PRUEBAS CUALITATIVAS EN LA DETERMINACIÓN DE AMINOÁCIDOS

Castañeda Valoyes Diana Liceth1, Henao Cardona Marlyn Yineth2, Silgado Cortázar Daniel
Gerardo3, Torres Lucas Jennifer Paola4

Facultad de Ciencias Básicas, Programa de Microbiología, Universidad Santiago de Cali.

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RESUMEN

Se identifico la presencia de 3 aminoácidos por la técnica de cromatografía además de identificar

cualitativamente la presencia de aminoácidos por las pruebas de reacción con ninhidrina, reacción
xantoproteica, reacción con nitroprusiato de sodio (prueba Mörner) y reacción con ácido glioxílico.
Para la parte de cromatografía se partido de los valores de Rf de cada aminoácido en la mezcla
respecto a los valores de Rf de muestras patrón para su identificación. Y para las preubas
cualitativas dieron resultados acordes a lo esperado exceptuando en la reacción con ninhidrina
debido a la falta de calentamiento de las soluciones.

PALABRAS CLAVES: Cromatografía de papel, aminoácido, xantoproteica, fase móvil, fase

estacionaria.

INTRODUCCIÓN identidad y las propiedades al aminoácido es

una cadena de estructura variable, asignada
Un aminoácido es una molécula orgánica como grupo R, como la cadena lateral del
compuesta por un grupo amino (-NH2), de aminoácido; a pesar de que se conocen
naturaleza básica y un grupo carboxílico (- cientos de aminoácidos diferentes, son
COOH), de carácter ácido 1. Los aminoácidos solamente 20 los que forman parte de las
son unidades de monómeros que, al unirse proteínas y estos son llamados aminoácidos
entre ellas, al menos 50 aminoácidos, forman estándar 2.
un polímero llamado proteína. Las
subunidades individuales de los aminoácidos En la cromatografía de reparto los
se unen por medio de enlaces de amida componentes de una mezcla se separan en
llamados enlaces peptidicos 2. base a una distribución diferente entre la fase
móvil y la fase estacionaria. El movimiento
relativo de las moléculas a lo largo de la
columna de papel es el resultado de un
equilibrio entre las fuerzas de transmisión o
arrastre ejercido por la fase móvil en su
desplazamiento sobre la fase estacionaria y
Figura 1. Estructura general de un alfa-aminoácido. las fuerzas que tienden a frenar dicho
desplazamiento. Las fuerzas de frenado
pueden ser tanto de reparto (basado en
Todos los aminoácidos componentes de las criterios de solubilidad) como de adsorción 8.
proteínas son alfa-aminoácidos, lo que indica
que el grupo amino está unido al carbono MATERIALES Y METODOLOGÍA
alfa, es decir, el carbono contiguo al grupo
Los materiales utilizados fueron: 30 tubos de
carboxilo 1. El grupo que determina la
ensayo, 3 gradillas, 4 pipetas de 5ml, 2
pinzas para tubos, plancha de calentamiento, colocaron en un baño de agua hirviendo por
1 vaso de precipitados de 500ml, 4 tubos 5 minutos. Se dejó enfriar y se anotaron las
capilares, 1 papel de cromatografía, 1 observaciones.
Erlenmeyer de 500ml, 1 rociador y un
secador de pelo. Reacción xantoproteica
En diferentes tubos de ensayo de añadieron
Los reactivos utilizados en el laboratorio 0.5 mL de solución de los siguientes
fueron: reactivo de ninhidrina, Ácido nítrico aminoácidos; glicina, tirosina, triptófano,
concentrado, Solvente: Etanol + Agua + fenilamina y fenol. Seguidamente se añadió
Amoniaco, NaOH 10 M, Ácido acético glacial, 0.5 mL de ácido nítrico concentrado, se dejó
Fenol, Nitroprusiato de sodio, Mezcla de enfriar el tubo de ensayo y se observan los
aminoácidos de alanina, leucina y ácido cambios de color. Finalmente, se le agrego 2
aspártico. Soluciones de los aminoácidos: mL de NaOH 10M y se anotó las
prolina, ácido aspártico, leucina, glicina, observaciones.
alanina, tirosina, fenilalanina, triptófano,
cisteína, metionina, lisina y asparagina.
Prueba con nitroprusiato de sodio
A) SEPARACIÓN DE AMINOÁCIDOS POR En diferentes tubos de ensayo de añadió 2
MEDIO DE LA CROMATOGRAFÍA DE mL de la solución de glicina, cisteína,
PAPEL tirosina, triptófano, fenilamina, metionina,
acido aspártico, arginina. Después de
Inicialmente en papel de cromatografía se añadieron 0.5mL de nitroprusiato y 0.5 mL de
trazaron dos líneas a dos 2cm de los bordes hidróxido de amonio. Finalmente se anotó las
inferior y superior. Sobre la línea inferior se observaciones.
realizaron tres aplicaciones de las soluciones Reacción con ácido glioxilico
de; alanina, acido aspártico, leucina y una En diferentes tubos de ensayo se colocó 2
mezcla de las soluciones anteriores. mL de glicina, tirosina, triptófano, fenilamina y
metionina. Seguidamente se añadió 2 mL de
Seguidamente se lleva el papel de
ácido acético glacial y con mucho cuidado se
cromatografía a un Erlenmeyer que contiene
agrega 2 mL de ácido sulfúrico concentrado.
30mL del solvente de etanol, agua y
Finalmente se anota las observaciones.
amoniaco, asegurándose que el borde que
contiene las soluciones quede sumergido en RESULTADOS Y DISCUSIONES
él. Se tapó el Erlenmeyer y se dejó correr el
solvente por el papel. En la presente práctica se llevó a cabo una
Una vez llegue el solvente a la línea superior cromatografía de reparto, en papel de gel de
y con ayuda de una pinza se saca el papel de silicio, para la separación de aminoácidos.
cromatografía y se deja secar.
La cromatografía de reparto se basa en: si
Una vez seco el papel cromatografico se
dos fases inmiscibles se encuentran en
rocío con ninhidrina y se rebeló con aire
contacto una con otra y si una de las dos
caliente de la secadora.
fases contiene un soluto, éste se distribuirá
B) ALGUNAS REACCIONES QUÍMICAS entre ambas de acuerdo con sus
CON AMINOÁCIDOS solubilidades relativas. Dicho fenómeno se
denomina reparto y viene determinado por el
coeficiente de reparto, que es la relación
Reacción con ninhidrina entre las concentraciones del soluto, en el
En diferentes tubos de ensayo se colocaron equilibrio, en las dos fases 8.
0.5 mL de solución de aminoácidos de
prolina, acido aspártico, arginina, leucina, En la figura 3, se muestra el papel
asparagina, metionina y tirosina. cromatográfico con alanina, ácido aspártico,
Seguidamente a cada tubo se le añadieron leucina y la combinación de las tres luego de
0.5 mL de ninhidrina en acetona al 1% y se agregar solución reveladora y ninhidrina
además de aplicarle calor. había usado por C y no quedo bien lavado,
aun así, este error se puede no tener en
cuenta ya que la mancha correspondiente en
B aun esta y se corrobora en D en donde
vuelve a aparecer la mancha al mismo nivel.

