BIOSEGURIDAD

¿A qué nos referimos con este término?

A todo conjunto de NORMAS, MEDIDAS, PROTOCOLOS Y PROCEMINIENTOS, que tienen como

objetivo EVITAR RIESGOS tanto para la salud como el medio ambiente.

ES IMPORTANTE RECONOCER EL USO DE BARRERAS: establece el concepto de seguridad, ya que

evita la exposición directa a todo tipo de muestras potencialmente contaminantes

• Barreras primarias: localizadas entorno al origen del riesgo (desinfectantes y cabinas de

seguridad)
• Barreras secundarias localizadas entorno al trabajador (vacunas; vestimenta uso de ropa
adecuada, guantes, gafas, pelo recogido; higiene personal)
• Barreras terciarias: Localizadas en torno al laboratorio(Contenedores especiares para
material bio-peligroso, autoclaves e incineradores para desechos contaminados)

DESINFECCIÓN, DESCONTAMINACIÓN Y ESTERILIZACIÓN ( son agentes que eliminan los

microorganismos)

*Agentes antisépticos: son germicidas químicos usados en tejidos vivos.

se usa en heridas abiertas o para reducir riesgos de infección

* Agentes desinfectantes: destruyen microorganismos, debido a que son tóxicos

se usa en superfecies inanimadas o sobre objetos

*Agentes esterelizantes: destruyen toda forma de vida (calor seco, óxido de etileno)

presentan alto poder de penetración y actua en un menor tiempo

NIVELES DE BIOSEGURIDAD 4
*Nivel de Bioseguridad 1 (BSL-1)

También conocido como nivel básico 1.

Laboratorio de enseñanza básica, investigación

*Nivel de Bioseguridad 2 (BSL-2)

También conocido como nivel básico 2.

Servicios corresponden a atención primaria, diagnóstico, investigación

*Nivel de Bioseguridad 3 (BSL-3)

También conocido como nivel de contención.

El laboratorio es empleado para diagnóstico especial, investigación

*Nivel de Bioseguridad 4 (BSL-4)

También conocido como nivel de contención máxima.

Los laboratorios presentan unidades de patógenos muy peligrosos

MICROSCOPIA: ESTUDIO Y MANEJO DEL MICROSCOPIO

I. PARTES DEL MICROSCOPIO

*PARTE MECANICA

El sistema mecánico es el esqueleto o armazón del microscopio, el cual proporciona soporte y

estabilidad al equipo

-Tubo portalentes y cremallera: El cual tiene forma cilíndrica

-Condensador; Capta los rayos de luz y los concentra en la muestra proporcionando mayor o
menor contraste.

-Tornillos macro y micrométrico: regulador de condensación

-Brazo y Pie

-Revolver: Importante por ser una pieza giratoria en la que se enroscan los objetivos.

-Charnela (elementos de plegamientos)

*PARTE OPTICA

-Ocular: sistema de lentes:: monoculares o binoculares

-Lentes de condensador

-Objetivos: Son un sistema de lentes convergentes en las que se pueden acoplar varios objetivos

-Diafragma: se encuentra sobre el reflector de la luz

-Espejo

II. SISTEMAS QUE COMPRENDE EL MICROSCOPIO

1. Sistema de soporte: brinda estabilidad al equipo, por tanto esta formado por brazo, pie, tubo
ocular, revólver y platina.

2. Sistema de Iluminación: comprende el foco, condensador y diafragma.

3. Sistema de Ajuste: tan y como lo hemos mencionado, estan los tornillos: macrométricoy
micrométrico, tambien cremallera

4. Sistema de Aumento: comprende el ocular generalmente de 10 x , 15 x, y los objetivos de 4x, 10,

20x, 40, y 100x

COLORACIONES

Proceso mediante el cual un cuerpo es teñido o toma color por la acción de una sustancia
colorante

La mayor parte de los colorantes usados en Microbiología son de tres tipos:

A) ACIDOS: Sales con base incolora y ácido coloreado, cuyo cromóforo es anión. EJM: colorante
citoplasmático (Eosina)

B) BÁSICOS: Sales con base coloreada y ácido incoloro, cuyo cromóforo es catión. EJM: colorante
nuclear (Azul de metileno)

C) NEUTROS: Sales con base y ácido coloreados. EJM: eosinato de azul de metileno.

