UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA

FACULTAD DE INGENIERÍA AMBIENTAL

ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA DE HIGIENE Y SEGURIDAD
INDUSTRIAL

TÉCNICAS DE COLORACIÓN DE BACTERIAS DE MUESTRAS

AMBIENTALES TINCIÓN POR EL MÉTODO DE GRAM

SEXTO LABORATORIO DEL CURSO MICROBIOLOGIA AMBIENTAL BO-122

MALPARTIDA SOTO JUAN CARLOS 20215015G

SAL Y ROSAS SANTOS BRYAN DAVID 20192705B

DOCENTE: Msc. Blgo. ALVARO MARTÍN MARTÍNEZ VILA

Lima, Perú
24 de octubre de 2021
 INDICE
I. RESUMEN.................................................................................................3

II. INTRODUCCIÓN.......................................................................................4

III. OBJETIVOS...............................................................................................5

IV. MARCO TEÓRICO....................................................................................6

V. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL........................................................9

5.1. MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS:.................................................9

5.2. METODOLOGIA.......................................................................................12

VI. RESULTADOS.........................................................................................14

VII. DISCUSION DE RESULTADOS..............................................................16

VIII. CONCLUSIONES....................................................................................17

IX. RECOMENDACIONES............................................................................18

X. CUESTIONARIO......................................................................................19

XI. FUENTES DE INFORMACIÓN................................................................21

XII. ANEXOS..................................................................................................22

XIII. APENDICE...............................................................................................23

2
I. RESUMEN

La tinción de Gram es un proceso muy usado en los laboratorios de

microbiología. Es una de las primeras pruebas que se hacen para clasificar a un
posible patógeno. En esta se utiliza colorantes para clasificar a las bacterias en
Gram positivas o negativas.

Para el sexto laboratorio se usarán las muestras que teníamos en agar TSA y
caldo BHI, realizamos la tinción Gram que presenta la siguiente secuencia: el
Frotis y fijado de la muestra en un portaobjetos con calor, se tiñe 1 min con
Violeta Cristal, se lava con agua, se cubre con Lugol durante 1 min y se lava de
nuevo con agua, decolorar con mezcla alcohol etílico/acetona durante 30 seg.
Escurrir y cubrir con Safranina (color de contraste) durante 30 seg. Una vez seco
se vierte un par de gotas de cristal violeta que actuará como colorante. Seguido
de ello se lavará en agua cuidadosamente para eliminar excesos de este
colorante para luego así añadir Lugol durante 30 segundos que actuará como
mordiente formando el complejo CV-l. Lavar con agua cuidadosamente y verter
safranina en la muestra para inmediatamente observar en el microscopio.

Resultó que las bacterias de 10-1 ,10-2,10-3,10-4, y10-5 se tiñeron de color

violeta, esto indica que son Gram positivas; por otro lado, las bacterias de la
mano y la boca resultaron ser Gram negativas tiñéndose de un color medio rojizo
Luego de Lavar y secar queda listo para observar los microorganismos en el
microscopio a un aumento de 1000X, si presentan coloración violeta son
considerados Gram positivos y si presentan coloración rojiza o rosada son Gram
negativos

