Principios de Citometría de Flujo

CAPÍTULO 2
Principios de citometría de flujo

THOMAS A. FLEISHER • JOAO B. OLIVEIRA • SERGIO D. ROSENZWEIG
La citometría de flujo se ha convertido en una mediada por células inmunitarias. Por último, la
herramienta de laboratorio estándar para evaluar caracterización de los linfocitos T específicos frente
las células hematopoyéticas, lo que comprende la al antígeno después de la inmunización o asociados
identificación de poblaciones y subpoblaciones de a las respuestas inmunitarias normales o anóma
leucocitos, un método conocido como inmunofenoti- las asociadas a estados patológicos puede lograrse
pado. La aplicación clínica de esta técnica se ha visto mediante el uso de la tecnología de los multímeros
facilitada por el desarrollo de instrumentos y siste y la detección intracelular de citocinas después de la
mas de análisis de datos adecuados para su uso sis exposición al antígeno.
temático en los laboratorios diagnósticos. Además, la Este capítulo se centra en los conceptos básicos de
gama ampliada de anticuerpos monoclonales (mAb) la citometría de flujo, incluidos las características del
específicos frente a antígenos de la superficie de los instrumento, el manejo de los datos, las puertas de
linfocitos (y otras células hematopoyéticas) conjuga los linfocitos y el uso dirigido de reactivos de prueba.
dos directamente con una serie de indicadores fluo Además, ofrece una breve descripción general de la
rescentes diferentes (fluorocromos) proporciona un detección de proteínas intracelulares, la activación
amplio grupo de reactivos que facilitan los estudios celular y los estudios de citotoxicidad celular, el aná
en múltiples colores (policromáticos). lisis del ciclo celular, la detección de la apoptosis
Las necesidades clínicas que impulsaron esta y la técnica de los multímeros, centrándose en la
técnica se remontan a la aparición de los recuentos aplicación adecuada de estos enfoques, así como en
absolutos de linfocitos T CD4 como medida crucial sus limitaciones.
para la evaluación y el seguimiento de la enfermedad
en el tratamiento de los pacientes infectados por
el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). INSTRUMENTACIÓN
La citometría de flujo aplicada a la vigilancia de la Los componentes básicos de un citómetro de flujo,
infección por el VIH fue seguida de la aplicación como se muestra en la figura 2.1, son una fuente de
habitual de la caracterización celular por citometría iluminación, un banco óptico, un sistema líquido,
de flujo en la evaluación de las neoplasias malignas un sistema electrónico y un ordenador1. Brevemente,
hematológicas y, más recientemente, del estudio las células teñidas fluyen en una sola fila por el sis
de los trastornos por inmunodeficiencias y otras tema líquido y son estudiadas por una o más fuentes
enfermedades inmunitarias. de luz; estas fuentes generan señales luminosas, que
Los recientes avances en la instrumentación y la son detectadas por el sistema óptico hasta los foto
química fluorocromática permiten ahora realizar detectores, que a su vez convierten la luz en señales
estudios de citometría de flujo policromáticos de electrónicas para su almacenamiento y posterior
forma habitual, con la evaluación concomitante de análisis. Este proceso se expone con más detalle en
los marcadores de la superficie celular y de paráme la sección siguiente.
tros intracelulares, incluidas las proteínas intrace El sistema líquido se encuentra en el corazón del
lulares, las fosfoproteínas y las citocinas, así como citómetro de flujo y consiste en un líquido isotónico
la identificación de los cambios relacionados con a modo de funda que mueve el chorro de muestra
la activación celular y la apoptosis. La citometría que contiene las células. Esto se logra inyectando la
de flujo intracelular también se puede aplicar para muestra celular en el flujo a modo de funda, esta
evaluar el estado del ciclo celular (es decir, G0-G1, S, bleciendo un flujo de células (partículas) de una sola
G2-M) mediante la tinción del ADN, lo que es útil fila centrado hidrodinámicamente que se mueven
para evaluar a las células tumorales y la respuesta a través del punto de análisis mientras mantienen
linfocítica in vitro a diversos estímulos. Además, la el flujo celular en una ubicación constante y central2.
evaluación de la proliferación de los linfocitos puede El flujo celular centrado asegura que la iluminación
realizarse con colorantes de seguimiento celular que de todas las células sea prácticamente equivalente. Por
permiten cuantificar las rondas de división celular lo tanto, la diferencia en la magnitud de la señal o
asociadas a la activación celular, y también se han señales de emisión generadas a partir de cada célula
desarrollado técnicas para evaluar la citotoxicidad refleja las diferencias biológicas entre las células (en
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14 Técnicas básicas de laboratorio en inmunología clínica
FIG. 2.1 Diseño simplificado de un citómetro de flujo con una fuente de iluminación (láser)
configurado para registrar cinco parámetros. Incluye los dos parámetros no fluorescentes (luz azul)
de dispersión frontal y lateral, junto a tres parámetros fluorescentes, de luz verde (FITC), naranja (PE)
y roja (PerCP).
lugar de reflejar la variación de la energía de ilumi La iluminación de una célula genera señales
nación si las células no estaban bien centradas). El fluorescentes y no fluorescentes, que se recogen y
uso del centrado hidrodinámico tiene la ventaja miden acoplando por medios ópticos la señal a un
adicional de producir poco o ningún cambio en la sistema de detección formado por filtros, cada uno
forma de la célula, aunque puede tener algún efecto de los cuales está conectado a un fotodetector. Los
sobre la orientación celular. La consistencia en el filtros se eligen para permitir que las señales no
mantenimiento de la forma de la célula facilita dis fluorescentes se midan a la misma longitud de onda
tinguir las diferencias «arquitecturales» entre tipos que la señal de excitación (p. ej., 488 nm desde una
específicos de leucocitos (v. la sección Selección de fuente de luz azul) para los canales de dispersión
poblaciones [gating])3. Sin embargo, este método frontal y lateral (v. sección Selección de poblaciones
puede generar filas de una sola célula con precisión [gating]), mientras que los de los canales de fluores
solo hasta un flujo de 60 a 100 µl/min, lo que puede cencia utilizan filtros específicos que permiten el
conducir a tiempos largos de adquisición para la paso de luz con longitudes de onda específicas para
detección de acontecimientos muy inusuales. Para cada reactivo de fluorescencia (p. ej., verde, naranja
superar este problema, los instrumentos de citome o rojo; v. sección sobre reactivos de fluorescencia).
tría de flujo recientemente introducidos utilizan el El número y disposición de los fotodetectores per
enfoque acústico, que alinea las células mediante mite la evaluación simultánea de múltiples colores
el uso de ondas sonoras, lo que permite flujos de la (parámetros) de cada celda, con un informe que
muestra de hasta 1.000 µl/min, sin ninguna pérdida describe un instrumento clínico modificado capaz
de calidad de la señal4,5. de evaluar 17 o más colores simultáneamente de
La iluminación en los instrumentos clínicos cada celda evaluada7.
estándar se genera con dos o más láseres, cada uno La electrónica interna del citómetro de flujo
de los cuales proporciona una fuente de luz mono proporciona al sistema la capacidad de convertir
cromática específica (p. ej., un láser de zafiro genera las señales luminosas analógicas (fotoelectrones)
un haz de longitud de onda de 488 nm [azul]). Los recibidas en los fotodetectores en señales digitales
láseres modernos son pequeños y están disponibles para su adquisición y almacenamiento en un orde
en múltiples longitudes de onda, incluidos ultra nador. La intensidad de estas señales convertidas se
violeta (350 nm), violeta (405 nm), azul (488 nm), mide en una escala relativa que generalmente se fija
verde (532 nm), amarillo (560 nm), naranja en 256 o 1.024 incrementos iguales (denominados
(610 nm) y rojo (633 nm), lo que permite el uso canales) para su visualización y análisis. Existen
simultáneo de múltiples fluorocromos que tienen varios programas de análisis especializados, y los
diferentes requisitos de excitación6. El punto en el resultados se representan gráficamente en forma de
que la luz ilumina la célula en los instrumentos histogramas de un solo parámetro que muestran la
analíticos se produce dentro de una célula de flujo, intensidad de la luz (fluorescencia) específica (eje x)
mientras que en los clasificadores de células, el haz frente al número de células (eje y) (fig. 2.2) o
se cruza con las células que fluyen como un flujo de pantallas de dos colores en las que el eje x y el eje y
aire. El banco óptico contiene lentes que dan forma reflejan la intensidad de la luz de los dos colores y
y enfocan el haz de luz para asegurar una energía de los números de células están representadas a través
excitación consistente en el punto de análisis. de puntos, seudocolores, contornos o diagramas de
Capítulo 2 Principios de citometría de flujo 15
FIG. 2.2 (A) Gráfica de puntos de dispersión frontal y lateral en una muestra de sangre completa
lisada, en la que se aprecia la diferenciación en tres partes de linfocitos, monocitos y granulocitos.
