera su actividad. En el tubo B1 ( Zona Calle Cenera de
Zalima), se observa una coloración más oscura que el tubo B pero más clara que
el control (Tubo C), lo que indicaría cierta actividad enzimática pero de menor
grado que la del tubo B. ( Detalle: Se han cogido datos experimentales de mi
compañera) Los tubos B y B1 pertenecen a la misma muestra pero se aisló
distintas colonias.
B1
B. C.
.
Fig. 6 Coloración obtenida final. B1: Zona Calle Cenera
de Zalima , B: Zona Calle Cenera de Zalima y C: Control
En la Tabla N° 1 se puede observar las absorbancias de las muestras y el

control. La muestra B (Zona Calle Cenera de Zalima) es la que obtuvo la menor
absorbancia y se escogió para realizar el cálculo del almidón hidrolizado y la
actividad amilásica. La actividad amilásica de la muestra B es de 19.54 mg de
almidón hidrolizado por ml de enzima por hora.
Tabla N° 1. Absorbancias a 640 nm
Cantidad de almidón Actividad amilásica

Absorbancia
hidrolizado (AH) (AA)
Control 0.522 19.54 mg almidón
Muestra B1 0.490 4.885 mg de almidón hidrolizado/ml enzima
Muestra B 0.471 xh
3.4. Extracción e inmovilización de amilasas de origen microbiano: Medida de la

actividad enzimática del inmovilizado
En la Tabla N° 2 se puede observar las absorbancias de la muestra y el control.

La actividad amilásica de las perlas de la muestra B es de 14.48 mg de almidón
hidrolizado por ml de enzima por hora.
Tabla N° 2. Absorbancias a 640 nm
Actividad amilásica de las

Absorbancia
perlas (AAp)
Control 0.756 14.48 mg almidón
Muestra B 0.482 hidrolizado/ml enzima x h
Los resultados arrojaron que existe una menor actividad enzimática (14.48 mg almidón
hidrolizado/ml enzima x h) cuando las enzima se encuentra inmovilizada en las esferas en
relación a cuando se encuentra en el extracto (19.54 mg almidón hidrolizado/ml enzima x h)
debido a varias razones: primero, al inmovilizarse la enzima amilasa en alginato de sodio
puede sufrir una alteración de su conformación respecto a su estado nativo perdiendo parte
de su funcionalidad de actuar sobre su sustrato; segundo, en el sistema enzima-soporte
(alginato de sodio) existe una gran heterogeneidad ya que se producen diferentes fracciones
de amilasas inmovilizadas con un diferente número de uniones al soporte (alginato de sodio)
lo que hace que la actividad de la enzima no sea uniforme y como tercera razón, durante la
inmovilización siempre suele haber una pérdida de la actividad enzimática (Calderón M,
2017).
Además, la actividad amilásica de la enzima inmovilizada es menor porque en este caso es
más difícil que la enzima pueda acceder al sustrato; también puede deberse a que la enzima
pudo haberse perdido si la polimerización no fue lo suficientemente eficiente.
4. ANEXOS
Cálculos para hallar la Cantidad de almidón hidrolizado (AH)
0.522−0.471
AH =50 x =4.885mg de almidón
0.522
Cálculos para hallar la Actividad amilásica (AA)
0.522−0.471
50 x
0.522 19.54 mg almidón hidrolizado/ml enzima x h
AA= =¿
0.5 ml X 0.5 h
Cálculos para hallar la Actividad amilásica de las perlas (AAp)
0.756−0.482
50 x
0.756 14.48 mg almidón hidrolizado/ml enzima x h
AAp= =¿
2.5 ml X 0.5 h
BIBLIOGRAFÍA
Arroyo, M (1998). Inmovilización de enzimas. Fundamentos, métodos y aplicaciones. Ars
Pharmaceutica, 39 (2) Recuperado de: www.ugr.es/~ars/abstract/arroyo.pdf
Calderón, M (2017). Aplicación de un sistema inmovilizado en esferas de alginato de calcio en la
remoción de fenoles. Tesis. Instituto tecnológico de Mérida, Yucatán.
Sánchez, E (2020). Aislamiento e identificación de microorganismos potencialmente amilolíticos y
celulolíticos de suelos de humedales de Bogotá. Rev. Colomb. Biotecnol, 7 (1) Recuperado de:
www.scielo.org.co/pdf/biote/v22n1/0123-3475-biote-22-01-36.pdf

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2.2. EXTRACCIÓN E INMOVILIZACIÓN DE AMILASAS DE ORIGEN

Fig. 2 Procedimiento para inmovilización de amilasas en geles de

Fig. 3 Revelado de almidón con la adición de la disolución de yodo en

En la Fig. 4 podemos observar el crecimiento de las colonias de cepas productoras de

Fig. 4 Colonias de cepas productoras de amilasas en agar

Fig. 5 Inóculo en matraz Erlenmeyer de 250 ml

3.3. Extracción e inmovilización de amilasas de origen microbiano: Determinación

En la Fig. 6 podemos observar un degradado de colores azul-negruzco en los

En la Tabla N° 1 se puede observar las absorbancias de las muestras y el

Tabla N° 1. Absorbancias a 640 nm

Cantidad de almidón Actividad amilásica

3.4. Extracción e inmovilización de amilasas de origen microbiano: Medida de la

En la Tabla N° 2 se puede observar las absorbancias de la muestra y el control.

Tabla N° 2. Absorbancias a 640 nm

Actividad amilásica de las

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