Se otorga una segunda clasificción, según el número de colorantes que utilizan:

A) Simples: cuando toda la muestra se tiñe del mismo color y se utiliza un sólo colorante (azul de
metileno de Löeffler o tinta china)

B) Diferenciales; se visualiza más de un color porque se utiliza un colorante primario y otro de

contraste.( se puede emplear mordientes y sustancias decolorantes, como en la coloración de

Gram o Ziehl-Neelsen)

C) Especiales: importante para el reconocimiento de estructuras celulares como la coloración de

Leishman o Hiss (para capsula)

1. REALIZACIÓN DE LA EXTENSiÓN

en donde se va realizar el deposito de la sustancia, reconocer que va ser diferente procedimiento

dependiedo del compuesto.

• Producto líquido
• Cultivo en medio sólido
• Sangre
• Órganos

2. SECADO

El cual se deja por sí solo, no obstante, en algunos casos se puede acelerar el proceso utilizando el
mechero Bunsen
3. FIJACIÓN

Recalcar que despues del secado no todos los colorantes seguiran con la fijación. El objetivo en
este momento es adherir el frotis al portaobjetos y de esta manera poder fijar la morfología de las
bacterias, células. Se pueden aplicar ciertas técnicas como:

• Alcohol flameado
• Por el calor
• Por el alcohol en frío

EJEMPLO: COLORACIÓN DE GRAM

Pertenece a la coloracion diferencial, en donde se mostraran a bacterias Gram positivas y Gram

negativas, ambas se tieñen de distintas maneras debido a la peculiar estructura y composición de

su pared celular.

GRAM POSITIVAS: presentan varias capas de peptidoglicano, ácidos teicioicos, lipoteicoicos y

teicurónicos.

GRAM NEGATIVAS: presentan una capa fina de peptidoglicano, proteinas, lipoproteinas y

fosfolípidos.

➔ RESULTADOS

Las bacterias Gram positivas se colorean de violeta y las bacterias Gram negativas de color rosado.

*Existen varias modificaciones del Gram, una de ellas es la de Kopeloff

MEDIOS DE CULTIVO

Hace referencia a toda preparación artificial, sólida, semisólida o líquida que suministra al
microorganismo cada una de las sustancias fundamentales, fuente de energía y condiciones
ambientales adecuadas para el desarrollo y la supervivencia del microorganismo.

En el cultivo se necesita medios especiales con una determinada concentración de iones de

hidrógeno, sales, compuestos nitrogenados, hidratos de carbono, humedad y temperatura.

TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO

De acuerdo a su consistencia

➔ Líquidos: Es el más usado en el caldo nutritivo, compuesto principalmente de extracto de

carne, peptona y agua. Se emplea tras tratar de conseguir una suspensión bacteriana de
una determinada concentración.
➔ Semisólidos: Es preparado utilizando como base medios líquidos, a lo cual se añade un
agente solidificante en pequeña proporción menor. Un ejemplo de su utilidad es la
investigación de la movilidad de las bacterias
➔ Sólidos: Generado a partir de los medios líquidos, agregándoles un agente gelificante , el
agar. ¿Qué es agar? Agar-agar: Es un polímero de azúcares obtenido de algas marinas,
soluble en agua caliente.
En cuanto a concentraciones:
Una solución al 1,5% p/v forma un gel firme entre 32 y 39ºC y no se funde por debajo de
85ºC. Funde a 90ºC y solidifica una vez fundido alrededor de los 45ºC.

No obstante, las complicaciones son que al introducirse compuestos orgánicos indefinidos

pueden falsear los resultados de las necesidades nutritivas de un microorganismo.
Especialmente útiles para el aislamiento de bacterias y observación de colonias, contienen
de 2 a 3 % de agar
SEGÚN SU UTILIZACIÓN.