(B) Gráfica de puntos con reactivos de selección (gating) de DC45/CD14, que muestra
la distribución de la fluorescencia de los tres tipos de linfocitos identificados (linfocitos,
© Elsevier. Fotocopiar sin autorización es un delito.
monocitos y granulocitos), así como un pequeño número de eritrocitos no lisados o residuos.
densidad (fig. 2.3). La mayoría de los programas flujo proporciona una plataforma con la capacidad
de análisis permiten al operador evaluar el número de evaluar múltiples piezas de información (pará
y porcentaje de acontecimientos, la fluorescencia metros) discreta generada a partir de cada célula
media y mediana del canal y medidas estadísticas individual contenida dentro de un gran número de
seleccionadas para cada célula identificada, y estas células presentes en la muestra de estudio, y éstas se
pueden agregarse en poblaciones o subpoblaciones suelen acumular a un ritmo de 1.000-2.000 (o más)
específicas de células. Por lo tanto, un citómetro de células por segundo.
FIG. 2.3 Histograma monoparamétrico de la expresión de CD3 en los linfocitos, que muestra
una población negativa, de linfocitos no T (linfocitos B, células citolíticas naturales [NK]),
y una población positiva de linfocitos T. La integración de las áreas bajo cada curva proporciona
el número y porcentaje de las células presentes en cada subpoblación.
REACTIVOS FLUORESCENTES un amplio espectro de excitación (525-800 nm)

Los mAb reactivos estándar de uso clínico se suelen y un espectro de emisión agudo y discreto que varía
conjugar directamente con un fluorocromo, un colo en función del tamaño de su núcleo9. Esto significa
rante que absorbe y emite luz de diferentes longitudes que pueden excitarse QD de diferentes tamaños (y
de onda basándose en la energía perdida durante el consecuentemente de diferentes colores) por la mis
retorno de los electrones excitados a su estado basal ma fuente láser, permitiendo una multiplexación
asociado a la iluminación por una longitud de onda más simple9. Además, los QD tienen un alto ren
de luz específica. Por lo tanto, la luz emitida tiene una dimiento cuántico, altos coeficientes de extinción
longitud de onda más larga (menor energía) que la molar y una extraordinaria resistencia a la fotode
longitud de onda del haz de excitación. El número de gradación y la degradación química. Estas cualidades
fluorocromos comercializados ha aumentado mucho los hacen perfectamente adecuados para su uso en
con el uso sistemático de conjugados de colorantes los estudios biológicos, incluidos las imágenes en
e instrumentos con tres o más láseres8. Los fluoro vivo intracelulares, el análisis de la transferencia de
cromos más usados en el inmunofenotipado clínico energía por resonancia de fluorescencia (FRET) y
son los tintes orgánicos isotiocianato de fluoresceína las imágenes dinámicas de proteínas individuales
(FITC), ficoeritrina (PE), proteína de peridina cloro durante períodos más largos9.
fílica (PerCP) y aloficocianina (APC). Las conjuga Se dispone de otros colorantes para estudios
ciones de PE y APC con las cianinas (Cy5, Cy5.5 y funcionales, entre los que se incluyen colorantes
Cy7) y colorantes Alexa Fluor producen colorantes sensibles al calcio (p. ej., fluo-3), colorantes sensibles
en tándem con espectros de emisión adicionales, al glutatión (p. ej., monoclorobimano) y colorantes
basados en la transferencia de energía de un fluoro sensibles al peróxido de hidrógeno (H2O2) (p. ej.,
cromo al segundo fluorocromo que sirve de fuente de colorantes que responden a la luz del sol), dihidro
luz emitida. Esto permite la evaluación simultánea de rrodamina 123[DHR123])10,11. La evaluación del
6-8 colores en la mayoría de los instrumentos clínicos contenido de ADN puede realizarse con coloran
actuales con solo dos o tres láseres. tes que intercalan el ADN y el ARN bicatenarios,
Un avance reciente en este campo fue el desa incluidos el yoduro de propidio (IP) y el bromuro
rrollo de una nueva clase de nanocristales semicon de etidio12. Además, existen colorantes excitados por
ductores fluorescentes inorgánicos, denominados los rayos ultravioleta que son muy específicos del
puntos cuánticos (QD, del inglés quantum dots) 9. ADN, incluidos Hoechst 33258 y 4,6-diamidino-2-
Estas partículas son perfectamente adecuadas para fenilindole (DAPI); la acridina naranja se utiliza para
la citometría de flujo policromática, ya que tienen la tinción simultánea del ADN y del ARN12.
ANÁLISIS DE LOS DATOS contaminantes (células) en esta «selección de los lin

Selección de poblaciones (gating) focitos». Por otro lado, las células linfocíticas malig
nas o activadas pueden no ajustarse a los patrones de
Conceptos clave dispersión de luz estándar antes descritos.
Puerta Un método para confirmar la integridad de la
selección de los linfocitos basada en la dispersión
• Método para definir la población celular de la luz utiliza los reactivos monoclonales «de
de interés selección» directamente conjugados, anti-CD45 y
• Suele realizarse usando la dispersión frontal
anti-CD1413. Estos dos mAb identifican con más
y lateral así como anticuerpos específicos del linaje
precisión el diferencial en tres partes. Los linfoci
tos son los que más CD45 ligan, pero no se unen
La evaluación adecuada de los tipos específicos de al anti-CD14; los granulocitos se unen menos al
células dentro de una mezcla requiere la identifica anti-CD45 y muestran una expresión intermedia
ción inicial de las células específicas del linaje, un de CD14, mientras que los monocitos expresan
método que se conoce como «puerta». En términos gran cantidad de CD45 y de CD14 (v. fig. 2.2B).
prácticos, el inmunofenotipado centrado en los lin Es importante destacar que las células que no son
focitos requiere minimizar las células no linfocíticas leucocitos, incluidos los eritrocitos y las plaquetas,
incluidas en la evaluación, y esto se logra abriendo la no expresan estos marcadores. Sin embargo, los
puerta de los linfocitos. La muestra estándar para los leucocitos malignos que tienen características de
estudios clínicos es la sangre completa anticoagula células precursoras tempranas presentan a menudo
da; para dirigir el estudio a los linfocitos es necesario una expresión alterada de CD45 o CD14, lo que
eliminar la gran mayoría de las células que no lo son debe reconocerse cuando se estudian las neoplasias
de los datos recogidos, de modo que la expresión de malignas hematológicas. Los reactivos de selección
un porcentaje de una subpoblación celular específica de poblaciones son un medio fiable de comprobar la
sea una medida precisa. Sin abrir la puerta, los datos selección de linfocitos basada en la dispersión de la
también pueden verse afectados de forma negativa luz, en lo que respecta a la frecuencia de células no
debido a la coexpresión de antígenos de superficie en linfocíticas dentro de la ventana de análisis (gate),
diferentes linajes celulares (p. ej., el CD4 se encuen así como en lo relativo al alcance de la exclusión de
tra en los linfocitos y en los monocitos en diferentes los linfocitos de tal ventana. Las pautas sobre un
densidades). Además, la unión inespecífica de reac grado aceptable de contaminación en el proceso
tivos monoclonales a través de los receptores Fcγ, de selección de linfocitos, y sobre el nivel acepta
y la concentración de inmunoglobulina humana ble de su exclusión, se incluyen en las directrices
citofílica (Ig), varía según el tipo de célula, lo que sobre inmunofenotipado de linfocitos del Clinical
hace que la apertura de la puerta adecuada sea crucial and Laboratory Standards Institute estadounidense.14
para generar datos válidos. Estas técnicas también se A raíz de la extensión del uso de la citometría de
utilizan para centrar la evaluación en otras células flujo policromática, algunos centros han pasado a
hematopoyéticas, como los monocitos, los granulo incluir anti-CD45 en todos los tubos para precisar la
citos, los eosinófilos, los eritrocitos y las plaquetas. ventana analítica y evitar la contaminación celular,
La puerta inicial para concentrarse en una pobla según se ha descrito anteriormente.
ción específica de leucocitos implica típicamente
usar dos parámetros no fluorescentes, la dispersión
Visualización de los datos
frontal (FSC, del inglés forward scatter) y la dispersión
lateral (SSC, del inglés side scatter) (v. fig. 2.2A)3. La
FSC es un reflejo del área transversal celular (relación Conceptos clave
directa con el tamaño de la célula), mientras que la Presentación de los datos
SSC es una indicación de la granularidad celular. La • La intensidad de la fluorescencia se representa

combinación de estos dos parámetros no fluores en una gráfica comparada con el número
centes proporciona una fórmula leucocítica en tres de células.
partes en la sangre completa con eritrocitos lisados • La citometría de flujo puede presentar datos
que distingue entre los linfocitos, los monocitos y los acumulados de más de un parámetro de cada
granulocitos normales. Como se puede ver en la figu célula.
