SEPARACIÓN DE MACROMOLÉCULAS DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE

Aristizabal Salazar Yesid Armando1; Becerra Aguirre Nalley2; Duran Gonzalez Isabella 3

Facultad de Ciencias Básicas, Programa de Microbiología, Universidad Santiago de Cali.

1
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RESUMEN

Se identificaron cualitativamente las principales macromoléculas (proteínas, ácidos nucleicos y

glucógeno), presentes en las células de Saccharomyces cerevisiae (levadura de cerveza).
Partiendo de una mezcla de levadura, arena y ácido tricloroacético al 5 %, se realizo una
extracción inicial de macromoléculas que junto con el centrifugado, a diferentes tiempos y
separaciones posteriores, se logran separar cada macromolécula para su identificación. A partir de
la prueba del Yodo, se determinó la presencia de glucógeno; con la prueba de Bial se determino la
presencia de ácidos nucleicos; con la prueba de Biuret se determino la presencia de proteínas. Se
obtuvieron resultados positivos para todas las pruebas mencionadas anteriormente.

PALABRAS CLAVES: Macromoléculas, Saccharomyces cerevisiae, sobrenadante, centrifugado,

prueba de Biuret, prueba de Bial, prueba de Lugol.

En un mortero se colocó la levadura y la

arena en el cual se maceró por 5 minutos,
INTRODUCCION posteriormente se le agregó 15 ml de ácido
Las células están constituidas por una gran tricloroacético al 5%, se macero durante 3
variedad de macromoléculas con la cual lleva minutos y se espera a que la arena asiente
a cabo sus procesos metabólicos. Estas luego se decanta la suspensión lechosa y se
macromoléculas son la unión repetidas de vierte en un tubo de ensayo que es llevado a
moléculas biológicas más simples que la centrífuga durante 5 minutos a 3000 r.p.m.
alcanzan pesos moleculares altos 1. Estas Se obtiene un precipitado que contiene
moléculas simples, a su vez, son el resultado ácidos nucleicos y un sobrenadante con
de la unión de moléculas más pequeñas glucógeno, se vierte el sobrenadante en un
llamados monómeros, por lo tanto la unión en tubo y se ponen en un baño de hielo. Se le
cadena de 5 o más monómeros o moléculas agrega 2 volúmenes de alcohol etílico para
de bajo peso forma un polímero; en este que precipite, se agita y de nuevo se coloca
sentido 2, las macromoléculas son usadas en baño de hielo, esta solución pasa a la
como sinónimo de polímeros al ser la base centrífuga a 3000 r.p.m, se descarta el
de toda estructura biológica. Las principales sobrenadante obtenido y se disuelve el
macromoléculas presentes en los seres vivos precipitado en 1 ml de agua destilada, se
son lípidos, carbohidratos, ácidos nucleicos y utiliza 1 ml de agua destilada en otro tubo y a
proteínas 2. En este trabajo se identificaran ambos se le agrega 1 ml del reactivo de
únicamente proteínas, ácidos nucleicos y yodo.
glucógeno (carbohidratos), por medio de Precipitado con ácidos nucleicos
ensayos químicos que adquieren una
coloración característica al existir la Al precipitado con ácidos nucléicos y
presencia de uno de estas macromoléculas. proteínas se le agregan 15 ml de cloruro de
sodio al 10 %, se agita cuidadosamente, se
METODOLOGIA vierte en un tubo de ensayo y se coloca en
Obtención de glucógeno y ácidos un baño de agua hirviendo por 10 minutos,
nucleicos se procede a enfriar cuidadosamente para
luego verterlo en un tubo y meterlo en la
centrífuga a 3000 r.p.m., durante 3 minutos. carbohidratos con respecto a las proteínas y
El sobrenadante que contiene ácidos ácidos nucleicos.
nucleicos se pasa a un tubo de ensayo y el
precipitado con proteínas se pasa a baño de
hielo. Se toma el tubo que contiene los
ácidos nucleicos y se precipita añadiendo 2
volúmenes de etanol frío, lentamente y
agitando sobre un baño de hielo dejándolo Figura 1. Estructura de ácido acético y ácido
reposar por unos 3 minutos. El contenido se tricloroacético.
vierte en un tubo para centrífugado y se
centrifuga durante 3 minutos a 3000 r.p.m. Al centrifugar la fase lechosa del macerado,
Se Descarta el sobrenadante y el precipitado se obtiene la separación en dos fases: una
se disuelve en 2 ml de amortiguador salino, fase líquida (sobrenadante), y una fase sólida
en otro tubo como control 2 ml de (sedimento), tal como se ve en la figura 2.
amortiguador salino, y a ambos se le agrega Esta separación se debe a que una de las
3 ml del reactivo de orcinol; se colocan los propiedades físicas de las macromoléculas
tubos en un baño de agua hirviendo durante es que por su alta densidad tienden a
algunos minutos. sedimentarse en medio acuoso, lo que
Precipitado con proteínas permite que se formen diminutos gránulos.
Esta característica física hace posible
Se disuelve el precipitado de proteínas separar macromoléculas con alto peso
coaguladas en 2 ml de solución salina 0.15M. molecular mediante la centrifugación 4, por lo
En otro tubo de ensayo se usa como control tanto optimiza el proceso de decantación de
2 ml de la solución salina., a cada tubo se le estas dos fases evitando así que estas se
agrega 1 ml de la solución de sulfato de vuelvan a mezclar.
cobre, luego 2 ml de hidróxido de sodio 10 M.

