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DETERMINACIÓN DE COMPUESTOS FENÓLICOS

(CATEQUINAS, CAFEÍNA, ÁCIDOS ORGÁNICOS) EN
TE VERDE (Camellia sinensis) USANDO CROMATOGRAFÍA
LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN
DETERMINATION OF PHENOLIC COMPOUNDS (CATECHINS, CAFFEINE, ORGANIC
ACID) OF GREEN TEA (camellia sinensis) USING HIGH PERFORMANCE LIQUID
CHROMATOGRAPHY RESOLUTION

RAMIRÉZ-ARISTIZABAl L.S1*, 2, ORTIZ A.3 4, OSPINA-OCAMPO L.F. 2, 5

RESUMEN concluir que el contenido de compuestos fenólicos

y flavonoides especialmente la EGCG se relaciona
Antecedentes: La búsqueda de compuestos con dicha actividad.
antioxidantes es un área que cada día adquiere más Palabras clave: Antioxidantes, Camellia sinen-
relevancia por el aumento de enfermedades y fac- sis, cromatografía líquida, fase reversa flavonoides,
tores ambientales que contribuyen a la generación nutraceuticos, Té verde,
de radicales libres, se hace necesaria la búsqueda de
fuentes de compuestos que generen equilibrio para
ABSTRACT
contrarrestar estos radicales, una de estas fuentes
naturales es el Té verde, que ha comenzado a hacer Background: The determination of antioxi-
parte de la dieta de los colombianos para mejorar la dant compounds is a research field that everyday
salud de forma natural. Objetivos: Determinar las becomes more relevant because of the increase of
condiciones para la extracción de catequinas, cafeína diseases and environmental factors contributing
y algunos ácidos fenólicos presentes en el té e im- to the generation of free radicals, therefore, the
plementar un método cromatográfico que permita location of antioxidants sources are necessary to
separar, identificar y cuantificar dichos compuestos; create a balance that off sets the radical damage.
comparar la calidad química de diferentes marcas Green tea is considere done of these natural sources
de Té comercializadas en Colombia. MÉTODOS: which has begun to be part of the diet of Colom-
Se usó diferentes marcas de té: Oriental, Hindú, bians seeking to improve their health naturally.
Liptón y Jaibel, los extractos se obtuvieron mediante Objectives: Determine the optimal conditions for
reflujo con agua acidulada. El método cromatográ- the simultaneous extraction of catechins, caffeine
fico se desarrolló en fase reversa empleando una and some phenolic acids present in green tea and
columna Ultra AQ C-18, y elución en gradiente implement a chromatographic method to separate,
(Ácido acético, acetato de etilo y Acetonitrilo). identify and quantify these compounds responsable
Resultados: Se cuantificaron 10 compuestos pre- for antioxidant activity; Also compare the chemical
sentes en el extracto de Té, los mayoritarios fueron quality of different brands of tea sold in Colombia.
Epigalocatequingalato (EGCG), cafeína y acido Methods: Different brands of green tea obtained
Gálico. Conclusión: El método cromatográfico directly from the chain stores are used, these are:
permitió cuantificar 10 compuestos presentes en Oriental, Hindú, Lipton and Jaibel, the extracts
el extracto acuoso del Té. La actividad antioxidante were obtained by refluxing with acidulated water.
previamente establecida en estas muestras permitió The chromatographic method was developed using