Finalmente, los factores de retención se

calcularon a partir de la altura máxima
alcanzada por la muestra y la distancia
recorrida del eluyente, como se muestra en la
ecuación 1 donde se pueden ver los Rf de
cada aminoácido y los de la mezcla
mostrando que los puntos encontrados en la
mezcla son los aminoácidos ya que los Rf de
la mezcla son similares a los aminoácidos
estando puros.

distancia recorrida por el soluto

Rf =
Figura 3. Cromatografia en papel en una solución distancia recorrida por el solvente
reveladora de ninhidrina. A) alanina B) ácido
aspártico C) leucina D) Mezcla de alanina, leucina y (1)
ácido aspártico.
Tabla 1. Valores de Rf obtenido en
cromatografía de papel de aminoácidos.
Distancia
Sustancia Rf(D/D1)
Las manchas que se observan son el (D1) (cm)
recorrido del aminoácido por medio del Leucina 4.7 0.67
solvente, estas son reveladas por la reacción Alanina 3 0.43
producida con la ninhidrina y al sometimiento Ácido
0.9 0.13
del calor. Esto es producto de las reacciones aspártico
que se da la ninhidrina con grupo amino libre Mezcla de 0.67; 0.43;
4.7; 3; 0.8
de los aminoácidos, dando lugar a la aminoácidos 0.11
formación de amoniaco y anhídrido
carbónico, con reducción de la ninhidrina a
hidrindantina (anexo 1). La hidrindantina Reacción con ninhidrina
sigue reaccionando, pero en esta ocasión
con el amoniaco y otra molécula de Se puede detectar la presencia de
ninhidrina para producir un compuesto que aminoácidos ya que la solución toma un color
presenta una coloración azul-púrpura 8. entre azul y violeta al tratar los aminoácidos
con ninhidrina; esto reacción forma un anión
De igual forma se observa que la leucina él es estabilizado por resonancia. A esto se
mostro un alto recorrido al contrario que el le conoce como púrpura de Ruhemann y este
ácido aspártico; esto es debido a que los es siempre igual sin importar la estructura del
aminoácidos no polares al contacto con el aminoácido del cual proviene 2, tal como se
solvente interaccionan mejor y son observa en el anexo 1. Esta prueba es
arrastrados por él. Así pues, la mezcla se positiva tanto para proteínas como para
separa entre los aminoácidos apolares y aminoácidos.
polares en donde el ácido aspártico es polar.

