NTC5699 Control de Calidad Lab Microbiología

NORMA TÉCNICA NTC
COLOMBIANA 5699
2009-08-19
ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD - CONTROL DE LA

CALIDAD EN LABORATORIOS DE MICROBIOLOGÍA
E: QUALITY ASSURANCE – QUALITY CONTROL IN

MICROBIOLOGY LABORATORIES.
CORRESPONDENCIA: esta norma es una adopción por

traducción y modificada (MOD)
respecto a su documento de
referencia, Standard Methods for the
examination of water and wastewater,
Section 9020 A y B. Quality Assurance –
Quality Control:2005.
DESCRIPTORES: directrices; programa de

aseguramiento; control de calidad;
laboratorio de microbilología.
I.C.S.: 03.120.10; 07.100.01
Editada por el Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación (ICONTEC)

Apartado 14237 Bogotá, D.C. - Tel. (571) 6078888 - Fax (571) 2221435
Prohibida su reproducción Editada 2009-09-01

PRÓLOGO
El Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación, ICONTEC, es el organismo

nacional de normalización, según el Decreto 2269 de 1993.
ICONTEC es una entidad de carácter privado, sin ánimo de lucro, cuya Misión es fundamental
para brindar soporte y desarrollo al productor y protección al consumidor. Colabora con el
sector gubernamental y apoya al sector privado del país, para lograr ventajas competitivas en
los mercados interno y externo.
La representación de todos los sectores involucrados en el proceso de Normalización Técnica

está garantizada por los Comités Técnicos y el período de Consulta Pública, este último
caracterizado por la participación del público en general.
La NTC 5699 fue ratificada por el Consejo Directivo de 2009-08-19.
Esta norma está sujeta a ser actualizada permanentemente con el objeto de que responda en
todo momento a las necesidades y exigencias actuales.
A continuación se relacionan las empresas que colaboraron en el estudio de esta norma a

través de su participación en el Comité Técnico 25 Microbiología.
3 M COLOMBIA LABCONTROL E.U.

ALIMENTOS POLAR COLOMBIA S.A. LABFARVE LABORATORIO DE FARMACOLOGÍA
ALIMENTOS CÁRNICOS S.A. – PLANTA VEGETAL
SUIZO LABORATORIO EMICAL
ALPINA PRODUCTOS ALIMENTICIOS S.A. LABORATORIOS ERMA S.A.
ARCHIVO DE BOGOTÁ LABORATORIOS GRAM
ASBIOQUIM LTDA. LABORATORIOS MICROLAB LTDA.
BIANÁLISIS LABORATORIO SFC LTDA.
BIOCONTROL LTDA. MERCADEO DE ALIMENTOS DE COLOMBIA
BIOQUILAB LTDA. S.A.
BIOTRENDS LABORATORIOS LTDA. MICROBIÓLOGOS ASOCIADOS
CALIDAD INDUSTRIAL LTDA. MULTIDIMENSIONALES
CARULLA VIVERO S.A. NULAB LTDA.
CASA LUKER S.A. PURIFICACIÓN Y ANÁLISIS DE FLUIDOS
CONGELAGRO S.A. LTDA.
CORPOLAC - CORPOICA QUALA S.A.
ENZIPÁN LABORATORIOS S.A. SECRETARÍA DISTRITAL DE SALUD DE
INDUSTRIAS ALIMENTICIAS ZENÚ S.A. BOGOTÁ
INDUSTRIA PRODUCTORA DE ACEITES UNIVERSIDAD DE LOS ANDES
RENOVABLES. UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
INSTITUTO DE GENÉTICA UNIVERSIDAD VECOL S.A.
NACIONAL DE COLOMBIA VILASECA LTDA.
IVONNE BERNIER LABORATORIO LTDA. VITROFARMA S.A.
KOYOMAD S.A.
.
Además de las anteriores, en Consulta Pública el Proyecto se puso a consideración de las
siguientes empresas:
ACEGRASAS S.A.
ABASTICO DEL VALLE FÁBRICA DE ESPECIAS Y CONDIMENTOS
ACUAGYR S.A. E.S.P. EL REY S.A.
ALGARRA S.A. FRUGAL S.A.
ANNAR DIAGNÓSTICA IMPORT LTDA. JOHNSONDIVERSEY
AQUALAB KLIK S.A
AREPAS DOÑA ALEJA LABORATORIO A.B.B.A
ASEBIOL LABORATORIO DE GENÉTICA Y BIOLOGÍA
ASINAL MOLECULAR
ASOCIACIÓN COLOMBIANA DE MICROBIOLOGÍA LA CAMPIÑA
BAVARIA S.A. LESNIAK E.U.
BECTON DICKINSON DE COLOMBIA LTDA. NESTLÉ DE COLOMBIA S.A.
CERVECERÍA LEONA S.A. PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
COLOMBINA S.A. PRODUCTOS NATURALES DE LA
COMPAÑÍA NACIONAL DE CHOCOLATES SABANA S.A. -ALQUERÍA-
S.A. QUIK LTDA.
CORPORACIÓN PARA EL AVANCE DE LA ROCHE DIAGNOSTICS
MICROBIOLOGÍA Y LA MICROSCOPIA SERVICIOS DE LABORATIO CLINICO
-MICROS- LTDA.
DUPONT QUALICON UNIVERSIDAD DEL VALLE
EMPRESA DE ACUEDUCTO Y UNIVERSIDAD MANUELA BELTRÁN
ALCANTARILLADO DE BOGOTÁ E.S.P.
ICONTEC cuenta con un Centro de Información que pone a disposición de los interesados
normas internacionales, regionales y nacionales y otros documentos relacionados.
DIRECCIÓN DE NORMALIZACIÓN
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 5699
CONTENIDO
Página
0. INTRODUCCIÓN ..........................................................................................................1
1. OBJETO .......................................................................................................................1
2. REFERENCIAS NORMATIVAS ...................................................................................2
3. TÉRMINOS Y DEFINICIONES .....................................................................................2
4. DIRECTRICES PARA UN PROGRAMA DE ASEGURAMIENTO DE

LA CALIDAD ................................................................................................................2
5. OBJETIVOS DEL PROGRAMA DE ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD ...............3
6. ELEMENTOS DE UN PROGRAMA DE ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD .........3
7. DIRECTRICES DE CONTROL DE LA CALIDAD INTRALABORATORIO .................4
7.1 PERSONAL ..................................................................................................................4
7.2 INSTALACIONES.........................................................................................................5
7.3 EQUIPO E INSTRUMENTACIÓN DEL LABORATORIO ............................................6
7.4 ELEMENTOS DE LABORATORIO..............................................................................9
8. PROCEDIMIENTOS NORMALIZADOS DE OPERACIÓN (PNO) .............................18
9. MUESTREO................................................................................................................18
10. MÉTODOS ANALÍTICOS...........................................................................................18

Página
11. PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS DE CONTROL DE LA CALIDAD.......................19
12. VERIFICACIÓN ..........................................................................................................21
13. DOCUMENTACIÓN Y MANTENIMIENTO DE REGISTROS.....................................23
14. MANEJO DE LA INFORMACIÓN ..............................................................................24
BIBLIOGRAFÍA......................................................................................................................29
DOCUMENTO DE REFERENCIA..........................................................................................30
ANEXO A (Informativo)
ENTIDADES COMPETENTES EN COLOMBIA ....................................................................28
Figura 1. Curva de frecuencia (distribución sesgada positiva) .......................................25
TABLAS
Tabla 1. Práctica clave de control de la calidad .................................................................5
Tabla 2.Calidad de agua reactiva utilizada en ensayo microbiológico ...........................11
Tabla 3. Tiempo y temperatura para esterilización en autoclave.....................................16
Tabla 4. Tiempos de almacenamiento para medio preparados .......................................17
Tabla 5. Cultivos de control para ensayos microbiológicos ............................................19
Tabla 6. Cálculo de criterio de precisión............................................................................21
Tabla 7. Chequeo diario de la precisión en los recuentos por duplicado* .....................23
Tabla 8. Recuento de coliformes y sus logaritmos ...........................................................25
Tabla 9. Comparación de frecuencia de datos MPN .........................................................26
Tabla 10. Comparación de frecuencia de datos de logaritmo de MPN............................26

ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD - CONTROL DE LA CALIDAD

EN LABORATORIOS DE MICROBIOLOGÍA
0. INTRODUCCIÓN
El énfasis creciente en los microorganismos, en normas de calidad y actividades de

cumplimiento, y su inclusión continúa en la investigación, control de procesos y monitoreo de
conformidad exigen el establecimiento y operación efectiva de un programa de aseguramiento
de la calidad (AC) para probar la validez de los datos analíticos.
Un programa de aseguramiento de la calidad de laboratorio consiste en la integración de

control de la calidad (CC) intralaboratorio e interlaboratorio, normalización y prácticas de
gestión en un programa formal documentado con responsabilidades y deberes claramente
definidos a fin de garantizar que los datos son del tipo, calidad y cantidad requeridos.
El programa debería ser práctico y requiere sólo una cantidad razonable de tiempo; de lo
contrario, se evitará. Comúnmente, cerca del 15 % del tiempo de laboratorio general debería
emplearse en aspectos diferentes de un programa de aseguramiento de la calidad. No
obstante, es posible que se requiera más tiempo para datos analíticos más importantes, por
ejemplo, datos para acciones de cumplimiento. Cuando se administra adecuadamente, un
programa de AC equilibrado y aplicado concienzudamente optimizará la calidad de los datos
sin afectar de manera adversa la productividad del laboratorio.
Puesto que los análisis microbiológicos miden organismos vivos que cambian constantemente,
son variables de manera inherente. Es posible que el microbiólogo no cuente con algunas
herramientas de control de la calidad que utilizan los químicos, tales como los patrones de
referencia, tablas de control de la calidad y calibración de instrumentos.
Debido a que los programas de AC varían entre laboratorios como consecuencia de las
diferencias en la misión, responsabilidades y objetivos de la organización, el tamaño del
laboratorio, las capacidades y las instalaciones; y las destrezas y formación del personal, esta
sección ofrece sólo orientación general. Cada laboratorio debería determinar el nivel de AC
apropiado para este propósito.
1. OBJETO
Esta guía técnica colombiana especifica las directrices necesarias para establecer un
programa de aseguramiento o control de la calidad en laboratorios de microbiología (alimentos,
aguas, cosméticos, farmacia, entre otros), basados en el Standard Methods, 21 st Edition,
SECTION 9020A y B.
1 de 30
2. REFERENCIA NORMATIVA
El siguiente documento normativo referenciado es indispensable para la aplicación de este

documento normativo. Para referencias fechadas, se aplica únicamente la edición citada. Para
referencias no fechadas, se aplica la última edición del documento normativo referenciado (incluida
cualquier corrección).
NTC 4092, Microbiología de alimentos y de alimentos para animales. Requisitos generales para
el examen microbiológico (ISO 7218).
3. TÉRMINOS Y DEFINICIONES
Para los propósitos de esta norma se aplican los siguientes términos y definiciones:
4. DIRECTRICES PARA UN PROGRAMA DE ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD
Se debería desarrollar un programa de AC que sea acorde con las necesidades específicas del
laboratorio y el uso planificado de los datos. El énfasis en el uso de los datos es de especial
importancia cuando decisiones significativas y costosas dependen de resultados analíticos. Un
programa de AC efectivo confirmará la calidad de los resultados e incrementará la confianza en
los datos.
a) Responsabilidades de la dirección: La dirección debería reconocer la necesidad del

aseguramiento de la calidad, comprometer recursos monetarios y de personal, asumir
una función de liderazgo e involucrar al personal en el desarrollo y operación del
programa de AC. La dirección debería reunirse con el supervisor de laboratorio y el
personal para desarrollar y mantener un programa detallado y establecer
responsabilidades específicas de la dirección, los supervisores y los analistas.
b) Funcionario de aseguramiento de la calidad: En laboratorios grandes, un funcionario de