3
II. INTRODUCCIÓN

El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan

difíciles de ver con el microscopio óptico. La principal dificultad es la falta de
contraste entre la célula y el medio que la rodea, y el medio más simple de
aumentar el contraste es la utilización de colorantes. Estos pueden
emplearse para distinguir entre tipos diferentes de células o para revelar la
presencia de determinados constituyentes celulares, tales como flagelos,
esporas, cápsulas, paredes celulares, centros de actividad respiratoria, etc.
Una de las técnicas de tinción más importantes es la tinción Gram. La tinción
de Gram, denominada así por el bacteriólogo danés Christian Gram, quien la
desarrolló en 1844. Sobre la base de su reacción a la tinción de Gram, las
bacterias pueden dividirse en dos grupos, Gram positivas y Gram. Es uno de
los métodos de tinción más importantes en el laboratorio bacteriológico y con
el que el estudiante debe estar perfectamente familiarizado. Su utilidad
práctica es indiscutible y en el trabajo microscópico de rutina del Laboratorio
de Microbiología las referencias a la morfología celular bacteriana (cocos,
bacilos, positivos, negativos, etc.) se basan justamente en la tinción de
GRAM. Las bacterias gram-positivas y gram-negativas tiñen de forma distinta
debido a las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes
celulares, Gram-positivos aparecen teñidos de color azul-violeta y los Gram
negativos cuando se visualizan de color rojo-rosado. Cuando se dispone de
un microscopio de luz, se pueden teñir las bacterias para facilitar su
visualización. Si se tiñe una muestra del cultivo extendida y fijada en una
lámina portaobjeto con un colorante dado, las células adquirirán el color del
colorante añadido y podrá observarse la forma, tamaño y el arreglo de las
mismas. Este tipo de coloración se conoce con el nombre de coloración
simple. Para obtener mayor información sobre la morfología y composición
química de las bacterias, debe recurrirse a tinciones diferenciales que
involucran el uso de varios reactivos y éstas pueden diferenciarse con base
al color que retienen. Ej. Tinción de Gram y Tinción de Ziehl Neelsen.

Una de las maneras de diferenciar a las bacterias es en base a la presencia de

una pared celular, ya que hay bacterias con una pared gruesa y otras con una
pared mucho más delgada, la tinción de Gram las divide fácilmente en dos

4
 grupos: Grampositivas y Gramnegativas, como se mencionó en base a su pared
celular y la permeabilidad de su membrana celular. Este mecanismo implica
además que la decoloración del solvente cause un daño significativo a las
superficies celulares de las bacterias Gramnegativas y solo un daño limitado a
las bacterias Grampositivas, esto sugiere que las bacterias gramnegativas tienen
más escapes, lo que hace que estas células ricas en lípidos de paredes
delgadas pierdan su tinte cristal violeta y se vean rojas por la contra tinción. Las
células grampositivas, de paredes gruesas y escasas en lípidos, aparecen de
color azul al conservar el cristal violeta original.

Estos dos grupos de bacterias son los pilares en los que se basa la clasificación
de la amplia mayoría de las bacterias. Cada uno de los grupos responde de
forma diferente, por eso es una muy técnica útil. En este presente laboratorio se
observará la forma y tipo de agrupación de los microorganismos.

III. OBJETIVOS

- Objetivos generales:
Conocer los fundamentos, utilidades y procedimiento aplicados a las tinciones
bacterianas, utilizando un método de tipo diferencial (distinguir microorganismos,
bacterias, ETC) basado en las características estructurales de su pared celular.

- Objetivos específicos:

- Estudiar y observar el uso de cada colorante a utilizar y sus funciones en

la tinción tinción Gram.
- Observar e identificar las diferencias entre los grupos bacterianos
grampositivas y gramnegativos por su reacción a las técnicas de tinción.
Como su morfología, la agrupación y algunas estructuras de la célula
bacteriana mediante la utilización de la tinción de colorantes.
- Reconocer los colorantes que reaccionan químicamente con la célula
bacteriana.
- Reconocimiento a través de la observación a los diferentes tipos de
bacterias, microorganismos, etc.
- Realizar adecuadamente el frotis de bacterias sobre el portaobjetos para
llevar a cabo la tinción con los colorantes que componen.

5
IV. MARCO TEÓRICO

Tinción de Gram

La tinción Gram es una técnica diferencial comúnmente empleada en el

diagnóstico microbiológico, fue descubierta por Hans Cristian Gram en 1884.

