excreción de ooquistes de cryptosporidium en el ganado caprino

EXCRECIÓN DE OOQUISTES DE CRYPTOSPORIDIUM EN EL

GANADO CAPRINO DE LA PROVINCIA DE ALMERÍA

Laura Sanz Ceballos(1), Pilar Illescas Gómez(2), Mª Remedios Sanz Sampelayo(1)

(3)
, Francisca Gil Extremera(1), Matilde Rodríguez Osorio(1)

RESUMEN

Entre los animales de granja, el ganado caprino es uno de los mas afectado por
cryptosporidiosis, la que además de la incidencia en la salud humana y animal, causa
a los ganaderos perdidas económicas considerables. Teniendo en consideración lo an-
terior, el objetivo del presente estudio ha estado centrado en determinar la prevalencia
de Cryptosporidium parvum, en heces de 582 cabras, de cuatro granjas seleccionadas
al azar en la provincia de Almería. La toma de muestras se realizó en los años 2004
y 2005, durante la paridera de primavera y otoño. Las muestras se agruparon según
edad, de la siguiente manera: grupo I, animales de 1-15 días, grupo II, > 15 días < 2
meses y, grupo III, > 2 meses a 9 años. Las muestras fueron tomadas al azar, directa-
mente del recto y marcadas para su identificación. Individualmente, cada muestra
fue concentrada, realizada su extensión y sometida a tinción ácida modificada por
Ziehl-Neelsen. La superficie total de la extensión fue examinada bajo microscopía y
objetivo de inversión. Ooquistes del parásito fueron detectados en todas las granjas.
De un total de 582 cabras examinadas, en 111 se encontró el parásito, siendo por tanto
la prevalencia del 19.1%. El valor obtenido para la granja nº 1 (10,1%) fue el más bajo
y estadísticamente diferente (P < 0,05) que el obtenido para la granja nº 2 (26,2%) y la
4 (26,5%). La presencia de Cryptosporidium en los tres grupos de edad considerados,
fue de 10,4%, 13,4% y del 25,2% para los grupos I, II y III, respectivamente. El grupo

(1)
Consejo Superior de Investigaciones Científicas, Estación Experimental del Zaidín, Unidad de Nu-
trición Animal, Profesor Albareda, 1. 18008 Granada
(2)
Laboratorio de Producción Animal. Junta de Andalucía. Granada
(3)
De la Real Academia de Ciencias Veterinarias de Andalucía Oriental

Anales - Vol. 21 (1) - Dic. 2008 - Real Academia de Ciencias Veterinarias de Andalucía Oriental 115
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III resultó ser estadísticamente diferente del grupo I y II (P < 0,05). Con respecto a los
resultados obtenidos analizados según estación, no encontramos diferencias signifi-
cativas (P > 0,05). Al mismo tiempo, en 222 muestras fecales de las total investigadas,
se ensayó un test comercial inmunocromatográfico, disponible para humanos. La
sensibilidad del mismo, fue del 2,3%, diferente estadísticamente (P < 0,05) del 10,4%
detectado por microscopía. En conclusión, los resultados del presente estudio indican
una alta prevalencia de la infección por Cryptosporidium en cabras. Esta especie puede
considerarse un importante reservorio para el hombre y otros animales de granja.
El uso del kit comercial para el diagnostico de cryptosporidiosis en humanos, no es
recomendable para el ganado caprino.

INTRODUCCIÓN

Para las regiones áridas y semiáridas de la zona mediterránea, su uso ganadero

basado en explotaciones extensivas o semiextensivas, se ha propuesto como la op-
ción con mayores posibilidades productivas, basado en razas autóctonas, integradas
en el medio natural, dentro de lo que se entiende por agricultura sostenible. En este
sentido, la cabra se señala como especie de elección por su excelente adaptación a las
condiciones climáticas, así como por el alto valor de sus producciones, leche y carne,
a las que se les reconoce una alta calidad, tanto desde un punto de vista nutritivo
como saludable (Boza, 2005). La cabra es uno de los animales de granja mas afectado
por la crystosporidiosis, sufriendo los ganaderos importantes perdidas económicas
producidas directa e indirectamente por este parasitismo.