1) Medios Simples: Presentan componentes mínimos para el crecimiento de bacterias que no

necesiten requerimientos especiales.
* Ejm: El medio agar nutritivo o agar común, que resulta de la adición de agar al caldo
nutritivo. O agar triplicase de soja, el agar Columbia, etc.

2) Medios de enriquecimiento: Manifiestan sustancias nutritivas normales e incorporan una serie

de factores indispensables para el crecimiento de microorganismos exigentes. Permite aumentar
el número de microorganismos de este tipo.

* Es realizado tras la adición de sangre u otros productos biológicos (sangre, suero, leche, huevo,
bilis, etc.) que aportan factores de crecimiento necesario para EL MICROORGANISMO QUE EL
MEDIO NO LO POSEA.

Ej. Caldo tetrationato utilizado para el enriquecimiento de las especies del género Salmonella
provenientes de muestras de heces, orina, agua o alimentos.

3) Medios selectivos: Busca favorecer el crecimiento de ciertas bacterias contenidas en una

población polimicrobiana, facilita nutricionalmente el crecimiento de una población microbiana
específica. Utiles en muestras mixtas

*Ejm: El caldo selenito, que se utiliza para favorecer el crecimiento de salmonellas y frenar el del
resto de enterobacterias.

➔ EJEMPLO DE MEDIO DE CULTIVO

 ➔ Agar Kligler: Se tratade un medio diferencial que permite conocer el comportamiento del
microorganismo ante dos azúcares (glucosa y lactosa), investigar la formación de gas y
comprobar si el microorganismo puede producir sulfatoferroso a partir del tiosulfato
sódico

TIPOS DE SIEMBRA

Uno de los factores que ocasionan el incremento marcado del número de células, es la siembra de
bacterias en un medio de cultivo y en condiciones adecuadas. Se han presentado casos donde
especies alcanzan una población máxima a las 24 horas, mientras que algunas necesitan un
período más prolongado para alcanzar su máximo desarrollo.

o ¿Qué son cultivos?

Los microorganismos que desarrollan en medios de cultivo en el laboratorio

o ¿Qué es colonia?

Es el resultado de la multiplicación bacteriana

o ¿Qué es siembra?

Se denomina al procedimiento por el cual se pone en contacto un microorganismo con un medio

de cultivo

Características morfológicas que presentan las colonias son:

▪ Forma : circular, elíptica, puntiforme y filamentosa.

▪ Elevación : plana, convexa, acuminada, umbilicada.
▪ Borde : entera, ondulada, dentada y filamentoso.
▪ Superficie : lisa, rugosa, granulada.
▪ Tamaño : diámetro en milímetros.
▪ Consistencia : cremosa, membranosa y mucoide.
▪ Cromogenesis : pigmentación verde, amarilla, roja, etc.

TIPOS DE SIEMBRA

❖ Siembra por estría: Diseminar en forma de zigzag, una pequeña cantidad de muestra
bacteriana sobre la superficie del medio de cultivo sólido con la ayuda de un Asa de
siembra en aro.
*Ejemplo agar urea, citrato, TSI, LIA
→ Siembra por agotamiento o aislamiento en estría Se tomará con el asa de siembra
(previamente esterilizado por flameado) una cantidad adecuada de muestra problema
depositando el inoculo en uno de los extremos superiores de la placa; a partir de aquí
se realizarán movimientos en zig-zag de un extremo a otro de la placa no tomándose
en ningún momento nuevo inoculo y no levantándose el asa hasta concluir la siembra
de toda la placa.
❖ Siembra por dispersión-agotamiento: Sembrar la muestra bacteriana en zigzag, hasta la
mitad de la superficie del medio de cultivo sólido que se encuentra en una placa Petri,
girar ésta unos 45º y continuar sembrando en zigzag, hasta que se agote toda la muestra
del Asa de siembra en aro.
*Ejemplo Agar manitol , Agar SS
❖ Siembra por puntura: Sembrar la muestra bacteriana en un tubo con Agar semi-sólido, con
ayuda del Asa de siembra en punta, introduciéndola en forma vertical hasta la mitad de
Agar.
*Ejemplo SIM, MIO ,TSI, LIA
❖ Siembra por inoculación: Con ayuda de un Asa en aro, tomar una muestra bacteriana e
introducirlo hasta el fondo del tubo con medio líquido, procurando no tocar las paredes
del tubo.
*Ejemplo los medios en caldo MR VP,PEPTONA, NUTRITIVO
 METABOLISMO BACTERIANO
• Inicialmente es realizada a través de la determinación:
1) características de las colonias
2) morfología con tinción de Gram u otras coloraciones.
• La caracterización final de un aislamiento bacteriano desconocido es dada por medio de
ciertos sistemas enzimáticos, los cuales son únicos para cada especie y sirven como
marcadores de identificación.