AC tiene la autoridad y responsabilidad de la aplicación del programa de AC. De
manera ideal, esta persona debería tener un cargo entre el personal que reporte
directamente a la dirección superior, no en posición lineal. El funcionario de AC debería
contar con educación técnica, conocer todos los aspectos del trabajo del laboratorio y
estar familiarizado con técnicas estadísticas para la evaluación de datos. El funcionario
de AC es responsable de iniciar el programa, convencer al personal de su valor y
ofrecer al personal la información y capacitación necesaria. Una vez el programa de AC
se encuentra en funcionamiento, el coordinador conduce revisiones frecuentes
(semanales a mensuales) con el supervisor del laboratorio y el personal a fin de
determinar el estado actual y los logros del programa, e identificar y resolver problemas.
Además, el funcionario de AC reporta periódicamente a la dirección con el propósito de
asegurar el respaldo a acciones necesarias para corregir problemas que amenazan la
calidad de los datos.
c) Personal: El personal de laboratorio y de campo participa con la dirección en la

planificación del programa de AC, preparando procedimientos de operación
normalizados y, lo más importante, implementando el programa de AC en sus tareas
diarias de recolección de muestras, conducción de análisis, realización de verificaciones
de control y cálculo y reporte de resultados. Puesto que el personal es el primero en
apreciar problemas potenciales, debería identificarlos y trabajar con los supervisores
para corregirlos y evitarlos. Resulta crítico para el éxito del programa de AC que el
personal lo comprenda y apoye de manera activa.
2
5. OBJETIVOS DEL PROGRAMA DE ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD
Los objetivos de un programa de AC incluyen proveer datos de calidad reconocida, asegurar un

desempeño de laboratorio de alta calidad, mantener la evaluación continua de las operaciones del
laboratorio, detectar necesidades de formación y mejorar la documentación y mantenimiento de
archivos.
6. ELEMENTOS DE UN PROGRAMA DE ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD
Cada laboratorio debería desarrollar e implementar un plan de AC escrito que describa el

programa de AC y las actividades de CC del laboratorio. El plan debería tratar los siguientes
aspectos comunes básicos:
a) Declaración de objetivos, que describa las metas específicas del laboratorio.
b) Procedimientos de muestreo, que incluyan la selección de elementos representativos y

tiempo de retención especificado y condiciones de temperatura. Si existe la posibilidad
de que los datos se sometan a litigio, se debería emplear procedimientos de cadena de
custodia.
c) Políticas de personal, que describa los requisitos específicos de calificación y formación

de supervisores y analistas.
d) Requisitos de equipos e instrumentos, que ofrezcan procedimientos de calibración y

requisitos de frecuencia y mantenimiento.
e) Especificaciones para suministros, para garantizar que los reactivos y suministros sean
de alta calidad y aceptabilidad comprobada.
f) Métodos analíticos, es decir, métodos normalizados establecidos por una organización

normalizadora y validados. De manera ideal, estos métodos de laboratorio cuentan con
precisión, sesgo, sensibilidad, selectividad y especificidad documentados.
g) Medidas analíticas de control de la calidad, que incluyan verificaciones analíticas tales

como análisis por duplicado, controles positivos y negativos, verificaciones de esterilidad
y ensayos de verificación.
h) Procedimientos normalizados de operación (PNO), es decir, declaración escrita y

documentación de todas las operaciones rutinarias de laboratorio.
i) Requisitos de documentación, relacionados con la adquisición de datos, mantenimiento

de archivos, trazabilidad y responsabilidad.
j) Requisitos de evaluación:
1) Auditorías internas de las operaciones del laboratorio, realizadas por el

funcionario de AC y el supervisor.
2) Evaluaciones en el sitio, realizadas por expertos externos a fin de garantizar que

laboratorio y su personal siguen un programa de AC aceptable.
3) Estudios de evaluación del desempeño, en los que el funcionario de AC trabaje

con el supervisor a fin de incorporar muestras de validación desconocidas en
3
corridas analíticas rutinarias y se motiva a los laboratorios a participar en

programas estatales y nacionales de acreditación y ensayo de competencia. Los
estudios conjuntos confirman las habilidades de un laboratorio de generar datos
aceptables comparables con los de otros laboratorios e identificar problemas
potenciales.
k) Acciones correctivas: Cuando el personal, el supervisor y/o el coordinador de AC

identifican los problemas, usan procedimientos escalonados para determinar las causas
y corregirlas. Las no conformidades identificadas por la evaluación externa se corrigen,
registran y resuelven por el director de laboratorio y el funcionario de AC.
Se encuentran disponibles descripciones detalladas de programas de aseguramiento de la

calidad.
Se recomiendan las directrices de CC analizadas en el numeral 7 y la sección 9020C del

Standard Methods como material de fuente útil, aunque se deberían tratar todos los elementos
al desarrollar un programa de AC.
7. DIRECTRICES DE CONTROL DE LA CALIDAD INTRALABORATORIO
Todos los laboratorios cuentan con algunas prácticas de control de la calidad (CC)
intralaboratorio que han evolucionado partiendo del sentido común y los principios de
experimentación controlada. Un programa de CC aplica las prácticas necesarias para minimizar
los errores sistemáticos y aleatorios originados por el personal, equipos, reactivos, suministros,
métodos analíticos y de muestreo, manipulación de datos y reporte de datos. Es especialmente
importante que los laboratorios que realizan sólo una cantidad limitada de ensayos
microbiológicos ejerzan estricto CC. En la Tabla 1 se presenta una lista de prácticas de CC. Se
encuentran disponibles otras fuentes de prácticas de CC. Estas prácticas y directrices serán de
ayuda para los laboratorios en el establecimiento y mejora de programas de CC. Los
laboratorios debería tratar todas las directrices de CC aquí analizadas, aunque la profundidad y
detalles pueden diferir para cada laboratorio.
7.1 PERSONAL
Siempre que sea posible, un microbiólogo profesional o técnico con formación en microbiología
ambiental debería realizar el ensayo microbiológico. De no ser así, debería contarse con la
orientación de un microbiólogo profesional. Se debería formar y evaluar el analista en los
procedimientos básicos de laboratorio. Periódicamente, el supervisor debería revisar los
procedimientos de recolección y manipulación de muestras, preparación de medios y artículos
de vidrio, esterilización, ensayo analítico de rutina, recuento, manipulación de datos y técnicas
de CC para identificar y eliminar problemas. La dirección debería guiar al personal del
laboratorio en la obtención de formación adicional y cursos para aumentar sus destrezas y
avanzar en su carrera.
4
Tabla 1. Prácticas clave de control de la calidad
Información adicional en
Ítem Acción Frecuencia
el numeral 7.
Agua reactiva Supervisar la calidad Véase Tabla 2
Superficie del banco Supervisar la contaminación Semanalmente 7.2 e
Aire en el sitio de trabajo
Supervisar la densidad Mensualmente 7.2 e
bacteriana
Termómetros Verificar la exactitud Semestralmente 7.3 a
Pesos y balanzas Verificar la exactitud Mensualmente 7.3 b
Balanzas Realizar mantenimiento y Anualmente 7.3 b
recalibrar
Medidor de pH Normalizar Cada vez que se use 7.3 c
Verificar contra otro medidor Mensualmente 7.3 c
Equipos dispensadores de Verificar la exactitud del Cada vez que se use 7.3 f
medios volumen
Horno de aire caliente Verificar el desempeño Mensualmente 7.3 g
Autoclave Verificar el desempeño Mensualmente 7.3 h, 7.4 i 2)
Refrigerador Verificar la temperatura Diariamente 7.3 i
Congelador Verificar la temperatura Diariamente 7.3 j
Descongelar Semestralmente 7.3 j

Equipo de filtración por Verificar fugas y rasguños en Cada vez que se use 7.3 k
membrana la superficie
Lámparas UV Ensayar con medidor de UV Trimestralmente 7.3 l
Campana contra riesgos Supervisar el aire y las Mensualmente 7.3 m

biológicos lámparas de UV
Inspeccionar el flujo de aire Trimestralmente 7.3 m
Incubadora Verificar la temperatura Dos veces al día 7.3 n y o
Microscopio Limpiar los elementos ópticos Cada vez que se use 7.3 p
y portaobjetos
Artículos de vidrio Inspeccionar la limpieza, Cada vez que se use 7.4 a
averías y corrosión
Verificar el pH Cada lote 7.4 a 1)
Conducir ensayo de residuos Anualmente 7.4 a 2)
inhibitorios
Botellas de agua de Verificar el pH y el volumen Cada vez que se use 7.4 c
dilución
Medios Verificar el pH y la apariencia Cada vez que se use 7.4 i 1)
Recuento en placa Realizar análisis duplicados Semanalmente 11 a 4)
Repetir recuentos Mensualmente 11 a 2)
7.2 INSTALACIONES
a) Ventilación: Se deberían planificar laboratorios con buena ventilación, que se puedan

mantener libres de polvo, corrientes de aire y cambios extremos de temperatura.
Siempre que sea posible, los laboratorios debería contar con aire acondicionado a fin de
reducir la contaminación, permitir una operación más estable de las incubadoras y
disminuir problemas de humedad en los medios y la instrumentación.
b) Utilización del espacio: Se debería diseñar y operar el laboratorio de modo que se

minimice el tráfico a través de él y los visitantes, con un área separada para la
5
preparación y esterilización de medios, artículos de vidrio y equipos. Se debería usar

una campana de flujo laminar ventilada para dispensar y preparar medios estériles,
transferir cultivos microbianos o trabajar con materiales patogénicos. En laboratorios
más pequeños puede ser necesario, aunque indeseable, realizar estas actividades en el
mismo recinto.
c) Áreas de los mesones de laboratorio:
NOTA Se recomienda dejar un espacio entre la pared y el mesón aproximadamente entre 15 cm y 30 cm si se

tienen conexiones eléctricas.
Se debe tener en cuenta la legislación nacional vigente, condiciones establecidas en las

políticas de Salud Ocupacional internas en cada laboratorio para aspectos ergonómicos.
NOTA La ARP realizará recomendaciones de acuerdo con las condiciones de los analistas analistas en general y
en su puesto de trabajo, así mismo establece los lineamientos básicos de otras condiciones a cumplir (condiciones
de iluminación, especificaciones de los materiales, diseño y construcción del mobiliario del laboratorio y las
actividades a realizar).
d) Paredes y pisos: Se debería cerciorar de que las paredes estén cubiertas con un
acabado liso que se pueda limpiar y desinfectar con facilidad. Se especifican pisos de
concreto liso, vinilo, baldosas de asfalto u otras superficies inmunes, selladas y lavables.
e) Supervisión del área de trabajo: Se deberían mantener estándares exigentes de limpieza en

las áreas de trabajo. Se debería supervisar el aire, por lo menos mensualmente, con placas
de densidad del aire. La cantidad de colonias en el ensayo de placa de densidad del aire no
debería exceder 160/m2/15 min de exposición (15 colonias/placa/15 min).
Se puede usar el método de placa o de hisopo semanalmente o con una frecuencia