Cryptosporidium parvum ha sido reconocido como un enteropatógeno ubicuo en

humanos y animales de granja. La infección por Crystoporidium en animales de granja,
llega a tener un importante impacto económico que incide en los ganaderos a causa
de la alta morbilidad y, en ocasiones, mortalidad de los animales. (Casemore et al.,
1997), incrementándose esta última cuando se asocia con infecciones concurrentes,
o deficiencias en la nutrición y/o en el manejo (de Graaf et al., 1999). Además, los
ooquistes excretados con las heces de los animales infectados, pueden ser una fuente
de infección para los humanos, constatándose una alta incidencia en el caso de pacien-
tes con SIDA, frente a la cual no hay tratamiento efectivo (Tzipori, 1998). La mayoría
de los datos publicados sobre la prevalencia de la infección por Cryptosporidium en
animales de granja, son referentes el ganado vacuno, siendo minoritarios los llevados
a cabo en el ganado ovino y caprino (Casemore et al., 1997). En cabras, la primera
denuncia de la infección se realizó en Australia, en un cabrito de dos semanas de edad

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con diarrea (Mason et al., 1981). Desde entonces la infección ha sido diagnosticada
en varias epidemias en cabritos, en diferentes países de Europa (Majewska et al.,
2000). En España, la primera denuncia en pequeños rumiantes fue realizada por Rojo
Vázquez et al. (1985), desde entonces la infección ha sido descrita en diferentes áreas
geográficas (Rojo Vázquez et al., 1987; Matos Fernández et al., 1993; Castro Hermida
et al., 2007), considerándose hoy uno de los principales enteropatógenos de estos
animales (Muñoz-Fernández et al., 1996). En este sentido los estudios realizados en
Andalucía resultan aún muy limitados (Llamas Trujillo et al., 1994).

Por todo lo anteriormente citado y relevancia del tema, tanto desde su aspecto
sanitario como económico, el objetivo del presente estudio ha estado dirigido a estimar
la prevalencia de la infección por Cryptosporidium, en cabras de granjas seleccionadas
al azar situadas en la provincia de Almería.

Por otra parte, es de interés el poder disponer de una técnica de diagnóstico

fácil de usar en condiciones de campo. En la actualidad se ha desarrollado un kit co-
mercial para el diagnóstico humano, y hemos comparado la sensibilidad del examen
microscópico fecal con la del citado kit.

MATERIAL Y MÉTODOS

Área de estudio

El estudio se ha llevado a cabo en 4 granjas de la provincia de Almería. El hecho

distintivo de esta localización geográfica es la escasez de precipitaciones, que hace de
esta zona el área más seca de toda Europa. Las explotaciones 1 y 2 estaban situadas
en Níjar y Tabernas respectivamente, zona árida templada, con lluvias no superiores
a los 200 mm, y la 3 y 4, en la comarca de Los Vélez, zona húmeda fría con lluvias
medias anual de 350 mm.

Animales y diseño experimental

Los animales fueron cabras de raza Murciano-Granadina y Malagueña, mante-

nidas bajo condiciones semi-extensivas de explotación, de edad comprendida entre
mayores de 1 día y hasta 9 años. Hemos examinado muestras fecales de 582 cabras
mediante microscopía y 222 por microscopia y técnica inmunocromatográfica (Crypto-
Strip, Coris Bioconcept, Namur, Bélgica). Las muestras fueron obtenidas durante los
años 2004 y 2005, en la época de paridera de primavera y otoño. Un cuestionario

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sobre condiciones higiénico-sanitarias de las instalaciones, mantenimiento y edad

de los animales se cumplimentó en cada caso. Los animales en cada granja, fueron
distribuidos en tres grupos: grupo I (1-15 días) grupo II (> 15 días–2 meses) grupo
III (> 2 meses-9 años). El número de animales muestreados de cada grupo en ningún
caso fue menor del 10% del número existente en cada grupo y granja en el momento
de la recogida de las muestras, durante las dos parideras estudiadas.

Examen parasitológico

Las 582 muestras fueron recogidas de animales seleccionados al azar, directamen-

te del recto, usando guantes estériles y, en animales pequeños (grupos I y II) mediante
hisopo rectal estéril. Para cada animal, las muestras fueron depositadas en tubos e
identificadas con la fecha de la toma, origen y edad, transportadas al laboratorio en
nevera a 4ºC, para su procesamiento. El tiempo transcurrido hasta su análisis no fue
superior a 24 horas. Las muestras fecales, 1,0 g o 0,3 g en el caso de las obtenidas
mediante hisopo rectal, fueron emulsionadas (en tampón fosfatos con formol 10%),
filtradas por dos capas de gasa (tamaño de 150 µm a 45 µm), agitadas vigorosamente
con éter etílico (1/1, vol/vol) y concentradas por centrifugación a 1000 g durante 5
minutos. Las tres capas resultantes se decantaban, realizándose a continuación una
extensión de 25 µl de sedimento, procediéndose a su tinción mediante el método de
Ziehl- Neelsen modificado por Heriksen y Pohlenz (1981). La superficie total de la
preparación se observaba bajo objetivo de inmersión.