• La presentación de datos en múltiples colores
ra 2.2A, entre los leucocitos, los linfocitos tienen la
aumenta en ocasiones la resolución de las
FSC y la SSC más bajas, los monocitos tienen la FSC
subpoblaciones celulares.
y la SSC más altas y los granulocitos tienen la SSC
más elevada. Este método distingue una población
de linfocitos relativamente pura en la mayor parte El método más sencillo para demostrar los datos
de las circunstancias. Sin embargo, la presencia de de citometría de flujo es el histograma de un solo
eritrocitos nucleados, plaquetas grandes, basófilos u parámetro (v. fig. 2.2), una presentación gráfica del
otros residuos de partículas puede inducir episodios número de células en el eje y frente a la intensidad
de fluorescencia (luz) de un solo fluorocromo en el Estos subgrupos diferenciados pueden identificar

eje x. La integración de áreas de curva proporciona el se de modo secuencial, distinguiendo primero las
número de células, y a menudo hay dos distribucio células positivas y negativas respecto a un reactivo
nes distintas, una referida como células identificado y, a continuación, evaluando las subpoblaciones
ras negativas a las que no se ha unido específicamente definidas por los dos reactivos restantes, utilizando
el reactivo monoclonal, y la segunda representa célu un abordaje con dos colores. También es posible
las a las que se ha unido el anticuerpo. La distribu usar programas informáticos más modernos que
ción negativa refleja en realidad la fluorescencia de representan múltiples poblaciones mediante gráficas
bajo nivel resultante de la autofluorescencia celular policromáticas, lo que simplifica el análisis de los
junto a cualquier unión inespecífica de los reactivos datos17. El enfoque policromático es una forma de
monoclonales, y la magnitud de ambos fenómenos resolver aún más subpoblaciones y ha sido particu
varía entre los diferentes tipos de células. La inter larmente útil en la evaluación de la diferenciación
pretación de los datos se simplifica cuando hay dos celular, la activación y los correlatos funcionales, así
poblaciones celulares distintas (es decir, negativas como en la aclaración de subpoblaciones celulares
y positivas), mientras que la evaluación de dos dis superpuestas.
tribuciones superpuestas es más difícil.
Los datos multiparamétricos pueden evaluarse Discriminación entre positiva y negativa
por medio de una serie de histogramas de un solo La evaluación de los datos de inmunofenotipado clí
parámetro, que consideran cada fluorocromo de nico requiere establecer criterios para establecer los
forma independiente. Sin embargo, es más infor límites entre las células negativas o no teñidas (con
mativo presentar dos parámetros simultáneamente autofluorescencia más células con tinción inespecí
utilizando una pantalla correlacionada (fig. 2.4), y se fica) y las células positivas (teñidas de forma espe
recomiendan pantallas de dos colores para la citome cífica). Un planteamiento utilizado con frecuencia
tría de flujo clínica15. Este enfoque permite la visuali consiste en el uso de mAb de control conjugados de
zación simultánea de cuatro poblaciones diferentes: la clase o subclase apropiada (p. ej., IgG1, IgG2a,
A+/B−, A–/B+, A+/B+ y A−/B−. Más recientemente, IgG2b o IgM) que no reaccionan específicamen
estas pantallas han sufrido un desarrollo avanzado te con antígenos de la superficie de los linfocitos
para incluir una mezcla de intensidad logarítmica humanos (denominados con frecuencia «controles
(para la expresión de intensidades más altas) y lineal de isotipo»). El marcador (discriminador) se ajusta
(para la expresión de intensidades más bajas) en al número de canales de los histogramas de fluores
cada eje, con el fin de permitir una mejor interpre cencia de forma que incluya el 98-99% de las células
tación de los episodios con una fluorescencia muy negativas (fig. 2.5A).
baja, cero o negativa. Este enfoque de visualización Como se señaló anteriormente, negativo se refiere
combinada resuelve el problema anterior de un gran al agregado de la autofluorescencia celular basal más
número de episodios que se muestran compactados la unión de reactivos inespecíficos, y esto puede variar
contra los ejes, incluso con muestras debidamente según el tipo de célula. Por esta razón, es posible que
compensadas, y se utilizará en las ilustraciones a lo el uso de controles de isotipo no identifique correcta
largo de este capítulo16. mente el umbral de discriminación positiva-negativa
El uso simultáneo de n reactivos monoclonales para tipos específicos de células, particularmente
puede identificar un total de 2n subpoblaciones. cuando se tiñen proteínas expresadas débilmente.
FIG. 2.4 Ejemplos de representaciones de puntos con seudocolor (izquierda), densidad (centro)
y contorno (derecha), basados en los mismos datos paramétricos de dos colores. Las tres técnicas
favorecen la evaluación simultánea de los dos parámetros que, en este caso, evalúan la expresión
de los marcadores A y B. Las gráficas identifican cuatro poblaciones de células: las que expresan
solo A o B, las que expresan tanto A como B (muy pocas) y las que no expresan ni A ni B.
FIG. 2.5 Estrategias de discriminación entre positiva y negativa. (A) Los anticuerpos inespecíficos
(isotipos) se emplearon para teñir la muestra representada a la izquierda y, a la derecha,
se representa el umbral de positividad determinado y aplicado a la muestra. (B) Fluorescencia
menos uno (FMO). El umbral de positividad se determinó tiñendo la muestra de la izquierda
con marcadores específicos frente a cada población (CD3, TCRαβ y CD8) y omitiendo el FAS.
La gráfica de la derecha contiene FAS. Se aprecia que el umbral de positividad es levemente
distinto en los linfocitos CD8+ y CD8−.
Además, para simular perfectamente el anticuerpo alternativo para la discriminación positiva-negativa,

específico utilizado, el control del isotipo necesitaría la fluorescencia menos uno (FMO)18.
tener la misma proporción de anticuerpos a fluoro La FMO consiste en la tinción de la muestra con
cromo y brillo, algo que no es fácil de lograr. Para todos los anticuerpos de interés, exceso con uno para
superar estas dificultades, se ha obtenido un método el que se establece el umbral de discriminación entre
positivo y negativo. A modo de ejemplo, para definir Métodos

el umbral negativo de la proteína FAS (CD95) en La lisis de sangre completa es la técnica más utilizada
los linfocitos T CD8+ y CD8−, el tubo de control de para la preparación de las muestras y consiste en
la FMO debe incluir los marcadores específicos del mezclar un volumen fijo de sangre completa (o de
subgrupo celular (CD3, TCRαβ y CD8) y omitir el médula ósea) anticoagulada con uno o más mAb
anti-FAS. Tras la selección adecuada de la población, conjugados directamente, seguido de la incubación
es posible definir adecuadamente el umbral, que a una temperatura y un tiempo determinados20.