La mayor parte de las muestras sometidas a examen cuando se sospecha de

infección bacteriana deben ser extendidas en frotis sobre laminillas de vidrio,
teñidas y examinadas en el microscopio. Los reactivos empleados en la tinción
Gram son el cristal violeta (colorante básico), Lugol (mordiente), safranina
(colorante de contraste).

El cristal violeta sirve como colorante básico uniéndose a la pared celular

bacteriana, con ayuda del Lugol que refuerza la unión del colorante. Las
bacterias Gram positivas, debido a la estructura de su pared retienen el complejo
cristal violeta-Lugol, por el contrario, las bacterias Gram negativas pierden el
colorante cuando son tratadas con el alcohol cetona y la safranina.

Las bacterias Gram negativas se tiñen en rojo ó rosa.

La mayoría de las bacterias se pueden dividir en dos grupos según la

composición de su pared celular:

1) Las paredes de las células grampositivas tienen una capa gruesa de

peptidoglicano más allá de la membrana plasmática. Los polímeros
característicos llamados ácidos teicoico y lipoteicoico sobresalen del

6
peptodiglicano, y es debido a su carga negativa que la pared celular es negativa
en general. Estos ácidos son también muy importantes en la capacidad del
cuerpo para reconocer bacterias extrañas.

2) Las paredes celulares gramnegativas son más complejas. Tienen una fina
capa de peptidoglicano y una membrana exterior más allá de la membrana
plasmática. El espacio entre la membrana plasmática y la membrana exterior se
llama espacio periplásmico. El prospecto exterior de la membrana exterior está
compuesto principalmente de una molécula llamada lipopolisacárido (LPS). El
LPS es una endotoxina importante en desencadenando la respuesta inmune del
cuerpo y contribuyendo a la carga negativa general de la célula. Atravesando la
membrana externa se encuentran proteínas porinas que permiten el paso de
moléculas pequeñas. Las lipoproteínas se unen a la membrana externa y a la
fina capa de peptidoglicano.

➢ Frotis

Se denomina frotis a la extensión que se realiza sobre un portaobjetos de una

muestra o cultivo con objeto de separar lo más posible los microorganismos, ya
que si aparecen agrupados en la preparación es muy difícil obtener una imagen
clara y nítida.

➢ Colorantes:

Los colorantes son sustancias que se emplean para dar color a las estructuras
que componen los tejidos animales y vegetales, es decir, para teñir las células, y
sus compartimentos, y la matriz extracelular. Hay un número muy elevado de
colorantes que se emplean en los laboratorios de histología con usos diversos, lo
que depende de lo que queramos observar en nuestra preparación. Los
colorantes se eligen en función de su color, forma y peso molecular, solubilidad y
su capacidad para reaccionar con moléculas del tejido.

Los colorantes pueden ser previsibles en cuanto a qué estructuras van a teñir y
con qué color lo van a hacer si consideramos su naturaleza química. Así, si
tenemos en cuenta su carga eléctrica, que se puede deducir de su estructura
molecular, podemos clasificarlos en catiónicos o ácidos que teñirán el núcleo (el
ácido desoxirribonucleico) y carbohidratos ácidos, aniónicos o básicos que
teñirán el citoplasma y matriz extracelular. Mientras que los colorantes no
cargados pueden ser reactivos que tiñen una gran variedad de estructuras, los

7
liposolubles que tiñen depósitos lipídicos y los mordientes que tiñen
principalmente mielina y núcleos. El tamaño de la molécula y su capacidad para
formar agregados es a veces importante por la diferente capacidad de
penetración en el tejido. Por ejemplo, se pueden usar dos colorantes aniónicos
con diferente tamaño para teñir estructuras diferentes.

➢ Fijación de una muestra microbiológica

Proceso por el cual se preservan y se fijan en una posición los microrganismos

de la forma más parecida posible a la de las células vivas. Este proceso es
necesario para la posterior tinción de la muestra. Fundamentalmente, existen
dos tipos diferentes de fijación:

LA FIJACIÓN POR CALOR se utiliza de forma rutinaria para observar

procariotas. Normalmente una película de células (un frotis) se calienta
suavemente pasando el portaobjetos por una llama. La fijación por calor
preserva la morfología global pero no las ultraestructuras.