I. ACCION SOBRE LOS CARBOHIDRATOS

o Fermentación se define como un proceso metabólico de oxido- reducción realizado en un
ambiente anaerobio. También, hace referencia a la utilización de hidratos de carbono
como la glucosa los cuales les servirán como fuente de energía y carbono.
o Las bacterias se diferencian por los hidratos de carbono que utilizan, los tipos y cantidades
de ácidos mixtos producidos, generando la acidificación del medio, el cual es visible por el
cambio de color en el medio de cultivo de fermentación (pH- indicador); la presencia de
gas (CO2 e H+) se manifiesta por la presencia de burbujas o rotura del medio sólido.

A) REACCIONES DE OXIDACIÓN- FERMENTACIÓN DE AZUCARES:

EN MEDIO TSI (Triple Sugar Iron)

EL medio TSI fue diseñado para la diferenciación de Bacilos Gram negativos, centrándose en la
capacidad potencial de estas bacterias para fermentar carbohidratos y producir sulfuro de
hidrógeno (H2S).

El medio contiene tres azúcares: glucosa, lactosa y sacarosa.

¿Cómo detectar productos ácidos?

Se emplea un indicador de pH que es el rojo de fenol cuyo rango de viraje está entre pH 8.4 (rojo)
y pH 6.8 (amarillo).

Los patrones de comportamiento de los bacilos Gram negativos ante los carbohidratos presentes
en este medio pueden ser fundamentalmente tres:

1. Fermentación de glucosa únicamente.

2. Fermentación de glucosa + lactosa, glucosa + sacarosa o glucosa + ambos carbohidratos.

3. No fermentación de carbohidratos.

Resultado: se puede formar gas, que se detecta como pequeñas burbujas o grietas en el medio o
por desplazamiento del mismo hacia arriba del tubo. El medio tiene incorporado tiosulfato de
sodio como fuente de azufre para generar H2S, y sales de hierro que al reaccionar con el gas
forman un precipitado negro insoluble de sulfuro ferroso (FeS).
B) PRODUCCION DE ACIDOS Y ACETIL- METIL- CARBINOL (Acetoina)

1. PRUEBA DEL ROJO DE METILO ( RM )

o Prueba cuantitativa
o Identificar especies bacterianas que producen ácidos fuertes (láctico, acético, fórmico) a
partir de glucosa.
o Estas bacterias siguen la vía de fermentación de ácidos mixtos generando suficiente ácido
después de una incubación prolongada, como para mantener un pH por debajo de 4.4 (el
punto ácido límite del indicador rojo de metilo), superando el sistema amortiguador del
pH del medio.
2 PRUEBA DE VOGES PROSKAUER ( VP )
o Formado en la degradación fermentativa de la glucosa
o Metabolizado por microorganísmos produciendo el acetilmetilcarbinol(Acetoina)
o La prueba se basa en la conversión del acetil- metil- carbinol en diacetil a través de la
acción del KOH y Oxígeno atmosférico.
o El diacetilo es convertido en un complejo rojo bajo la acción catalítica del Alfa naftol y
Creatinina.

II. ACCION SOBRE LAS PROTEINAS

PRODUCCION DEL INDOL

▪ Las bacterias que poseen la enzima triptofanasa son capaces de actuar sobre el
aminoácido triptofano, produciendo indol, un benzil pirrol, ácido pirúvico y
amoniaco(NH3).