1
Ph.D. Bioquímca. Profesor asociado
2
Facultad de Tecnología, Departamento de Química, Universidad Tecnológica de Pereira.
3
M.Sc. Ciencias Químicas. Investigador I. Disciplina de Calidad, Universidad Tecnológica de Pereira.
4
Centro Nacional de investigación del café. CENICAFE
5
Profesor Catedrático, Química Industrial. Universidad Tecnológica de Pereira.
*
Autor a quien se debe dirigir la correspondencia: luramire@utp.edu.co
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a reversed phase column C AQ-18 Ultra and gradi- sinensis (5). La calidad del té se relaciona con la
ent elution composed of acetic acid, ethylacetate and composición de sus constituyentes, por lo tanto es
acetonitrile. Samples and standards were analyzed importante desarrollar un método analítico que
in triplicate. Results: Ten compounds in Green tea permita evaluar la naturaleza y la capacidad bioló-
extracts were separated, identified and quantified, gica de catequinas en muestras como cosméticos
epigallocatechingallate (EGCG), caffeine and gallic bebidas, suplementos dietarios, u otros alimentos a
acid were the major compounds. Conclusions: The base de té (2)1.8\u03bcm. El objetivo de este trabajo
chromatographic method allowed to quantify 10 fue desarrollar un método para, separar, identificar
compounds present in the aqueous extract of green y cuantificar Cafeina (CAF), acido gálico (AG),
tea. The antioxidant activity previously established Acido Clorogenico (AC), Acido ferrulico (AF)tri-
on the sesamples showed that this content of flavo- gonelina (T), Catequina (C), Galocatequina (GC),
noids and phenolic compounds EGCG especially Epicatequingalato (ECG) Epigalocatequina (EGC),
relates tosuch activity. Epicatequina (EC), Epigalocatequingalato (EGCG)
Keywords: Antioxidants, camellia sinensis, en cuatro muestras de té verde comercializadas es
liquid chromatography, flavonoids, reverse phase, Colombia.
nutraceuticals, green tea.
MATERIALES Y MÉTODOS
INTRODUCCIÓN
Las muestras se seleccionaron de los almacenes
Se considera que los alimentos nutracéuticos de cadena, las marcas fueron: Oriental, Hindú,
tienen efectos terapéuticos y su consumo ha ido Liptón y Jaibel, cada muestra de té fue analizada
aumentando por la población en general. El té en su por triplicado.
forma pura se considera una de las bebidas naturales
Extracción y análisis cromatografico
más benéficas para la salud. Los fitoquímicos son
compuestos bioactivos que se generan en las plan- Se tomó 0,2 gramos de cada muestra de Té,
tas e incluyen metabolitos secundarios que surgen con 10 mL de ácido acético 0,1% y se sometió a
como mecanismo de defensa y adaptación al estrés un proceso de reflujo durante 30 minutos, se dejó
del medio ambiente. En el Té se han reportado alre- enfriar y se centrifugo a 7500 rpm por 15 minutos.
dedor de 4000 compuestos bioactivos, de los cuales El sobrenadante se llevó a 15 mL, se alicuotó y se
la tercera parte son compuestos fenólicos princi- guardó a 4 °C. Los extractos fueron analizados en
palmente flavonoides, conocidos como catequinas, un cromatógrafo líquido, Jasco 2000 con detector
estos compuestos son responsables de la actividad de arreglo de Diodos Jasco MD- 2015 Plus, Au-
antioxidante mediante la neutralización de radicales tomuestreador Jasco AS-2059 Plus y horno Jasco
libres generados en los procesos metabólicos(1). CO-2065 Plus. Las separación se realizó en una
La mayoría de las catequinas que se encuentran columna en fase reversa (Ultra AQ C-18 150 x 3,2
en los extractos de té verde son conocidas como mm id, 3 µm de partícula), la temperatura fue de a
(+)-catequina (C), (-)-epicatequina (EC), (+)-ga- 35°C, el software EZChromElit, la fase móvil fue
locatequina (GC), (-)-epicatequingalato (ECG), (-) ácido acético 0,5%, solvente A, y una mezcla de
epigalocatequina (EGC), y (-)- epigalocatequinga- Acetonitrilo: Acetato de Etilo: ácido acético 0,1% en
lato (EGCG), además de la cafeína quien tiene un proporción (10:2:88) como solvente B. El gradiente
efecto estimulante, (2)1.8\u03bcm. Sus contenidos de elución es presentado en la tabla 1. Las señales
pueden variar según las características del Té. Para cromatográficas fueron identificadas por compa-
obtener el té verde las hojas son tratadas con vapor a ración de los tiempos de retención de las muestras
altas temperaturas y secadas para desactivar la poli- con los estándares.
fenoloxidasa y prevenir la oxidación catequinas y la
degradación enzimática de vitaminas. (3). También CURVAS DE CALIBRACIÓN
puede variar con el tiempo, edad de las hojas, clima,
y post cosecha.(4), por ejemplo la variedad assamica La cuantificación se realizó por el método de
generalmente no es usada para la producción de té estándar externo. Se prepararon soluciones Stock de
verde porque el contenido de flavonoides lo hace T, AG, AC, CAF y EC a 5000 mg/L, EGC, C, AF
ser una bebida más amarga que los de variedad y ECG a 1000 mg/L y EGCG a 2000 mg/L. pre-
paradas en Metanol: ácido acético 0,1% (50:50 v/v).
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Tabla 1. Condiciones del Gradiente de Elución