LA FIJACIÓN QUÍMICA se utiliza para proteger las subestructuras celulares

finas y la morfología de los microrganismos más grandes. Los fijadores químicos
penetran en la célula y reaccionan con los componentes celulares, normalmente
se unen a proteínas y lípidos para inactivarlos, insolubilizarlos e inmovilizarlos.
Las mezclas comunes de fijadores contienen sustancias como etanol, ácido
acético, cloruro de mercurio, formaldehído y glutaraldehído.

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V. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

5.1. MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS:

A. MATERIALES:

Mechero de Bunsen o de alcohol:

Instrumento utilizado en laboratorios para
calentar muestras y sustancias químicas,
1
está constituido por un tubo vertical que va
enroscado a un pie metálico con ingreso para
el flujo de gas, el cual se regula a través de
una llave sobre la mesa de trabajo.

Portaobjetos:
Pieza de vidrio delgada, plana y rectangular. Se
2
utiliza como plataforma para la observación de
muestras en el microscopio.

Cubreobjetos:
Un portaobjetos es una fina placa de cristal
3
sobre el cual se disponen objetos para su
examen microscópico. Sus dimensiones son de
75 mm x 25mm.

Asa de siembra:
Las asas de siembra se utilizan normalmente
para trasvasar muestras de microorganismos en
4
suspensión. Ideales para uso en condiciones
que requieren esterilidad y no es posible flamear
el asa de cultivo.

5 Pinza metálica:
Son un tipo de sujeción ajustable, generalmente
de metal, que forma parte del equipamiento de
laboratorio, mediante la cual se pueden sujetar
diferentes objetos de vidrio, etc.

9
6 Soporte para placas Petri:
Trasladan placas de Petri apiladas con muestra
bacteriológica.

B. EQUIPOS:

1 Microscopio:
Equipo que permite observar objetos que
son demasiado pequeños para ser
observados a simple vista, contiene dos
lentes que permiten obtener una imagen
aumentada del objeto y que funciona por
refracción.

C. REACTIVOS:

Aceite de inmersión:
El aceite de inmersión es un líquido viscoso
y transparente que tiene un alto índice
1
refractivo. Por este motivo es muy utilizado
en las observaciones microscópicas, ya que
brinda la propiedad de concentrar la luz
cuando esta pasa a través del objetivo de
100X del microscopio, aumentando su poder
de resolución

Alcohol isopropílico:
Alcohol incoloro, inflamable, con un olor intenso
y muy miscible con el agua. Es un isómero del
2
1- propanol y el ejemplo más sencillo de alcohol
secundario, donde el carbono del grupo alcohol
está unido a otros dos carbonos.

Cristal violeta:
El violeta de metilo, comúnmente denominado
cristal violeta o violeta de genciana, es el
3
nombre dado a un grupo de compuestos
químicos empleados como indicadores de pH y
colorantes.

10
 Lugol:
Disolución de yodo molecular I2 y yoduro
potásico KI en agua destilada, se emplea
4
frecuentemente como desinfectante y
antiséptico, para la desinfección de agua en
emergencias y como un reactivo para la prueba
del yodo en análisis de laboratorio.

Alcohol acetona:
Mezcla que sirve para realizar la decoloración,
ya que en la misma es soluble el complejo
5
I2/cristal violeta. Se puede visualizar los
organismos gran positivos (no se decoloran) y
gram negativos (sí lo hacen)

Fucsina o safranina:
Colorante biológico, de contraste que se utiliza
en la Tinción de Gram para proporcionar un
color violeta más intenso a las bacterias Gram+
6 y tiñe de rosa a las bacterias G-; en histología y
en citología.