es diferente en las dos poblaciones ejemplificadas A continuación, los eritrocitos se lisan y la muestra se
(fig. 92.5B, imagen derecha). Una limitación obvia de lava y se introduce en el citómetro de flujo, por lo
este método es su elevado coste, dado el alto número general después de fijarla con paraformaldehído para
de tubos de control necesarios para cada muestra. reducir el riesgo de infección. Las células no lisadas
que permanecen comprenden todos los leucocitos
Compensación de la sangre periférica, así como los eritrocitos, las
Los filtros no separan completamente las señales de plaquetas y los restos no lisados. La heterogeneidad
fluorescencia emitidas por los diferentes fluorocro de la muestra requiere una cuidadosa selección de
mos. Esto puede llevar a una superposición de señal, los linfocitos (v. la sección Selección de poblaciones
que se corrige mediante la sustracción electrónica [gating]) para generar datos exactos de inmunofeno
de la señal superpuesta, un proceso conocido como tipado. Entre las ventajas del método de análisis de
compensación. El solapamiento es particularmente sangre completa están menos pasos preparatorios,
significativo cuando se utilizan varios fluorocromos, menos manipulación de la muestra y menor pro
cada uno con diferentes propiedades espectrales18. babilidad de pérdida diferencial de linfocitos que
El proceso de compensación implica la sustracción puede ocurrir cuando se utilizan técnicas de gradien
de la señal de «desbordamiento» detectada por el te de densidad para preparar las células mononu
fotodetector generada por muestras teñidas con un cleares para el análisis. También pueden evaluarse
solo fluorocromo. Actualmente, la mayoría de los otras fuentes de células (p. ej., médula ósea, líquido
programas informáticos de análisis por citometría del lavado alveolar bronquial, aspirados con aguja
de flujo permiten la compensación fuera de línea, fina) con la citometría de flujo21. Los estudios de
donde se utilizan tubos teñidos con un solo reactivo las muestras de pacientes deben determinarse con
para crear una matriz de compensación, que luego los mismos métodos y reactivos que se utilizan en
se aplica a todos los tubos del experimento. Esto la determinación de los intervalos de control para
permite el uso de técnicas de compensación muy garantizar la comparabilidad. El número de episo
simplificadas, sin necesidad de ninguna compen dios (células) analizados oscila típicamente entre
sación del sistema físico durante la recopilación de 10.000 y 20.000 en los estudios clínicos habituales,
los datos. pero debe incrementarse cuando se evalúan subpo
blaciones muy pequeñas de células para producir
Control de calidad datos estadísticamente relevantes necesarios en el
El control de calidad es un componente crucial de análisis de episodios poco frecuentes.
la citometría de flujo clínico para asegurar resulta La aplicación de los intervalos de control debe
dos óptimos19. Esto incluye el control de la confi tener en cuenta el hecho de que se producen cam
guración y el rendimiento de los instrumentos, la bios significativos en la distribución y el desarrollo
optimización de la preparación de las muestras y de los linfocitos durante la infancia, así como los
los reactivos y la estandarización de los controles cambios en los linfocitos que se producen entre las
y la interpretación de los datos. La citometría de personas de edad muy avanzada22,23. Además, dado
flujo cuantitativa basada en una curva de fluores que las inducen diferencias inmunofenotípicas sus
cencia estándar proporciona datos cuantitativos en tancias como los productos del tabaco, siempre que
unidades denominadas equivalentes moleculares sea posible, se debe obtener información sobre los
de fluorocromo soluble (MESF, del inglés molecular medicamentos que toma el paciente. Otros factores
equivalents of soluble fluorochrome). Cuando se utilizan también pueden repercutir en la distribución de los
curvas estándar correctamente construidas, se pue linfocitos, como la raza, el sexo, la variación diurna
den generar y comparar datos cuantitativos referidos y las infecciones recientes o intercurrentes24.
a diferentes reactivos. Por último, la participación en La elección de los reactivos de inmunofenotipado
encuestas entre laboratorios de pruebas de compe depende de las células que se estudien y de la pre
tencia, como las muestras trianuales proporcionadas gunta que se plantee. Sin embargo, independiente
por el College of American Pathologists (CAP), es una mente de la configuración específica, se recomienda
medida adicional importante para controlar el ren la inclusión de un tubo con reactivos de selección
dimiento de los laboratorios, y así lo exige la Clinical (anti-CD45 y anti-CD14) para confirmar la inte
Laboratory Improvement Amendment de 1988 sobre gridad de la selección estándar de los linfocitos13.
la mejora de los laboratorios clínicos en Estados Además, deben incluirse reactivos de control para
Unidos (CLIA 88). establecer la intensidad de fluorescencia de las
datos. También pueden detectarse hallazgos bioló

TABLA 2.1
gicos inusuales en este tipo de evaluación (p. ej., la
Antígenos linfocíticos de la superficie
presencia aumentada de una población de linfocitos T
seleccionados para el inmunofenotipado
doblemente negativos CD4−/CD8−)25.
LINFOCITOS T El reto al realizar el inmunofenotipado es iden
Todos los linfocitos T: CD3, CD2, CD7, CD5 tificar con precisión las células con características
Subgrupo de linfocitos T principales: CD4, CD8 específicas en su superficie (antígenos). Como se
Antígenos de superficie asociados a la función: CD28, señaló antes, la capacidad de discriminar a las subpo
CD31, CD38, CD45RA, CD45RO, CD62L, CXCR7 blaciones celulares aumenta a menudo mediante el
Antígenos de activación: CD25, CD40L, CD69, uso dirigido de combinaciones de anticuerpos. Los
CD71, HLA-DR datos típicos generados consisten en el porcentaje de
LINFOCITOS B células negativas frente a positivas cuando se utiliza
Todos los linfocitos B: CD19, CD20, inmunoglobulina un reactivo y en múltiples subpoblaciones cuando se
de superficie utiliza más de un reactivo. Independientemente del
Subgrupo de linfocitos B principales: CD5, CD21 diseño experimental, es importante considerar no
Antígenos de superficie asociados a la función: solo el porcentaje de células dentro de cada subpo
CD27, CD40, CD80, CD86 blación, sino también el número absoluto de ellas.
Antígenos de activación: CD23, CD25 Esto suele obtenerse multiplicando el porcentaje rele
CÉLULAS NK vante del citómetro de flujo por el recuento absoluto
Todas las células citolíticas naturales (NK): CD16, CD56 de linfocitos obtenido utilizando un recuento total
Subgrupo de NK: CD2, CD8, CD57 y diferencial de leucocitos. Por ejemplo, cuando se
analizan los recuentos de linfocitos T CD4, el por
centaje de células CD4+ se multiplica por el recuento
células negativas (no teñidas). Entre los controles absoluto de linfocitos periféricos para obtener el
internos importantes se incluye un marcador de recuento absoluto de CD4. Un posible problema de
linfocitos T, B y de células citolíticas naturales (NK) este enfoque es el requisito de dos técnicas separadas
en cada muestra (tabla 2.1), basado en el principio (es decir, plataformas duales) para generar el resul
de que el todo es la suma de sus partes. Por lo tan tado final. Esto introduce la posibilidad de un error
to, el porcentaje total de linfocitos contenido en el aditivo, basado en los errores inherentes a los dos
intervalo determinado por los reactivos de selección métodos diferentes. Esto ha impulsado la búsqueda
debe ser aproximadamente igual a la suma de los de enfoques que faciliten la realización de ambas
porcentajes de los linfocitos T, B y células NK. Debe tareas con la citometría de flujo (es decir, una sola
darse una explicación técnica o biológica cuando plataforma). Una alternativa consiste en la inclusión
esta relación no se mantenga. Entre las explicaciones de un número fijo de microesferas fluorescentes (en
biológicas de una diferencia significativa estarían la un volumen definido) en cada tubo como estándar
presencia de células inmaduras o malignas que no se de referencia para generar números absolutos sin
identificaron con los reactivos estándar de linfoci necesidad de utilizar el recuento sanguíneo completo
tos T, B y células NK. Además, si no se hubieran incluido y diferencial para generar un recuento de linfocitos.
los reactivos de selección (CD45/CD14), no pueden Un enfoque alternativo es usar un recuento celular
descartarse células contaminantes (p. ej., precursores basado en la impedancia en el citómetro de flujo para
mielocíticos, eritrocitos nucleados, plaquetas gran generar un recuento absoluto de linfocitos (depen
des) con características de FSC y SSC similares a las diente del volumen fijo de la muestra que se esté
de los linfocitos. Los problemas técnicos potenciales realizando) y después generar tanto el porcentaje
son la degradación del reactivo o del fluorocromo, como el número absoluto de células en cada pobla
la falta de adición de un reactivo y muchos otros. ción o subpoblación específica. Independientemente
El indicio de cualquier error técnico importante debe del enfoque, es necesario informar tanto de los por
dar lugar a repetir el estudio. centajes como de los números absolutos cuando se
Los datos adicionales que se pueden utilizar realiza el inmunofenotipado de linfocitos periféricos.
para los controles dependen de la configuración. El objetivo de evaluar las células malignas es a
Por ejemplo, la disponibilidad de múltiples anti menudo caracterizar el linaje y el nivel de diferencia
cuerpos que identifican una subpoblación de células ción de las células anómalas, más que cuantificar las
similares puede servir de control útil (p. ej., linfo subpoblaciones. El patrón de reactividad combinado
citos T totales al comparar CD3 con CD5 o CD2; con la intensidad de la fluorescencia es a menudo útil
linfocitos B totales al comparar CD19 y CD20). para identificar patrones leucémicos, mientras que no
Además, el uso de reactivos específicos en >1 tubo suele ser necesario el número absoluto de células. Sin
permite comparar entre los valores repetidos como embargo, la detección y cuantificación citométrica de
medida de la consistencia. La aplicación de controles células anómalas raras puede ser útil en la evaluación
internos debe realizarla el operador del flujo como de la enfermedad residual mínima después del trata
un medio sencillo de confirmar la validez de los miento de los trastornos linfoproliferativos.