mayor para supervisar la contaminación de la superficie del mesón. Aunque no se han
establecido límites uniformes para la densidad bacteriana, cada laboratorio puede
emplear estos ensayos para fijar una línea de base y emprender acciones sobre un
incremento significativo.
f) Limpieza del laboratorio: Se debería limpiar regularmente los cuartos del laboratorio y
lavar los mesones, estantes, pisos y ventanas. Se humedece y friegan los pisos y se
tratan con una solución desinfectante; no barrer ni restregar en seco. Se limpian las
superficies de los mesones y se tratan con un desinfectante antes y después de usarlos.
No se permite el desorden en el laboratorio.
7.3 EQUIPO E INSTRUMENTACIÓN DEL LABORATORIO
Se verifica que cada elemento del equipo satisfaga las necesidades del usuario de precisión y
minimización del sesgo. Se realiza mantenimiento al equipo sobre una base regular según lo
recomiende el fabricante o se obtienen contratos de mantenimiento preventivo de autoclave,
balanzas, microscopios y otros equipos. De manera directa, se registran todas las
verificaciones de control de la calidad en los formatos de registro correspondientes.
Se usan los siguientes procedimientos de control de la calidad:
a) Termómetro/Instrumentos de registro de temperatura: Se verifica la exactitud de los

termómetros o instrumentos de registro de temperatura semestralmente contra un
termómetro certificado o termocuplas certificadas por ente regulatorio correspondiente o
autorizado por el mismo (véase Anexo informativo A “SIC”), o uno trazable a NIST y
conforme con las especificaciones de NIST. Para propósitos generales, se usan
termómetros graduados en incrementos de 0,5 ºC o menos. Se mantienen en agua o
6
glicerol para incubadoras de aire y refrigeradores y glicerol para congeladores y se

sellan en un matraz. Para un baño de agua de 44,5 ºC, se usa un termómetro
sumergible graduado a 0,2 ºC o menos. Se registran los datos de verificación de
temperatura en un registro de control de la calidad. Se marcan las correcciones de
calibración necesarias en cada termómetro, termocupla e incubadora, refrigerador o
congelador. Cuando sea posible, se equipan las incubadoras y baños de agua con
instrumentos de registro de la temperatura que ofrezcan un registro continuo de la
temperatura operante.
b) Balanzas: Se siguen las instrucciones del fabricante sobre la operación y mantenimiento

de rutina de balanzas analíticas y de carga superior. Un técnico del fabricante debería
realizar el mantenimiento y recalibración de las balanzas anualmente o con mayor
frecuencias de acuerdo con el cambio de condiciones o la ocurrencia de problemas. Para
pesar 2 g ó menos, se usa una balanza analítica con una sensibilidad inferior a 1 mg a una
carga de 10 g. Para cantidades mayores, se utiliza una balanza de bandeja o platillo con
sensibilidad de 0,1 g a una carga de 150 g.
Se limpia la balanza, con un cepillo suave, antes de usarla. Se asean las bandejas o
platillos de las balanzas después de usarse y se limpian los derrames de inmediato con
un papel absorbente de laboratorio. Se inspeccionan las pesas en cada uso y se
cambian si se encuentran corroídas. Se usan sólo fórceps de punta plástica para
manipular las pesas. Se verifica la exactitud, precisión y linealidad de los pesos de
trabajo y de balanza mensualmente contra un conjunto de pesos de referencia
(ANSI/ASTM Clase 1 ó NIST Clase S para los cuales la SIC cuenta con trazabilidad de
estas pesas y medidas). Se registran los resultados.
c) Medidor de pH: Se usa un medidor graduado en 0.1 unidades de pH o menos, que

incluye compensación de la temperatura. Preferiblemente se usan medidores digitales y
soluciones amortiguadoras comerciales. En cada uso, se normaliza el medidor con dos
amortiguadores que encierran el pH de interés y se registra. Se fechan las soluciones
amortiguadoras cuando se abren y se verifican mensualmente contra otro medidor de
pH. Se desecha la solución después de cada uso y se reemplaza por un buffer con
fecha de expiración vigente. Véase en la Sección 4500-H del Standard Methods detalles
completos de uso y mantenimiento del medidor de pH.
d) Sistema de purificación del agua: Se encuentran disponibles sistemas comerciales que

incluyen cierta combinación de prefiltración, carbono activado, resinas de lecho mixto y
osmosis inversa con filtración final que producen agua de grado reactivo. La vida de
dichos sistemas se extenderá en gran medida si el agua fuente se trata previamente por
destilación u osmosis inversa para retirar sólidos disueltos. Tales sistemas tienden a
producir agua de la misma calidad hasta que las resinas o el carbono activado se hallan
próximos a la extinción y la calidad se vuelve abruptamente inaceptable. En la
actualidad existen algunos componentes de desionización que regeneran de forma
automática las resinas de intercambio iónico. No se debería almacenar agua reactiva a
menos que se instale un dispositivo comercial de irradiación UV y se confirme que
mantiene la esterilidad.
Continua o diariamente se supervisa el agua reactiva con un medidor de

conductividad calibrado y se analiza mínimo una vez al año el contenido de trazas
de metales. Se remplazan los cartuchos en intervalos recomendados por el
fabricante con base en el uso calculado y la calidad del agua fuente. No se debería
esperar hasta que falle la columna. Si se desea agua libre de bacterias, se incluye
filtración final aséptica con un filtro de membrana de poro de 0,22-µm y se recoge en
7
un contenedor estéril. Se supervisa que no haya contaminación en el agua tratada y

se remplaza el filtro, si es necesario.
e) Destilador de agua: Los destiladores producen agua de buena calidad que, de manera
característica, se deteriora lentamente con el paso del tiempo a medida que ocurra
corrosión, lixiviación y ensuciamiento. Estas condiciones pueden controlarse con
mantenimiento y limpieza adecuados. Los destiladores remueven, en forma eficiente,
sustancias disueltas, aunque no gases disueltos ni sustancias químicas orgánicas
volátiles. El agua recién destilada puede contener cloro y amoniaco (NH3). En
almacenamiento, se absorben NH3 y CO2 del aire. Se usa agua suavizada como agua
fuente a fin de reducir la frecuencia de la limpieza del destilador. Se drena y limpia el
destilador y el depósito de acuerdo con las instrucciones del fabricante y el uso.
f) Aparatos dispensadores de medios: Se verifica la exactitud de los volúmenes

dispensados con un cilindro graduado al inicio de cada cambio de volumen y
periódicamente a lo largo de ciclos extendidos. Si se usa la unidad más de una vez por
día, se bombea un volumen grande de agua reactiva caliente a través de la unidad para
enjuagar entre ciclos. Se corrigen las fugas, se sueltan las conexiones o
malfuncionamientos de inmediato. Al finalizar el día laboral, se desarman los aparatos,
se lavan, se enjuagan con agua reactiva y se secan. Se lubrican las partes de acuerdo
con las instrucciones del fabricante o por lo menos una vez al mes.
g) Horno de aire caliente: Una vez al mes se ensaya el desempeño con tiras de esporas
Bacillus subtilis o suspensiones de esporas disponibles comercialmente. Se supervisa la
temperatura con un termómetro exacto en el intervalo de 160 ºC a 180 ºC y se registran
los resultados. Se usa cinta indicadora de calor para identificar suministros y materiales
que se han expuesto a temperaturas de esterilización.
h) Autoclave: Se registran los elementos esterilizados, la temperatura, presión y tiempo de

cada ciclo. De manera óptima, se usa un termómetro registrador. Se verifica y registra la
temperatura operante cada semana con un termómetro mínimo/máximo. Se ensaya
cada mes el desempeño con tiras de esporas Geobacillus stearothermophilus,
suspensiones o cápsulas. Se usa cinta indicadora del calor para identificar suministros y
materiales que se han esterilizado.
i) Refrigerador: Se mantiene la temperatura a 1 ºC a 8 ºC. Se verifica y registra la temperatura

cada día y se limpia cada mes. Se identifican y fechan los materiales almacenados. Se
descongela según se requiera y se desechan los materiales que han superado su fecha de
vencimiento.
j) Congelador: Se mantiene la temperatura a -20 ºC a -30 ºC Se verifica y registra la

temperatura diariamente. Resultan muy deseables un termómetro de registro y un
sistema de alarma. Se identifican y fechan los materiales almacenados. Se descongela
y limpia según lo establecido por cada laboratorio; se desechan los materiales que han
superado su fecha de vencimiento.
k) Equipo de filtración de membrana: Antes de usarse, se ensamblan unidades de filtración

y se verifica que no haya fugas. Se desechan unidades si las superficies interiores
presentan rasguños. Se lava y se enjuagan los ensambles de filtración a cabalidad
después de usarse, se envuelven en papeles no tóxicos y se esterilizan.
l) Lámparas ultravioleta: Se desconectan las lámparas cada mes y se limpian las

bombillas con un paño suave humedecido con etanol. Se ensayan las lámparas
trimestralmente con un fotómetro UV apropiado (de onda corta o larga) y se remplazan
8
bombillas si la salida es inferior al 70 % del original. Para lámparas de onda corta que se
usan en desinfección de áreas de trabajo, se exponen placas de agar para recuento en
placa que contienen 200 a 300 organismos de interés, durante 2 min. Se incuban las
placas a 30ºC durante 48 h y se cuentan las colonias. Se remplaza la bombilla si el
recuento no se reduce en un 99 %.
PRECAUCIÓN Aunque se sabe que la luz UV (254-nm) de onda corta es más peligrosa que la UV (365-nm)
de onda larga, ambos tipos de luz UV pueden lesionar los ojos y la piel y son potencialmente carcinógenos. Se
deberían proteger los ojos y la piel de la exposición a la luz UV. (Véase la Sección 1090B. Standard Methods)
m) Cabina de seguridad contra riesgos biológicos: Una vez por mes se exponen las placas
de agar para recuento en placa al flujo de aire durante 1 h. Se incuban placas a 30 ºC
durante 48 h y se examina la contaminación. Una campana de protección contra riesgos
biológicos que opere adecuadamente no debería producir crecimiento en las placas. Se
desconectan las lámparas ultravioleta y se limpian cada mes frotando un paño suave
humedecido con etanol. Se verifica la eficiencia de las lámparas de la manera especificada
anteriormente. Se inspecciona la presencia de fugas en el gabinete y la tasa de flujo de aire
trimestralmente. Se usa un dispositivo de monitoreo de presión para medir la eficiencia del
desempeño de la campana. Se deberían tener cabinas de seguridad de flujo laminar que
contengan filtros HEPA con servicio de mantenimiento por el fabricante. Se mantienen las
campanas de acuerdo a lo indicado por el fabricante.
n) Incubadora de baño de agua. Se verifica que las incubadoras mantengan la temperatura