5.2. METODOLOGIA
Guardar las condiciones de bioseguridad y, establecer el orden, la limpieza y
la desinfección de la mesa de trabajo. Para realizar este laboratorio se debe usar
guantes y mandil para evitar una fuerte coloración con lo tintes a las manos y
ropa.
Se debe tener mucha cautela y seguir los procedimientos establecidos.

I. Frotis

Se deberá emplear portaobjetos limpios, sin corte y sin rayaduras para evitar
interferencias en la observación.

1. Con un asa bacteriológica previa esterilización por incineración al rojo y

fría, se toma la colonia, la colonia que obtuvimos del Agar Nutritivo o del
Agar Plate Count , o si no de un medio líquido, se toma la colonia
sosteniéndolo entre el dedo meñique y la palma de la mano y se flamea
la boca del tubo en la llama del mechero; se toma la muestra con el asa y

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 antes de tapar se flamea nuevamente la boca del tubo. Se deposita el
material extraído con el asa sobre
el portaobjeto y se extiende formando una capa fina.
Secar utilizando el mechero de alcohol para evitar quemar la muestra,
solo se necesita secarla.
2. Si se trabaja con una muestra sólida, previamente se debe agregar agua
destilada o una solución salina al portaobjeto para poder emulsificar .
Se coloca la gota de agua destilada o solución salina en el cetro del
portaobjetos , y luego colocar la colonia que se puede obtener del -Agar
TSA plano inclinado, usando el asa de siembra y se comienza a
emulsilficar y con la misma asa se comienza a extender uniformemente y
se seca con la ayuda del mechero de alcohol.
3. Otro método de extensión es utilizar un portaobjetos que se encuentra a
45 grados con respecto al portaobjetos que eta horizontal con la muestra,
para luego proceder a correr la muestra de un extremo a otro del
portaobjetos horizontal.

II. Fijación

Es el secado propiamente con el calor, se explicó dentro del apartado anterior

(frotis)

III. Tinción Gram

1. Cubrir un frotis con una gota de cristal violeta y dejar actuar durante un
minuto.
2. Lavar con agua corriente, sin que caiga el chorro de agua de frente a la
muestra si no echar el chorro de agua por un lado para que no arrastre la
muestra y eliminar el exceso de agua.
3. Agregar la solución de Lugol sobre la muestra y dejar reposar un minuto.
4. Lavar con agua corriente
5. se decolora con el alcohol acetona (añadir gota a gota), preferiblemente
por 20 segundos.
6. Lavar con agua corriente
7. Agregar el colorante diferencial, en este caso la Safranina y dejar actuar
por 30 segundos.
8. Lavar con agua corriente
9. Secar con el fuego del mechero de alcohol.

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 10. Para observar en el microscopio agregar una gota de aceite de inmersión
de menor a mayor aumento hasta llegar al objetivo de 100X.

IV. Interpretación

Las bacterias Gram positivas retienen el complejo cristal violeta - Lugol y se tiñen
de color violeta o azul violáceo.

Las bacterias Gram negativas se tiñen en rojo ó rosa.

Proceso de la tinción de Gram, donde se observa el color tomado por las células
en cada etapa. (A) Cristal violeta, (B) Adición de Lugol, (C) Decoloración con
Alcohol-acetona y, (D) adición de Safranina. Las bacterias Gram-positivas
mantienen su color violeta y la Gram-negativas son decoloradas por el solvente,
aceptando el color conferido por la Safranina, y por lo cual se ven rojas-rosadas
(Fuente: Rojas, A.)

VI. RESULTADOS

Los resultados se obtuvieron del informe de laboratorio de Microbiología

Ambiental correspondiente al periodo 2019-2 a cargo del docente: msc. blgo.
Alvaro Martín Martínez Vila

 CULTIVO N° 1 (caldo)

En esta muestra observamos un cultivo mixto. Según su morfología

bacteriana, tenemos células:

• Gram negativos (coloración rosa). Bacilos.