FASE A (%) FASE B (%) Tiempo (min) Flujo (mL/min)
10 90 0 0,5
40 60 15 0,5
50 50 17 0,7
60 40 20 0,7
40 60 25 0,7
20 80 30 0,7
10 90 35 0,5

Se prepararon las curvas de calibración con las

concentraciones de trabajo: Trigonelina (1,25-20
mg/L), Catequina (1-10mg/L), Epigalocatequinga-
lato (50-300 mg/L), Acido gálico (5-80 mg/L), Ca-
feína (25-400 mg/L), Acido ferrúlico (0,5 -5 mg/L),
ácido Clorogénico (50-1200 mg/L), epicatequina
(30-250 mg/L), Epicatequingalato (5-80 mg/L).
EGC (50-600 mg/L). Cada curva de calibración se
corrió por triplicado. Figura 1. Perfil Cromatográfico a) Mezcla de estándares.
b) Muestra de té verde (Liptón)
RESULTADOS
Las concentraciones, se determinaron con las
Se analizaron los estándares individualmente curvas de calibración de cada estándar y se resumen
y se compararon los tiempos de retención con la en la tabla 3 con su respectiva ecuación. Todas las
mezcla de estándares, los resultados se observan en curvas de calibración presentaron un rango lineal
la tabla 2, en la figura 1a se muestra el perfil croma- (0,951-0,997). Los valores de límite de detección
tográfico de una mezcla de estándares, se logró la (LD) y límite de cuantificación (LC) se calcula-
separación de 9 compuestos. Con estas condiciones ron determinando la relación señal-ruido de los
cromatográficas se analizaron las muestras de los estándares más diluidos. Se presentaron errores
extractos de té. En la figura 1b se observa el perfil relativamente bajos en la gran mayoría <5, excep-
cromatográfico de una muestra de té (Liptón), que tuando la Catequina.
al ser comparada con el perfil de una mezcla de es-
tándares (figura 1a) permitió separar e identificar 9
compuestos fenólicos, siendo la cafeína y la EGCG
los más abundantes, los compuestos se relacionan
en la tabla 2.

Tabla 2. Tiempo de retención de los estándares, LD y LC

Estándares pico # tiempo de retención (min) Señal (mV) S/R LD(mg/L) LC (mg/L)
Trigonelina 1 1,58 19,44 486 0,02 0,05
Ácido Gálico 2 2 28,23 705,78 0,04 0,14
Catequina 3 3,28 1,04 25,9 0,23 0,77
Ácido Clorogénico 4 3,37 1,6 40 7,5 25
cafeína 5 4,24 47,38 1184,5 0,13 0,42
Epicatequina 6 4,38 111,45 2786,25 0,06 0,22
EGCG 7 4,37 27,47 686,83 0,44 1,46
Ácido ferrúlico 8 7,05 13,43 335,65 0,01 0,03
epicatequingalato 9 11,66 1,76 43,98 0,68 2,27
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Tabla 3.Concentración de Cafeína, Catequinas y ácido orgánicos en extractos de té verde determinados por
HPLC-DAD (mg/L± Error); N=3