Técnica inmunocromatográfica

En 222 animales seleccionados al azar de los 582 que habían intervenido en el

estudio, se recogieron las muestras por duplicado, una para le realización del diag-
nóstico parasitológico por microscopía, y la segunda para la realización del diagnos-
tico por la técnica inmunológica. Siguiendo las instrucciones indicadas por la casa
comercial para la realización de la técnica, las muestras no se trataban con tampón
fosfatos conteniendo formaldehido ni ningún derivado. La muestra fecal se diluía en
una solución tampón, la que era suministrada con el test. Las tiras de nitrocelulosa
estaban sensibilizadas con un anticuerpo monoclonal específico, producido en ratón
frente a antígenos de membrana de ooquistes de Cryptosporidium parvum, y conjugado
con oro coloidal responsable de la especificidad del test. Como control del ensayo,
cada tira contiene adsorbido, un segundo reactivo, un anticuerpo anti-IgG de ratón. La

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técnica consiste en sumergir la tira en cada solución de muestra diluida en el tampón

en una relación 1/5 (vol/vol) durante 5-10 minutos (máximo 15 minutos), apareciendo
una línea roja en caso positivo. La solución sigue migrando hasta encontrarse con el
segundo reactivo (anti-IgG de ratón) al que se fija el exceso de conjugado, generando
otra banda obscura (validación del ensayo).

Análisis estadístico

Los resultados obtenidos, han sido analizados mediante el test de igualdad de

porcentajes, con objeto de establecer las posibles diferencias de parasitación entre
granjas, grupos de edad y parideras (Rodríguez Osorio et al., 2003).

RESULTADOS

Observación microscópica

De las 582 cabras examinadas, Cryptosporidium ha sido detectado en 111, obte-

niéndose una prevalencia del 19,1%. En la Tabla 1 se muestran los resultados obtenidos
en los tres grupos de edad considerados, explotaciones y parideras.

Tabla 1. Prevalencia de la infección por Cryptosporidium parvum en cabras naturalmente

infectadas, en relación con la edad, granja y paridera. Resultados del análisis estadístico

Edad Muestras examinadas Positivas

0-15 días 134 14 (10.4%)a
16-60 días 134 18 (13.4%)a
61 días -9 años 314 79 (25.2%)b
Granja
1 148 15(10.1%)a
2 130 34(26.2%)b
3 168 26(15.5%)a,b
4 136 36(26.5%)b
Paridera
Primavera 303 54 (17.8%)
Otoño 279 57 (20.4%)
Para una misma comparación, valores afectados por distintas letrasa,b, son diferentes (P < 0.05).

Respecto a la edad, la más alta prevalencia la hemos encontrado en el grupo III,

diferente estadísticamente de los valores encontrados en los grupos I y II (P < 0,05).

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Con respecto a los porcentajes de parasitación entre las distintas granjas, el correspon-
diente a la explotación nº 1, fue significativamente más bajo que los encontrados en las
granjas 2 y 4 (P < 0,05). Los datos agrupados por parideras (primavera y otoño) fueron:
54 positivos (17,8%) para la paridera de primavera y 57 (20,4%) para la de otoño, no
siendo los porcentajes de parasitación estadísticamente significativos (P > 0,05).

Comparación de la observación microscópica y test inmunocromatográfico

Los resultados de las muestras de las 222 cabras examinadas por las dos técnicas
(Tabla 2) han demostrado que la eficacia de los dos métodos es diferente (P < 0,05),
obteniéndose un porcentaje de positivos por observación microscópica, del 10,4%
frente al 2,3% para la inmunocromatográfica. Todas las muestras que fueron positivas
mediante el test comercial (Crypto-Strip) lo fueron por observación microscópica, no
detectándose ninguna positiva de las negativas por microscopía.

Tabla 2. Resultados obtenidos mediante observación microscópica

de las muestras fecales y test inmunocromatográfico. Análisis estadístico

Muestras examinadas Positivas Negativas

Detección microscópica 222 23 (10,4%)a 199
Detección inmunocromatográfica 222 5 (2,3%)b 217
a,b
(P < 0.05).