• Gram positivos (coloración violeta). Diplococos, cocos,

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 estreptococos, estafilococos.

 CULTIVO N° 2 (caldo)

En esta muestra, según su morfología bacteriana, tenemos células:

• Gram positivos (coloración violeta). Cocos, estafilococos,

estreptococos.

 CULTIVO N° 3 (TSA)

En esta muestra, según su morfología bacteriana, tenemos células:

• Gram positivos (coloración violeta). Estreptococos, diplococos,

cocos.

 MUESTRA DE LA BOCA

En esta muestra, según su morfología bacteriana, tenemos células:

• Gram positivos (coloración violeta).

Cocos, diplococos, estafilococos, estreptococos.

 MUESTRA DE LA MANO

En esta muestra, se observa un cultivo mixto. Según su morfología

14
 bacteriana, tenemos células:

• Gram negativos (coloración rosa). Bacilos.

• Gram positivos (coloración violeta).

Cocos, diplococos, estreptococos.

Para realizar la técnica de tinción Gram. Primero seleccionamos 4 tubos en

medio sólido: Uno de la muestra del sarro dental (cultivo mixto) y los otros 3 de
las colonias seleccionadas anteriormente (cultivo puro). Luego seleccionamos 3
tubos en medio líquido: uno de la muestra de mano (cultivo mixto) y los otros 2
tubos de las colonias seleccionadas anteriormente (cultivo puro).
Los resultados que se observaron en el microscopio fueron:

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VII. DISCUSION DE RESULTADOS

Los resultados sobre un estudio de Gram positiva o negativa es realmente

importante para el diagnóstico y buen tratamiento de la patología relacionada
microorganismos es necesario saber cómo influyen en las manifestaciones
clínicas las diferencias existentes entre la pared celular de las bacterias Gram
positivas y Gram negativas en su detección y en el tratamiento. Porque existen
componentes de la pared celular que contribuyen a la virulencia de las bacterias
protegiéndolas de las respuestas inmunitarias. En el laboratorio se desearía
eliminar de forma selectiva las bacterias Gram positivas de una mezcla de
bacterias Gram positivas y Gram negativas. La tinción de Gram no es una
prueba fiable de tinción (por ej. Cultivos viejos o en fase estacionaria) o tratados
con antibióticos debido a la degradación del peptidoglicano por parte de estos
fármacos. Los fundamentos de esta técnica se basan en las diferencias entre las
paredes celulares de las bacterias Gram Positivas y Gram Negativas. La pared
celular de las bacterias Gram Positivas posee una gruesa capa de
peptidoglicano, en cambio en Gram Negativas la capa de peptidoglicano es
delgada, este factor que es la capa de peptidoglicano será lo que ocasionará ver
los resultados en la tinción.

En los resultados obtenidos se tuvo que, en los cultivos en medio líquido,

mayormente hay presencia de bacterias Gram Positivas, que la clasificamos
según su morfología bacteriana (cocos, diplococos, estafilococos, estreptococos,
sarcina); y poca cantidad de células Gram Negativas (bacilos, cocobacilos,
estreptobacilos y más), vistos mayormente en las muestras, bacilos.

En los resultados de la muestra de la boca, podemos observar que en nuestra

boca hay un montón de bacterias Gram Positivas, por ello debemos manejar una
mejor higiene bucal para evitar cualquier tipo de infección patológica. Y en la
muestra de la mano, se presentan células de bacterias Gram Positivas y Gram
Negativas; de igual manera que en la boca se debe manejar una mejor higiene
en nuestras manos debido a que esta siempre está en contacto con ojos, cara,
etc. Y esto nos puede traer consecuencias patológicas.

En la segunda fuente hubo unos inconvenientes en cuanto al desarrollo de la

tinción, por lo que se presentó dificultad en la observación de las células. Con
todo esto podemos decir que, es muy importante respetar el proceso de tinción,
tanto el orden de los reactivos como el tiempo que debe actuar cada reactivo.