Oriental Hindú Liptón Jaibel

Estándares Ecuación Curva R²
( mg/L) ( mg/L) ( mg/L) ( mg/L)
Trigonelina y = 24414x + 17088 0,989 77,6 ± 3,0 68,6 ±1,1 80,6±0,9 56,9±0,7
Ácido Gálico y = 86560x + 1675,4 0,993 20,3 ± 0,8 6,8 ±0,2 11,2±0,3 6,6±3,2
Epigalocatequina y = 8133,7x - 131117 0,997 74,4 ± 3,4 51,4 ±2,5 161,9±0,8 144,0±1,3
Catequina y = 3399,6x + 10527 0,951 349,8 ± 12,4 705,7±11,3 113,9±0,6 66,6±4,7
Ácido Cloro génico y = 27359x - 801055 0,995 119,5 ± 7,6 52,6±1,2 93,5±3,6 46,5±0,01
cafeína y = 77523x - 426137 0,991 167,4 ± 5,9 150,8±0,6 190,1±4,2 233,0±0,01
Epicatequina y = 43747x - 628730 0,995 77,1 ± 2,8 58,7±1,6 79,2±0,7
EGCG y = 25520x - 1E+06 0,981 320,5 ±10,4 345,9±3,3 439,3±5,2 351,7±0,3
Ácido ferrúlico y = 62677x - 30571 0,974 7,5 ±0,6 12,9±0,1 9,7±0,6 6,2±0,5
epicatequingalato y = 41232x - 116878 0,996 40,0 ±3,5 44,6±1,3 59,8±0,7 33,1±1,7

DISCUSIÓN los resultados obtenidos en el presente estudio con

otro realizado por Zielinski AAF(9) cuyo objetivo
La extracción de la cafeína, trigonelina, ácidos fue determinar un metodo para la optimización
e isómeros de la Catequina presentes en el té verde de la extracción los compuestos fenólicos del té,
se realizó por reflujo, algunos autores (6)(7) esta- se puede afirmar que las cuatro marcas comercia-
blecen el tiempo de extracción entre 0,5 a 3 horas lizadas en colombia tienen alto contenido de ácido
a 80 °C, aunque al realizar la comparación de los clorogénico y EGCG, estos resultados son consis-
métodos de extracción Myoung-GunChoung (7), tentes con reportes previos (10) que indica que la
establece que la galocatequina se extrae totalmen- EGCG es la más abundante de las catequinas del
te mediante reflujo mientras que el ácido gálico, Té. Algunos autores reportan que el contenido de
Catequina y epigalocatequingalato incrementan EGCG en infusiones de té comercial se encuentran
gradualmente por encima de las tres horas de entre 22-53 mg/g (3), estos datos se relacionan
calentamiento. Otros autores sugieren que el con los obtenidos por el presente estudio pues las
contenido de catequinas incrementa del 30-40% cuatro marcas se encuentran dentro del rango, sin
cuando se extrae por un periodo de 10 minutos, embargo lipton es quien presenta diferencia por su
las hojas viejas contienen menos cafeína pero más alto contenido (Tabla 4). La actividad antioxidante
EGCG (8). Generalmente los niveles de cafeína en de los flavonoides depende en parte de el numero
infusiones se encuentra entre 141-338 mg/L (8), de y la posicion de los grupos hidroxilo en la molecula
todas las marcas quien contiene una gran cantidad y la EGCG es el compuesto con mayor numero de
de cafeína es Jaibel (233 mg/L) lo que podría sugerir grupos hidroxilo, esta caracteristica estructural la
que sus hojas son más jóvenes que las de las demás hace una molecula responsable de las actividades
marcas. Al comparar los resultados obtenidos en biologicas del Té. Todas las muestras de te verde
ocho variedades de té cosechados en Korea(7), se mostraron una composcion homogenea de Cate-
observó similitud en cuanto a los contenidos de quinas, cafeina y acidos organicos siendo este un
cafeína y catequinas, la muestra de Liptón tuvo una método adecaudo para la separacion, identificacion
concentración de EGCG igual (32,9 mg/g) compa- y cuantificacion de sus compuestos fenolicos.
rada con la obtenida por dicho estudio (32,8 mg/g); Este trabajo contribuyo a la caracterización quí-
donde las muestras son extractos de Té de ocho mica de las infusiones de te verde comercializadas
variedades exóticas japonesas, lo que indica que el en Colombia, los resultados sugieren que hay di-
método de extracción durante 30 minutos fue el ferencias en cuanto a la composicion de las marcas
apropiado para este tipo de matriz, pues una falta de analizadas y por lo tanto es necesario realizar otros
control estricto en la temperatura podría provocar estudios que determinen las posibles causas de ello.
rompimientos en el grupo galato(7). Comparando
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CONCLUSIÓN los compuestos mayoritarios en todas las muestras