de ensayo, tal como 35 ºC ± 0,5 ºC ó 44,5 ºC ± 0,2 ºC. Se mantiene un termómetro
apropiado (Véase el numeral 7.3 a)) inmerso en el baño de agua; se monitorea y
registra la temperatura dos veces al día (en la mañana y en la tarde). Para una
operación óptima, se equipa el baño de agua con una cubierta o tapa. Se debería usar
sólo estantería de acero inoxidable, recubierta de plástico u otro material a prueba de
corrosión. Se limpian los baños según sea necesario.
o) Incubadora (con camisa de aire, agua o aluminio): Se verifica que las incubadoras
mantengan temperaturas de ensayo apropiadas. Además, se verifica que se incuben
muestras frías a la temperatura de ensayo durante el tiempo requerido. Se revisa y
registra la temperatura dos veces al día (en la mañana y la tarde) en las bandejas en
uso. Si se utiliza un termómetro de vidrio, se sumerge la ampolla y el capilar en agua o
glicerina hasta la marca del capilar. Para obtener mejores resultados, se usa un
termómetro de registro y un sistema de alarma. Se coloca la incubadora en un área
donde la temperatura ambiente se mantiene entre 16 ºC y 27 ºC (60 ºF a 80 ºF).
p) Microscopios: Se usa papel para lentes para limpiar los elementos ópticos y
portaobjetos después de cada uso. Se cubre el microscopio cuando no esté en uso.
Sólo se permite que técnicos capacitados usen el microscopio de fluorescencia y la

fuente luminosa. Se monitorea la lámpara de fluorescencia con un fotómetro y se
remplaza cuando se observa una perdida significativa de la fluorescencia. Se registra el
tiempo de operación de la lámpara, la eficiencia y la alineación. Se verifica periódicamente la
alineación de la lámpara, en especial cuando se ha cambiado la bombilla; se realinea de ser
necesario. Se usan portaobjetos de fluorescencia 4 + positiva como controles.
7.4 ELEMENTOS DE LABORATORIO
a) Artículos de vidrio. Antes de cada uso, se examinan los artículos de vidrio y se eliminan
los elementos con bordes estropeados o superficies interiores corroídas. En especial se
examina en las botellas de dilución de tapa roscada y los matraces la presencia de
bordes menoscabados que pudieran causar fuga y contaminar al analista y el área. Se
9
inspeccionan los artículos de vidrio después de lavar y volver a lavar, si es necesario.

Se realizan los siguientes ensayos en artículos de vidrio limpio, según sea necesario:
1) revisión del pH: Puesto que algunas soluciones de limpieza son difíciles de
remover por completo, en lotes de verificación de artículos de vidrio limpios se
observa la reacción de pH, en especial si se sumergen en álcali o ácido. A fin de
ensayar artículos de vidrio para determinar si existe residuo alcalino o ácido, se
agregan unas cuantas gotas de azul de bromotimol (BTB) al 0,.04 % u otro
indicador de pH y se observa la reacción del color. El BTB debería ser azul
verdoso (en el intervalo neutral).
Para preparar solución indicadora de azul de bromotimol al 0,04 %, se agregan

16 ml 0,01N NaOH a 0,1 g de BTB y se diluye hasta alcanzar los 250 ml con
agua reactiva.
2) Se realiza un ensayo de residuos inhibidores en artículos de vidrio y de plástico –

Algunos agentes humectantes o detergentes utilizados para lavar los artículos de
vidrio pueden contener sustancias bacterioestáticas o inhibidoras que requieren
de 6 enjuagues a 12 enjuagues para remover todos los vestigios y garantizar
que se encuentren libres de acción bacterioestática residual. Se realiza este
ensayo anualmente y antes de usar un nuevo suministro de detergente. Si se ha
prelavado, se utilizan elementos de plástico, preesterilizados, se realiza ensayo
de residuos inhibitorios. Aunque el siguiente procedimiento describe el ensayo
de cajas de Petri para residuos inhibidores, es aplicable a otros artículos de
vidrio o plástico.
a) Procedimiento: Se lavan y enjuagan seis cajas de Petri, de acuerdo con

la práctica de laboratorio habitual y se designan como Grupo A.
Se lavan las seis cajas de Petri como se indica arriba, se enjuagan 12 veces
con porciones sucesivas de agua reactiva, y se designan como Grupo B.
Se enjuagan seis cajas de Petri con agua para lavar con detergente (en
la concentración de uso) y se seca al aire sin enjuague posterior y se
designan como Grupo C.
Se esterilizan las cajas de los Grupos A, B y C mediante el procedimiento

habitual. Para artículos de plástico pre-esterilizados, se conforman seis
cajas de Petri plásticas y se designan como Grupo D.
Se preparan y esterilizan 200 ml de agar para recuento en placa y se

mantienen en un baño de agua a 44 ºC a 46 ºC.
Se prepara un cultivo de E. aerógenos con contenido conocido de 50 a

150 unidades formadoras de colonia/ml (UFC/ml). Puede ser necesario el
ensayo preliminar para lograr este intervalo de recuento. Se inoculan tres
cajas de Petri de cada grupo de ensayo con 0,1 ml y las otras tres cajas
de cada grupo con 1 ml de cultivo.
Se analizan los cuatro conjuntos de seis cajas de Petri cada uno,

siguiendo el método de recuento de placa heteorotrófico (Sección 9215B
del Standard Method) y se incuban a 35 ºC durante 48 h. Se recuentan
las placas con 30 colonias a 300 colonias y se registran los resultados
como UFC/ml.
10
b) Interpretación de resultados – La diferencia en recuentos promediados en

placas de los Grupos A a D deberían ser inferiores al 15 % si no existen
efectos tóxicos o inhibidores.
Las diferencias en recuentos promediados inferiores al 15 % entre

Grupos A y B y superiores al 15 % entre Grupos A y C indican que el
detergente limpiador presenta propiedades inhibidoras que se eliminan
durante el lavado de rutina. Las diferencias entre B y D que sean
mayores al 15 % indican un residuo inhibidor.
b) Utensilios y contenedores para preparación de medios
Se emplean utensilios y contenedores de vidrio de borosilicato, acero inoxidable,

aluminio u otro material resistente a la corrosión (véase la Sección 9030 Standard
Methods). No se emplean utensilios de cobre.
c) Botellas de agua de dilución: Se usan botellas marcadas con gramil, elaboradas de

vidrio de borosilicato o plástico con tapas roscadas que contengan revestimientos
inertes. Se limpian antes de usar. Se encuentran disponibles en el comercio botellas
plásticas desechables estériles pre-llenadas con agua de dilución, las cuales son
aceptables. Antes de utilizar cada lote, se verifica el pH y el volumen y se examina si en
las botellas estériles de agua de dilución existe un precipitado; de ser así se elimina. Si
es necesario, se vuelven a limpiar las botellas con ácido, y se recompone el agua de
dilución. Si se repite el precipitado, se obtiene una fuente diferente de botellas.
d) Calidad de agua grado reactivo: La calidad del agua obtenible de un sistema de

purificación de agua difiere de acuerdo con el sistema que se utilice y su mantenimiento.
Véase el numeral 7.3 d y e arriba. En la Tabla 2 se presentan límites recomendados
para calidad de agua reactiva. Si no se cumplen tales límites, se investiga y corrige o
cambia la fuente de agua. Aunque la medición del pH del agua reactiva se caracteriza
por la desviación, las lecturas extremas son indicadoras de contaminación química.
e) Ensayo de uso para evaluar el agua reactiva, los medios y las membranas: Cuando se va a
emplear un nuevo lote de medio de cultivo, filtros de membrana o una nueva fuente de agua
grado reactivo, se realizan ensayos de comparación, por lo menos trimestralmente, del lote
actual en uso (lote de referencia) contra el nuevo (lote de ensayo).
Tabla 2. Calidad de agua reactiva utilizada en ensayo microbiológico
Ensayo Frecuencia de monitoreo Límite aceptable máximo

Ensayos químicos:
Conductividad Continuamente o con cada uso > 0,5 megaohms de resistencia ó
<2 µmhos/cm a 25 ºC
pH Con cada uso 5.5-7.5
Carbono orgánico total Mensual < 1,0 mg/l
Metales pesados, únicos (Cd, Cr, Cu, Anual* < 0,05 mg/l
Ni, Pb y Zn)
Metales pesados, total Anual* < 0,10 mg/l
Nitrógeno orgánico/amoniaco Mensual < 0,10 mg/l
Total cloro residual Mensual o con cada uso < 0,01 mg/l
Ensayos bacteriológicos:
Recuento de placa heterotrófico Mensual < 1 000 UFC/ml
(Véase la Sección 9215)
Ensayo de uso (véase 7.4e) Trimestral y para una fuente [Student´s t] valor t de Student ≤ 2.78
nueva
* con mayor frecuencia si existe algún problema
11
1) Procedimiento. Se utiliza un lote único de agua de control (agua redestilada o

destilada tratada mediante desionización), artículos de vidrio, filtros de
membrana u otros materiales requeridos para controlar todas las variables,
excepto el factor en estudio. Se realizan ensayos paralelos de placa de filtro de
membrana o placa de vertido o esparcimiento en el lote de referencia y el lote de
ensayo, de acuerdo con los procedimientos de las secciones 9215 y 9222
Standard Methods. Como mínimo, se realizan ensayos únicos en cinco muestras
de agua diferentes positivas para el organismo objeto. Se realizan análisis
replicados y se pueden ensayar muestras adicionales para incrementar la
sensibilidad de la detección de diferencias entre lotes de referencia y de ensayo.
Al realizar el ensayo de uso en agua reactiva, se realizan ensayos bacteriales

cuantitativos paralelos empleando agua de alta calidad reconocida como agua
de control. Se prepara el agua de dilución/enjuague y medios con una fuente
nueva de agua reactiva y de control. Se ensaya el agua para todos los usos
(dilución, enjuague, medios, preparación, etc.).
2) Recuento y cálculos: Después de la incubación, se comparan las colonias

bacterianas de los dos lotes en cuanto a tamaño y apariencia. Si las colonias en
las placas del lote de ensayo son atípicas o notablemente más pequeñas que las
colonias en las placas del lote de referencia, se registra la evidencia de inhibición
u otro problema, sin importar las diferencias de recuento. Se cuentan las placas
y se calcula el recuento individual por 1 ml o por 100 ml. Se transforma el
recuento a logaritmos y se ingresa los resultados transformados en logaritmo
para los dos lotes en columnas paralelas. Se calcula la diferencia, d, entre los
dos resultados transformados para cada muestra, incluido el signo + ó -, la
media, d y la desviación estándar sd de estas diferencias (véase la Sección
1010B del Standard Methods). Se calcula la estadística t de Student, usando el
número de muestras como
−
d
t =
sd / n
Estos cálculos pueden realizarse con varios paquetes de software estadísticos

disponibles para computadores personales.
3) Interpretación: Se usa el valor crítico t de un t de Student que se pueda comparar

contra el valor calculado. En el nivel de significación 0,05 este valor es 2,78 para
cinco muestras (libertad de cuatro grados). Si el valor t calculado no excede
2,78, el ensayo no produce resultados diferentes significativamente y el lote de
ensayo es aceptable. Si el valor t calculado excede 2,78, los lotes producen
resultados diferentes significativamente y el loto de ensayo es inaceptable.
Si las colonias son atípicas o notoriamente más pequeñas en el lote de ensayo,

o el valor t de Student excede 2,78, se revisan las condiciones de ensayo, se
repite y/o se rechaza el lote de ensayo y se obtiene otro.
f) Reactivos Puesto que los reactivos son una parte integral de los análisis
microbiológicos, se debería asegurar su calidad. Se deberían usar sólo sustancias
químicas de grado ACS o equivalente ya que las impurezas pueden inhibir el
crecimiento bacteriano, proporcionar nutrientes o no producir la reacción deseada. Se
fechan las sustancias químicas y los reactivos cuando se reciben y cuando se abren
para uso por primera vez. Se conforman los reactivos hasta el volumen en matraces
volumétricos y se transfieren para almacenamiento en botellas de vidrio de borosilicato
12
o plástico inerte de buena calidad con detenedores o tapones de borosilicato, polietileno