APLICACIONES PRÁCTICAS los pacientes con una inmunodeficiencia variable

DE LA CITOMETRÍA DE FLUJO común, a pesar de que estos pacientes no producen
Estudios de inmunofenotipado normalmente Ig30. Sin embargo, los cambios en las
características de los linfocitos B, particularmente en
Relevancia clínica relación con los linfocitos B memoria, proporcionan
Estudios de inmunofenotipado una posible visión de los diferentes fenotipos de este
trastorno y apoyo adicional para la heterogeneidad
• Los estudios de inmunotipado se emplean de los pacientes que sufren la enfermedad31,32. Debi
para identificar subgrupos y linajes celulares, do a las limitaciones del inmunofenotipado, cuando
estadios de diferenciación celular, estados
se evalúa el estado del sistema inmunitario, es una
de activación celular y clonalidad.
• Los resultados relativos a los linfocitos se verifican
práctica frecuente realizar pruebas de la función
con la suma de linfocitos T + linfocitos B + celular en paralelo.
células citolíticas naturales (NK) = 100%. La citometría de flujo se puede utilizar para detec
• Los estudios de inmunofenotipado no son tar la presencia o ausencia de un antígeno específico
equivalentes a los de la función de los linfocitos. en la superficie celular. Un ejemplo de este tipo de
aplicación es la evaluación de un paciente con ante
cedentes de infecciones cutáneas recurrentes, un
La mayoría de los estudios de inmunofenotipado retraso de la cicatrización de las heridas y una gra
tienen como objetivo enumerar subpoblaciones nulocitosis persistente, lo que induce a pensar en un
celulares específicas, evaluar la presencia o ausencia diagnóstico de deficiencia de adhesión del leucocito
de antígenos de superficie particulares, identificar del tipo 1 (LAD-1)28,33. Este trastorno es el resultado
el nivel de diferenciación de células específicas, de un defecto en el gen que codifica el CD18, lo que
determinar el linaje celular, evaluar correlaciones impide o disminuye la expresión de tres moléculas
funcionales basadas en la expresión de antígenos de adhesión heterodiméricas diferentes (integrinas β2),
específicos, examinar las pruebas de activación celu cada una de las cuales contiene CD18. Este trastor
lar y establecer pruebas de la monoclonalidad. no generalmente puede diagnosticarse estudiando
La cuantificación de una determinada subpo en los granulocitos (y los linfocitos) la expresión de
blación celular puede establecerse con facilidad CD18 (así como las tres isoformas de CD11). Los
mediante la citometría de flujo, junto a un recuento pacientes a menudo expresan una cantidad menor
de los leucocitos y un recuento diferencial. El recuen de CD18 en lugar de no expresarlo y la confirmación
to absoluto de linfocitos sirve para determinar el del diagnóstico puede lograrse demostrando la falta
número de células de poblaciones o subpoblaciones de aumento de CD18 (y CD11a, CD11b, CD11c) tras
en función de los porcentajes de los correspondien la activación de los granulocitos28,29.
tes tipos celulares detectados con el citómetro de El inmunofenotipado también puede ayudar a
flujo. La evaluación del recuento absoluto de linfo abordar las cuestiones relacionadas con el nivel de
citos T CD4 ha constituido la base del seguimiento diferenciación celular. Los anticuerpos específicos
de los pacientes con una infección por el VIH26. La frente a las proteínas expresadas por las células tem
cuantificación de las células madre hematopoyéticas pranas (precursoras) constituyen un posible enfo
(HSC) CD34+ en la sangre periférica del donante o que, e incluirían la evaluación del marcador de los
en la médula ósea se utiliza en muchos protocolos timocitos CD1 o del marcador de los prelinfocitos B
de reconstitución celular27. La caracterización de la CD10 (CALLA), por citar algunos. Sin embargo,
subpoblación también puede ser útil para evaluar la mejor manera de definir el nivel de desarrollo de
a pacientes con antecedentes clínicos y hallazgos una población o subpoblación celular en particular
de laboratorio que indiquen una inmunodeficien es utilizando un grupo de reactivos que abarque la
cia28,29. Esto ha adquirido una mayor importancia evolución natural del linaje celular. Este abordaje
en el contexto del cribado de la inmunodeficien es el estándar para estudiar las leucemias y los lin
cia grave de linfocitos T en recién nacidos a través fomas, que puede proporcionar una información
del análisis del círculo de escisión del receptor del pronóstica útil34. Además de definir la presencia
linfocito T (TREC, del inglés T-cell receptor excision o ausencia de antígenos específicos, la evaluación
circle), que, cuando es anómala, suele ir seguido de su grado de expresión también es valiosa, puesto
de un inmunofenotipado para evaluar la presencia que puede alterarse en las células anómalas. Las cé
de linfocitos T vírgenes basada en la expresión de lulas malignas también pueden expresar antígenos
CD45RA, CD127 o CD62L. asociados a diferentes linajes y tener características
Al evaluar la presencia o ausencia de proteínas de alteradas de FSC y SSC, así como una expresión
superficie asociadas a atributos funcionales específi menor o nula de CD45, lo que requiere ventanas
cos, es importante tener en cuenta que este enfoque de selección modificadas.
no evalúa el estado funcional real de las células. Este Los problemas de la monoclonalidad se pueden
punto queda claramente ilustrado por el hallazgo de tratar utilizando la citometría de flujo cuando se
números normales de linfocitos B en la mayoría de analizan los linfocitos B y, en algunas circunstancias,
cuando se estudian los linfocitos T. Normalmente, los tipos 1 y 2, respectivamente. De modo similar,
los linfocitos B son una mezcla heterogénea de célu la falta de expresión de perforina intracelular en
las que expresan cadenas ligeras k o λ. La capacidad las células NK debe ser indicativa de una linfohis
de evaluar la monoclonalidad de los linfocitos T tiocitosis hemofagocítica (LHH) del tipo 2. Además,
mediante la citometría de flujo es menos definitiva y la evaluación de la expresión superficial de CD107a,
se centra en el uso de reactivos específicos frente a la que normalmente se produce en gránulos citoplás
cadena β variable (Vβ) de los receptores antigénicos micos y mediante la incubación con células diana
de los linfocitos T, con objeto de detectar signos específicas (p. ej., células K562) en la superficie de
de una representación aumentada significativa de las células NK, es útil para determinar un posible
una familia de la cadena Vβ. Este abordaje habi defecto génico causante de la LHF37,38. Específica
tualmente consiste en disponer una serie de tubos, mente, la falta de aumento de CD107a es indicativa
cada uno con tres mAb distintos específicos frente de defectos en la sintaxina 11 o MUNC-13.4.
a la familia Vβ, uno conjugado con FITC, otro con
PE y un tercero con FITC y PE. Esta combinación
facilita la distinción de la frecuencia de cada una de EVALUACIÓN INTRACELULAR
las tres familias Vβ diferentes en cada tubo (verde+, Activación celular
naranja+, verde+/naranja+), y es un método de cito
metría de flujo que complementa a la tipificación Relevancia clínica
espectroscópica mediante la reacción en cadena de Citometría de flujo intracelular
la polimerasa (PCR)36.
El estado de activación de los linfocitos puede • Estudios dirigidos a la activación:
abordarse evaluando la presencia de antígenos de • Flujo de calcio.
superficie que solo se encuentran en las células • Fosforilación de proteínas intracelulares.
• Explosión oxidativa: neutrófilos.
activadas o que aumentan después de la activación.