Se desarrolló un método para cuantificar catequi- fue EGCG, cafeína y Catequina a quienes se les
nas, cafeína y ácidos orgánicos presentes en extractos debe posiblemente la actividad antioxidante, Liptón
de Té comercializado en Colombia, siendo apropiado fue una de las marcas que presentó concentraciones
para el control de calidad de la mayoría de los produc- altas de los compuestos individuales, la acción
tos elaborados a base de té que podrían ser importan- conjunta de cada uno de ellos puede ser el
tes para la industria farmacéutica o alimentaria. La responsable de los resultados positivos encontrados
identificación química de las muestras sugiere que en la evaluación antioxidante.
las marcas de mayor calidad son Oriental y Liptón.
Teniendo en cuenta la actividad antioxidante AGRADECIMIENTOS
de las muestras del té se concluye que hubo
Los autores agradecen a la Universidad Tecno-
correlación entre los compuestos fenólicos y dicha
lógica de Pereira por el financiamiento del proyecto
actividad evaluada por el método ORAC. Uno de
9-15-2

Tabla 4. Resumen de composición química del Té verde

extractos de té verde extractos de té verde b

Análitos de in- a ref. (8) c ref. (5) D Ref. (10)
(concentración mg/l) (mg/g muestra seca) ref(9)
terés
Oriental Liptón Hindú Jaibel Oriental Liptón Hindú Jaibel mg/g mg/l ug/ml mg/g
Trigonelina 77,6 80,6 68,6 56,9 5,8 6 5,1 4,3
Acido Ácido
20,3 11,2 6,8 6,6 1,5 0,8 0,5 0,5 152,16 6,49-20,09 0,59-1,16
Galico
Epigaloatequina 74,4 161,9 51,4 144 5,6 12,1 3,9 10,8 10,06-20,12 239,35 7,13-11,68
Catequina 349,8 113,9 705,7 66,6 26,2 8,5 52,9 5 1,43-2,83
Acido
119,5 93,5 52,6 46,5 9 7 3,9 3,5 2,3 1,17-6,84
Clorogenico
cafeina 167,4 180,3 145,9 233 12,6 13,5 10,9 17,5 9,26-13,11 4164 15,66-23,50
Epicatequina 77,1 79,2 58,7 0 5,8 5,9 4,4 0 2,89-6,69 130,37 3,34-6,64
EGCG 320,5 439,3 345,9 351,7 24 32,9 25,9 26,4 23,51-32,84 297,67 53,14-126,20
Acidoferrulico 7,5 9,7 12,9 6,2 0,6 0,7 1 0,5 0,009-0,032
epicatequingalato 40 59,8 44,6 33,1 3 4,5 3,3 2,5 3,39-7,76 81,53 18,75-27,80

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