o plástico. Se rotulan los reactivos preparados con el nombre y la concentración, la
fecha de preparación y las iniciales del preparador. Se incluyen cultivos de control
positivos y negativos con cada serie de ensayos de cultivo o bioquímicos.
g) Tintes y teñidos: En análisis microbiológicos, se utilizan sustancias químicas orgánicas

como agentes selectivos (por ejemplo, verde brillante), como indicadores (por ejemplo,
rojo fenólico) y como teñidos (por ejemplo, reactivo de Gram). Los tintes de proveedores
comerciales varían entre lotes en tinte en porcentaje, complejo de tinte, insolubles y
materiales inertes. Puesto que los tintes para microbiología deberían tener resistencias
adecuada y estabilidad para producir reacciones correctas, se deberían usar reactivos
analíticos certificados. Se verifican los teñidos bacteriológicos antes de usarlos, con
mínimo un cultivo de control positivo y uno negativo y se registran los resultados.
h) Filtros de membrana y almohadillas: La calidad y desempeño de los filtros de membrana

varía con el fabricante, tipo, marca y lote. Estas variaciones se originan debido a
diferencias en métodos de manufactura, materiales, control de la calidad, condiciones
de almacenamiento y aplicación.
1) Los filtros de membrana y las almohadillas para análisis de agua deberían

cumplir las siguientes especificaciones:
a) Diámetro de filtro de 47 mm, diámetro de poro promedio 0,45 µm. Se

pueden emplear tamaños alternativos de filtro y poro si el fabricante
ofrece datos que verifiquen que el desempeño es igual o mejor que el
filtro de 47 mm de diámetro, poro de 0,45 µm de tamaño. Mínimo el 70 %
del área del filtro deberían ser poros.
b) Cuando los filtros flotan en agua reactiva, el agua se difunde uniformemente

a través de los filtros en 15 s sin puntos secos en los filtros.
c) Las tasas de flujo son mínimo 55 ml/min/cm2 a 25 ºC y una presión

diferencial de 93 kPa.
d) Los filtros son no tóxicos, libres de sustancias inhibidoras de crecimiento

bacteriano o estimulantes y libres de materiales que interfieran directa o
indirectamente con los sistemas indicadores de bacterias en el medio; la
retícula de tinta es no tóxica. La media aritmética de cinco recuentos en
filtros debería ser mínimo el 90 % de la media aritmética de los recuentos
en las cinco placas de esparcimiento de agar usando los mismos
volúmenes de muestra y medios de agar.
e) Los filtros retienen los organismos de una suspensión de 100-ml de

Serratia marcescens que contiene 1 x 103 células.
f) Las sustancias extraíbles de agua en el filtro no exceden el 2,5 %

después de la membrana hierve en 100 ml de agua reactiva durante 20
min, se seca, se enfría y se lleva a peso constante.
g) La almohadilla absorbente tiene un diámetro de 47 mm, espesor de 0.8 mm

y es capaz de absorber 2,0 ± 0,2 ml de caldo Endo.
13
h) Las almohadillas liberan menos de 1 mg de acidez total calculada como

CaCo3 cuando se titulan hasta el punto final de fenolftaleína con 0,02N
NaOH.
i) Si el filtro y la almohadilla absorbente no son estériles, no deberían

degradarse mediante esterilización a 121 ºC durante 10 min. Se confirma
la esterilidad por ausencia de crecimiento cuando se coloca un filtro de
membrana en una almohadilla saturada con caldo de extracto de glucosa
de triptona o agar de extracto de glucosa de triptona y se incuba a 35 ºC
± 0,5 ºC durante 24 h.
j) Algunos lotes de filtros de membrana producen recuperaciones inferiores,

diferenciación deficiente o malformación de colonias debido a la toxicidad,
composición química o defectos estructurales. Se realiza el ensayo de
uso numeral 7.4 e) en lotes nuevos de filtros.
2) Ensayos normalizados:
Se encuentran disponibles ensayos normalizados para evaluar características de

retención, recuperación, extraíbles y tasa de flujo de los filtros de membrana.
Algunos fabricantes ofrecen información más allá de la requerida por las

especificaciones y certifican que sus membranas son satisfactorias para el
análisis de agua. Reportan retención, tamaño del poro, tasa de flujo, esterilidad,
pH, porcentaje de recuperación y límites para extraíbles químicos inorgánicos y
orgánicos específicos. Aunque los ensayos normativos de evaluación del filtro de
membrana se desarrollaron para fabricantes, un laboratorio puede conducir sus
propios ensayos.
A fin de mantener el control de la calidad, se debería inspeccionar cada lote de

membranas antes de usarlas y durante el ensayo para asegurarse de que sean
redondas y plegables, con líneas de retícula no distorsionadas después de
someterse a autoclave. Después de la incubación, las colonias deberían estar
bien desarrolladas y con color y forma bien definidos, de acuerdo a lo definido en
el procedimiento de ensayo. La tinta de la línea de la retícula no debería
canalizar crecimiento a lo largo de la línea de tinta ni restringir el desarrollo de la
colonia. Las colonias deberían estar distribuidas de manera uniforme a través de
la superficie de la membrana.
i) Medios de cultivo: Puesto que los métodos de cultivo dependen de medios preparados
adecuadamente, se utilizan los mejores materiales y técnicas disponibles en la
preparación, almacenamiento y aplicación de los medios. Para fines de control de la
calidad, se usan medios preparados comercialmente siempre que se hallen disponibles,
pero se observa que la calidad de tales medios puede variar entre fabricantes e incluso
entre lotes del mismo fabricante.
Se ordenan medios en cantidades que no duren más de 1 año. Se usan los medios
sobre una base de primero en llegar, primero en salir. Cuando resulte práctico, se
ordenan medios en múltiples de cuarto de libra (114 g), en lugar de botellas de una libra
(454 g), a fin de mantener el suministro sellado el mayor tiempo posible. Se registra la
clase, cantidad y apariencia de los medios recibidos, número de lote, fecha de
vencimiento y fechas en que se recibe y se abre. Se verifica el inventario
trimestralmente para volver a hacer pedidos.
14
Se almacenan los medios deshidratados a una temperatura uniforme en un lugar seco

fresco, lejos de la luz solar directa. Se descaran medios que se endurezcan, decoloren
o muestren otras señales de deterioro. Si el fabricante ofrece una fecha de vencimiento,
se descartan los medios sin usar después de dicha fecha. Un límite de tiempo de
conservación para botellas sin abrir es de 2 años a temperatura ambiente. Se comparar
la recuperación de lotes recién comprados de medios contra lotes probados, usando
muestras recientes aisladas de cultivo puro y naturales.
Se utilizan botellas abiertas de medios en un período de seis meses. Los medios

deshidratados son higroscópicos. Se protegen de la humedad las botellas abiertas. Se
cierran las botellas con el mayor hermetismo posible, inmediatamente después de
usarlas. Si se endurecen, u ocurre decoloración de los medios, se eliminan los medios.
Se almacenan las botellas abiertas en un desecador.
1) Preparación de los medios - Se preparan los medios en contenedores que tenga

mínimo dos veces el volumen del medio que se está preparando. Se agitan los
medios, en especial los agares, mientras se calientan. Se evita la tostación o la
sobre-ebullición, empleando un baño de agua en ebullición para lotes pequeños
de medios y atendiendo continuamente los volúmenes mayores calentados en
una placa caliente o quemador de gas. Preferiblemente se usan combinaciones
de agitador magnético y placa caliente. Se rotulan y fechan los medios
preparados. Se preparan los medios en agua reactiva. Se miden los volúmenes
de agua y los medios con probetas o pipetas conformes con las normas NIST y
APHA, respectivamente. No se usan pipetas de soplado. Después de la
preparación y almacenamiento, se vuelven a fundir los medios de agar en agua
hirviendo o flujo de vapor.
Se verifica y registra el pH de una porción de cada medio después de la

esterilización y el enfriamiento. Se verifica el pH del medio sólido con una sonda
de superficie. Se registran los resultados. Se realizan ajustes menores en el pH
(<0.5 unidades de pH) con 1N de solución de NaOH ó HCl hasta el pH
especificado en la formulación. Si la diferencia del pH es mayor a 0.5 unidades,
se elimina el lote y se verifican las instrucciones de preparación y el pH del agua
reactiva para resolver el problema. Los valores incorrectos de pH pueden
deberse a la calidad del agua reactiva, el deterioro del medio o la inadecuada
preparación. Se revisan las instrucciones de preparación y se verifica el pH del
agua. Si el pH del agua no es satisfactorio, se prepara un lote nuevo de medio
usando agua de una fuente nueva (véase 7.3d y e). Si el agua es satisfactoria,
se recompone el medio y se verifica; si el pH es incorrecto nuevamente, se
prepara el medio de otra botella.
Se registran los problemas de pH en el libro de registro de medios y se informa

al fabricante si el medio es la fuente de error indicada. Se examinan los medios
preparados en cuanto a color inusual, oscurecimiento o precipitación y se
registran las observaciones. Se consideran las variaciones del tiempo de
esterilización y la temperatura como causas posibles de problemas. Si ocurre
cualquiera de los eventos anteriores, se elimina el medio.
2) Esterilización: Se esterilizan los medios a 121 ºC hasta 124 ºC durante el tiempo

mínimo especificado. Una autoclave de doble pared permite mantener la presión
y temperatura plenas en la chaqueta entre cargas y reduce la oportunidad de
daño por calor. Se deberían seguir las instrucciones del fabricante para la
esterilización de medios específicos. El tiempo de exposición requerido varía con
la forma y tipo de material, tipo de medio, presencia de carbohidratos y volumen.
15
En la Tabla 3 se presentan directrices para elementos típicos. No se exponen los

medios que contienen carbohidratos a las temperaturas elevadas durante más
de 45 min. El tiempo de exposición se define como el período desde la
exposición inicial hasta la remoción del autoclave.
Algunos modelos de autoclave disponibles en la actualidad son automáticos e

incluyen características tales como puertas que se abren y auto-sellan,
deslizamiento vertical, ciclos de esterilización programables y monitoreo continuo
de múltiples puntos de la temperatura y presión de la cámara. Estas unidades
también pueden incorporar características de enfriamiento de la solución y
remoción del vapor. Cuando el diseño del esterilizador incluye intercambiadores
de calor y características de enfriamiento de soluciones como parte de un ciclo
de líquido programado en la fábrica, no es necesaria la estricta adherencia a la
duración de 45 min en el autoclave siempre y cuando los registros impresos
verifiquen la operación del ciclo normal y el enfriamiento de la cámara durante el
escape y la remoción del vapor.
Tabla 3. Tiempo y temperatura para esterilización en autoclave
Material Tiempo a 121 ºC*