• Estudios de citocinas intracelulares:
Entre ellos están los receptores para factores de cre
• Aclaración del estado de los linfocitos T
cimiento específicos (p. ej., la cadena α del receptor cooperadores 1 (Th1)/Th2/Th17
para la interleucina 2 [IL-2], CD25), receptores en una respuesta inmunitaria.
de elementos esenciales requeridos para el creci • Puede evaluarse en una respuesta
miento celular (p. ej., receptor para la transferrina, específica de antígeno in vitro.
CD71), ligandos necesarios para la comunicación • Puede combinarse con evaluación
celular tras la activación de las células (ligando de de estudios de la superficie celular.
CD40 [CD152] en los linfocitos T CD4 activados)
y antígenos de superficie que aumentan debido a
la activación (p. ej., moléculas de adhesión, HLA- La unión de los ligandos a sus receptores y la trans
DR, CD69). Por otro lado, el estado timésico de ducción de señales transmembranarias causantes de
los linfocitos T y B puede valorarse en función de la activación celular pueden evaluarse con la citome
la expresión diferencial de moléculas de superficie tría de flujo. Los cambios en la concentración de
asociadas al encuentro previo con un antígeno. calcio iónico (Ca2+) intracelular se emplean para con
Esto permite distinguir entre linfocitos T vírgenes trolar la activación celular tras la unión de los ligan
que expresan CD45RA, CD31 (emigrantes tímicos dos a sus receptores. Estos cambios se asocian a una
recientes), CD62L y CXCR7 y linfocitos T memoria activación de la fosfolipasa C y de la proteína cinasa C.
que expresan la isoforma alternativa CD45, CD45RO En general, para medir el Ca2+ se usan tres reacti
(y CD62L o CXCR7 variados, dependiendo de si vos: quin-2, indo-1 y fluo-3. Quin-2 tiene un bajo
las células son memoria centrales o efectoras) 37. coeficiente de excitación y no es útil para la citometría
Además, los linfocitos B memoria pueden detec de flujo; indo-1 requiere una excitación ultravioleta;
tarse por la expresión de CD27 y pueden dividirse y fluo-3 puede excitarse con 488 nm pero no permite
en linfocitos memoria con y sin cambio de isotipo el análisis ratiométrico. Sin embargo, debido a su
en función de su patrón de expresión de inmuno facilidad de uso, fluo-3 es actualmente la sonda más
globulinas de superficie30,38. utilizada para evaluar el Ca2+ intracitoplásmico por
Los defectos asociados a la linfohistiocitosis citometría de flujo. Se debe prestar especial atención
familiar (LHF) generalmente se relacionan con la a las condiciones de carga, la presencia o ausencia de
función anómala de las células NK. Muchos de los Ca2+ libre en el medio, la temperatura experimental,
defectos que causan la LHF pueden determinarse las medidas basales y la calibración. Este enfoque
con la citometría de flujo. Por ejemplo, la tinción puede combinarse con la evaluación del marcador de
intracelular de la proteína de activación de la trans la superficie de la célula o del ciclo celular10.
ducción de señales en los linfocitos (SLAM) y del También se pueden evaluar los cambios intrace
inhibidor de la apoptosis ligado al cromosoma X lulares del pH relacionados con la activación celu
(XIAP) pueden emplearse para evaluar trastornos lar. La sonda más útil para el pH es SNARF-110. Esta
linfoproliferativos ligados al cromosoma X (LPX) de sonda puede excitarse a 488 nm y permite el análisis
ratiométrico con detección de longitudes de onda La evaluación del estallido oxidativo después de
de 575 y 640 nm. El glutatión (glutamilcisteinilgli la estimulación celular desempeña un papel central
cina[GSH]), un antioxidante importante generado en las pruebas de función de los neutrófilos, donde
durante la activación celular, puede medirse con la se utiliza el colorante DHR123 sensible al peróxi
citometría de flujo10. Para esta medida suele utilizarse do de hidrógeno. Este método implica la carga de
la sonda fluorescente monoclorobimano, aunque el granulocitos con el colorante, la estimulación con
proceso se complica por la necesidad de determinar miristato acetato de forbol (PMA) y la evaluación
la GSH mediante un método independiente, como la del aumento de la fluorescencia con la citometría de
cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC). flujo11,46. Esta prueba se ha mostrado sumamente
Otros enfoques para la evaluación de la acti precisa en el diagnóstico de los pacientes con una
vación celular son la evaluación de marcadores enfermedad granulomatosa crónica (EGC) y en los
intranucleares (Ki-67, PCNA), así como de proteí portadores de una EGC ligada al cromosoma X46.
nas de la superficie que aumentan después de la Una de las principales ventajas es su sensibilidad,
activación celular (p. ej., CD69, CD25, CD71)41. La que permite detectar una célula normal en una
división celular real puede evaluarse mediante el uso población de 1.000 células anómalas. Esto hace
de colorantes de membranas lipofílicos (p. ej., PKH26, que la evaluación del estallido oxidativo sea una
CFSE, Cell Trace Violet), también conocidos como herramienta útil para vigilar la supervivencia de los
colorantes de seguimiento celular, que pierden el 50% granulocitos alógenos después de su transfusión
de su fluorescencia con cada ronda de división ce en pacientes con una EGC, así como una forma de
lular42. Este enfoque se ha vuelto más frecuente en seguir el quimerismo del donante en el contexto
la evaluación clínica de la función de los linfocitos del trasplante de células madre alógenas. También
debido a la capacidad de evaluar subpoblaciones sirve para identificar células corregidas después de
específicas de linfocitos que responden a estímulos la genoterapia en la EGC y es útil para el pronóstico
mitógenos y antigénicos. Los colorantes de mem de la enfermedad47,48.
branas lipofílicas también pueden utilizarse para
marcar las células diana en análisis de citotoxicidad Detección de citocinas intracelulares
basados en células43. Recientemente, se ha descrito La citometría de flujo ofrece una plataforma para
un método para evaluar la proliferación de los lin evaluar la producción de citocinas a nivel de una sola
focitos después de la estimulación celular mediante célula mediante el uso de mAb conjugados direc
el uso del nucleósido modificado EdU. La detección tamente específicos frente a la citocina después de
de la síntesis de ADN inducida por los diferentes la fijación y permeabilización de las células49. Este
agentes activadores se mide utilizando un compues método permite la detección simultánea de dos o
to de química clic catalizado por el cobre, lo que da más citocinas intracelulares junto a marcadores de la
como resultado una unión covalente de EdU a una superficie celular u otros marcadores intracelulares.
azida fluorescente44. Este enfoque permite evaluar la Entre los aspectos importantes de la detección de
proliferación celular a nivel de población o subpo citocinas intracelulares están el uso de un inhibidor
blación celular (p. ej., CD3, CD4, CD8) y se puede del transporte de proteínas durante la activación,
utilizarse junto a la estimulación con mitógenos el uso de los controles adecuados y la elección de
y antígenos de recuerdo. anticuerpos. Como la producción espontánea de
La evaluación funcional de la activación celular se citocinas en los linfocitos humanos circulantes es
efectúa mediante detección dirigida por citometría escasa o nula, la detección intracelular de citocinas
de flujo de la generación de proteínas intracelulares requiere su activación in vitro. La experiencia inicial
fosforiladas asociadas a señales de activación espe se basó en la estimulación suprafisiológica con el
cíficas. Un ejemplo es la detección del transductor uso de PMA e ionomicina, pero los sistemas de
de la señal y activador de la transcripción 1 (STAT1) activación específicos de antígenos también se han
fosforilado, tras la estimulación con interferón γ mostrado factibles. Cabe destacar que, independien
(IFN-γ) de los monocitos, un método que se ha temente del método de activación, la duración de la
mostrado tanto o más sensible que la inmunotrans activación es una variable importante, ya que cada
ferencia45. Este tipo de pruebas requieren la fijación célula alcanza la máxima producción de citocinas en
y la permeabilización para permitir la penetración diferentes momentos. Además, diferentes citocinas
del reactivo específico, y su uso se ha extendido a tienen diferentes períodos óptimos de activación.
numerosas proteínas intracelulares, que se fosforilan Se recomienda que se establezca un perfil cinético
tras exponerse a estímulos específicos en determina adecuado del sistema biológico o de la alteración
das células. En la actualidad, numerosas proteínas clínica que se está estudiando49.