DISCUSIÓN

En el área geográfica considerada, éste es el primer estudio realizado sobre la

prevalencia de esta protozoosis en cabras. En España la prevalencia de cryptospori-
diosis es alta. Nuestros resultados han mostrado que de las 582 cabras examinadas,
en 111 (19,1%) encontramos ooquistes de Cryptosporidim en heces. El parásito estuvo
presente en todas las granjas incluidas en este estudio; estando nuestros resultados de
acuerdo con los encontrados por otros autores. Así en León , Matos Fernández et al.
(1993), sobre 367 cabritos de 5 semanas de edad, procedentes de 31 granjas, elegidas
al azar, encontraron que el 36% de las granjas y el 11% de los animales muestreados,
estaban infectados por Cryptosporidiun. Llamas Trujillo et al. (1994), examinaron 47
cabritos muertos de 1-10 días de edad, pertenecientes a granjas de la provincia de
Granada, encontrando que el 20,78% de los animales presentaban ooquistes en sus
heces o en la mucosa del epitelio intestinal. En Galicia, Castro Hermida et al. (2007),
denunciaron que en 116 cabras, el 7,7% estaban parasitadas.

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Desde el punto de vista económico, no solo hay que considerar las perdidas
ocasionadas por la muerte de los animales más pequeños, sino también las debidas
a la perdida de peso en los animales afectados, gastos derivados de su tratamiento
veterinario y manipulación de los animales y sus instalaciones, factores que inciden
negativamente en la economía del ganadero. Las deficientes condiciones higiénicas
favorecen el mantenimiento y diseminación de este parasitismo (de Graaf et al., 1999).
En nuestro caso, el mayor numero de animales parasitados se obtuvo en la granja
4 que era la que mantenía peores condiciones sanitarias. Respecto a los grupos de
edad considerados, el mayor porcentaje de animales infectados fue el que comprendía
animales de 60 días a 9 años. Se ha sugerido que la eliminación de ooquistes por estos
portadores es uno de los mecanismos del mantenimiento de la infección en rumiantes.
Estos ooquistes emitidos, son capaces de trasmitir la infección a los animales recién
nacidos altamente vulnerables, y debido a su alto poder de multiplicación, pueden
ejercer su poder contaminante medioambiental, incidiendo en la epidemiología de
esta enfermedad (Noordeen et al., 2001). Por otra parte, estos adultos asintomáticos
constituyen un alto riesgo para los humanos, especialmente para los afectados por
inmunosupresión, tales como los que padecen SIDA, debido a su potencial efecto
zoonótico (Tzipori, 1998). En este sentido, en la primavera de 1998, hubo en la Sierra
de Guadarrama, una epidemia de gastroenteritis causada por Cryptosporidium, con
21 niños afectados, encontrándose el parásito en 9 de ellos (43%) (Rodríguez-Salinas
et al., 2000), indicando estos mismos autores la importancia de este parasitismo como
enfermedad emergente.

Respecto a la incidencia en las parideras aquí estudiadas (primavera y otoño)

no hemos encontrado diferencias significativas en la prevalencia de la infección,
resultados que se muestran de acuerdo con los indicados por Noordeen et al. (2001).
Este hecho puede ser debido a las condiciones climáticas de la zona estudiada, carac-
terizada por presentar lluvias poco frecuentes.

El kit comercial aquí empleado, ha sido desarrollado para el diagnóstico humano.

En el estudio realizado por Llorente et al. (2001), se encontró una especificidad del
100% y una alta sensibilidad. De acuerdo con esto, pensamos que el citado kit podría
ser una herramienta útil por su facilidad de ejecución y rapidez en la obtención de
resultados, para el diagnóstico de la cryptosporidiosis en cabras. Los resultados que
hemos obtenido con este kit han demostrado que es menos sensible que la observación
microscópica de las heces. Esta baja sensibilidad puede ser debida al hecho de que el
kit comercial es capaz de detectar ooquistes a una concentración de 1.000 ooquistes/
ml lo cual es equivalente a 1.000 ooquistes/gr de heces (indicaciones del kit), y en

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nuestras muestras, en algunos casos, estos podrían estar presentes en menor concentra-
ción, o bien que los inmunoreactivos del kit fueran obtenidos con Cryptosporidium de
diferente genotipo al presente en las muestras que hemos analizado. En este sentido,
Widmer (1998) ha demostrado la existencia de dos subgrupos genéticos en Cryptos-
poridium parvum: genotipo H o 1, encontrado solamente en infecciones humanas, y
los pertenecientes al genotipo C o 2, encontrado en humanos y animales.

En conclusión, los resultados del presente estudio revelan una alta prevalencia de
Cryptosporidium en cabras en la zona estudiada. Esta especie debería ser considerada
un reservorio de interés para otros animales de granja y humanos. El kit comercial
desarrollado para diagnóstico humano, no es recomendable para el diagnóstico de
la cryptosporidiosis caprina.

AGRADECIMIENTOS

Este estudio ha sido financiado por la Consejería de Innovación Ciencia y Em-

presa. Junta de Andalucía. (Proyecto CO3-177).

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