Filtros de membrana y almohadillas 10 min
Medios con contenido de carbohidratos (triptosa laurílica, 12,15 min
caldo BGB, etc.)
Materiales contaminados y cultivos eliminados 30 min
Conjuntos de filtro de membrana (envueltos), botellas de 15 min
recolección de muestras (vacías)
Agua de dilución buferada, 99 ml en botella de tapa 15 min
roscada
Agua de enjuague, volumen > 100 ml Se ajusta de acuerdo con el volumen
*Excepto para medios, los tiempos son directrices, se debería verificar la esterilidad.
Se retiran los medios esterilizados del autoclave tan pronto como la presión de la
cámara alcance cero, o, si se utiliza un modelo completamente automático, tan
pronto como se abra la puerta. No se vuelve a esterilizar en autoclave los medios.
Se verifica la efectividad de la esterilización mensualmente colocando

suspensiones o tiras de espora de Geobacillus stearothermophilus
(comercialmente disponibles) en el interior de elementos de vidrio. Se esteriliza a
121 ºC durante 15 min. Se coloca en tubos de caldo de soya tripticasa y se
incuba a 55 ºC durante 48 h. Si ocurre crecimiento de las esporas esterilizadas
en autoclave después de la incubación a 55 ºC o según las recomendaciones de
incubación dadas por el fabricante de los indicadores biológicos, la esterilización
fue inadecuada. Se encuentra disponible en el comercio una incubadora de 55 ºC
pequeña, relativamente no costosa.
Se esterilizan las soluciones o medios sensibles al calor mediante filtración a

través de un filtro de 0,22 -µm de diámetro de poro en un aparato receptor y de
filtración estéril. Se filtra y dispensa el medio en un gabinete de seguridad o
campana contra riesgos biológicos, si se encuentra disponible. Se esterilizan los
artículos de vidrio (pipetas, cajas de Petri, botellas de muestra) en un autoclave o
un horno a 170 ºC durante 2 h. Se esterilizan el equipo, los suministros y otros
materiales sólidos o secos que son sensibles al calor, mediante la exposición al
óxido de etileno en un esterilizador. Se usan tiras o suspensiones de esporas
comercialmente disponibles para verificar el calor en seco y la esterilización con
óxido de etileno.
16
3) Uso de agares y caldos: Se atemperan los agares fundidos en un baño de agua

entre 44 ºC a 46 ºC hasta que se utilice totalmente, pero no se dejan por más de
3 h. A fin de monitorear la temperatura del agar, se expone una botella de agua
o medio a las mismas condiciones de calentamiento y enfriamiento que el agar.
Se inserta un termómetro en la botella de monitoreo para determinar cuando la
temperatura se encuentra en 45 ºC a 46 ºC y es apropiada para usar encajas de
Petri. Si es posible, se preparan lo medios el día de su uso. Después de verter el
agar en las cajas de Petri para proceso de estría, se secan las superficies del
agar manteniendo la caja ligeramente abierta durante mínimo 15 min en una
superficie lisa en un ambiente aséptico para evitar la contaminación. Se elimina
el agar líquido sin utilizar; no se deja endurecer o volver a fundir para uso
posterior.
Se manipulan cuidadosamente los tubos de caldo para fermentación estériles a

fin de evitar el atrapamiento de aire en las campanas de Durham, produciendo
así falsos positivos. Se examinan los tubos recién preparados para determinar
que no haya presencia de aire.
Tabla 4. Tiempos de almacenamiento para medios preparados
Medio Tiempo de almacenamiento

Caldo de filtro de membrana (FM) en matraces de tapa 96 h
rosca a 4 ºC
Agar de FM en placas con cubiertas de ajuste hermético 2 semanas
a 4 ºC
Agar o caldo en tubos de tapón holgado a 4 ºC 2 semanas
Agar o caldo en tubos de tapa rosca cerrada 3 meses
herméticamente u otros contenedores sellados
Cajas de Petri con agar con cubiertas de ajuste holgado 2 semanas
en bolsas plásticas selladas a 4 °C
Volumen grande de agar en matraz o botella de tapa 3 meses
rosca cerrada herméticamente a 4 ºC
4) Almacenamiento de los medios: Se preparan los medios en cantidades que se

usarán dentro de los límites del tiempo de almacenamiento presentados en la
Tabla 4. Se protegen de la luz los medios que contienen indicadores; si ocurren
cambios de color, se eliminan dichos medios. Se refrigeran las placas de agar
vertido no usadas en el día de la preparación, invertidas. Se sellan las placas de
agar con tapas de ajuste holgado en bolsas plásticas si se mantienen más de 2 d. Se
preparan medios de caldo que se almacenarán durante más de 2 semanas en tubos
de tapa roscada, otros tubos sellados herméticamente, o en tubos de tapa holgada
colocados en una bolsa plástica sellada u otro contenedor sellado herméticamente
para evitar la evaporación.
Se marca el nivel del líquido en varios tubos y se monitorea la pérdida de líquido.

Si la pérdida es del 10 % o más, se elimina el lote. Si se refrigeran los medios, se
debería incubar durante la noche a temperatura de ensayo antes de usarlos y se
rechaza el lote si ocurren falsos positivos. Los caldos estériles y agares
preparados disponibles de fuentes comerciales pueden ofrecer ventajas cuando
los análisis se realizan de manera intermitente, cuando no se cuenta con
personal para la labor de preparación, o cuando el costo puede equilibrarse
contra otros factores de operación de laboratorio. Se verifica el desempeño de
estos medios, según se describe en el numeral 5 a continuación.
5) Control de la calidad de medios preparados. Se mantiene un registro completo

de cada lote preparado de medio con el nombre del preparador y la fecha, el
nombre y el número de lote del medio, la cantidad de medio pesada, el volumen
17
del medio preparado, el tiempo de esterilización y la temperatura, las mediciones

de pH y ajustes y las preparaciones de componentes lábiles. Se comparan las
recuperaciones cuantitativas de lotes nuevos con los previamente aceptables. Se
incluyen verificaciones de esterilidad y de cultivos de control positivos y
negativos en todos los medios como se describe a continuación.
8. PROCEDIMIENTOS NORMALIZADOS DE OPERACIÓN (PNO)
Los PNO son la columna vertebral operacional de un laboratorio analítico. Los PNO describen
en detalle todas las operaciones de laboratorio tales como la preparación de reactivos, el agua
reactiva, los patrones, los medios de cultivo, el uso adecuado de las balanzas, las prácticas de
esterilización y los procedimientos de lavado de recipientes, lo mismo que los métodos de
muestro, análisis y control de la calidad. Los PNO son únicos del laboratorio. Describen las
tareas como se realizan sobre una base diaria, ajustadas al equipo, la instrumentación y tipos
de muestra propios del laboratorio. Los PNO guían las operaciones de rutina de cada analista,
ayudan a asegurar operaciones uniformes y ofrecen una herramienta sólida de formación.
9. MUESTREO
a) Planificación
Los microbiólogos deberían participar en la planificación de programas de monitoreo

que incluyan análisis microbianos. Pueden proporcionar experiencia valiosa en la
selección de los sitios de muestreo, número de muestras y análisis necesarios, carga de
trabajo y necesidades de equipos y suministros. Para aguas naturales, se requiere el
conocimiento de las densidades microbianas probables y el impacto de patrones de
estación, tiempo atmosférico y de viento, fuentes conocidas de contaminación y otras
variables, para formular el plan de muestreo más efectivo.
b) Métodos
Los planes de muestreo deberían ser específicos para cada sitio de muestreo. La
orientación de muestreo previo sólo puede ser de naturaleza general, dirigiéndose a los
factores que se deberían considerar para cada sitio. Los PNO de muestreo describen el
equipo, las técnicas, frecuencia, tiempos y condiciones de almacenamiento, reglas de
seguridad, etc. de muestreo, que se utilizarán bajo condiciones diferentes para sitios
diferentes. A partir de la información de estos PNO, se trazarán los planes de muestreo.
10. MÉTODOS ANALÍTICOS
a) Selección del método: Debido a que variaciones menores en la técnica pueden causar
cambios significativos en los resultados, los métodos microbiológicos deberían
normalizarse de modo que laboratorios múltiples arrojen datos uniformes. Se
seleccionan métodos analíticos apropiados para el tipo de muestra de Standard
Methods, Documentos Normativos Colombianos (NTC o GTC) u otra fuente de métodos
normalizados y se garantiza que se hayan validado los métodos en un estudio
multilaboratorio con los tipos de muestra de interés.
b) Objetivos de información: Se revisan los métodos disponibles y se determina cuál

produce información que satisfaga las necesidades del programa de precisión, sesgo,
especificidad, selectividad y límite de detección. Se asegura que los métodos hayan
18
demostrado un desempeño dentro de las especificaciones anteriores para las muestras

de interés.
c) Control de la calidad interno: Los métodos analíticos escritos deberían contener

verificaciones de control de la calidad de cultivos de control positivos y negativos, blanco
estéril, análisis duplicados (precisión) y un cultivo cuantitativo conocido, si es posible.
d) Métodos PNO: Como parte de los PNO, se entrega a cada analista una copia de los
métodos analíticos escritos por pasos exactamente como se van a realizar y específicos
para el tipo de muestra, equipo e instrumentación usados en el laboratorio.
11. PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS DE CONTROL DE LA CALIDAD
a) Procedimientos generales de control de la calidad:
1) Métodos nuevos: Se realizan ensayos paralelos con el procedimiento

normalizado y un método nuevo para determinar la aplicabilidad y capacidad de
comparación. Se realizan mínimo 100 ensayos paralelos durante el año antes de
cambiarse al método nuevo para uso rutinario.
2) Comparación de recuentos de placa: Para evaluación rutinaria, se repiten los

recuentos en una o más muestras positivas mínimo cada mes y se comparan los
recuentos con los de otros analistas que ensayan las mismas muestras. Los
recuentos duplicados para el mismo analista deberían coincidir en un 5 % y los
realizados entre analistas deberían coincidir en un 10%. Véase en el numeral 14,
literal b (Medidas de Tendencia Central Sesgadas), un cálculo estadístico de
precisión de datos.
3) Cultivos de control: Para cada lote de medio, se verifican los procedimientos

analíticos ensayando con cultivos de control positivos y negativos conocidos
para el (los) organismo(s) bajo ensayo. Véase en la Tabla 5 ejemplos de cultivos
de ensayo.
4) Análisis duplicados: Se realizan análisis duplicados en el 10 % de muestras y en

mínimo una muestra por corrida de ensayo. Una corrida de ensayo se define
como una serie ininterrumpida de análisis. Si el laboratorio realiza menos de 10
ensayos/semana, se realizan análisis por duplicado en mínimo una muestra cada
semana.
Tabla 5. Cultivos de control para ensayos microbiológicos
Cultivo de control
Grupo Positivo Negativo
Coliformes totales Escherichia coli Staphylococcus aureus
Enterobacter aerogenes Pseudomonas sp.
Coliformes fecales E. coli E. aerogenes

Streptococcus faecalis
Escherichia coli E. coli E. aerogenes
Streptococcus faecalis Enterococcus faecalis Staphylococcus aureus