III. UTILIZACION DEL CITRATO COMO UNICA FUENTE DE CARBONO

o Identifica varias especies de la familia Enterobacteriaceae

o las cuales pueden obtener energía por vía distinta de la fermentación de los
carbohidratos, utilizando el citrato de sodio como única fuente de carbono para su
metabolismo y desarrollo, por lo tanto, cualquier medio que se emplee para
determinar esta característica no debe contener proteínas ni carbohidratos. El citrato
de sodio es una sal del ácido cítrico, compuesto orgánico simple que constituye uno de
los metabolitos del ciclo de Krebs. PRINCIPIO La utilización del citrato por una bacteria
se detecta por su crecimiento en un medio con citrato con formación de subproductos
alcalinos. El medio (Citrato de Simmons) incluye citrato de sodio, un anión como única
fuente de carbono y fosfato de amonio como única fuente de nitrógeno. Las bacterias
que pueden utilizar citrato también pueden extraer nitrógeno de la sal de amonio, con
producción de amonio(NH3), alcalinizando el medio por conversión del NH3 en
 hidróxido de amonio(NH4OH), detectándolo con el indicador de pH incorporado el
azul de bromotimol cuyo rango de viraje esta entre pH 6.9(verde) y pH 7.8(azul).
IV. HIDRÓLISIS DE LA UREA (PRUEBA DE LA UREASA) Prueba importante para la
identificación de especies bacterianas que poseen la enzima ureasa que hidroliza la
urea, según el siguiente esquema: El amoniaco reacciona en la solución para dar
carbonato de amonio, produciéndose una alcalinización y un aumento del pH del
medio que lleva como indicador el rojo neutro.

V. PRUEBA DE LA CATALASA La catalasa es una enzima que poseen la mayoría de las

bacterias aerobias y facultativas anaerobias. El peróxido de hidrógeno (H2O2) es uno
de los productos finales del metabolismo oxidativo de los carbohidratos y sí se
acumula es letal para el microorganismo. La catalasa convierte el peróxido de
hidrógeno en agua y oxígeno de acuerdo a la siguiente reacción: La prueba es de vital
importancia en la diferenciación de los estreptococos (catalasa negativa) de los
estafilococos (catalasa positiva).

VI. PRUEBA DE LA CITOCROMO – OXIDASA Los citocromos son hemoproteínas que

contienen hierro y actúan como el último eslabón de la cadena respiratoria aerobia,
transfiriendo electrones (H) al oxígeno con formación de agua. El sistema citocromo se
encuentra en los organismos aerobios o anaerobios facultativos, permitiendo
identificar a organismos que carecen de la enzima o son anaerobios estrictos. En el
laboratorio se hace reaccionar la bacteria con un sustrato oxidable como el dimetil o
tetrametil- p- fenilendiamina ( el cual se presenta en solución, discos o tiras llamados
comúnmente oxidasa).

AGAR LIA (Agar Lisina Hierro) Principio: Determina la capacidad de un microorganismo

para utilizar el aminoácido Lisina descarboxilándolo o desaminándolo, la fermentación
de la glucosa, la producción o no de gases (CO2), junto con la producción o no de ácido
sulfhídrico (H2S). Lectura: Se efectúa después de 18 a 24 horas de incubación. Se lee la
reacción producida en la superficie (parte aerobia) y en la profundidad (parte
anaerobia) del medio. El indicador de pH del medio es purpura de bromocresol, el cual
en acidez vira al color amarillo y en alcalinidad al color purpura. Por contener una
pequeña cantidad de glucosa (1g/L) al ser fermentada el fondo del tubo es amarillo y
la superficie alcalina Interpretación: en este medio se leen las siguientes reacciones
bioquímicas: a) Fermentación de la glucosa: la bacteria no utiliza el aminoácido sólo
fermenta la glucosa: superficie purpura/fondo amarillo. b) Descarboxilación de la
lisina: Positivo (purpura todo el medio), Negativo (superficie violeta/fondo amarillo). c)
Desaminación de la lisina: superficie roja/fondo amarillo. d) Producción de gas:
ruptura del medio. e) Producción de H2S: ennegrecimiento del medio.