transmisoras de señales intracelulares que sufren una Para aumentar la cantidad de citocinas intrace
fosforilación tras una señal de activación específica lulares, es frecuente usar inhibidores del transporte
pueden evaluarse con la citometría de flujo, con reac de las proteínas intracelulares (p. ej., monensina o
tivos comerciales, algunos de los cuales se ofrecen brefeldina), lo que da lugar a la acumulación de
en forma de juego de reactivos. proteínas en el interior de la célula. La unión ines
pecífica de anticuerpos constituye un problema, Análisis del ciclo celular

en la medida en que la permeabilización permite
el acceso no solo a la citocina que es objeto de Relevancia clínica
interés, sino también a otras proteínas presentes en Análisis del ciclo celular
mucho mayor cantidad dentro de la célula que en
• Útil para la detección selectiva del porcentaje
su superficie. Por otra parte, la fijación incrementa
de la fase S y la aneuploidía.
en mayor medida la unión inespecífica, y el uso
• Puede combinarse con estudios de la superficie
de muestras de control negativo, que contienen celular.
exceso de anticuerpos anticitocínicos no marcados • Puede combinarse con marcadores
o «fríos», y las muestras equiparadas por subclase de la apoptosis.
o con control de FMO proporcionan un control
óptimo. Cuando el anticuerpo anticitocínico con
jugado se añade a una muestra control negativa, Además del inmunofenotipado de superficie y la
solo se une a otras proteínas de manera inespecífica, caracterización citoplásmica, la citometría de flujo
aportando una medida que permite discriminar la también se utiliza para el análisis del ciclo celular. PI
unión específica de la inespecífica. El uso de anti es el fluorocromo más utilizado debido a su capaci
cuerpos contra las citocinas conjugados directa dad de unión lineal óptima al ADN en varios tipos
mente no solo simplifica el proceso de tinción, sino diferentes de células. Por lo tanto, un histograma de
que también consigue la mejor distinción entre la un solo parámetro del contenido de ADN utilizando
unión específica y la inespecífica. Debido a que la PI permite determinar fácilmente los compartimen
sustancia fijadora puede cambiar el estado natural tos del ciclo celular, expresados como porcentajes de
de ciertos epítopos, también es importante utilizar células en G0-G1, S y G2-M (fig. 2.6A). Además de
anticuerpos que reconozcan antígenos después de estos parámetros tradicionales, puede determinarse
la fijación cuando se combinan la caracterización la presencia o ausencia de aneuploidía mediante
de la superficie celular con la evaluación de las la inspección del pico G0-G1 o el uso de un índice
citocinas intracelulares. de ADN (relación entre el contenido anómalo de
Una de las principales aplicaciones de la detec ADN y un patrón de ADN diploide). También se
ción de citocinas intracelulares por citometría de puede detectar la elevación en las fases S y/o G2-M.
flujo ha sido el estudio y perfeccionamiento del para La visualización óptima de estos datos utiliza
digma linfocitos T cooperadores (Th)1/Th2/Thh17. una combinación de CSS y contenido de ADN. Las
Recientemente ha quedado claro que puede usarse células observadas en el histograma en el área por
la secreción regulada de citocinas para estudiar la debajo del nivel de G0-G1 pueden estar experimen
respuesta de cada linfocito T tanto a estímulos poli tando una apoptosis51. Cuando se trata de tinción de
clonales como a antígenos específicos. La medida de ADN, debe utilizarse una fuente celular consistente
la expresión de citocinas por los linfocitos T espe de ADN (p. ej., eritrocitos de pollo) como referencia
cíficos frente al antígeno en respuesta a antígenos interna para evaluar el contenido de ADN y la dis
específicos ofrece una alternativa útil al enfoque tribución del ciclo celular.
basado en multímeros (expuesto a continuación) Cabe puntualizar que se han desarrollado varios
para cuantificar la frecuencia de los linfocitos T algoritmos informáticos destinados a determinar
específicos frente al antígeno50. la proporción relativa de cada compartimento del
FIG. 2.6 (A) Valoración del contenido de ADN como reflejo del ciclo celular, que muestra células
en las fases G1, S y G2-M. (B) Valoración de células vivas frente a células muertas, en función
de las características de dispersión frontal (FSC) y lateral (SSC). (C) Valoración de la apoptosis
celular, utilizando yoduro de propidio (PI) y Dioc6 (3), con identificación de células que han iniciado
recientemente la apoptosis (temprana) y de células muertas (apoptosis tardía) y vivas.
ciclo celular, por lo que la selección del programa fosfolípidos distribuidos de forma asimétrica en las
informático apropiado no es un aspecto intrascen membranas plasmáticas interna y externa, con fos
dente. Los principales fabricantes de instrumental fatidilcolina y esfingomielina en la superficie externa
comercializan programas de análisis del ciclo celular, y fosfatidilserina (PS) en el lado interno. Al comienzo
y se dispone asimismo de programas de terceros. En de la apoptosis las células pierden asimetría, expo
general, el programa más idóneo es el que permite niendo la PS al exterior. La anexina V es una proteína
elaborar modelos de dos o más poblaciones aneu que se une preferentemente a los fosfolípidos de
ploides, sustrayendo los residuos (en particular, si se carga negativa, como la PS, y la anexina V conjugada
usa material de archivo incluido en parafina y fijado directamente es un reactivo útil para la detección
con formol [FFPE]) y con una precisa estimación de la específica de células apoptósicas55.
células en fase S51,52. La combinación de un marcador Otra característica de las membranas plasmáti
de superficie y del ciclo celular ha sido muy útil para cas asociadas a las células vivas es que rechazan los
diferenciar las poblaciones de células normales de colorantes catiónicos cargados, como PI y 7-amino-
las poblaciones de células tumorales. Un ejemplo es actinomicina-D (7-AAD). En consecuencia, solo las
el uso de reactivos anti-k-, anti-λ-, o reactivos frente células en una etapa tardía de apoptosis, con las
a linfocitos B para separar el clon de linfocitos B membranas celulares rotas, absorberán estos colo
aneuploides de los restantes linfocitos B normales y rantes. Así, el uso combinado de colorantes catió
reactivos en una mezcla de células linfocíticas. Otro nicos (p. ej., PI) con la anexa V permite discriminar
utiliza la citoqueratina como marcador para distinguir entre las células vivas (que no expresan anexa V ni
entre las células tumorales y las células inflamatorias. PI), las células apoptósicas tempranas (que expresan
Otro acontecimiento destacado en el análisis del anexa V pero no PI) y las células apoptósicas tardías
ciclo celular ha sido el desarrollo de una técnica que (que expresan anexa V y PI).
utiliza la incorporación de bromodesoxiuridina53. La valoración del potencial transmembranario
Este análogo de la timidina se emplea directamente mitocondrial (∆ψm) es otro método de identifi
para determinar el porcentaje de células en fase S. Por cación de las células apoptósicas. Las células ven
otro lado, cuando se aplica en estudios cinéticos, per reducido su ∆ψm en una fase muy temprana del
mite determinar los tiempos individuales de cada uno proceso apoptósico, antes de la rotura de la membra
de los componentes del ciclo celular y determinar la na plasmática, perdiendo su capacidad de acumular
fracción de crecimiento. Por último, recientes avances colorantes dependientes del potencial, tales como
han determinado la disponibilidad de dos reactivos rodamina 123, JC-1 o 3yoduro de 3’ ’-dihexiloxa
de anticiclina que permiten evaluar los puntos de carbocianina (Dioc63). Estos colorantes también se
transición del ciclo celular en las células malignas54. usan con PI para detectar células en diferentes fases
de la apoptosis (v. fig. 2.6C).
La medida del contenido de ADN también puede
DETECCIÓN DE LA APOPTOSIS emplearse para distinguir las células vivas de las célu
La citometría de flujo se ha convertido en el método las muertas, como se ha descrito antes (v. la sección
de elección para la detección y cuantificación de la Análisis del ciclo celular). Este tipo de análisis tiene
apoptosis celular55, en parte debido a su capacidad que hacerse usando una escala lineal, no una escala
para evaluar con rapidez un gran número de células logarítmica, para discriminar las células moribundas
y muestras. Muchas de las características distintivas de los residuos. El desdoblamiento del ADN también
de una célula apoptósica pueden evaluarse usando la expone los extremos -OH asociados a las roturas del
citometría de flujo basada en la dispersión de la luz, ADN, y estos pueden detectarse mediante la unión
los cambios en la membrana plasmática, el potencial de desoxinucleótidos conjugados a fluorocromos,
transmembranario mitocondrial, el contenido de en una reacción catalizada por TdT exógeno, una
ADN y la integridad del ADN. técnica llamada TUNEL.