En el proceso de la cromatografía se puede

observar en B que hay dos manchas esto se
debe a la contaminación del capilar que se
usó para disponer las gotas el cual ya se
 la nitración, mientras que la fenilalanina
(anexo 9) no se somete fácilmente a la
nitración, debido a que el anillo aromático no
está activado para la sustitución electrofilica
aromática, por lo cual no cambia su
coloración.

La nitración de compuestos aromáticos da

Figura 5. Solución de ninhidrina con aminoácidos como resultado una solución de color
antes de ser calentada (Izquierda a Derecha: Ácido amarillo, en compuesto aromáticos mono
aspártico, prolina, leucina, asparagina, metionina, sustituidos la nitración en posición orto es
tirosina).
amarillo, mientras que la nitración en posición
En esta prueba las soluciones se someten a para es incolora 6. En la figura 6, se observa
un baño maría para proporcionarles calor y que la tirosina no presenta coloración dado
con esto poder completarse la reacción; ya que el anillo aromático esta doblemente
que esto fuerza la formación del complejo el sustituido: por grupo hidroxilo (-OH), y un
cual les da el color. Sin embargo, debido a grupo alquilo (-R, la alanina comportándose
que no se pudo calentar lo suficiente las como sustituyente). Por lo tanto, la coloración
soluciones no se completó las reacciones es ausente aun cuando la sustitución
para ver un cambio en su coloración electrofílica se presenta en posición orto
característico. respecto al grupo hidroxilo o respecto al
grupo alquilo, dando una mezcla de ambos
Aun así, la literatura describe lo que se compuestos como se observa en el anexo
debería de haber observado, dando cambios 10; por resonancia de los sustituyentes
de color en todas las soluciones con estabilizan al grupo nitro que por conjugación
ninhidrina y como resultados positivos para con el anillo aromático da el característico
aminoácidos3: para leucina (anexo 3), color amarillo, dando como resulta una
metionina (anexo 4), asparagina (anexo 5), solución incolora. Pero al añadir una base
ácido aspártico (anexo 6) y tirosina (anexo 7) fuerte el grupo hidroxilo se desprotona,
dan positivo para alfa-amino primario, para desestabilizando el anillo aromático que por
prolina (anexo 2) da positivo para alfa-amino resonancia del grupo nitro hace que el
secundario. Ya que el mismo compuesto compuesto presente coloración amarilla, tal
causante del color purpura se forma con como se observa en la figura 6.
todos los aminoácidos en los que el grupo α-
amino es primario, en cambio cuando el α-
amino es secundario, produce un compuesto
anaranjado al reaccionar con la ninhidrina 4.

Reacción Xantoproteica

Esta reacción, a base de ácido nítrico, sirve

para identificar proteínas con grupos
aromáticos los cuales son derivados del
benceno, esto debido a la formación de
compuestos nitrados de color amarillo 5, tal Figura 6. Reacción xantoproteica. Aminoácidos
como se observa en la figura 7. La intensidad nitrados en medio ácido. (Izquierda a Derecha:
Glicina, tirosina, triptofano, fenilalanina, fenol).
del color amarillo se intensifica cuando la
reacción ocurre en una solución básica, tal El triptófano previamente nitrado ya presenta
como se observa en la figura 6. En la prueba coloración amarilla por la influencia del grupo
realizada en el laboratorio, la tirosina (anexo nitro, pero al añadir una base fuerte ioniza al
7) y triptófano (anexo 8) contienen anillos de grupo hidroxilo haciendo que la influencia del
benceno activados y se someten fácilmente a grupo nitro en la desestabilización de la
densidad electrónica del anillo aromático sea En la figura 8, se observa como el único
aún más pronunciado; el desdoblamiento de aminoácido que dio positivo para el ensayo
los niveles electrónicos del compuesto hace cualitativo fue la cisteína, confirmando la
que la absorción de luz visible se altere, en validez del ensayo químico.
este caso la luz transmitida del compuesto
pasa del amarillo al rojo-naranja. Reacción con ácido glioxílico (Reacción
de Hopkin-Cole)

La prueba de Hopkins-Cole es específica

para el triptófano, el único aminoácido que
contiene un grupo de indol. El anillo de indol
reacciona con el ácido glioxílico en presencia
de un ácido fuerte (ácido sulfúrico) para
formar un producto cíclico color violeta 3, tal
como se observa en la figura 9 y la reacción
en el anexo 11. 