VII. VII. PRUEBA DE LA HEMOLISINA Algunos microorganismos son capaces de producir

una serie de enzimas y sustancias tóxicas que pueden ser detectadas al sembrar el
microorganismo en una placa de Agar sangre, produciendo la lisis de los eritrocitos,
según el tipo de lisis que producen pueden clasificarse en tipo Alfa, Beta y Gamma
 PRACTICA N° 9 PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A LOS ANTIBIOTICOS
(ANTIBIOGRAMA)

Es una prueba de laboratorio clínico que se utiliza para medir la actividad antibacteriana
de los antibióticos y quimioterapéuticos empleados en el tratamiento de las
enfermedades infecciosas.
¿Qué métodos se emplean para la medida de la actividad antibacteriana?
• Método de dilución
• Método de Difusión en Agar

DILUCION EN TUBO
Permite estimar cuantitativamente la susceptibilidad de un antibiótico, midiendo la
concentración inhibitoria mínima.
*Consiste en la preparación de una serie de diluciones del antibiótico estudiado en caldo o
en medio agar al cual se inocula luego una suspensión del germen. Luego de una
incubación por 24 horas, se puede observar la CIM como la dilución más alta en la que no
existe crecimiento macroscópico bacteriano.
DIFUSION EN AGAR (Según Kirby- Bauer y col.)
Es un método simple de rutina en Microbiología médica, para seleccionar el antibiótico o
quimioterápicos más adecuado en la terapia de las enfermedades infecciosas.
Consiste en sembrar la muestra en estudio sobre toda la superficie de una placa de Agar y
colocar luego discos de papel filtro que contienen los antibióticos y que después de una
incubación de 24 horas, se observan las zonas de inhibición alrededor de cada disco de
antibiótico.
MATERIALES • Placas de Agar Müller Hilton o Tripticase soya • Tubos con caldo nutritivo •
Tubos con Agar semisólido • Tubos con cultivo bacteriano • Asas de siembra • Discos
impregnados con diferentes antibióticos o quimioterápicos (sensi- disck). • Pinzas •
Mecheros • Tubo de McFarland (0.5) • Espectrofotómetro

PROCEDIMIENTO
1. Para la preparación del inóculo o caldo bacteriano se toma de 3 -5 colonias y se siembra
en 4 o 5 ml de caldo triplicase de soya , se incuba a 35°C por a 2 horas luego se mide
turbidez para que sea igual al estándar de McFarland (0.5) o hacer la medición con un
espectrofotómetro.
2. Sumergir la torunda en el caldo bacteriano, escurrir en las paredes del tubo y sembrar
uniformemente sobre la superficie de la placa de Agar.
3. Dejar reposar por 5 minutos a temperatura ambiente.
4. Con la pinza en condiciones estériles, colocar los discos impregnados con los diferentes
antimicrobianos sobre la superficie del Agar. La distancia entre los discos debe ser de
20mm.
5. Incubar a 37°C durante 24 horas.
LECTURA
a) Medir en milímetros el diámetro de las zonas de inhibición del desarrollo bacteriano
alrededor de los discos, incluyendo el diámetro del disco.
b) Comparar con la tabla el diámetro de las zonas de inhibición obtenidas y determinar si
el microorganismo es Resistente (R), intermedio (I), o sensible (S) a los diferentes
antimicrobianos utilizados. Un resultado intermedio (I) indica que el aislado es menos
susceptible de lo normal, pero puede responder a dosis altas del antibiótico.
c) La cantidad de antibiótico presente en el disco depende de la concentración y de su
capacidad de difusión en el Agar.
d) Anotar e interpretar los resultados.

PROTOCOLO • Desarrollar y esquematizar un cuadro indicando los resultados que se han

obtenido en la práctica desarrollada • Desarrollar y esquematizar un cuadro indicando los
resultados que se han obtenido en la práctica desarrollada