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VIII. CONCLUSIONES

 Se concluye que la técnica de tinción de Gram es una de las más

importantes y se considera básica en la valoración inicial de muestras
para el análisis bacteriológico.
 La tinción de Gram diferencia a las bacterias en dos grandes grupos, una
es las bacterias Gram positivas a aquellas que retienen la tinción azul-
violeta y la segunda denominada bacterias Gram negativas a las que se
decoloran y después se tiñen con safranina.
 Esta diferencia de tinciones se debe a la estructura de las paredes
celulares de ambos tipos de bacterias. Las bacterias Gram positivas
tienen una pared gruesa compuesta de peptidoglucanos y polímeros, e
impermeable, que hace que resista la decoloración. En cambio, las
bacterias Gram negativas tienen una capa delgada de peptidoglucanos
más una bicapa de lipoproteínas que se puede deshacer con la
decoloración.
 La tinción de Gram puede proporcionar información rápida para
diagnósticos de infecciones, puede revelar los agentes causales incluso
con una toma de muestra no adecuada.
 También hace posible distinguir entre contaminación de la muestra y una
verdadera infección. Puede ayudar al clínico a seguir o cambiar un
tratamiento antibiótico inicial antes de los resultados del cultivo, y en
algunos casos, es capaz de mostrar la necesidad de una atención médica
urgente.
 Actualmente la tinción de Gram sigue siendo un método eficaz e
importante en el laboratorio, además de que es rápido y económico, por
lo que se debe estandarizar para evitar errores técnicos o de
interpretación.

IX. RECOMENDACIONES

 Para el procedimiento en la tinción de Gram se debe realizar en

condiciones asépticas, el asa de siembra debe estar previamente
esterilizada a la llama por incandescencia.
 Recordar que cuando se extrae la muestra con un asa de siembra se
debe hacer cerca del mechero de Bunsen.

17
  Realizar un correcto seguimiento del procedimiento del frotis y la fijación
para obtener resultados correctos.
 Se recomienda que en la fijación de las bacterias en el portaobjetos es
recomendable hacerlo con calor y con la muestra mirando hacia arriba,
sin quemar la muestra si no se pueden durante el procedimiento de
tinción donde se hace varios lavados y esto trae como consecuencia la
perdida de las bacterias.
 Se recomienda en la fijación por calor el mechero de alcohol para que no
haya coagulación del protoplasma celular y la muerte de los
microorganismos.
 Al fijar tener cuidado con un sobrecalentamiento ya que esto puede
generar una ruptura de la morfología de las células bacterianas.
 Recordar el uso correcto del microscopio, se debe de tomar en cuenta
que el extendido en la lámina con el cultivo bacteriano (muestra) debe ser
fina, caso contrario no será visible en el lente del microscopio, es decir,
que las estructuras no se podrán evidenciar.
 No perder de vista el lugar donde está la muestra, colocar de manera
correcta el portaobjetos, y de la misma forma una vez que la lámina está
en la platina del microscopio.

X. CUESTIONARIO

1- ¿Cuál es el fundamento de tinción de Gram?

Los elementos de la técnica se basan en las diferencias entre las paredes
celulares de las bacterias Gram Positivas y Gram Negativas. El burladero celular
de las bacterias Gram Positivas posee una obesa madre de peptidoglucano,
igualmente de dos clases de ácidos teicoicos: anclado en el morro interno de la
refugio celular y aparejado a la membrana plasmática, se encuentra el ácido
lipoteicoico, y más en el envoltorio, el ácido teicoico que está anclado
únicamente en el peptidoglicano (todavía sabido como mureína). por el contrario,
el curso de peptidoglucano de las bacterias Gram Negativas es flaca, y se
encuentra unida a una segunda laminilla plasmática exterior (de balada distinta a
la interna) por entorno de lipoproteínas. Tiene una capa flaca de peptidoglicano
unida a una laminilla exterior por lipoproteínas. La película afuera está hecha de
proteína, fosfolípido y lipopolisacayermado. Por lo tanto, entre ambos tipos de