Figura 7. Reacción xantoproteica. Aminoácidos nitrados

en medio básico. (Izquierda a Derecha: fenol,
fenilalanina, triptófano, tirosina, Glicina).

Reacción con nitroprusiato de sodio

(Prueba Mörner)

La reacción de nitroprusiato de sodio solo es

específica para aminoácidos o proteínas que Figura 9. Reacción de Hopkin-Cole.
contienen grupo tiol, -SH (para cisteína) y (Izquierda a Derecha: glicina, tirosina,
grupo disulfuros, -S-S (para cistina) dando un triptófano, fenilalanina, metionina).
compuesto soluble de color rojo-púrpura,
CONCLUSIONES
llamado también prueba de Mörner 7. Para el
caso de proteínas es necesario un pre Se concluyo que las diferentes pruebas para
tratamiento de los puentes disulfuro con la identificación de aminoácidos que
cianuro para generar grupos sulfhidrilo libres permiten establecer un resultado positivo o
para reaccionar con le nitroprusiato. negativo de acuerdo a las características y
composición de cada una de ellas,
evidenciando en las distintas coloraciones,
la presencia de diferentes grupos
funcionales propias de cada aminoácido,
son consecuentes a las propiedades
fisicoquímicas y cinéticas que cada uno
posee. La cromatografía en papel resultó ser
una técnica de análisis cualitativo sencilla y
rápida que permite determinar la presencia
Figura 8. Reacción de nitroprusiato de sodio. de un compuesto presente en una muestra
problema a partir de los valores de Rf de
muestras patrones.
 REFERENCIAS

[1] Universidad Autonoma de Zacatecas. ANEXOS

(2009). Aminoácido [Ebook] (pp. 1-3).
Zacatecas, México. Consultado de (1) Reacción de aminoácido con
https://www.uaz.edu.mx/histo/Biologia/Wiki/a ninhidrina
minoacido.pdf

[2] Wade, L. (2012). Química Orgánica

Volumen 2 (7th ed., pp. 1153-1157, 1169,
1170). Ciudad de México: Pearson.

[3] Qualitative and Quantitative Tests for

Amino Acids and Proteins. (2015).
Consultado de
http://www.biologydiscussion.com/proteins/qu
alitative-and-quantitative-tests-for-amino-
acids-and-proteins/13065

[4] Carey, F. (2006). Química Orgánica (6th

ed., pp. 1137-1138). México, D.F.: McGraw-
Hill.

[5] Qualitative Analysis of Amino Acid

(Theory): Biochemistry Virtual Lab I:
Biotechnology and Biomedical Engineering:
Amrita Vishwa Vidyapeetham Virtual Lab. (2) Prolina
(2011). Consultado de
http://vlab.amrita.edu/?
sub=3&brch=63&sim=1094&cnt=1

[6] Beyer, H., & Walter, W. (1987). Manual de

Química Orgánica (19th ed., pp. 531-534). (3) Leucina
Greifswald: S. Hirzel Verlag Stuttgart.

[7] Practical Proteins and Amino Acids

Identification. [Ebook]. Consultado de
http://www.magdyelnashar.com/new/images/
pdf2/Practical%20Proteins%20and%20Amino
%20Acids%20Identification.pdfteins%20and (4) Metionina
%20Amino%20Acids%20Identification.pdf

[8] Jorrin, J., Diaz, M., & Barcena,

J. Separación de aminoácidos por
cromatografía en capa fina y detección
mediante reacción con ninhidrina [Ebook]. (5) Asparagina
Córdoba, España. Retrieved from
https://www.academia.edu/8273125/1._Separ
aci%C3%B3n_de_amino
%C3%A1cidos_por_cromatograf
%C3%ADa_en_capa_fina_y_detecci
%C3%B3n_mediante_reacci (6) Ácido aspártico
%C3%B3n_con_ninhidrina
(7) Tirosina

(8) Triptófano

(9) Fenilalanina

(10) Nitración de tirosina

(11) Prueba de aldehído – Hopkin-Cole