Las propiedades de dispersión de la luz de una
célula que sufre muerte celular programada son los
atributos más simples que se pueden evaluar median MULTÍMEROS PÉPTIDO-MHC
te la citometría de flujo. Las células moribundas típi
camente se encogen, produciendo una pérdida de Conceptos clave
FSC, y, a pesar de un aumento transitorio inicial de la Tetrámeros péptido-MHC
CSS, finalmente muestran una disminución de la CSS
(v. fig. 2.6B). El uso de la dispersión de la luz puede • Útiles para valorar el número de linfocitos T
específicos frente al antígeno.
combinarse con la tinción de la superficie celular,
• Pueden dirigirse a los linfocitos T CD4+ y CD8+.
para contribuir a la identificación de las células que • Requieren información sobre el péptido
están muriendo. No obstante, los cambios en la dis antigénico y la restricción por el antígeno
persión por sí solos no son específicos de la apoptosis leucocítico humano (HLA) (complejo principal
y han de acompañarse de otra característica adicional de histocompatibilidad [MHC]).
asociada a la muerte celular. Las células vivas tienen
A diferencia de los linfocitos B, la visualización con varios marcadores de la superficie celular y feno
directa de linfocitos T específicos frente al antígeno típicos y funcionales intracelulares. Ya hay indicios
ex vivo no ha tenido éxito hasta hace poco. En 1996, de que el fenotipo de los linfocitos T específicos
Altman et al. introdujeron un nuevo método basado frente al antígeno varía entre los individuos y entre
en la citometría de flujo que permite visualizar y las diferentes fases de la respuesta inmunitaria. Ade
cuantificar directamente los linfocitos T específicas más, los linfocitos T que se unen a los tetrámeros
frente a antígenos56. Los multímeros péptido-MHC pueden clasificarse para su ulterior análisis, como
solubles se generan de manera que capten múltiples análisis de citotoxicidad o de expansión in vitro. La
receptores de linfocitos T (TCR) al mismo tiempo, técnica basada en los tetrámeros no solo se ha mos
lo que implica que la avidez de los ligandos multi trado útil en el estudio de la respuesta inmunitaria a
méricos por estos TCR específicos frente a péptidos los microorganismos infecciosos, sino que también
se incrementa sustancialmente. El método conlleva se ha aplicado al estudio de la tolerancia oral, las
la creación de una secuencia de reconocimiento de enfermedades autoinmunitarias y la inmunología
biotinilación en el extremo −COOH del dominio tumoral. Es probable que esta técnica muy sensible
extracelular de una cadena de la molécula del MHC, y específica y otros enfoques que definen la respuesta
que, tras combinarse con un péptido antigénico específica al antígeno encuentren muchas más apli
específico, es enlazado por acción de la avidina o caciones y conduzcan a nuevos descubrimientos y a
la estreptavidina. Dado que tanto la avidina como una reevaluación de ciertos conceptos existentes58.
la estreptavidina tienen cuatro sitios de unión a la
biotina, el resultado es un complejo tetramérico pép
tido-MHC que sirve de ligando para los linfocitos T CONCLUSIONES
específicos, tanto para el péptido como para el MHC.
La detección mediante citometría de flujo se consi Perspectivas futuras
gue marcando la estreptavidina con un fluorocromo. • La combinación de la citometría de flujo
El principal inconveniente de este planteamiento y la espectrometría de masas aumenta el
es la necesidad de conocer el péptido derivado del número de marcadores celulares analizados
antígeno y sus restricciones del HLA, así como el tipo simultáneamente (≥35 en la actualidad), lo que
de HLA de cada sujeto estudiado. Desde el primer incluye objetivos extracelulares e intracelulares,
informe, se ha realizado un número cada vez mayor con el fin de aportar una evaluación detallada
de estudios basados en tetrámeros. La mayoría se ha y amplia de los marcadores funcionales.
• La citometría de flujo en la que se utilizan
centrado en la respuesta inmunitaria mediada por el
análisis de luz espectral, en vez de tradicional,
MHC de la clase I, tanto en los ratones como en los permite evaluar de manera precisa más
seres humanos, a una variedad de microorganismos «colores» sin necesidad de complejos
infecciosos, como el citomegalovirus (CMV), el VIH, esquemas de compensación con el fin
el virus de Epstein-Barr (VEB) y otros. Desde la des de manejar las emisiones de luz solapada de
cripción inicial con reconocimiento restringido de los fluorocromos tradicionales. De este modo
la clase I, también se ha informado de la detección se facilita la realización en el laboratorio clínico
de linfocitos T CD4 específicos frente a antígenos de estudios policromáticos más extensos.
con tetrámeros de moléculas del MHC solubles de
la clase II y péptidos unidos de forma covalente57.
Se han publicado estudios que, además de demos La citometría de flujo se ha hecho fácilmente dis
trar la viabilidad de este abordaje, han aportado ponible en los laboratorios clínicos, y la aplicación
nuevas interpretaciones de la respuesta inmunitaria de esta técnica ha avanzado junto a mejoras signifi
mediada por el MHC de la clase I. Por ejemplo, ha cativas en la instrumentación y la disponibilidad de
quedado claro que el alcance de la respuesta celular una serie de reactivos monoclonales. Una citometría
mediada por la clase I del MHC es mucho mayor de flujo correctamente realizada puede proporcionar
de lo que antes se pensaba. Por otra parte, la nota una identificación rápida y precisa de las subpo
ble proliferación de los linfocitos T CD8 durante blaciones de linfocitos. Las principales indicaciones
una infección aguda no es consecuencia de una clínicas del inmunofenotipado siguen siendo la
activación, sino que obedece a una expansión de cuantificación de los recuentos de linfocitos T CD4
los linfocitos T CD8 específicos frente al antígeno. en la infección por el VIH, la asignación del linaje en
Las pruebas con tetrámeros de péptido-MHC han leucemias y linfomas, la evaluación de otros tipos de
arrojado resultados prometedores en el estudio de células hematológicas y la evaluación de la expresión
la cinética de las respuestas inmunitarias primarias de CD34 para identificar células madre para el tras
y secundarias y han incrementado el conocimiento plante. Otros usos comprenden la caracterización
de nociones tales como inmunodominancia o el de trastornos por inmunodeficiencias, la evaluación de
agotamiento clonal. enfermedades inflamatorias mediadas por el sistema
Un aspecto obviamente atractivo de esta técnica inmunitario y la evaluación de los pacientes después
es que la tinción de tetrámeros puede combinarse de un trasplante de órganos. Por lo general, el inmu
nofenotipado no es una técnica diagnóstica, sino 14. Clinical US, Laboratory Standards, Institute. Clinical
que interviene en la evaluación y comprensión de Applications of Flow Cytometry: Quality Assurance and
trastornos complejos y en la evaluación longitudinal Immunophenotyping of Peripheral Blood Lymphocytes.
del tratamiento inmunomodulador. Villanova, PA: NCCLS Publication H24-T; 1992.
15. Stewart CC, Stewart SJ. Multiparameter data acqui
Es fundamental reconocer que el inmunofenoti
sition and analysis of leukocytes. Methods Mol Biol.
pado es un medio para identificar las células, pero 2004;263:45-66.
no está orientado a la función celular. La expansión 16. Parks DR, Roederer M, Moore WA. A new “Logicle”
de las técnicas de citometría de flujo para evaluar display method avoids deceptive effects of logarithmic
las características intracelulares, evaluar los cambios scaling for low signals and compensated data. Cyto-
intracelulares asociados a la activación, caracterizar metry A. 2006;69:541-551.
la apoptosis e identificar los linfocitos T específicos 17. Roederer M, Moody MA. Polychromatic plots: grap
frente al antígeno ha llevado esta técnica al campo hical display of multidimensional data. Cytometry A.
de la función celular. Estos nuevos enfoques amplían 2008;73:868-874.
la utilidad de la citometría de flujo como un método 18. Roederer M. Spectral compensation for flow cytometry:
visualization artifacts, limitations, and caveats. Cyto-
valioso para caracterizar varios aspectos de la función
metry. 2001;45:194-205.
inmunitaria. 19. Owens MA, Vall HG, Hurley AA, et al. Validation and
Este trabajo fue apoyado en parte por el Intra- quality control of immunophenotyping in clinical flow
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