18
bacterias se tiñen diferencialmente porque estas diferencias constitutivas de su
valla. La interesante es el peptidoglicano, visto que es el equipaje que confiere
su parquedad al burladero celular bacteriana, y las Gram Positivas lo poseen en
mucha mayor cadencia que las Gram Negativas.

2- ¿Cuál es la función que desempeña el Lugol en esta coloración?

En microbiología se utiliza en la tinción de Gram para retener el colorante cristal
violeta. El I2 entra en las células y forma con el colorante cristal violeta un
complejo insoluble en agua.

3- Escribir el nombre científico (género y especie), de 5 bacterias Gram

positivas y 5 Gram negativas.

Bacterias Género Especie

Streptococcus S. Pyrogenes

Staphylococcus S. Aureus

Gram Positivas Clostridium C.Tetani

Clostridium C. Perfringes

Bacillus B. Antracis

Neisseria N. Meningitidis

Escherichia E. Coli

Gram Negativa Salmonella S. Typhi

Haemophilus H. Influenzae

Brucella B. Abortus

4- ¿Por qué algunos microorganismos Gram Positivos en un cultivo joven se

vuelven Gram negativos cuando envejecen?
La pared celular puede dañarse motivo por el cual se altera el Gram de las
baterías positivas lo mismo que el medio ácido, en el cual la pared celular no es
capaz de valorar el colorante primario violeta de genciana y solo se tiñe con el
colorante secundario dando como resultado la célula Gram negativa en toda la
muestra

19
XI. FUENTES DE INFORMACIÓN
1- Universidad de Navarra. (2011, 7 marzo). Demostración de una tinción de
Gram por un doctorando de la Universidad de Navarra.mpg. YouTube.
https://www.youtube.com/watch?v=nqzDzuwOvXo&feature=emb_logo
2- Mary Carmen Urzua. (2017, julio 5). TINCION DE GRAM.wmv. YouTube.
https://www.youtube.com/watch?v=bdlKR0BBczE&feature=emb_logo
3- López-Jácome, L. E., Hernández-Durán, M., Colín-Castro, C. A., Ortega-
Peña, S., Cerón-González, G., & Franco-Cendejas, R. (2014). Las
tinciones básicas en el laboratorio de microbiología. Investig. en
discapacidades, 3(1), 10-18.
4- Ferré, C., Llopis Roca, F., Jacob, J., Juan i Pastor, A., Palom, X., Bardés,
I., & Salazar Soler, A. (2011). Evaluación de la utilidad de la tinción de
Gram del esputo para el manejo de la neumonía en urgencias.
Emergencias, 2011, vol. 23, num. 2, p. 108-111.
5- Hernández, F., & Moraga, M. (1997). Valor diagnóstico de la tinción de
Gram en las vaginosis bacterianas. Revista Costarricense de Ciencias
Médicas, 18(1), 49-58.
6- Bueno, D. S. (2016). Informe n 1: Procedimientos básicos para análisis
macroscópico y microscópico de bacterias, obtención y caracterización
de microbiota normal y ambiental (Doctoral dissertation, Pontificia
Universidad Católica de Chile).
7- Osorio, L. M. Á., & Piñeros, C. C. aislamiento, descripción e identificación
de una bacteria ambiental.
8- Camargo Rodas, D. Z. (2009). Aplicación del método de tinción gram
Normal y modificado, para mejorar la Visualización de bacterias
Grampositivas y gramnegativas en Sedimento urinario (Doctoral
dissertation).

20
XII. ANEXOS

XIII. APENDICE
 DIAGRAMA DE FLUJO

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