E. coli
Enterococcus
S. faecalis S. mitis/salivarius
19
5) Verificaciones de esterilidad: Para ensayos de filtro de membrana, se verifica la

esterilidad de los medios, los filtros de membrana, la dilución buferada y el agua
de enjuague, las pipetas, matraces, cajas de Petri y equipos, como mínimo al
finalizar cada serie de muestras, usando agua reactiva estéril como muestra. Si
se presenta contaminación, se verifica la fuente. Para procedimientos de
presencia-ausencia y tubos múltiples, se verifica la esterilidad de los medios, se
incuba una porción representativa de cada lote en una temperatura apropiada
durante 24 h a 48 h y se observa el crecimiento. Se verifica la esterilidad de cada
lote de agua de dilución buferada agregando 20 ml de agua a 100 ml de un caldo
no selectivo. De manera alternativa, se pasa asépticamente 100 ml ó más de
agua estéril a través de un filtro de membrana y se coloca el filtro en medio de
crecimiento adecuado para bacterias heterotróficas. Se incuba a 35 ºC ± 0,5 ºC
durante 24 h y se observa el crecimiento. Si se evidencia contaminación, se
determina la causa y se rechazan los datos analíticos de muestras ensayadas
con estos materiales. Se exige un nuevo muestreo y análisis de inmediato.
b) Precisión de métodos cuantitativos: Se calcula la precisión de análisis duplicados para

cada tipo diferente de muestra examinada, por ejemplo, agua potable, agua ambiental,
agua de desecho, etc., de acuerdo con el siguiente procedimiento:
1) Se realizan análisis duplicados en las primeras 15 muestras positivas de cada

tipo y un único analista analiza cada conjunto de duplicados. Si existe más de un
analista, se incluyen todos los analistas que en forma regular llevan a cabo los
ensayos y cada analista realiza aproximadamente una cantidad igual de
ensayos. Se registran análisis duplicados como D1 y D2.
2) Se calcula el logaritmo de cada resultado. Si cualquier conjunto de resultados

duplicados es <1, se agrega 1 a ambos valores antes de calcular los logaritmos.
3) Se calcula el intervalo (R) de cada pareja de duplicados transformados como el

promedio (R ) de estos intervalos.
Véase un ejemplo de cálculo en la Tabla 6.
4) Posteriormente, se analiza el 10 % de las muestras de rutina por duplicado. Se

trasforman los duplicados como se indica en el numeral 2 de este literal) y se
calcula su intervalo. Si el intervalo es superior a 3.27 R, existe una probabilidad
mayor al 99 % de que la variabilidad del laboratorio sea excesiva. Se determina
si la imprecisión incrementada es aceptable; de no ser así; se descartan todos
los resultados analíticos desde la última verificación de precisión (véase la Tabla 7):
Se identifica y resuelve el problema analítico antes de realizar análisis posteriores.
5) Se actualiza el criterio empleado en el numeral 4 de este literal) mediante

repetición periódica de los procedimientos de el numeral 1) al 3) utilizando los
conjuntos más recientes de 15 resultados duplicados.
20
Tabla 6. Cálculo de criterio de precisión
Análisis duplicados Logaritmos de recuentos Intervalo de logaritmos

Muestra No. (Rlog)
D1 D2 L1 L2 (L1-L2)
1 89 71 1,949 4 1,851 3 0,098 1
2 38 34 1,579 8 1,531 5 0,048 3
3 58 67 1,763 4 1,826 1 0,062 7
. . . . . .
. . . . . .
. . . . . .
14 7 6 0,845 1 0,778 2 0,066 9
15 110 121 2,041 4 2,082 8 0,041 4
Cálculos:
Σ de Rlog = 0,098 1 + 0,048 3 + 0,062 7 + ... + 0,066 9 + 0,041 4 = 0,718 89
− Σ Rlog 0,718 89
R = = 0,047 9
n 15
−
1) Criterio de precisión = 3,27. R = 3,27 (0,047 9) = 0,156 6
12. VERIFICACIÓN
Para la mayor parte, los procedimientos de confirmación/verificación para agua potable difieren
de aquellos para otras aguas debido a requisitos reglamentarios específicos.
a) Métodos de fermentación de tubo múltiple (FTM):
1) Procedimiento de coliformes (sección 9221 B del Standards Methods)
a) Agua potable. Se llevan las muestras a través de la fase confirmativa. No

se requiere verificación. Para propósitos de control de la calidad, si
normalmente no existen resultados positivos, se analiza mínimo un agua
de fuente positiva trimestralmente para confirmar que el medio produzca
respuestas apropiadas. Para muestras con historial de alto crecimiento
sin gas en tubos de fase presuntiva, se llevan los tubos a través de la
fase confirmada para verificar los falsos negativos para bacterias
coliformes . Se verifican los positivos para coliformes fecales o E.coli.
b) Otros tipos de agua. Se verifica realizando el Ensayo MTF en el 10 % de

muestras positivas a través de la fase confirmada.
2) Ensayo en substrato enzimático para coliformes (coliformes totales/E. coli) (sección

9223 B del Standards Method)
a) Agua potable. Se verifica mínimo el 5 % de resultados positivos de

coliformes totales de los ensayos en substrato enzimático para coliformes,
inoculando el crecimiento de una muestra positiva conocida y verificando la
fermentación de lactosa o β-D-galactopiranosidasa mediante el ensayo de o-
nitrofenil-β-D-galactopiranosidasa (ONPG) e indofenol mediante el ensayo
de citocromo-oxidasa (CO). Véanse estos ensayos en 9225D del Standards
21
Methods. Los coliformes son ONPG positivos y citocromo-oxidasa negativos.

Se verifica E.coli usando el ensayo EC MUG (véase 9221F del Standards
Methods).
b) Otros tipos de agua. Se verifica mínimo el 10% de muestras positivas de

coliformes totales como se indica en el numeral 2 literal a anterior.
3) Procedimiento de Streptococcus faecalis: Se verifica como se indica en 9230 C.5.

del Standards Methods. El crecimiento de coco gram positivo, catalasa negativa en
agar bilis esculina a 35 ºC y en caldo de infusión cerebro-corazón a 45 ºC verifica
que los organismos son Streptococcus faecalis. El crecimiento a 45 ºC y en caldo de
NaCl al 6,5 % indica que los Streptococcus son miembros del grupo Enterococcus.
4) Se incluyen los cultivos puros positivos y negativos conocidos como verificación

del control de la calidad.
b) Métodos de filtración por membrana:)
1) Procedimientos de coliformes totales
a) Agua potable. Se seleccionan hasta 5 colonias típicas y 5 colonias atípicas

(sin brillo) de muestras positivas en medio M-Endo y se verifica de acuerdo
con 9222B.5f del Standard Method. Además se verifican los positivos para
coliformes fecales ó E. coli. Si no existen muestras positivas, se ensaya
trimestralmente mínimo un agua de fuente positiva conocida.
b) Otros tipos de agua: Se verifican los positivos mensualmente

recolectando mínimo 10 colonias con brillo de una muestra de agua
positiva como se indica en 9222B.5f del Standard Method . Se ajustan los
recuentos con base en el porcentaje de verificación.
c) A fin de determinar falsos negativos, se seleccionan colonias atípicas

representativas de diferentes tipos morfológicos y se verifican de acuerdo
con 9222B.5f del Standard Method.
2) Procedimiento de coliformes fecales
a) Se verifican los positivos mensualmente seleccionando mínimo 10

colonias azules de una muestra positiva. Se confirma en caldo lauril
triptosa y caldo EC como se indica en 9221B.1 y 9221E del Standard
Method. Se ajustan los recuentos con base en el porcentaje de
verificación.
b) A fin de determinar falsos negativos, se seleccionan colonias atípicas

representativas de diferentes tipos morfológicos y se verifican de acuerdo
con 9221B.3 y 9221E del Standard Method.
3) Procedimiento de Escherichia coli
a) Agua potable: Se verifica mínimo el 5 % de resultados MUG-positivos y

MUG-negativos. Se toman de colonias con brillo bien aisladas que emitan
fluorescencia en el agar nutritivo con MUG (NA-MUG), teniendo cuidado
de no recoger un medio que pueda causar un resultado falso positivo.
Además, se verifican las colonias sin brillo que emiten fluorescencia. Se
22
verifica realizando el ensayo de citrato y el ensayo de indol, (según se

describe en 9225D del Standard Method), aunque se incuba el ensayo de
indol a 44,5 ºC. Las E.coli son indol-positivas y no producen crecimiento
en citrato.
b) Otros tipos de agua – Se verifica una muestra positiva mensualmente

como se indica en el literal a) anterior. Se ajustan los recuentos en el
porcentaje de verificación.
4) Procedimiento de Streptococcus faecalis: Se selecciona, para verificar,

mensualmente mínimo 10 colonias rojas de esculina positiva aisladas de un agar
de m-Enterococcus a medios de infusión de cerebro corazón (BHI). Se verifica
según se determina en 9230 C del Standard Method. Se ajustan los recuentos
con base en el porcentaje de verificación.
5) Procedimientos Enterococcus: Se selecciona, para verificar, mensualmente

mínimo 10 colonias rosadas a rojas bien aisladas con precipitado marrón rojizo
de agar EIA. Se transfiere a medios BHI como se describe en 9230 C del
Standard Method. Se ajustan los recuentos basados en el porcentaje de
verificación.
6) Se incluyen cultivos puros positivos y negativos conocidos como una verificación

de control de la calidad.
NOTA En el mercado existen pruebas bioquímicas, rápidas, miniaturizadas o automatizadas, pueden ser
empleadas para estas determinaciones.
Tabla 7. Chequeo diario de la precisión en los recuentos por duplicado*
Fecha del Análisis duplicados Logaritmos de recuentos Rango de Rango de

análisis D1 D2 L1 L2 Logaritmos aceptación
29 71 65 1,851 3 1,812 9 0,038 3 A
30 110 121 2,041 4 2,082 8 0,041 4 A
31 73 50 1,863 3 1,699 0 0,164 3 B
−
*Criterio de precisión = (3,27 R ) = 0,1566
A = aceptable;
B = no aceptable
13. DOCUMENTACIÓN Y MANTENIMIENTO DE REGISTROS
a) Plan de control de la calidad: El programa de control de la calidad documenta el

compromiso de la dirección con una política de control de la calidad y establece los
requisitos necesarios para apoyar los objetivos del programa. El programa describe
políticas generales, organización, objetivos y responsabilidades funcionales para lograr
las metas de calidad. Además, el programa debería desarrollar un plan de proyecto que
especifique los requisitos de control de la calidad de cada proyecto. El plan especifica
las actividades de control de la calidad requeridas para lograr representatividad,
integridad, capacidad de comparación y compatibilidad de los datos. Además, el plan de
aseguramiento de la calidad debería incluir un plan de implementación del programa
que garantice máxima coordinación e integración de actividades de control de la calidad
dentro del programa general (muestreo, análisis y manejo de datos).
23
b) Registros de muestreo: Un PNO escrito para tratamiento de la muestra registra la

recolección, transferencia, almacenamiento, análisis y eliminación de la muestra. El
registro se mantiene con mayor facilidad en una serie de formas impresas que motivan
al usuario a brindar toda la información necesaria. Resulta especialmente crítico que
este registro sea exacto y completo si existe posibilidad de litigio. Puesto que los
laboratorios no siempre saben si los resultados analíticos se usarán en litigios futuros,
algunos mantienen cadena de custodia de todas las muestras. En la Sección 1060B del
Standard Method y otras partes se encuentran detalles de la cadena de custodia.
c) Mantenimiento de registros: Un sistema de mantenimiento de registros aceptable ofrece

la información necesaria sobre la recolección y preservación de la muestra, métodos
analíticos, información inicial, cálculos por medio de resultados reportados y un registro
de personas responsables del muestreo y análisis. Se escoge un formato con el que
estén de acuerdo tanto el laboratorio como el cliente (el usuario de los datos). Se
garantiza que todas las hojas de datos estén firmadas y fechadas por el analista y el
supervisor. El formato de registro debe ser un libro foliado, escrito en tinta, de forma
legible; en caso de corrección se debe trazar una línea con la modificación al lado, debe
ser firmado por la persona que la realiza y debería ser fechado.
Se mantienen los registros de análisis microbiológicos durante mínimo 5 años. Se pueden