RESULTADOS Y DISCUSIONES

La maceración inicial de la levadura con la

arena cumple la función de romper la pared
celular del hongo. La adición secuencial de
ácido tricloroacético tiene como propósito el
separar el glucógeno de los ácidos nucleicos
y proteínas, debido a la alta ramificación de
su estructura que el glucógeno presenta lo
hace ser más soluble en disolventes de baja
polaridad como el acido tricloroacético 3.
Generalmente el ácido acético es un
disolvente con alta polaridad, no obstante si Figura 2. Sobrenadante y sedimento de la
este ácido contiene en su estructura primera centrifugación.
molecular agentes desactivantes como
halógenos la polaridad de este compuestos Al sobrenadante que se obtuvo del primer
se verá disminuida por la acción del grupo centrifugado, observado en la figura 3, se
halógeno que compite con la adiciono alcohol etílico con alto grado de
electronegatividad y polaridad del oxígeno pureza con el propósito de precipitar el
que es menor (figura 1), por lo tanto este glucógeno, el etanol al poseer grupos
solvente es favorable para la separación hidroxilo (-OH) puede formar puentes de
diferencial de macromoléculas de hidrogeno con los grupos hidroxilo de la
estructura del glucógeno provocando que se
solubilicen, pero para la precipitación del es sensible a la temperatura, ya que si se
glucógeno se debe disminuir la temperatura calienta el contenedor, el color desaparece,
con el fin de disminuir las interacciones entre ya que el calor libera el poliyoduro de las
estos dos grupos funcionales y por ende espira del glucógeno, reorganizándose
disminuir su solubilidad, las propiedades nuevamente a como estaban antes.
polares del etanol en este experimento lo
convierten en un buen agente precipitante del
glucógeno.

Figura 4. Tubos con precipitado color pardo

rojizo indican la presencia de glucógeno.

Figura 5. Hélice de glucógeno, formado por

glucosas (hexágonos), con átomos de yodo
Figura 3. Solución etanol + glucógeno en (esferas) en su interior.
frio.

