Laboratorio 7
Electroforesis y espectrofotometría de ADN
Concentración y pureza ADN ------------------ Espectrofotometría
Calidad ADN ------------------------------------- Electroforesis en gel de Agarosa
La cuantificación del ADN y del ARN por espectrofotometría se realiza aprovechando que
los anillos que forman las bases nitrogenadas tienen la propiedad de absorber la luz
Ultravioleta cuando están en solución acuosa. La mejor cuantificación se realiza a 260nm.
Espectrofotometría
la ley de Lambert-Beer, la cual establece que “la concentración de una molécula en
solución es directamente proporcional con la cantidad de luz absorbida a una longitud onda
determinada en condiciones estándar de las moléculas disueltas”.
Se puede emplear para evaluar la pureza de la muestra:
260 nm/280 nm = 1,8 – 2,0 = Pura
260nm/280 nm = < 1,8 – 2.0 = Contaminación por proteínas cuyo máximo de absorción
esta a 280 nm
260 nm/230 nm = 2.0 – 2.2 = Pura
260 nm/ 230nm = < 2.0 – 2.2 = Presencia de carbohidratos y fenoles cuya absorción es
cercana a 230 nm
Electroforesis
La configuración de la agarosa al ser gelificada forma una red fibrosa que puede ser
utilizada como filtro para la clasificación de diferentes moléculas, donde la concentración
de agarosa es inversamente proporcional al tamaño del poro.
A nivel molecular, el gel es una matriz de moléculas de agarosa que se mantienen unidas
por puentes de hidrógeno y que forman pequeños poros. En un extremo, el gel tiene
muescas en forma de ranuras llamadas pozos, en donde se añaden las muestras de ADN
Ha sido reportado un límite de tamaño máximo de fragmentos de ADN que pueden ser
analizados con gel de agarosa, siendo entre 100 a 2000 pb a una concentración de 2-3% del
polisacárido. Por otro lado, la longitud mínima del fragmento se establece a valores
superiores a 50 kb, donde la concentración recomendada es de 0.25% de agarosa
La electroforesis consiste en aplicar una corriente a través de un gel (soporte semisólido)
que contiene las moléculas de interés para su separación. Con base en su tamaño y carga,
las moléculas se desplazarán por el gel en diferentes direcciones o a distintas velocidades,
con lo que se separan unas de otras.
Todas las moléculas de ADN tienen la misma cantidad de carga por masa. Debido a esto, la
electroforesis en gel de agarosa separa los fragmentos de ADN únicamente por su tamaño.
La electroforesis nos permite ver cuántos fragmentos diferentes de ADN están presentes en
una muestra y cuán grandes son unos con respecto a otros. También se puede determinar el
tamaño absoluto de un fragmento de ADN por comparación de su migración con la
migración de varios fragmentos de ADN de tamaño conocido (marcador de peso
molecular).
La visualización del ADN una vez es separado en el gel de agarosa se realiza utilizando un
compuesto fluorescente (Bromuro de etidio o SYBR) con la propiedad de unirse a las bases
nitrogenadas, de forma que su fluorescencia se eleva hasta 100 veces al estar unido a la
molécula de ADN y puede ser visualizado al exponer el gel a luz ultravioleta.
ELEMENTOS PARA DESTACAR:
1. Buffer TBE: se agrega en la preparación del gel.
a. Tris: Estabilizador de pH para la carga -
b. Borato: Acido generador de iones para el paso eléctrico.
c. EDTA: Gelante de iones inhibidor de DNA asas
2. SYBER safe: Se agrega a el gel preparado, Intercalarte que permite la observación
del ADN por fluorescencia.
3. Buffer muestra:
a. Azul de bromofenol: Tinte, permite observar la posición de el frente en la
corrida
b. Glicerol: Aumenta la densidad de la muestra para que esta permanezca en el
pocillo
c. EDTA: Inhibidor de las DNA asas
4. Transiluminador: Permite ver el ADN por fluorescencia
Aplicaciones electroforesis:
Observación de un producto de PCR o de una reacción de digestión con una enzima de
restricción, hasta el análisis de un plásmido recombinante.
El análisis de ADN para cualquier técnica de diagnóstico o estudio del ADN se inicia con
su aislamiento y posterior evaluación de la calidad o integridad, pureza y cantidad. Por tal
motivo esta técnica es una de las más utilizadas cuando se realizan estudios con ADN.
La utilización de las muestras de ADN en el área clínica es muy amplia iniciando con el
diagnóstico molecular de enfermedades hereditarias, enfermedades infecciosas,
determinación de identidad para casos de medicina forense, pruebas de paternidad,
diagnóstico molecular de cáncer, para estas aplicaciones las muestras de ADN son
posteriormente utilizadas en protocolos como PCR, hibridación in situ, secuenciación entre
otras. El ADN se emplea también en los protocolos investigación para la producción de
vacunas, fármacos recombinantes y terapia génica. Todas las técnicas anteriores requieren
el uso de un ADN de alta calidad y adecuada concentración.
El ADN se encuentra cargado negativamente gracias a los grupos fosfato.
Nanodrop
Su funcionamiento se basa en el empleo de un sistema de retención de muestra que
aprovecha la tensión superficial para formar un puente de líquido entre el pedestal inferior y
un pedestal superior. En los espectrofotómetros NanoDrop el pedestal superior es el
extremo de una fibra óptica conectada a una fuente de emisión de Xenon. Ambos
pedestales definen un preciso y estrecho paso óptico cuya longitud varía automáticamente
con la concentración de la muestra, permitiendo hacer mediciones en un rango muy amplio
de concentraciones sin hacer diluciones. Esta característica lo hace idóneo para determinar
la concentración y pureza de los ácidos nucleicos
Enzimas de restricción
Cortan fragmentos específicos de ADN
Las enzimas de restricción son una herramienta primordial para la ejecución de diversos
ensayos útiles en investigación clínica, desde la determinación de polimorfismos de
longitud de fragmentos de restricción (restriction fragment length polymorphism, RFLP),
así como en la construcción de vectores con ADN recombinante y clonación de secuencias
de ADN provenientes de humano, virus, bacterias y demás microorganismos de interés para
la generación de conocimiento o para su aplicación en el área de la medicina.