mantener informes reales de laboratorio, o se pueden transferir los datos a cuadros de
resumen o resumen en forma de tablas), siempre y cuando se incluya la siguiente información:
fecha, lugar y hora de muestreo; nombre del recolector de la muestra; identificación de la
muestra; fecha de recibo de la muestra y análisis; persona(s) responsable(s) de realizar el
análisis; método analítico utilizado; información inicial y los resultados calculados del análisis.
Se verifica que se ingrese cada resultado de forma correcta en la hoja de registro y que tenga
las iniciales del analista. Si se utiliza un sistema de almacenamiento y recuperación de la
información, se verifica dos veces la información de los impresos.
14. MANEJO DE LA INFORMACIÓN
a) Distribución de poblaciones bacterianas: En la mayoría de análisis químicos, la

distribución de los resultados analíticos sigue la curva Gausiana, que presenta
distribución simétrica de valores cerca del promedio (véase la Sección 1010B del
Standard Methods). Las distribuciones microbianas no son necesariamente simétricas.
Con frecuencia, los recuentos bacterianos se caracterizan por una distribución sesgada
debido a los muchos valores inferiores y los pocos superiores. Estas características
conducen a una media aritmética que es considerablemente mayor que la mediana. La
curva de frecuencia de esta distribución tiene una larga cola recta, tal como se muestra
en la Figura1 y se dice que exhibe sesgo positivo.
La aplicación de las técnicas estadísticas más rigurosas requiere la suposición

de distribuciones simétricas tales como la curva normal. Por consiguiente,
comúnmente es necesario convertir los datos sesgados de modo que resulte una
distribución simétrica que se parezca a los resultados de distribución normal. Se
puede obtener una distribución aproximadamente normal de datos sesgados
positivamente convirtiendo números en logaritmos, como se muestra en la Tabla
8. La comparación de las tablas de frecuencia para los datos originales (Tabla 9)
y sus logaritmos (Tabla 10) muestra que los logaritmos se aproximan a una
distribución simétrica.
24
Frecuencia
Cantidad de medida
Figura 1. Curva de frecuencia (distribución sesgada positiva)
b) Medidas de tendencia central de distribución sesgada: Si los logaritmos de números de

una distribución sesgada de manera positiva están distribuidos aproximadamente en
forma normal, los datos originales tienen una distribución de logaritmo normal. El mejor
cálculo de tendencia central de datos de logaritmo normal es la media geométrica,
definida como:
−
x g = n ( x1 ) ( x2 ) ....( X n )
y
− Σ(log xi )
log x g =
n
es decir, la media geométrica es igual al antilogaritmo de la media aritmética de los

logaritmos. Por ejemplo, las siguientes medias calculadas de los datos de la Tabla 8.
son diferentes de manera drástica.
Tabla 8. Recuento de coliformes y sus logaritmos
NMP Recuento de coliformes Nro/100 ml Log NMP

11 1,041
27 1,431
36 1,556
48 1,681
80 1,903
85 1,929
120 2,079
130 2,114
136 2,134
161 2,207
317 2,501
601 2,779
760 2,881
1020 3,009
3100 3,491
X = 442 Xg = antilog 2,1825 = 152
25
Tabla 9. Comparación de frecuencia de datos MPN
Intervalo de Clase Frecuencia

(Logaritmo NMP)
0 a 400 11
400 a 800 2
800 a 1200 1
1 200 a 1 600 0
1 600 a 2 000 0
2 000 a 2 400 0
2 400 a 2 800 0
2 800 a 3 200 0
−
log x g =
∑ (log x ) = 32 ,737 = 2,182 5
i
n 15
significado geométrico
−
x g = anti log (2 ,182 5) = 152
significado aritmétrico
−
xg =
∑ ( x ) 6 632 = 442
1
n 15
Por consiguiente, aunque las regulaciones o la tradición exijan o hagan que los datos
microbiológicos se reporten como la media o mediana aritmética, la estadística preferida para
resumir los datos de monitoreo microbiológico es la media geométrica. Puede ser una
excepción la evaluación de datos de evaluación del riesgo. La media aritmética puede ser una
medida mejor para este propósito ya que puede generar una tendencia central superior y
posiblemente presente un factor de seguridad mayor.
Tabla 10. Comparación de frecuencia de datos de logaritmo de NMP
Frecuencia
Intervalo de Clase
(Logaritmo de NMP)
1,000 a 1,300 1
1,300 a 1,600 2
1,600 a 1,900 1
1,900 a 2,200 5
2,200 a 2,500 1
2,500 a 2,800 2
2,800 a 3,100 2
3,100 a 3,400 0
3,400 a 3,700 1
c) Valores “Menos que”(<): Siempre ha existido incertidumbre en cuanto a la manera

adecuada de incluir valores “menos que” en el cálculo y evolución de datos
microbiológicos puesto que tales valores no se pueden tratar estadísticamente sin
modificación. Las modificaciones propuestas incluyen cambiar tales números a cero,
escogiendo valores en la mitad entre cero y el valor “menos que”, o asignando el valor
“menos que” mismo, es decir cambiando valores <1 a 1, ½ ó 0.
Existen razones válidas para no incluir valores <, estén modificados o no. Si la base de
datos es bastante grande con sólo unos pocos valores <, la influencia de estos valores
inciertos será mínima y sin beneficio. Si la base de datos es pequeña o tiene una
cantidad relativamente grande de valores <, la inclusión de valores < modificados
ejercería una influencia indebida en los resultados finales y podría conllevar a un sesgo
26
negativo o positivo artificial. La inclusión de valores < es especialmente inapropiada si

los valores < son < 100, < 1 000, o mayores, puesto que los valores verdaderos
desconocidos podrían ser cualquiera de 0 a 99, a 999, etc. Cuando se observan por
primera vez los valores <, se ajustan o expanden los volúmenes de ensayo. La única
excepción a esta precaución sería el ensayo reglamentario con límites de conformidad
definidos, tales como los valores <1/100 ml reportados para sistemas de agua potable
donde se requiere el volumen de 100 ml.
27
ANEXO A
(Informativo)
ENTIDADES COMPETENTES EN COLOMBIA
[1] SIC Superintendencia de Industria y Comercio. Ente dedicado a acreditar entidades de

certificación y laboratorios de análisis y ente de Metrología para Colombia.
28
BIBLIOGRAFÍA
[1] NTC 5014, Microbiología de alimentos y alimentos para animales. Protocolo para la
validación de métodos alternos.
[2] GASKIN, J.E. 1992. Quality Assurance in Water Quality Monitoring. Inland Water
Directorate, Conservation & Protection, Ottawa, Ont. Canada.
[3] RATLIFF, T.A., JR. 1990. The Laboratory Quality Assurance System. A Manual of
Quality Procedures with Related Forms. Van Nostrand Reinhold, New York, N.Y.
[4] GARFIELD, F.M. 1984. Quality Assurance Principles of Analytical Laboratorios. Assoc.
Official Analytical Chemists, Arlington, Va.
[5] DUX, J-P 1983. Quality Assurance in the Analytical Laboratory. Amer. Lab. 26:54.
29
DOCUMENTO DE REFERENCIA
AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION. Standard Methods for the Examination of Water
and Wastewate. 20th Edition, 2005.
30

NTC5699 Control de Calidad Lab Microbiología

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NORMA TÉCNICA NTC

ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD - CONTROL DE LA

E: QUALITY ASSURANCE – QUALITY CONTROL IN

CORRESPONDENCIA: esta norma es una adopción por

DESCRIPTORES: directrices; programa de

I.C.S.: 03.120.10; 07.100.01

Editada por el Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación (ICONTEC)

Prohibida su reproducción Editada 2009-09-01

El Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación, ICONTEC, es el organismo

La representación de todos los sectores involucrados en el proceso de Normalización Técnica

La NTC 5699 fue ratificada por el Consejo Directivo de 2009-08-19.

A continuación se relacionan las empresas que colaboraron en el estudio de esta norma a

3 M COLOMBIA LABCONTROL E.U.

2. REFERENCIAS NORMATIVAS ...................................................................................2

3. TÉRMINOS Y DEFINICIONES .....................................................................................2

4. DIRECTRICES PARA UN PROGRAMA DE ASEGURAMIENTO DE

5. OBJETIVOS DEL PROGRAMA DE ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD ...............3

6. ELEMENTOS DE UN PROGRAMA DE ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD .........3

7. DIRECTRICES DE CONTROL DE LA CALIDAD INTRALABORATORIO .................4

7.1 PERSONAL ..................................................................................................................4

7.3 EQUIPO E INSTRUMENTACIÓN DEL LABORATORIO ............................................6

7.4 ELEMENTOS DE LABORATORIO..............................................................................9

8. PROCEDIMIENTOS NORMALIZADOS DE OPERACIÓN (PNO) .............................18

10. MÉTODOS ANALÍTICOS...........................................................................................18

11. PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS DE CONTROL DE LA CALIDAD.......................19

12. VERIFICACIÓN ..........................................................................................................21

13. DOCUMENTACIÓN Y MANTENIMIENTO DE REGISTROS.....................................23

14. MANEJO DE LA INFORMACIÓN ..............................................................................24

Figura 1. Curva de frecuencia (distribución sesgada positiva) .......................................25

Tabla 1. Práctica clave de control de la calidad .................................................................5

Tabla 2.Calidad de agua reactiva utilizada en ensayo microbiológico ...........................11

Tabla 3. Tiempo y temperatura para esterilización en autoclave.....................................16

Tabla 4. Tiempos de almacenamiento para medio preparados .......................................17

Tabla 5. Cultivos de control para ensayos microbiológicos ............................................19

Tabla 6. Cálculo de criterio de precisión............................................................................21

Tabla 7. Chequeo diario de la precisión en los recuentos por duplicado* .....................23

Tabla 8. Recuento de coliformes y sus logaritmos ...........................................................25

Tabla 9. Comparación de frecuencia de datos MPN .........................................................26

Tabla 10. Comparación de frecuencia de datos de logaritmo de MPN............................26

ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD - CONTROL DE LA CALIDAD

El énfasis creciente en los microorganismos, en normas de calidad y actividades de

Un programa de aseguramiento de la calidad de laboratorio consiste en la integración de

El siguiente documento normativo referenciado es indispensable para la aplicación de este

4. DIRECTRICES PARA UN PROGRAMA DE ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD

a) Responsabilidades de la dirección: La dirección debería reconocer la necesidad del

b) Funcionario de aseguramiento de la calidad: En laboratorios grandes, un funcionario de

c) Personal: El personal de laboratorio y de campo participa con la dirección en la

5. OBJETIVOS DEL PROGRAMA DE ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD

Los objetivos de un programa de AC incluyen proveer datos de calidad reconocida, asegurar un

6. ELEMENTOS DE UN PROGRAMA DE ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD

Cada laboratorio debería desarrollar e implementar un plan de AC escrito que describa el

a) Declaración de objetivos, que describa las metas específicas del laboratorio.

b) Procedimientos de muestreo, que incluyan la selección de elementos representativos y

c) Políticas de personal, que describa los requisitos específicos de calificación y formación

d) Requisitos de equipos e instrumentos, que ofrezcan procedimientos de calibración y

f) Métodos analíticos, es decir, métodos normalizados establecidos por una organización

g) Medidas analíticas de control de la calidad, que incluyan verificaciones analíticas tales

h) Procedimientos normalizados de operación (PNO), es decir, declaración escrita y

i) Requisitos de documentación, relacionados con la adquisición de datos, mantenimiento

1) Auditorías internas de las operaciones del laboratorio, realizadas por el