Se pudo evidenciar con la prueba del Yodo El sedimentado que contiene ácidos
(Lugol), la presencia de glucógeno en el nucleicos y proteínas se trato con NaCl al
sobrenadante extraído el cual tiñe de color 10%, el cual solubiliza los grupos fosfatos y
pardo rojizo a diferencia del control que bases nitrogenadas de los ácidos nucleicos,
permanece con un color anaranjado, tal pero debido a que la cinética de la reacción
como se evidencia en la figura 4. La solución es muy baja se lleva a un baño de agua
de Lugol es una disolución de yodo molecular hirviendo para aumentar las interacciones de
(I2) y yoduro de potasio (KI), formando las moléculas favoreciendo la solubilidad de
cadenas de poliyoduro que se introduce entre los ácidos nucleicos.
las espiras de la molécula ramificada del
Después de la centrifugación y posterior
glucógeno como se observa en la figura 5, es
decantación, el sobrenadante que contiene
por lo tanto un compuesto de inclusión
los ácidos nucleicos se le añade dos
termolábil 5, es decir modifica las
volúmenes de etanol frio, no obstante los
propiedades físicas de esta molécula, más
grupos OH- de este compuesto van a
sin embargo no hay una verdadera reacción
solubilizar a ciertos grupos fosfatos y bases
entre ambos componentes. Debido a que el
nitrogenadas, por esta razón es necesario
polisacárido con mayor ramificaciones es el
disminuir la temperatura del sistema para
glucógeno este presenta una coloración más
desfavorecer la solubilidad entre estos dos
intensa al rojo (café-rojo intenso), mientras
compuestos, se realiza un ciclo de
entre menos ramificaciones posea el
centrifugación con el fin de obtener una
polisacárido el corrimiento del color es hacia
separación más rápida favorecida por la baja
el azul (violeta-azul intenso) 6. Este complejo
solubilidad obtenida; al obtener la separación
en dos fases, el sedimento previamente suficiente para que absorba todo el rango del
extraído se le añade amortiguador salino (pH visible exceptuando el amarillo o absorbe
ácido) y orcinol para la prueba de Bial, se todos los colores del espectro visible
aumenta la temperatura de dicha solución exceptuando el violeta, la única forma de
para favorecer la reacción y se observa como saber con certeza es realizando un análisis
la solución va tornando una coloración verde espectrofotométrico de la especie colorida
indicando la presencia de ARN, tal como se para establecer el espectro de absorción del
observa en la figura 5. Esta reacción detecta complejo.
la presencia del furfural producido en medio
ácido por las pentosas (la ribosa de una base
nitrogenada), reaccionado con orcinol en
presencia de iones férricos para formar un
cromógeno de color verde 7, tal como se
observa en el anexo 1.

Figura 6. Prueba de Biuret. Coloración

purpura indica positivo para proteínas.

CONCLUSIONES
Figura 5. Prueba de Bial. Coloración verde
Se concluye que para una buena aplicación
indica positivo para ácidos nucleicos.
de cada prueba cualitativa es necesario
Finalmente, al precipitado proteico se le ajustar la temperatura con tal de garantizar
añaden solución salina al 0.15M, solución de una buena solubilidad de reactivos con los
sulfato de cobre e hidróxido de sodio al 10M, biomoleculas, ya que estas presente unas
en donde se observa la aparición de un color fuertes interacciones entre sí que imposibilita
violeta, dando como positivo para la prueba una adecuada reacción con el solvente en el
de Biuret. La reacción general de esta prueba medio. Además la centrifugación cumple un
se observa en el anexo 2. Esta reacción al papel importante en la separación de las
formarse un complejo con el cobre (Cu2+) con biomoléculas por la densidad relativa de cada
hibridación cuadrado planar, presenta una sustrato por mediación de la gravedad. Dado
coloración violeta en el espectro del visible. que son pruebas cualitativas no fue
La absorción de la luz visible de todos los necesaria la exactitud en la toma de
colores exceptuando el amarillo (580-560 volúmenes en cada reactivo usado, sin
nm), da como resultado la observación del embargo para evitar cualquier problema en
color complementario de este que es el las pruebas y evitar gastos en reactivos y el
violeta, a partir de de la teoría de campo tiempo empleado el aseguramiento de tomar
cristalino (TCC) y junto con la serie espectro medidas exactas permite garantizar que las
química del tipo de ligando, generan el pruebas sean exitosas.
desdoblamiento de los niveles de energía del
cobre en su estado de oxidación 2+, lo
 REFERENCIAS

[1] Salud, C., & Macromolécula, S. (2019).

Significado de Macromolécula. Recuperado
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https://www.significados.com/macromolecula/

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[3] Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff,

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[4] Skoog, D., West, D., Holler, F., & Crouch,

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Analítica (9th ed., pp. 952-954). México:
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[5] Reconocimiento de glucidos. (2019).

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luengo.es/practicas/glucidos.html

[6] Universidad de Bogota - JORGE TADEO

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diferenciación de carbohidratos [Ebook] (pp.
2,4,5,6). Bogota. Recuperado de
http://avalon.utadeo.edu.co/comunidades/est
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[7] Prácticas de Bioquímica I: Reacciones de

Identificación y Propiedades de los
Carbohidratos. (2019). [Ebook] (pp. 1,2,5).
Recuperado de
http://www.fcv.luz.edu.ve/images/stories/cate
dras/bioquimica_i/reacciones_propiedades.p
df

ANEXOS

(1) Reacción de la prueba de Bial

(2) Reacción de la prueba de Biuret